Velvet Antler Polypeptide کا اینٹی ایجنگ اثر گٹ مائکرو بائیوٹا کی ماڈیولیشن اور PPAR/APOE4 پاتھ وے کے ضابطے پر منحصر ہے PART 1

ہم نے D-galactose (D-gal) کی حوصلہ افزائی والے عمر رسیدہ چوہوں پر مخمل اینٹلر پولی پیپٹائڈ کے عمر رسیدہ اثرات کی تحقیقات کی۔ D-gal-حوصلہ افزائی والے عمر رسیدہ چوہوں کو قائم کیا گیا تھا اور تصادفی طور پر پانچ گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا، کنٹرول، ماڈل، وٹامن E (VE)، velvet antler polypeptide low-dose، اور velvet antler polypeptide high-dose گروپس۔ مورس واٹر میز ٹیسٹ کا استعمال عمر رسیدہ چوہوں کی سیکھنے اور یادداشت کی صلاحیتوں کو جانچنے کے لیے کیا گیا تھا۔ ہپپوکیمپل نیوران کا مشاہدہ ہیماتوکسیلین-ایوسین سٹیننگ اور ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی کے ذریعے کیا گیا۔ بائیو کیمیکل طریقوں کو سپر آکسائیڈ خارج کرنے، مالونالڈہائڈ، اور دیگر خامروں کی سرگرمیوں کا پتہ لگانے اور عمر بڑھنے والے چوہوں کی اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت پر مخمل اینٹلر پولی پیپٹائڈ کے اثر و رسوخ کا جائزہ لینے کے لیے استعمال کیا گیا۔ 16S rRNA جین کی ترتیب اور میریسٹیم ٹیکنالوجی کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے عمر رسیدہ چوہوں کے آنتوں کے پودوں اور فیٹی ایسڈ میٹابولزم پر مخمل اینٹلر پولی پیپٹائڈ کے اثر کا اندازہ کیا۔ تجرباتی نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ مخمل اینٹلر پولی پیپٹائڈ عمر رسیدہ چوہوں کی سیکھنے اور علمی صلاحیتوں کو نمایاں طور پر بہتر بنا سکتا ہے، اور مالونالڈہائیڈ کے مواد کو کم کرنے کے لیے سیرم میں سوپر آکسائیڈ خارج کرنے، گلوٹاتھیون پیرو آکسیڈیز، اور کیٹالیس کی سرگرمیوں کو بڑھا سکتا ہے۔ آنتوں کے مائکرو ایکولوجیکل تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ مخمل اینٹلر پولی پیپٹائڈ فائدہ مند بیکٹیریل جینس لییکٹوباسیلس کی کثرت کو نمایاں طور پر بڑھا سکتا ہے۔ مغربی دھبے کے تجزیے نے مزید ثابت کیا کہ ویلویٹ اینٹلر پولی پیپٹائڈ فیٹی ایسڈ میٹابولزم کو فروغ دے سکتا ہے پیروکسوم پرولیفیریٹر ایکٹیویٹڈ ریسیپٹر (PPAR) کو چالو کرکے اور نیچے کی دھارے والے انزائمز کارنیٹائن-پالمیٹائل ٹرانسفراز-1 A اور acyl-CoA کو ڈاون سٹریم کر کے اظہار کو بڑھاوا دیتا ہے۔ جو کہ apolipoprotein E4 (APOE4) کا ہے، اس طرح فیٹی ایسڈ کے جمع ہونے کو کم کرتا ہے اور اڈینوسین ٹرائی فاسفیٹ (ATP) کی پیداوار میں اضافہ ہوتا ہے۔ لہذا، مخمل اینٹلر پولی پیپٹائڈ آنتوں کی مائکرو ایکولوجی کو بہتر بناتا ہے اور فیٹی ایسڈ میٹابولزم کو منظم کرنے کے لیے PPAR/APOE4 راستے کو چالو کرتا ہے۔

