خلاصہ:سرکوپینیا، جو عمر بڑھنے کے دوران ہوتا ہے، اس کی خصوصیت کنکال کے پٹھوں کے بڑے پیمانے اور افعال کے بتدریج نقصان سے ہوتی ہے، جس کے نتیجے میں جسمانی صلاحیتوں میں فعال کمی واقع ہوتی ہے۔ سارکوپینیا کے آغاز میں کئی عوامل کارفرما ہیں، جن میں دوبارہ پیدا کرنے کی صلاحیت میں کمی، کم درجے کی دائمی سوزش، مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن، اور آکسیڈیٹیو تناؤ میں اضافہ، جس سے کیٹابولک راستے فعال ہوتے ہیں۔ جسمانی سرگرمی اور مناسب پروٹین کی مقدار کو مؤثر حکمت عملی سمجھا جاتا ہے جو عمر بڑھنے کے دوران پٹھوں کے انابولک ردعمل کو بہتر بنانے میں فائدہ مند اثرات مرتب کرکے سارکوپینیا کے واقعات اور شدت کو کم کرنے کے قابل ہے۔ ٹورائن ایک غیر ضروری امینو ایسڈ ہے جو ممالیہ کے ٹشوز میں بہت زیادہ ظاہر ہوتا ہے اور خاص طور پر کنکال کے پٹھوں میں جہاں یہ حیاتیاتی عمل کے ضابطے میں شامل ہوتا ہے اور جہاں یہ ایک اینٹی آکسیڈینٹ اور سوزش کے عنصر کے طور پر کام کرتا ہے۔ یہاں، ہم نے اندازہ کیا کہ آیا پرانے چوہوں میں ٹورائن انتظامیہ کنکال کے پٹھوں میں عمر بڑھنے کے فزیو پیتھولوجیکل اثرات کا مقابلہ کرتی ہے۔ ہم نے دکھایا کہ، زخمی ہونے والے پٹھوں میں، ٹورائن سوزش کے ردعمل کو کم کرکے اور پٹھوں کے فائبر کی سالمیت کو محفوظ کرکے تخلیق نو کے عمل کو بڑھاتا ہے۔ مزید برآں، ٹورائن ایک مناسب سیلولر ریڈوکس توازن کو برقرار رکھتے ہوئے، ایک اینٹی آکسیڈینٹ مالیکیول کے طور پر کام کرتے ہوئے عمر رسیدہ عضلات میں ROS کی پیداوار کو کم کرتا ہے۔ اگرچہ کنکال کے پٹھوں کے ہومیوسٹاسس پر ٹورائن کے فائدہ مند اثر کے لیے ذمہ دار مالیکیولر میکانزم کو بہتر طور پر واضح کرنے کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے، لیکن یہ اعداد و شمار یہ ظاہر کرتے ہیں کہ ٹورائن انتظامیہ مائیکرو ماحولیات کو بہتر بناتی ہے جس سے ایک موثر تخلیق نو کے عمل اور کیٹابولک راستوں کی کشیدگی کی اجازت دی جاتی ہے

سیستانچ کا گلائکوسائیڈ دل اور جگر کے بافتوں میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بھی بڑھا سکتا ہے، اور ہر ٹشو میں لیپوفسن اور ایم ڈی اے کے مواد کو نمایاں طور پر کم کر سکتا ہے، مختلف رد عمل آکسیجن ریڈیکلز (OH-، H₂O₂، وغیرہ) کو مؤثر طریقے سے ختم کر سکتا ہے اور DNA کو پہنچنے والے نقصان سے بچا سکتا ہے۔ OH ریڈیکلز کے ذریعے۔ Cistanche phenylethanoid glycosides میں آزاد ریڈیکلز کو صاف کرنے کی مضبوط صلاحیت ہوتی ہے، وٹامن C سے زیادہ کم کرنے کی صلاحیت، سپرم معطلی میں SOD کی سرگرمی کو بہتر بناتی ہے، MDA کے مواد کو کم کرتی ہے، اور سپرم کی جھلی کے کام پر ایک خاص حفاظتی اثر رکھتی ہے۔ Cistanche polysaccharides D-galactose کی وجہ سے تجرباتی طور پر حساس چوہوں کے erythrocytes اور پھیپھڑوں کے ٹشوز میں SOD اور GSH-Px کی سرگرمی کو بڑھا سکتے ہیں، نیز پھیپھڑوں اور پلازما میں MDA اور کولیجن کے مواد کو کم کر سکتے ہیں، اور elastin کے مواد کو بڑھا سکتے ہیں۔ ڈی پی پی ایچ پر اچھا اثر ڈالتا ہے، سینسنٹ چوہوں میں ہائپوکسیا کے وقت کو طول دیتا ہے، سیرم میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بہتر بناتا ہے، اور تجرباتی طور پر سنسنی والے چوہوں میں پھیپھڑوں کے جسمانی انحطاط میں تاخیر کرتا ہے، سیلولر مورفولوجیکل انحطاط کے ساتھ، تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ Cistanche میں اینٹی آکسیڈنٹ کی اچھی صلاحیت ہے۔ اور جلد کی بڑھتی ہوئی بیماریوں کو روکنے اور علاج کرنے کے لیے ایک دوا بننے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ ایک ہی وقت میں، Cistanche میں echinacoside میں DPPH فری ریڈیکلز کو ختم کرنے کی قابل ذکر صلاحیت ہے اور یہ ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں کو نکالنے اور آزاد ریڈیکل-حوصلہ افزائی کولیجن کے انحطاط کو روکنے کی صلاحیت رکھتا ہے، اور یہ تھامین فری ریڈیکل ایون کے نقصان پر بھی اچھا مرمتی اثر رکھتا ہے۔

Cistanche Tubulosa پر کلک کریں۔

【مزید معلومات کے لیے:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. تعارف

عمر بڑھنے کی خصوصیت اعضاء اور بافتوں کے بنیادی جسمانی اور حیاتیاتی کیمیائی افعال کی بتدریج خرابی سے ہوتی ہے، اور یہ اکثر کنکال کے پٹھوں کے بڑے پیمانے اور طاقت کے بڑھتے ہوئے نقصان سے منسلک ہوتا ہے، یہ حالت سارکوپینیا [1] کہلاتی ہے۔ سارکوپینیا کے لیے ذمہ دار میکانزم مکمل طور پر سمجھ میں نہیں آئے ہیں۔ اس کے باوجود، یہ ممکنہ طور پر متعدد واقعات کا نتیجہ ہے جس میں ایک سمجھوتہ شدہ تخلیقی صلاحیت [2,3]، دائمی سوزش [4,5]، آکسیڈیٹیو تناؤ کی بڑھتی ہوئی سطح [5,6]، اور مائٹوکونڈریل dysfunctions [7] شامل ہیں۔

پٹھوں کی تخلیق نو ایک مربوط عمل ہے جس میں سیٹلائٹ خلیات، کنکال کے پٹھوں کا سٹیم سیل کمپارٹمنٹ، ٹشو کی ساخت کو برقرار رکھنے اور محفوظ رکھنے کے لیے چالو ہوتے ہیں اور نقصان پر کام کرتے ہیں [8]۔

تخلیق نو کے عمل کا پہلا مرحلہ مایو فائیبر نیکروسس کی خصوصیت رکھتا ہے جس کی وجہ ایکسٹرا سیلولر کیلشیم کی آمد ہے جس کی وجہ سے myofibrils [9,10] کے پروٹولیسس ہوتے ہیں۔ اس واقعہ کے نتیجے میں ایک مخصوص اشتعال انگیز ردعمل کو چالو کیا جاتا ہے جو مختلف سوزشی خلیوں کی آبادیوں کے ذریعہ پٹھوں پر ترتیب وار حملے کا باعث بنتا ہے [11]۔ اشتعال انگیز ردعمل سیٹلائٹ سیل ایکٹیویشن اور دوبارہ پیدا کرنے والے ریشوں کی تشکیل کے بعد ہوتا ہے، جو کہ خصوصیت کے مرکزی مرکزے [12,13] کے ذریعہ شکلیاتی طور پر ممتاز ہیں۔ تاہم، ایک موثر تخلیق نو کا پروگرام بڑھاپے یا پیتھولوجیکل حالات کی صورت میں بری طرح متاثر ہو سکتا ہے، اور توسیع شدہ فائبروٹک ٹشوز کی تشکیل فنکشنل خرابی میں حصہ ڈال سکتی ہے [14,15]۔ مزید برآں، پرانے کنکال کے پٹھوں کے ماحول میں سوزش والی سائٹوکائنز، نمو کے عوامل، اور میٹابولک سگنلز میں تبدیلیاں سیٹلائٹ سیل کے پھیلاؤ اور/یا میوفائبر کی چوٹ پر ایکٹیویشن کو متاثر کر سکتی ہیں [16]۔ یہ جانا جاتا ہے، درحقیقت، کہ عمر بڑھنے کا تعلق کم درجے کی سوزش والی حالت سے ہے، ایک ایسی حالت جسے "سوجن" کہا جاتا ہے، جس کی خصوصیت سوزش کے حامی ثالثوں کے پلازما کی سطح میں قدرے اضافہ سے ہوتی ہے، جیسے ٹیومر نیکروسس فیکٹر (TNF) اور انٹرلییوکن 6 ( IL-6)، اور اس کے نتیجے میں NF-κB پاتھ وے کی ایکٹیویشن [13]۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ NF-κB پروٹین کی تعداد نوجوانوں کے مقابلے بزرگ انسانی عضلات میں چار گنا زیادہ پائی گئی۔ اس بڑھتی ہوئی حراستی کے ساتھ انابولک سگنلنگ خسارے ہوتے ہیں جس کے نتیجے میں عمر رسیدہ عضلات ضائع ہوتے ہیں [17]۔

سوزش کی بڑھتی ہوئی سطح کا آکسیڈیٹیو نقصان سے گہرا تعلق ہے، اور دونوں ہی پٹھوں کے بڑے پیمانے اور طاقت میں عمر سے متعلق کمی میں ملوث ہیں۔ آکسیڈیٹیو تناؤ ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) اور/یا ری ایکٹیو نائٹروجن پرجاتیوں (RNS) کی اعلیٰ سطح سے نمایاں ہوتا ہے۔ یہ اینٹی آکسیڈینٹ کی صلاحیت میں کمی کی وجہ سے اینٹی آکسیڈینٹ انزائم کی خراب سرگرمی اور/یا ROS کی پیداوار میں اضافہ [18] کی وجہ سے ہوسکتا ہے۔ اس کے علاوہ، ROS اور RNS کی بلند سطح بھی عمر سے متعلق mitochondrial DNA اتپریورتنوں، حذف ہونے اور نقصان [19-21] کی وجہ سے ہونے والے مائٹوکونڈریل dysfunction کے نتیجے میں ہو سکتی ہے۔ ROS کنکال کے پٹھوں میں TNF- کے لئے دوسرے میسنجر کے طور پر کام کرتا ہے، NF-κB کو براہ راست یا بالواسطہ طور پر چالو کرتا ہے [14]۔