سیستانچ کا گلائکوسائیڈ دل اور جگر کے بافتوں میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بھی بڑھا سکتا ہے، اور ہر ٹشو میں لیپوفسن اور ایم ڈی اے کے مواد کو نمایاں طور پر کم کر سکتا ہے، مختلف رد عمل آکسیجن ریڈیکلز (OH-، H₂O₂، وغیرہ) کو مؤثر طریقے سے ختم کر سکتا ہے اور DNA کو پہنچنے والے نقصان سے بچا سکتا ہے۔ OH ریڈیکلز کے ذریعے۔ Cistanche phenylethanoid glycosides میں آزاد ریڈیکلز کو صاف کرنے کی مضبوط صلاحیت ہوتی ہے، وٹامن C سے زیادہ کم کرنے کی صلاحیت، سپرم معطلی میں SOD کی سرگرمی کو بہتر بناتی ہے، MDA کے مواد کو کم کرتی ہے، اور سپرم کی جھلی کے کام پر ایک خاص حفاظتی اثر رکھتی ہے۔ Cistanche polysaccharides D-galactose کی وجہ سے تجرباتی طور پر حساس چوہوں کے erythrocytes اور پھیپھڑوں کے ٹشوز میں SOD اور GSH-Px کی سرگرمی کو بڑھا سکتے ہیں، نیز پھیپھڑوں اور پلازما میں MDA اور کولیجن کے مواد کو کم کر سکتے ہیں، اور elastin کے مواد کو بڑھا سکتے ہیں۔ ڈی پی پی ایچ پر اچھا اثر ڈالتا ہے، سینسنٹ چوہوں میں ہائپوکسیا کے وقت کو طول دیتا ہے، سیرم میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بہتر بناتا ہے، اور تجرباتی طور پر سنسنی والے چوہوں میں پھیپھڑوں کے جسمانی انحطاط میں تاخیر کرتا ہے، سیلولر مورفولوجیکل انحطاط کے ساتھ، تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ Cistanche میں اینٹی آکسیڈنٹ کی اچھی صلاحیت ہے۔ اور جلد کی بڑھتی ہوئی بیماریوں کو روکنے اور علاج کرنے کے لیے ایک دوا بننے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ ایک ہی وقت میں، Cistanche میں echinacoside میں DPPH فری ریڈیکلز کو ختم کرنے کی قابل ذکر صلاحیت ہے اور یہ ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں کو نکالنے اور آزاد ریڈیکل-حوصلہ افزائی کولیجن کے انحطاط کو روکنے کی صلاحیت رکھتا ہے، اور یہ تھامین فری ریڈیکل ایون کے نقصان پر بھی اچھا مرمتی اثر رکھتا ہے۔

Cong Rong Cistanche پر کلک کریں۔

【مزید معلومات کے لیے:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

مطلوبہ الفاظ

مخمل اینٹلر پولی پیپٹائڈ؛ D-galactose؛ بڑھاپا؛ آنتوں کی مائکرو ایکولوجی؛ سیکھنا علمی خرابی؛ PPAR/APOE4 راستہ؛ مائیکرو بائیوٹا

1. تعارف

Velvet antler polypeptide (VAP) velvet antler کے گیلے وزن کا 50-60 فیصد ہے اور یہ اس کے بنیادی فعال اجزاء میں سے ایک ہے [1]۔ VAP پروٹین، امینو ایسڈز، فاسفولیپڈز، کولیسٹرول، اور کیلشیم آئنوں سے بھرپور ہے اور صحت کو فروغ دینے والے مختلف اثرات مرتب کرتا ہے، جس میں اینٹی آکسیڈنٹس [2]، آسٹیوپوروسس مزاحمت [3]، اور مدافعتی ضابطے [4] کے اثرات رپورٹ ہوئے ہیں۔ نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کی روک تھام اور علاج میں VAP کے کردار کو بہتر طور پر سمجھنے کے لیے، ہمارے ریسرچ گروپ کی پچھلی تحقیق نے بھی اس بات کی تصدیق کی تھی کہ VAP گلوکوکورٹیکائیڈ ریسیپٹر، منرالوکورٹیکائیڈ ریسیپٹر، اور کورٹیکوٹروپین جاری کرنے والے ہارمون کی سطح کو کم کر سکتا ہے۔ تھیلامس-پٹیوٹری-ایڈرینل محور پر VAP کے اثرات اور نیورونل اپوپٹوس کو روکنے کی اس کی صلاحیت کو بھی دیکھا گیا ہے [5]۔

دماغی عمر بڑھنا ایک قدرتی جسمانی عمل ہے جس کی خصوصیات آکسیڈیٹیو تناؤ (OS)، آکسیڈیٹیو نقصان کے مالیکیولز کا جمع ہونا، اور نیوران کی ساخت اور کام میں تبدیلیاں، بالآخر علمی زوال اور یادداشت کی کمی کا باعث بنتی ہیں [6]۔ ان عوامل میں سے، OS کو بڑھاپے سے منسلک نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کی بنیادی وجہ سمجھا جاتا ہے [7]۔ جب جسم کو نقصان دہ محرکات کا نشانہ بنایا جاتا ہے، تو آزاد ریڈیکلز کے پیدا ہونے اور ہٹانے کے درمیان عدم توازن پیدا ہوتا ہے، جس کے نتیجے میں آزاد ریڈیکلز میں اس سطح تک اضافہ ہوتا ہے جو جسم میں اینٹی آکسیڈینٹ کی صلاحیت سے زیادہ ہو جاتا ہے۔ خاص طور پر، ضرورت سے زیادہ آزاد ریڈیکلز سائٹوٹوکسک ہیں، جو مرکزی اعصابی نظام کو براہ راست نقصان پہنچاتے ہیں [8، 9]۔ انسانی دماغ انسانی جسم کے وزن کا صرف 2-3 فیصد ہے۔ پھر بھی، مرکزی اعصابی نظام (CNS) انسانی جسم کی کل آکسیجن سپلائی کا 20 فیصد ہے۔ لہذا، CNS میں نیورونل فری ریڈیکلز کا مواد کافی ہے، جو OS [10] کا زیادہ خطرہ پیش کرتا ہے۔