کنکال کے پٹھوں میں، ٹرانسکرپشنل کوایکٹیویٹر پیروکسیسم پرولیفریٹر-ایکٹیویٹڈ ریسیپٹر-گاما کوایکٹیویٹر-1 (PGC-1 ) ایک سب سے اہم مالیکیول ہے جو مائٹوکونڈریل بائیو جینیسس کے محرک میں شامل ہے، سیلولر آکسیڈینٹ کے ضابطے – اینٹی آکسیڈینٹ ہوم ، دائمی سوزش کا دباو، اور پٹھوں کی کیٹابولزم [22]۔ PGC-1 نیوکلیئر ریسیپٹرز اور ٹرانسکرپشن عوامل کے ساتھ تعامل کرتا ہے تاکہ ان کے ٹارگٹ جینز کی نقل کو چالو کیا جا سکے، اور اس کی سرگرمی متعدد محرکات کے لیے جوابدہ ہے جن میں کیلشیم آئنز، ROS، انسولین، تھائیرائڈ اور ایسٹروجن ہارمونز، ہائپوکسیا، اے ٹی پی ڈیمانڈ، اور سائٹوکائنز شامل ہیں۔ 23]۔ خاص طور پر، مائٹوکونڈریل بایوجنسیس کے پی جی سی-1 ریگولیشن میں کئی جوہری نقل کے عوامل کے ساتھ اس کا تعامل شامل ہے، بشمول پی پی اے آر خاندان کے افراد، نیوکلیئر ریسپائریٹری فیکٹر (NRF)-1 اور NRF-2، myocyte enhancer factor-2 {10}} (MEF2)، اور فورک ہیڈ باکس پروٹین O (FOXO) 1 [24,25]۔ PGC-1 NRF-1، 2 کی ایکٹیویشن متعدد نیوکلیئر انکوڈ شدہ مائٹوکونڈریل پروٹینز کے اظہار کو فروغ دیتی ہے، جو براہ راست مائٹوکونڈریل ڈی این اے کی نقل اور نقل [23,26,27] کو متحرک کرتی ہے۔ مزید برآں، PGC-1، MEF2C ٹرانسکرپشن فیکٹر کے تعاون سے، myofiber فینوٹائپک پروفائلز کو بھی متاثر کر سکتا ہے جو تیز رفتار MHC سے بڑھاپے کے دوران زیادہ مزاحم سست MHC کی طرف منتقل کرنے کے حق میں ہیں [28,29]۔

پچھلی دہائی میں، عمر بڑھنے کے دوران کنکال کے پٹھوں کی خرابی کو ممکنہ طور پر کم کرنے کے لیے جسمانی سرگرمی اور غذائیت جیسی کئی حکمت عملیوں کی تجویز دی گئی ہے۔ درحقیقت، جسمانی ورزش سارکوپینیا کو کم کرنے اور جسم میں چربی کے جمع ہونے اور سوزش کو روکنے کے لیے اطلاع دی گئی ہے [30–32]۔ اس کے علاوہ، پروٹین یا اینٹی آکسیڈینٹ کی مقدار کو نشانہ بنانے والی غذائی مداخلتوں کا پٹھوں کے بڑے پیمانے اور طاقت میں اضافہ پر مثبت اثر پڑ سکتا ہے [33]۔ یہ جانا جاتا ہے کہ بوڑھوں میں ہونے والے پٹھوں کے بڑے پیمانے پر اور فنکشن کے نقصان میں کھانے کی مقدار میں کمی شامل ہوتی ہے، جس کے نتیجے میں کم عمر لوگوں کے مقابلے میں پٹھوں کی پروٹین کی ترکیب میں کمی آتی ہے [34]۔ اس کے نتیجے میں، غذائیت، خاص طور پر امینو ایسڈ کی تکمیل، عمر بڑھنے کے دوران پٹھوں کے انابولک ردعمل کو بہتر بنانے کے لیے ایک اہم نقطہ نظر کی نمائندگی کر سکتی ہے [35-39]۔

ٹورائن ایک سیسٹین سے ماخوذ نیم ضروری امینو ایسڈ ہے جس کا اظہار ممالیہ کے ٹشوز میں ہوتا ہے۔ کنکال کے پٹھوں میں، جہاں عمر بڑھنے کے دوران اس کی سطح کم ہوتی ہے، یہ ایک اینٹی آکسیڈینٹ اور سوزش کے انو کے طور پر اہم کردار ادا کرتا ہے [40,41]۔ چونکہ ٹورائن سے محروم کنکال کے عضلہ اپنی شکل اور افعال میں کئی اسامانیتاوں کو ظاہر کرتا ہے، جو کہ عمر بڑھنے کے دوران ہوتا ہے [42]، اس لیے ٹورائن کی تکمیل کنکال کے پٹھوں میں عمر بڑھنے کے منفی اثرات کا مقابلہ کرنے کے لیے ایک امید افزا حکمت عملی کی نمائندگی کر سکتی ہے۔

یہاں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ انٹراپریٹونیل ٹورائن انتظامیہ سوزش کو کم کرکے کنکال کے پٹھوں کی تخلیق نو کی عمر بڑھنے سے وابستہ رکاوٹ کا مقابلہ کرتی ہے۔ اس کے علاوہ، ہمارے نتائج ایک اینٹی آکسیڈینٹ مالیکیول کے طور پر ٹورائن کے کردار کی حمایت کرتے ہیں جو پٹھوں کے مائیکرو ماحولیات کو بہتر بنانے، تنزلی کے عمل کا مقابلہ کرنے اور عمر بڑھنے کے دوران ٹشو ہومیوسٹاسس کے حق میں ہے۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 جانور اور علاج

نوجوان (8–10 ہفتے) اور عمر (18–20 ماہ) نر C57BL6J چوہوں کو مستقل درجہ حرارت اور نمی پر 12 گھنٹے کے ہلکے/تاریک چکر کے ساتھ ایک سہولت میں رکھا گیا تھا۔ چوہوں کو کھانے اور پینے کی اجازت دی گئی۔ چوہوں کا علاج کیتھولک یونیورسٹی آف دی سیکرڈ ہارٹ روم کی اخلاقیات کمیٹی کے رہنما خطوط کے مطابق کیا گیا (تصدیق نمبر 150/2017-پی آر اطالوی وزارت صحت) استعمال شدہ جانوروں کے تحفظ سے متعلق قومی ضوابط کی تعمیل میں سائنسی مقاصد کے لیے (اطالوی فرمان نمبر 26 مورخہ 4 مارچ 2014، یورپی ہدایت 2010/63/EU کو تسلیم کرتے ہوئے)۔ ٹورائن کو نمکین محلول میں تیار کیا گیا تھا اور لگاتار پانچ ہفتوں تک 100 ملی گرام/کلوگرام فی دن کی خوراک میں انٹراپریٹونیل انجیکشن کے ذریعے لگایا گیا تھا [43–45] (اسکیم 1)۔ اس خوراک کا انتخاب شائع شدہ اعداد و شمار کی بنیاد پر کیا گیا تھا جس میں ویوو ماؤس ماڈلز [46,47] میں اینٹی آکسیڈینٹ اثرات دکھائے گئے تھے۔ کنٹرول چوہوں کو صرف نمکین ملا۔ کارڈیوٹوکسن (CTX) انجیکشن کے ساتھ TA کو پہنچنے والے نقصان کو شامل کرنے سے پہلے، جانوروں کو کیٹامین 70 ملی گرام/کلوگرام اور میڈیٹومائڈائن 1 ملی گرام/کلوگرام کے مکس کے انٹراپریٹونیل انجیکشن کے ذریعے بے ہوشی کی گئی تھی، جسے جسمانی محلول میں پتلا کیا گیا تھا۔ کنٹرول اور ٹورائن سے علاج شدہ چوہوں کے بائیں طرف کے ٹبیالیس اینٹریئر (TA) کے پٹھوں پر چوٹ کو پٹھوں کی پوری لمبائی کے ساتھ چار CTX انجیکشن (فی سائٹ 10 µM CTX کا 5 µL) [48,49] کے ساتھ انجام دیا گیا تھا۔ دائیں طرف کا TA بطور کنٹرول ہم منصب استعمال ہوتا تھا۔ جانوروں کو اینستھیزیا کے بعد سروائیکل ڈس لوکیشن کے ذریعے قربان کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔ ہسٹولوجیکل تجزیوں کے لیے، TA کے پٹھے OCT کمپاؤنڈ (Miles, Elkhart, IN, USA) میں سرایت کر گئے تھے اور فوری طور پر −80 ڈگری پر isopentane میں منجمد ہو گئے تھے۔

2.2 ہسٹولوجیکل اور ہسٹو کیمیکل تجزیہ

پرانے چوہوں کے ٹی اے پٹھوں کو لائیکا کریوسٹیٹ کے ذریعہ 10 µm کی موٹائی پر سیکشن کیا گیا تھا۔ ہسٹولوجیکل تجزیہ کے لئے، حصوں کو معیاری طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے ہیماتوکسیلین اور eosin (H&E) سے داغ دیا گیا تھا [50]۔ کارخانہ دار کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے ایک غیر مخصوص ایسٹیریز سٹین کٹ (بائیو آپٹیکا، میلان، اٹلی) کا استعمال کرتے ہوئے ایسٹریس سٹیننگ کی گئی تھی۔

2.3۔ مورفومیٹرک تجزیہ

TA نمونوں کے حصوں پر ہیماتوکسیلین اور eosin اور esterase سٹیننگ کی گئی تھی۔ فائبر سائز کی مورفومیٹرک تشخیص کے لیے، تجزیہ ہر حالت کے لیے پورے پٹھوں کے کراس سیکشنز کی ہائی میگنیفیکیشن امیجز کے 4 تصادفی طور پر منتخب کردہ فیلڈز پر کیا گیا تھا۔ ہر علاج کے لیے جانچے گئے جانوروں کی تعداد 3–4 تھی۔ ریشوں کے کراس سیکشنل ایریا کا جائزہ لینے کے لیے امیج جے، سیون امیج سافٹ ویئر (ورژن بیٹا 4۔{6}}.2؛ سکین کارپوریشن، فریڈرک، ایم ڈی، یو ایس اے، 2 مئی 2022 کو حاصل کیا گیا) کا استعمال کرتے ہوئے فائبرز کے فوٹو مائکروگرافس کا تجزیہ کیا گیا۔ . دوبارہ پیدا کرنے والے ریشوں کو مرکزی نیوکللی کی موجودگی سے نمایاں کیا گیا تھا۔