انسانی آنتوں کا مائیکرو بائیوٹا، جو کہ 100 سے زیادہ پرجاتیوں پر مشتمل ہے، انسانی خلیات سے تقریباً 10-گنا زیادہ بیکٹیریا پر مشتمل ہے [11]۔ Firmicutes انسانی گٹ مائیکرو بائیوٹا کے اندر سب سے زیادہ پائی جانے والی انواع ہیں، جو کل بیکٹیریا کا 60 فیصد بنتی ہیں، اس کے بعد بیکٹیرائڈائٹس (15 فیصد) اور دیگر اجزاء جو ایک چھوٹا سا تناسب رکھتے ہیں۔ گٹ مائکروبیوٹا انسانی جسم کے ساتھ متحرک توازن کی حالت میں ہے، اور آنتوں کے جرثوموں کا انسانی میٹابولزم، اینڈوکرائن فنکشن، اور مدافعتی ضابطے میں اہم کردار ہوتا ہے۔ لہذا، جب گٹ مائکرو بائیوٹا کا ڈھانچہ پریشان ہوتا ہے، نیوروڈیجینریٹو امراض، قلبی امراض، اور موٹاپا ہو سکتا ہے [12]۔ آنتوں کے مائکروجنزموں کی مقدار اور تنوع میں تبدیلی آنتوں اور مرکزی اعصابی نظام کو بھی متاثر کر سکتی ہے۔ ان تعاملات کو مائکرو بائیوٹا-گٹ-دماغ کے محور کے نام سے جانا جاتا ہے، جو جسم کے کام کے لیے اہم ہے [13، 14]۔ اگرچہ گٹ مائکرو بائیوٹا پروفائلز میں تبدیلیاں ضروری طور پر صحت کو متاثر نہیں کرتی ہیں، لیکن بنیادی مائکرو بائیوٹا میں تنوع کا نقصان علمی فعل اور یادداشت میں کمی سے وابستہ ہے [15]۔ درحقیقت، بڑھتی ہوئی عمر کے ساتھ، بیکٹیریل فلورا میں تبدیلیاں بنیادی طور پر تنوع، پروبائیوٹکس، فیکلٹیٹیو اینیروبس، اور کل شارٹ چین فیٹی ایسڈز میں کمی کی وجہ سے ہوتی ہیں [16]۔

اگرچہ متعدد مطالعات نے اس بات کی تصدیق کی ہے کہ VAP سے وابستہ اینٹی آکسیڈنٹ اور اینٹی ایجنگ اثرات بڑھاپے کو کم کرتے ہیں، لیکن اس سرگرمی کا صحیح طریقہ کار ابھی تک واضح نہیں ہے۔ لہذا، موجودہ کام میں، VAP کے اینٹی ایجنگ اثر کا اندازہ چوہوں میں Vivo میں مورس واٹر میز (MWM) ٹیسٹ، بائیو کیمیکل تجزیہ، hematoxylin-eosin (H&E) سٹیننگ، اور ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (TEM) کے ذریعے کیا گیا۔ مزید برآں، ہم نے VAP کے ساتھ 16S رائبوسومل RNA (rRNA) جین سیکوینسنگ ٹکنالوجی کا استعمال کرتے ہوئے عمر رسیدہ ماؤس ماڈلز میں آنتوں کی مائکرو ایکولوجی میں ہونے والی تبدیلیوں کا جائزہ لیا۔ ہمارا مقصد عمر بڑھنے کے تناظر میں VAP سرگرمی کے طریقہ کار کو واضح کرنا تھا اور عمر بڑھنے کے علاج کے نئے طریقوں کی ترقی کے لیے ایک نظریاتی بنیاد فراہم کرنا تھا۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 تجرباتی مواد

VAP was provided by the Molecular Pharmacology Laboratory, Changchun University of Chinese Medicine. Dgalactose (D-gal) and VE (purity >90 فیصد ) شنگھائی یوآنی بائیو ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ (شنگھائی، چین) سے خریدے گئے تھے۔ کمرشل سپر آکسائیڈ ڈسمیوٹیز (SOD)، مالونالڈہائیڈ (MDA)، catalase (CAT)، اور glutathione peroxidase (GSH-Px) کٹس Nanjing Jiancheng Technology Co., Ltd (Nanjing, China) سے خریدی گئیں۔ تمام کیمیکلز اور ری ایجنٹس تجزیاتی گریڈ کے تھے۔

مورس واٹر میز (MWM) ویڈیو ٹریکنگ اور تجزیہ کا نظام Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd. (Chengdu, China) سے خریدا گیا تھا۔ ایک ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ Tecnai کارپوریشن (Hillsboro, OR, USA) سے خریدی گئی تھی۔ ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ پلیٹ فارم (MiSeq PE300) Illumina (San Diego, CA, USA) نے فراہم کیا تھا۔