2.4 امیونو فلوروسینس تجزیہ

منجمد حصوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے 4 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ میں طے کیا گیا تھا، PBS سے دھویا گیا تھا، اور 1 فیصد بوائین سیرم البومین (BSA) (Sigma-Aldrich، St. Louis, MO, USA) پر مشتمل محلول کے ذریعے پارمیبلائز کیا گیا تھا۔ , #A9418)، 0.2 فیصد ٹریٹن-X فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) میں 30 منٹ کے لیے کمرے کے درجہ حرارت پر، اور 10 فیصد گدھے کے سیرم (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, #D9663) کے ساتھ 1 کے لیے بلاک کمرے کے درجہ حرارت پر h حصوں کو راتوں رات 4 ◦C پر پرائمری اینٹی باڈیز کے ساتھ مناسب کمزوری پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ درج ذیل اینٹی باڈیز استعمال کی گئیں: سست MHC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, #M8421, 1:500) اور 4-HNE (Alpha Diagnostics International, San Antonio, TX, #HNE{{20) }S، 1:500)۔ پی بی ایس میں تین بار دھونے کے بعد، حصوں کو پھر مخصوص سیکنڈری اینٹی باڈیز کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 60 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ خاص طور پر، درج ذیل کا استعمال کیا گیا: AlexaFluor594-conjugated anti-mouse 1:1000 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA, #A21203) اور AlexaFluor488-conjugated anti-rabbit 1:1000 (مالیکیولر Probes, Eugene, OR, USA, #A21206) PBS میں 1.5 فیصد گدھے کے سیرم پر مشتمل ہے۔ حصوں کو DAPI (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, #P36935) کے ساتھ ProLong™ Gold Antifade Mountant کے ساتھ نصب کیا گیا تھا اور Leica SP5 Laser confocal سے جانچا گیا تھا۔ تجرباتی گروپوں میں 4-HNE سگنل میں تبدیلیوں کی مقدار کا تعین کثافت کے تجزیوں کے ذریعے کیا گیا۔ پس منظر کو گھٹانے کے بعد، 4-HNE فائبر سے وابستہ سگنلز کو دستی طور پر انفرادی ریشوں کا خاکہ بنا کر اور ImageJ سافٹ ویئر کے ساتھ فائبر سے وابستہ فلوروسینس کی شدت کی پیمائش کر کے مقدار درست کی گئی۔ F/A تناسب انفرادی ریشوں (F) کی اوسط فلوروسینس کی وضاحت کرتا ہے جو کل فائبر کراس سیکشنل ایریا (A) میں نارمل ہوتا ہے۔ مقدار کا تعین 50 ریشوں فی گروپ (n=3 چوہوں فی گروپ) پر کیا گیا۔

2.5 پروٹین نکالنا اور مغربی بلاٹ تجزیہ

چوہوں سے حاصل کردہ TA کے مسلز کو لیسز بفر (سیل سگنلنگ ٹکنالوجی، ڈینورس، MA، USA، #9803) کے ساتھ الگ کیا گیا، کیما بنایا گیا اور فینائل میتھائل سلفونائل فلورائیڈ (PMSF) پر مشتمل (سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ڈینورس، MA, USA, #8553) اور ایک مکمل پروٹیز انہیبیٹر کاک ٹیل (سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ڈینورس، MA، USA، #5872)۔ بریڈفورڈ پروٹین پرکھ (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) اور Varioskan™ LUX جو Thermo Scientific™ SkanIt™ کے زیر کنٹرول ہیں، مائکروپلیٹ ریڈرز کے لیے (تھرمو فشر سائنٹیفک، والتھم، MA، USA، سافٹ ویئر ورژن 4.1) استعمال کیے گئے تھے۔ کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق پروٹین کی مساوی مقدار کا تعین کرنے کے لیے۔ پروٹینز کو SDS/PAGE (Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gels یا Mini-PROTEAN TGX سٹین فری پریکاسٹ PAGE جیل؛ Bio-Rad Laboratories Inc.، Hercules, CA, USA) کے ذریعے الگ کیا گیا اور ایک نائٹروسیلوز جھلی میں منتقل کیا گیا۔ Trans-Blot® Turbo™ Mini Nitrocellulose Transfer Packs #1704158; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)۔ Tris-buffered saline (TBS) (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) میں 0.1 فیصد ٹوین-20 اور 5 فیصد نان فیٹ خشک دودھ پر مشتمل (Bio-Rad Laboratories Inc. , Hercules, CA, USA #1706404) کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے۔ استعمال ہونے والی بنیادی اینٹی باڈیز یہ تھیں: ماؤس مونوکلونل اینٹی ایس او ڈی-1 (1:500، سانتا کروز بائیوٹیکنالوجی ڈلاس، ٹیکساس 75220 امریکہ، sc-17767)؛ خرگوش مونوکلونل اینٹی فاسفو ایم ٹی او آر (1:1000، #2971، سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ڈینورس، ایم اے، یو ایس اے)؛ خرگوش مونوکلونل اینٹی ایم ٹی او آر (1:1000، #2972، سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ڈینورس، ایم اے، یو ایس اے)؛ ماؤس مونوکلونل اینٹی سلو-ایم ایچ سی (1:500، سگما-الڈرچ، #M8421)؛ ماؤس مونوکلونل اینٹی مائیوسین (اسکیلیٹل، فاسٹ) (1:500، سگما-الڈرچ، سینٹ لوئس، MO، USA، #M4276)؛ خرگوش مونوکلونل اینٹی فاسفو-NF-κB p65 (Ser468) (1:1000, #3039، سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ڈینورس، MA، USA)؛ خرگوش مونوکلونل اینٹی NF-κB p65 (1:250، #3034، سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ڈینورس، MA، USA)؛ ماؤس مونوکلونل اینٹی G6PD (1:300، سانتا کروز بائیوٹیکنالوجی ڈلاس، ٹیکساس 75220 USA، sc-373887)، اور ماؤس مونوکلونل اینٹی GP91[phox]۔ اس کے بعد دھبوں کو بائیو ریڈ لیبارٹریز سے درج ذیل ثانوی اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا: بکری اینٹی ریبٹ آئی جی جی (1:3000، ایچ آر پی کنجوگیٹ، بائیو ریڈ لیبارٹریز انکارپوریشن، ہرکیولس، سی اے، یو ایس اے، #1706515) اور گوٹ اینٹی ماؤس IgG (1:3000, HRP Conjugate, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA, #1706516) کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے۔ سگنلز ChemiDoc™ امیجنگ سسٹم (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) نے ایک بہتر کیمیلومینیسینس سسٹم (SuperSignal Chemoluminescent Substrate, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے تھے۔ ڈینسٹومیٹرک تجزیے امیج لیب™ ٹچ، سافٹ ویئر ورژن 5.2.1 (بائیو ریڈ لیبارٹریز انکارپوریشن، ہرکیولس، سی اے، یو ایس اے) کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے۔

2.6۔ ریئل ٹائم پی سی آر تجزیہ

چوہوں سے حاصل کردہ TA کے مسلز کو الگ کر دیا گیا، اور مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق کل RNA نکالنے کو TriReagent (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) میں ٹشو لائزر (QIAGEN) کے ساتھ کیا گیا۔ ڈبل پھنسے ہوئے cDNA کو QuantiTect ریورس ٹرانسکرپشن کٹ (QIAGEN Srl، میلان، اٹلی،) کے ساتھ ترکیب کیا گیا تھا۔ میسنجر-آر این اے کا تجزیہ ABI PRISM 7500 SDS (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) پر مخصوص TaqMan Assays (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ خاص طور پر، درج ذیل اسسیس استعمال کیے گئے تھے: GPX1: mm_00656767_g1; MEF2C: ملی میٹر_00600423_m1; PGC1- : ملی میٹر_01280835_m1; SOD1: ملی میٹر_01344233_m1; اور CAT: ملی میٹر_00437992_m1۔ متعلقہ مقدار کا تعین اینڈوجینس کنٹرول Hprt1 (اپلائیڈ بایو سسٹم، والتھم، MA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ ریئل ٹائم پی سی آر کو ہر گروپ کے لیے تین سے پانچ مختلف جانوروں سے آر این اے کی تیاریوں کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا جیسا کہ اعداد و شمار میں بیان کیا گیا ہے۔ متعلقہ اظہار کا حساب 2−∆∆Ct طریقہ استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔

2.7۔ شماریاتی تجزیہ

گروپوں کے درمیان متعدد شماریاتی موازنہ یکطرفہ ANOVA کے ذریعے کیے گئے۔ جہاں لیجنڈز میں اشارہ کیا گیا ہے، Mann-Whitney rank-sum test یا غیر جوڑی والے طالب علم کا t-ٹیسٹ استعمال کیا گیا تھا۔ ہر بار اوسط ± SEM (وسط کی معیاری غلطی) کی نمائندگی کرتا ہے۔

3. نتائج

3.1 ٹورائن انتظامیہ کنکال کے پٹھوں کی تخلیق نو کی عمر بڑھنے سے وابستہ رکاوٹ کا مقابلہ کرتی ہے۔