2.2 جانوروں کے تجربات

ساٹھ صحت مند ICR چوہے (SPF گریڈ، آدھا نر اور آدھا مادہ، 22–26 گرام وزن) چانگچن یسی لیبارٹری اینیمل ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ (سرٹیفکیٹ نمبر SCXK(Ji) -2018-0007) سے خریدے گئے تھے۔ چوہوں کو الگ الگ پنجروں میں 12 گھنٹے روشنی/تاریک چکروں اور معیاری درجہ حرارت (22 ± 2 ◦C) کے تحت اٹھایا گیا تھا، جس میں خوراک اور پانی فراہم کیا جاتا تھا۔ تجربات شروع ہونے سے کم از کم ایک ہفتہ تک تمام چوہوں کو ان حالات کے مطابق ڈھال لیا گیا تھا۔ تمام چوہوں کو پانچ گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا، کنٹرول، ماڈل، وٹامن ای (VE)، VAP کم خوراک (VAP1)، اور VAP ہائی ڈوز (VAP2) گروپس۔ VE، VAP1، اور VAP2 گروپوں کو VE (100 mg/kg)، VAP (200 mg/kg)، اور VAP (400 mg/kg) بالترتیب 10 دنوں کے لیے دیا گیا، جبکہ کنٹرول اور ماڈل گروپس کو آست پانی ملا۔ (ایک ہی حجم اور اسی انٹرا گیسٹرک راستے سے)۔ 11 ویں دن سے، کنٹرول گروپ کو عام نمکین کے ساتھ subcutaneous طور پر انجکشن لگایا گیا تھا۔ D-gal (1000 mg/kg) دوسرے گروپوں میں چوہوں کی گردن کے پچھلے حصے میں subcutaneously انجکشن لگایا گیا تھا، اور ماڈل انتظامیہ کو 60 دن تک جاری رکھا گیا تھا۔

2.3 مورس واٹر میز

MWM ٹیسٹ D-gal انتظامیہ کے 1 گھنٹے بعد دن 57 کو کیا گیا۔ مختصراً، پانی کی بھولبلییا کے بیچ میں ایک پلیٹ فارم رکھا گیا تھا۔ پلیٹ فارم میں پانی اس وقت تک شامل کیا گیا جب تک کہ یہ 1 سینٹی میٹر سے زیادہ نہ ہو جائے اور اسے تقریباً 25 ◦C پر برقرار رکھا گیا۔ چوہوں کو 1 ہفتے تک مسلسل تربیت دی گئی، اور MWM ٹیسٹ باضابطہ طور پر واٹر میز کے معیاری آپریٹنگ طریقہ کار کے مطابق کیا گیا۔ تجربے کے باضابطہ آغاز سے پہلے ٹائٹینیم ڈائی آکسائیڈ کو پانی میں شامل کیا گیا تاکہ چوہے پلیٹ فارم کی مخصوص پوزیشن کو نہ سمجھ سکیں۔ ڈیٹا کو ٹریک کرنے اور جمع کرنے کے لیے چوہوں کے سروں کو پیلے رنگ سے رنگ دیا گیا تھا۔ مورس واٹر میز ویڈیو ٹریکنگ تجزیہ سافٹ ویئر نے چوہوں کے تیراکی کا راستہ، درمیانی رنگ میں رہائش کے وقت کا فیصد، اور درمیانی رنگ کی حرکت کے فاصلے کا فیصد ریکارڈ کیا۔

2.4 H&E سٹیننگ

چوہوں کے پورے دماغ کو 4 فیصد پیرافارمیلڈہائڈ محلول میں طے کیا گیا تھا اور پیرافین میں سرایت کیا گیا تھا۔ 24 گھنٹے کے بعد، دماغ کے ٹشوز کو سیکشن کیا گیا، ڈیپرافینائز کیا گیا، ری ہائیڈریٹ کیا گیا، اور H&E سے داغدار کر دیا گیا۔ اس کے بعد حصوں کو ایک نظری خوردبین کے تحت مشاہدہ کیا گیا تاکہ پیتھولوجیکل تبدیلیوں کو ریکارڈ کیا جا سکے۔

2.5 آئٹم

پرفیوژن کے بعد، ہپپوکیمپل ٹشوز کو منقطع کر دیا گیا، 2 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ اور 2.5 فیصد گلوٹرالڈہائیڈ فاسفیٹ بفر سلوشن کے ساتھ فکس کیا گیا، الکحل گریڈینٹ کا استعمال کرتے ہوئے پانی کی کمی کی گئی، ایتھوکسی پروپین سے صاف کیا گیا، ایمبیڈڈ، کٹے ہوئے، اور یورینیل ایسٹیٹریٹ لیڈ سے داغ دیا گیا۔ ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ کے تحت ہپپوکیمپل نیوران کے الٹرا سٹرکچر کا مشاہدہ کیا گیا۔

2.6 بائیو کیمیکل تجزیہ

ماؤس کے خون کے نمونے اکٹھے کیے گئے اور 3000 rpm پر 15 منٹ کے لیے 4 ◦C پر سینٹرفیوج کیے گئے، جس کے بعد سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا۔ سیرم MDA مواد اور SOD، GSH-Px، اور CAT سرگرمی کا تعین سب کٹ ہدایات کے ذریعہ کیا گیا تھا۔

2.7 فیکل کے نمونوں کی مائکرو بایوٹا پروفائلنگ

کل ڈی این اے فیکل کے نمونوں سے نکالا گیا تھا اور بیکٹیریل 16S rRNA جین کے V3–V4 خطے کو PCR بڑھانے کے لیے بطور ٹیمپلیٹ استعمال کیا گیا تھا۔ خام ڈیٹاسیٹ کو NCBI BioProject PRJNA731623 میں BioSample الحاق نمبر SAMN19291644 سے SAMN19291668 کے تحت جمع کیا جاتا ہے۔ پی سی آر مصنوعات کا مقداری تجزیہ کیا گیا، اور 16S rRNA جین کی ترتیب کو Illumina MiSeq پلیٹ فارم (Illumina، San Diego، USA) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ خام ڈیٹا 0.2 (پہلے سے طے شدہ) کے اوورلیپ ایریا میں زیادہ سے زیادہ قابل اجازت مماثلت کے تناسب کے ساتھ 10 bp کی کم از کم اوورلیپ لمبائی پر مبنی ہے۔ ہر نمونے کے ریڈز کو الگ کیا گیا تھا، اور کوالٹی کنٹرول کے بعد ٹیگ کی لمبائی کے 75 فیصد سے کم لمبائی والے ٹیگ فلٹر کیے گئے تھے۔ chimeras (یعنی، اگر دونوں والدین کی ترتیب 80 فیصد سے زیادہ استفسار کی ترتیب سے ملتی ہے، تو استفسار کو chimera سمجھا جاتا ہے) کو اعلی معیار کے ٹیگ کی ترتیب حاصل کرنے کے لیے ہٹا دیا گیا تھا۔ ریسرچ سافٹ ویئر (سونوما، USA) [17] کو 97 فیصد مماثلت کی سطح پر ٹیگز کو کلسٹر کرنے، آپریشنل ٹیکنومک یونٹس (OTUs) کی درجہ بندی کرنے، OTU ترتیب کی ساخت کی بنیاد پر پرجاتیوں کی درجہ بندی حاصل کرنے، اور پلاٹ کے نمونے کو کم کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا [18] اور شینن انڈیکس منحنی خطوط . PICRUST (Halifax، CAN) [19] کو 16S rRNA جین کی ترتیب کے نتائج کے مطابق پرجاتیوں کی ساخت کی معلومات کے موازنہ کے ذریعے ہر نمونے کی فعال جین کی ساخت کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ اس طرح، مختلف نمونوں یا گروپوں کے درمیان فعال فرق کا تعین کیا جا سکتا ہے۔ کیوٹو انسائیکلوپیڈیا آف جینز اینڈ جینومز [20] ڈیٹا بیس کا استعمال کرتے ہوئے ہر فنکشنل زمرے کے تناظر میں کثرت، راستے، EC کی معلومات، اور OTU کثرت حاصل کی گئیں۔

2.8 مغربی دھبہ

دماغ کے بافتوں سے کل پروٹین نکالا گیا تھا، اور پروٹین کی ارتکاز کا اندازہ لگانے کے لیے Coomassie شاندار بلیو طریقہ استعمال کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، SDS-PAGE الیکٹروفورسس کے بعد، پروٹینز جھلی میں منتقل ہو گئے ہیں، جو اس کے بعد ٹارگٹ پروٹینز apolipoprotein E (APOE4)، acyl-CoA oxidase 1 (ACOX1)، peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) کے خلاف بنیادی اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ ہوئے تھے۔ carnitine-palmitoyl transferase-1 A (CPT1A)، اور glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) رات کو 4 ◦C پر۔ اس کے بعد، جھلی کو دھویا گیا اور پھر ثانوی اینٹی باڈی کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ جھلی کو Tris-buffered saline اور Tween 20 (TBST) سے دھونے کے بعد، ایک بہتر کیمیلومینسینٹ (ECL) محلول شامل کیا گیا۔ ایک مکمل خودکار جیل امیجنگ سسٹم (Aplegen, Pleasanton, USA) فوٹو گرافی کو اسکین کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔

2.9 دماغی بافتوں میں مفت فیٹی ایسڈ (FFA) کی سطح کا پتہ لگانا

ماؤس کے دماغ کے ؤتکوں کو جمع کیا گیا تھا، اور عام نمکین کی مناسب مقدار شامل کی گئی تھی. اس کے بعد، نمونے 10 منٹ کے لیے 3000 rpm پر 4 ◦C پر سینٹرفیوج کیے گئے، اور سپرنٹنٹس جمع کیے گئے۔ دماغی بافتوں میں ایف ایف اے کی سطح کا تعین کٹ ہدایات کے ذریعے کیا گیا تھا۔