کنکال کے پٹھوں کی تخلیق نو پر ٹورائن انتظامیہ کے اثر کی تحقیقات کے لیے، ہم نے کنٹرول (گاڑی) کے ٹی اے مسلز اور ٹورائن سے علاج شدہ پرانے چوہوں میں CTX انجیکشن کا استعمال کرتے ہوئے نقصان پہنچایا۔ مورفولوجیکل اور مورفومیٹرک تجزیوں سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ چوٹ کی عدم موجودگی میں (شکل 1A، B: پینل a، b، اور شکل 1C)، ٹورائن سے علاج شدہ چوہوں کے پٹھوں کے ریشوں نے کنٹرول کے مقابلے میں تھوڑا سا بڑھے ہوئے کراس سیکشنل ایریا کو ظاہر کیا۔ چونکہ کنکال کے پٹھوں میں پروٹین ہومیوسٹاسس پروٹین کی ترکیب اور پروٹین کے انحطاط کے درمیان توازن پر قائم ہے، اس کے بعد ہم نے فاسفو-mTOR دونوں کی سطحوں کا تجزیہ کیا، پروٹین کی ترکیب کے اہم ریگولیٹر کے طور پر، اور Atrogin-1، ایک بڑے ریگولیٹرز کے طور پر۔ یوبیوکیٹین – پروٹیزوم سسٹم کے ذریعے پروٹین کیٹابولزم میں شامل ہے [40]۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ٹورائن سے علاج شدہ چوہوں کے پٹھوں کے نچوڑ میں فاسفو-ایم ٹی او آر کی سطح میں نمایاں اضافہ ہوا ہے، جبکہ اس حالت میں ایٹروگین-1 (FBXO32) کی کوئی قابل ذکر ترمیم سامنے نہیں آئی (شکل 1D–F)۔ یہ اعداد و شمار کنکال کے پٹھوں کے فائبر CSA میں مشاہدہ شدہ اضافے پر ٹورائن کے اثر میں ایم ٹی او آر پر منحصر راستے کی شمولیت کو ظاہر کرتے ہیں۔ مزید برآں، پٹھوں کو پہنچنے والے نقصان کے 1 ہفتہ کے بعد، گاڑیوں سے علاج شدہ چوہوں (CTX) میں ریشوں کے کراس سیکشن نے ساتھ ساتھ شدید سوزش اور نیکروسس کے ساتھ انحطاط کا انکشاف کیا، ساتھ ہی ساتھ چھوٹے دوبارہ پیدا ہونے والے ریشوں کی موجودگی، جس کی شناخت مرکزی مرکزے (Central Nuclei) سے ہوتی ہے۔ شکل 1G، H: پینل c)۔ دوسری طرف، بڑے دوبارہ پیدا کرنے والے مایوفائبرز اور کم نیکروٹک ریشے (شکل 1G، H: پینل d) ٹورائن سے علاج کیے جانے والے پرانے چوہوں کے زخمی پٹھوں میں کم دراندازی کے ساتھ نمودار ہوئے۔ ان نتائج کے تجزیے سے، جو شکل 1I کے خاکوں میں دکھائے گئے ہیں، نے انکشاف کیا کہ ٹورائن انتظامیہ نے زخمی ہونے والے پٹھوں کے مقابلے میں بڑے ریجنریٹنگ ریشوں کے جمع ہونے کے حق میں فائبر سائز کی تقسیم کو متاثر کیا۔ آخر میں، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ ٹورائن کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کی سالمیت کی دیکھ بھال میں حفاظتی کردار ادا کرکے اور نئے مائیوفائبرز کی تشکیل میں تیزی لانے کی حمایت کرتے ہوئے تخلیق نو کے عمل کو متحرک کر سکتا ہے۔

3.2 ٹورائن سپلیمنٹیشن بوڑھے پٹھوں میں سوزش کے ردعمل کو ماڈیول کرتی ہے۔

عمر بڑھنے کے ساتھ ایک دائمی کم درجے کی سیسٹیمیٹک سوزش والی حالت ہوتی ہے [51] جو کہ کنکال کے پٹھوں کی خرابی دوبارہ پیدا کرنے کی صلاحیت کے لیے ذمہ دار ہو سکتی ہے [52]۔ اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ آیا ٹورائن سے علاج کیے جانے والے چوہوں کے زخمی پٹھوں میں دیکھا جانے والا بہتر تخلیقی ردعمل سوزش کے عمل کی ماڈیولیشن سے وابستہ تھا، ہم نے ایسٹریس سٹیننگ کے ذریعے میکروفیجز کی موجودگی کی جانچ کی۔ شکل 2A، B سے پتہ چلتا ہے کہ، CTX انجیکشن کے نتیجے میں، تمام پٹھوں کے حصوں نے غیر زخمی ہم منصبوں کے مقابلے میں mononucleated سوزش کے خلیوں کی بڑھتی ہوئی تعداد کو ظاہر کیا۔ تاہم، پرانے زخمی پٹھوں (شکل 2A: پینل سی اور شکل 2B) میں موجود ایسٹریس-مثبت میکروفیجز کی زیادہ تعداد ٹورائن سپلیمنٹیشن کی موجودگی میں نمایاں طور پر کم ہوئی تھی (شکل 2A: پینل ڈی اور شکل 2B)۔ تخلیق نو کے عمل کے دوران سوزش کی حد کو کم کرنے پر ٹورائن کے اثر کا اندازہ ٹرانسکرپشن فیکٹر NF-kB کے فاسفوریلیٹڈ آئسوفارم کی سطحوں کا تجزیہ کرکے بھی کیا گیا کیونکہ یہ معلوم ہے کہ کنکال کے پٹھوں میں اس کا ایکٹیویشن مخصوص پٹھوں کے پروٹینوں کے انحطاط کا باعث بنتا ہے۔ ، سوزش اور فائبروسس کو اکساتا ہے، اور چوٹ کے بعد myofibers کی تخلیق نو کو روکتا ہے [53-55]۔ جیسا کہ شکل 2C، D میں دکھایا گیا ہے، phospho-NF-kB کنٹرول اور ٹورائن سے علاج شدہ غیر زخمی عضلات دونوں میں بہت نچلی سطح پر قابل شناخت تھا، جب کہ CTX کے زخمی عضلات میں پائے جانے والے فاسفو-NF-kB کی اعلی سطح میں ڈرامائی طور پر کمی واقع ہوئی تھی۔ ٹورائن سے علاج شدہ پرانے چوہوں کے عضلات۔ NF-kB کی کل سطحوں اور فاسفو-NF-kB اور NF-kB کے درمیان تناسب کا تجزیہ کیا گیا اور یہ ثابت ہوا کہ اس میں اضافہ ہوا ہے، اگرچہ CTX سے متاثر ہونے والے نقصان کے ساتھ نمایاں طور پر نہیں، جبکہ ٹورائن نے اس اثر کو روکا (شکل 2C، E، F) . یہ نتائج ظاہر کرتے ہیں کہ ٹورائن کل NF-kB اور phospho-NF-kB دونوں کی سطح کو کم کرکے زخمی پٹھوں میں سوزش کی کیفیت کو کم کرتا ہے۔