2.10 دماغی بافتوں میں اے ٹی پی مواد کا پتہ لگانا

ماؤس کے دماغ کے ٹشوز کو اکٹھا کیا گیا تھا اور دماغ کے ٹشو پر لیس کیا گیا تھا: 1:5 کا لیسس بفر تناسب۔ پھر، نمونوں کو 12،000× g 4 ◦C پر 5 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا، اور سپرنٹینٹس کو جمع کیا گیا۔ دماغی بافتوں میں اے ٹی پی کے مواد کا تعین کٹ ہدایات کے ذریعے کیا گیا تھا۔

2.11 شماریاتی تجزیہ

SPSS 19۔{1}} (شکاگو، IL، USA) ڈیٹا کے تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ نتائج کو اوسط ± معیاری انحراف (x ± s) کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ طالب علم کا ٹی ٹیسٹ گروپس کا موازنہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، اور P < 0 میں فرق کو اہم سمجھا جاتا تھا۔{5}}5 یا P <0.01۔

3. نتائج

3.1 VAP کے ساتھ علاج کیے جانے والے عمر رسیدہ چوہوں میں ادراک، سیکھنے اور یادداشت میں بہتری

ایم ڈبلیو ایم ٹیسٹ فرار کے پلیٹ فارم کو تلاش کرنے کے لیے جانوروں کی بقا کی جبلت پر انحصار کرتا ہے اور اس میں میموری سے متعلق مقامی پوزیشن کی تلاش شامل ہے۔ تصویر 1 میں چوہوں کے نمائندہ ٹریکس دکھائے گئے ہیں جن کو آخری دن MWM ٹیسٹ دیا گیا تھا۔ ماڈل گروپ کا ماؤس کے رویے کی رفتار کا خاکہ زیادہ پیچیدہ اور بے قاعدہ تھا، اور چوہوں کو پلیٹ فارم نہیں ملا۔ قابل غور بات یہ ہے کہ VAP1 اور VAP2 گروپوں میں چوہوں کے رویے کی رفتار کا خاکہ سادہ تھا، اور ایک پلیٹ فارم ملا۔ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، درمیانی رنگ میں برقرار رکھنے کے وقت کا فیصد اور ماڈل گروپ میں درمیانی رنگ کے ذریعے منتقل ہونے والے فاصلے کا فیصد نمایاں طور پر کم ہو گیا تھا (P < 0۔{8}}1)۔ ماڈل گروپ کے مقابلے میں، درمیانی رنگ میں برقرار رکھنے کے وقت کا فیصد اور درمیانی رنگ کے ذریعے منتقل ہونے والے فاصلے کا فیصد VE، VAP1، اور VAP2 گروپوں میں نمایاں طور پر بڑھ گیا تھا (P < 0.05، P <0.01)۔ ان نتائج سے ظاہر ہوتا ہے کہ VAP کی انتظامیہ نے D-gal-حوصلہ افزائی والے عمر رسیدہ چوہوں کی علمی صلاحیت کو بہتر کیا۔

3.2 عمر رسیدہ چوہوں میں ہپپوکیمپل نیوران پر VAP کا حفاظتی اثر

عمر رسیدہ چوہوں میں دماغی بافتوں کی پیتھولوجیکل مورفولوجی کا مشاہدہ کرنے کے لیے H&E سٹیننگ کا استعمال کیا گیا تھا تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا VAP D-gal-حوصلہ افزائی نیورونل پیتھولوجیکل نقصان کو بہتر بنا سکتا ہے (تصویر 2A)۔ کنٹرول گروپ سے ہپپوکیمپی میں CA1 خلیات وافر تھے، عام خلیات کی ساخت، مکمل مورفولوجی، اور واضح مرکزے کے ساتھ۔ اس کے برعکس، ماڈل گروپ سے ہپپوکیمپی میں CA1 خلیوں کی تعداد میں کمی آئی اور اس نے فاسد مورفولوجی ظاہر کی، جس میں خوردبین کے نیچے کوئی واضح نیوکلیولی نہیں دیکھا گیا۔ ہپپوکیمپی کے CA1 علاقے میں نیوران نسبتاً نارمل تھے، اور ماڈل گروپ کے مقابلے VE گروپ میں جوہری سکڑنے کو کم کیا گیا تھا۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ VAP1 اور VAP2 گروپوں سے ہپپوکیمپی میں CA1 کا علاقہ ماڈل گروپ میں مشاہدہ کرنے والے اور کنٹرول گروپ سے ملتا جلتا تھا۔ ساخت نسبتاً نارمل تھی، خلیات قریب سے ترتیب دیئے گئے تھے اور باقاعدہ تھے، اور مورفولوجی مکمل تھی۔

TEM کو مزید عمر رسیدہ چوہوں میں ہپپوکیمپل نیوران کے الٹرا سٹرکچر کا مشاہدہ کرنے اور یہ سمجھنے کے لیے استعمال کیا گیا کہ آیا سیکھنے اور یادداشت میں کمی پر VAP کا الٹ اثر دماغ میں نیورون مائیکرو اسٹرکچر کو ریگولیٹ کرنے سے منسلک تھا (تصویر 2B)۔ ہپپوکیمپل نیوران نے کنٹرول گروپ میں سائٹوپلازم میں ایک برقرار مورفولوجی، یکساں کرومیٹن کی تقسیم، اور وافر آرگنیلز کو دکھایا۔ اعلی میگنیفیکیشن پر، مائٹوکونڈریا بیضوی تھا، واضح ڈبل بیرونی جھلی اور برقرار کرسٹے کے ساتھ۔ اس کے برعکس، ماڈل گروپ کے ہپپوکیمپل علاقے میں نیوران غیر معمولی تھے۔ ابتدائی اپوپٹوٹک تبدیلیاں جیسے کرومیٹن گاڑھا ہونا دیکھا گیا۔ lipofuscin corpuscles زیادہ کثرت سے تھے؛ Synaptic ڈھانچہ واضح نہیں تھا؛ لپڈ کی بوندیں بکھری ہوئی تھیں، اور گولگی کمپلیکس کی ویسیکل جیسی توسیع اور کھردری اینڈوپلاسمک ریٹیکولم میں کمی کا پتہ چلا۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ ماڈل گروپ کے مقابلے میں، VAP1 اور VAP2 گروپوں میں ہپپوکیمپل نیورون تھے جو ساخت اور شکل میں نارمل ہوتے ہیں، ہموار نیوکلیائی جھلیوں، نارمل نیوکلیولی، اور وافر آرگنیلز کے ساتھ۔ خاص طور پر، زیادہ Synapses دیکھے گئے، anterior membrane میں synaptic vesicles میں غیر معمولی جمع نہیں تھا، intracytoplasmic Golgi باڈی اور mitochondria کی مورفولوجی نارمل تھی، اور lipofuscin نایاب تھا۔

3.3 آکسیڈیٹیو نقصان سے متعلق خامروں پر VAP کے اثرات

OS کا منفی اثر جسم میں آزاد ریڈیکلز کی پیداوار ہے، جو عمر رسیدگی اور بیماری کی بنیادی وجوہات میں سے ایک ہے (تصویر 3)۔ کنٹرول گروپ کے مقابلے، D-galadministered ماڈل چوہوں کے سیرم میں SOD، CAT، اور GSH-Px کی سرگرمیوں میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی (P < 0۔{5}}1, P < {{7} }}۔ ماڈل گروپ کے مقابلے میں، VE گروپ میں SOD، CAT، اور GSH-Px کی سرگرمیوں میں نمایاں اضافہ ہوا (P < 0۔{24}}1, P < 0.05) . ماڈل گروپ کے مقابلے میں، VAP1 گروپ میں SOD اور GSH-Px کی سرگرمیوں میں نمایاں اضافہ ہوا (P <0.05، P <0.01)۔ اس کے برعکس، CAT میں قدرے اضافہ کیا گیا تھا لیکن نمایاں طور پر مختلف نہیں تھا۔ ماڈل گروپ کے مقابلے میں، VAP2 گروپ میں SOD، CAT، اور GSH-Px کی سرگرمیوں میں نمایاں اضافہ ہوا (P <0.05، P <0.01)۔ ماڈل گروپ کے مقابلے میں، VAP1 اور VAP2 گروپوں میں چوہوں کے سیرم MDA کے مواد کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا (P <0.05)۔ مندرجہ بالا نتائج سے ظاہر ہوتا ہے کہ VAP کا اینٹی ایجنگ اثر عمر رسیدہ چوہوں میں سیرم اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کی سرگرمی کو بڑھانے اور لپڈ پیرو آکسیڈیشن کو کم کرنے سے متعلق ہے۔

3.4 چوہوں میں گٹ مائکرو بائیوٹا کی ساخت اور تنوع پر VAP کے اثرات

16S rRNA جین کی ترتیب کے نتائج سے 1,999,460 PE ریڈز برآمد ہوئے، اور chimeras کو فلٹر کرنے اور ہٹانے کے بعد، 1,776,708 موثر ٹیگز حاصل کیے گئے۔ کنٹرول، ماڈل، VE، VAP1، اور VAP2 گروپس میں نمونوں کی اوسط ترتیب کی لمبائی بالترتیب 417.2، 416.2، 418.2، 421.0، اور 420.4 bp تھی۔ 30 (Q30) سے زیادہ فریڈ کوالٹی اسکور کے ساتھ پڑھنے کا تناسب 94.15 سے 95.71 فیصد تک ہے۔