3.3 ٹورائن بوڑھے چوہوں کے TA پٹھوں میں PGC1- اور MEF2C اظہار کو ماڈیول کرتا ہے۔

کنکال کے پٹھوں کے ہومیوسٹاسس پر ٹورائن کے مثبت اثر میں شامل مالیکیولر میکانزم کی بہتر تفتیش کرنے کے لیے، ہم نے ٹرانسکرپشنل کو ایکٹیویٹر PGC-1 کے کردار کا جائزہ لیا۔ PGC-1 پٹھوں میں سوزش کے خلاف ماحول کو فروغ دینے میں ایک اہم عنصر ہے۔ اس کے علاوہ، یہ اطلاع دی گئی ہے کہ PGC-1 نہ صرف پٹھوں کے کام کو بہتر بنا سکتا ہے بلکہ myofiber مورفولوجی اور سالمیت کو بھی بہتر بنا سکتا ہے، جو کہ فائبر کی مرمت اور تخلیق نو میں PGC-1 کے لیے ایک ممکنہ کردار کو ظاہر کرتا ہے۔ MEF2C ٹرانسکرپشن فیکٹر کے ساتھ تعاون میں، PGC-1 کو کنکال کے پٹھوں میں فائبر کی قسم کے تعین کو منظم کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے، جس سے گلیکولیٹک فائبرز سے زیادہ مزاحم آکسیڈیٹیو [56,57] کی طرف سوئچ کو فروغ دیا گیا ہے۔

اس طرح، RT-PCR تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے PGC-1 اور MEF2C کے ایم آر این اے ایکسپریشن لیولز کا جائزہ لیا جوان، بوڑھے اور بوڑھے چوہوں کے ٹی اے کے نچوڑ میں یہ تعین کرنے کے لیے کہ آیا ٹورائن انتظامیہ نے مذکورہ بالا کی نقلی تبدیلیوں کی حوصلہ افزائی کی۔ اس کی غیر موجودگی میں جو مشاہدہ کیا گیا اس کے مقابلے میں عوامل۔ صحت مند حالات میں نوجوان چوہوں کو ان عوامل کے اظہار کی سطح کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ جیسا کہ شکل 3A، B میں دکھایا گیا ہے، ٹورائن کی غیر موجودگی میں، PGC-1 کی سطحوں میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی اور MEF2C کی سطحوں میں صرف چھوٹے چوہوں کے مقابلے پرانے چوہوں کے نچوڑ میں معمولی کمی دیکھی گئی، جبکہ mRNA کی سطح پرانے چوہوں میں دونوں مالیکیولز کو نمایاں طور پر اپریگولیٹ کیا گیا تھا جس کا نشانہ انٹراپریٹونیل ٹورائن انجیکشن تھے۔ یہ ثابت کیا گیا ہے کہ قسم I سلو ٹووِچ آکسیڈیٹیو فائبرز (مائوسین ہیوی چین کے سست آئسوفارم کا اظہار کرتے ہوئے، سست MHC) نقصان کے لیے زیادہ مزاحم ہے اور قسم IIb فاسٹ ٹویچ گلائکولیٹک فائبرز [29] کے مقابلے میں مختلف قسم کے ایٹروفک حالات ہیں۔ پٹھوں کی متعدد پیتھالوجیز میں، بشمول سارکوپینیا، تیز ترین پٹھوں کی فینوٹائپ کو سست مروڑ والے پٹھوں کے مقابلے میں زیادہ شدید طور پر سمجھوتہ کیا جاتا ہے، اور IIb ریشوں کی قسم کی زیادہ حساسیت اس کے مقابلے میں پی جی سی-1 کے کم مواد کی وجہ سے ہو سکتی ہے۔ آکسیڈیٹیو ریشوں کی [58,59]۔ یہاں، ہم نے مغربی دھبے کے تجزیے سے یہ ظاہر کیا کہ پرانے چوہوں کے TA کے مسلز نے نوجوان سے حاصل کردہ پٹھوں کے عرقوں کے مقابلے میں سست MHC isoform کی بہت کم سطح کا اظہار کیا۔ تاہم، ٹورائن سے علاج شدہ چوہوں کے پٹھوں کے عرقوں میں سست MHC اظہار میں اضافہ ہوا (شکل 3C، D)۔ اس کے علاوہ، فاسٹ-ایم ایچ سی آئسوفارم کے مغربی دھبے کے تجزیے سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ ٹورائن کی موجودگی میں، اس کے اظہار کو اس کے مقابلے میں نمایاں طور پر اپ گریڈ کیا گیا تھا جو کہ پرانے چوہوں سے حاصل کردہ TA کے نچوڑ میں دیکھا گیا تھا جنہیں ٹورائن ایڈمنسٹریشن نہیں ملی تھی (شکل 3F) . مستقل طور پر، پرانے چوہوں کے پٹھوں کے نچوڑ میں پائے جانے والے MHC (MF20) کی کم سطح، جوان چوہوں کے مقابلے میں، ٹورائن انتظامیہ کے ساتھ بڑھائی گئی۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ بوڑھے چوہوں کے کنکال کے پٹھوں کے ہومیوسٹاسس پر ٹورائن کا مثبت اثر PGC1- /MEF2C پاتھ وے کے محرک کے ذریعے ثالثی کیا جا سکتا ہے، جو کہ آکسیڈیٹیو فینوٹائپ کی طرف مائیوفائبرز کی ممکنہ میٹابولک تبدیلی کے حق میں ہے اور زیادہ سے زیادہ کو محفوظ رکھتا ہے۔ حساس گلائکولیٹک ریشے۔

【مزید معلومات کے لیے:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】