اس کے بعد، ہم نے 16S rRNA جین ریڈز کا استعمال کرتے ہوئے گٹ مائکرو بائیوٹا کمپوزیشن کا تعین کیا۔ ہائی تھرو پٹ سیکوینسنگ کے ذریعے حاصل کردہ ٹیگز کو 97 فیصد کی مماثلت کی سطح پر کلسٹر کیا گیا تھا، اور ایک وین ڈایاگرام تیار کیا گیا تھا (تصویر 4A)۔ ہر گروپ میں 490 OTUs تھے، اور فی گروپ میں بنیادی طور پر کوئی مخصوص OTUs نہیں تھے۔ اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ آیا ترتیب کی گہرائی پرجاتیوں کی شناخت کے تقاضوں کو پورا کرتی ہے، ہم نے تمام نمونوں کے لیے شینن اور نایاب منحنی خطوط تیار کیے (تصویر 4B، C)۔ تمام نمونوں میں دونوں منحنی خطوط سنترپتی سطح مرتفع کے قریب تھے، جو ایک اعلی کوریج (99 فیصد) کو ظاہر کرتے ہیں۔ یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ نمونوں میں مائکروبیل تنوع کی معلومات کی اکثریت کو نکالا گیا تھا اور یہ کہ بیکٹیریل کمیونٹی کی ساخت اور تنوع کا درست تعین کیا جا سکتا ہے۔

الفا تنوع پرجاتیوں کی کثرت (امیریت) اور پرجاتیوں کے تنوع کی عکاسی کرتا ہے۔ شینن اور سمپسن اشاریہ جات کا استعمال انواع کے تنوع کی پیمائش کے لیے کیا جاتا ہے اور نمونہ برادری میں پرجاتیوں کی کثرت اور پرجاتیوں کی یکسانیت (کمیونٹی یکسانیت) سے متاثر ہوتے ہیں۔ شینن انڈیکس ویلیو جتنی بڑی ہوگی، سمپسن انڈیکس ویلیو اتنی ہی کم ہوگی، جو اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ نمونے کی نسلی تنوع زیادہ ہے [21]۔ تصویر 4D میں پیش کردہ نتائج گروپوں کے درمیان ماؤس فلورا کے شینن انڈیکس کی اقدار میں کوئی خاص فرق نہیں دکھاتے ہیں۔

کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، ماڈل گروپ کی سمپسن انڈیکس ویلیو میں کوئی خاص فرق نہیں ہے۔ ماڈل گروپ اور ہر علاج گروپ کے درمیان کوئی خاص فرق نہیں دیکھا گیا۔ یہ نتائج گروپوں کے درمیان چوہوں کے آنتوں کے پودوں کے تنوع میں کوئی خاص فرق نہیں دکھاتے ہیں۔

پی سی اے ماؤس آنتوں کے نباتات (تصویر 4E) پر انجام دیا گیا تھا، جہاں PC1 اور PC2 دو خصوصیت کی قدریں ہیں جو نمونوں کے درمیان سب سے بڑا فرق پیدا کرتی ہیں۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ 32.94 اور 19.74 فیصد اثر و رسوخ کی ڈگری بالترتیب PC1 اور PC2 کے لیے تھی۔ پوائنٹس جتنے دور ہوں گے فرق اتنا ہی زیادہ ہوگا۔ نمونوں کے پانچ گروپوں کو تین زمروں میں کلسٹر کیا گیا ہے، ماڈل گروپ کے نمونے دوسرے گروپوں سے بہت دور، اعداد کے اوپری بائیں کونے میں تقسیم کیے گئے ہیں۔ کنٹرول، VE، اور VAP2 گروپوں نے زیادہ اوورلیپ دکھائے، اور نمونوں کے تین گروپ ایک دوسرے کے قریب تھے۔ تصویر 4E کے اوپری وسط سے پتہ چلتا ہے کہ VAP مداخلت کے بعد، VAP2 گروپ کے چوہوں کے آنتوں کے پودوں کی کنٹرول چوہوں کے ساتھ مماثلت کو بہتر بنایا گیا تھا۔

کنٹرول ماڈل، VE، VAP1، اور VAP2 گروپس میں بیکٹیریا کی کثرت میں فرق کو سرفہرست 20 نسلوں (تصویر 4F) کے لیے جانچا گیا۔ Lachnospiraceae_NK4A136_گروپ اور Lactobacillus کی کثرت کنٹرول اور ماڈل جانوروں کے درمیان مختلف تھی، جہاں ماڈل گروپ میں Lactobacillus کی کثرت میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی۔ اس کے برعکس، باقی نسلوں کی کثرت میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ خاص طور پر، Lactobacillus ممبران پروبائیوٹکس ہیں جو عمر بڑھنے اور انسداد سوزش اثرات کے ساتھ ہیں [22، 23]۔ اس لیے یہ نتائج حیران کن نہیں تھے۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ ماڈل گروپ کے مقابلے VAP1 اور VAP2 گروپس میں Lactobacillus کی کثرت نمایاں طور پر بڑھی تھی، جس سے پتہ چلتا ہے کہ VAP آنتوں میں فائدہ مند بیکٹیریا کے مواد کو بڑھا سکتا ہے، عمر بڑھنے سے روکتا ہے۔

【مزید معلومات کے لیے:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】