محفوظ شدہ سیسٹین سے بھرپور سیکرٹری پروٹین MaCFEM85 پودوں کے دفاع کو فعال کرنے کے لیے MsWAK16 کے ساتھ بات چیت کرتا ہے۔

خلاصہ: Metarhizium anisopliaeایک اینٹوموپیتھوجینک فنگس ہے جو میزبان پودوں میں اینڈوفائٹ کے طور پر کام کرتے وقت پودوں کی نشوونما اور مزاحمت کو بڑھا سکتی ہے۔ تاہم، پروٹین کے تعاملات یا ان کے فعال کرنے کے طریقہ کار کے بارے میں بہت کم معلوم ہے۔ فنگل ایکسٹرا سیلولر میمبرین (CFEM) پروٹین میں عام طور پر پودوں کے مدافعتی ریگولیٹرز کے طور پر شناخت کیا گیا ہے جو پودوں کی مزاحمتی ردعمل کو دبانے یا فعال کرتے ہیں۔ یہاں، ہم نے CFEM ڈومین پر مشتمل پروٹین، MaCFEM85 کی نشاندہی کی، جو بنیادی طور پر پلازما جھلی میں مقامی تھی۔ خمیر دو ہائبرڈ (Y2H)، glutathione-S-transferase (GST) پل-ڈاؤن، اور bmolecular fluorescence complementation asses نے یہ ظاہر کیا کہ MaCFEM85 نے ایکسٹرا سیلولر ڈومین کے ساتھ بات چیت کی۔Medicago sativa(alfalfa) جھلی پروٹین، MsWAK16. جین کے اظہار کے تجزیوں سے پتہ چلتا ہے کہ MaCFEM85 اور MsWAK16 کو نمایاں طور پر بڑھا دیا گیا تھا۔M. anisopliaeاورM. sativaبالترتیب، ٹیکہ لگانے کے بعد 12 سے 60 گھنٹے تک۔ اضافی خمیر دو ہائبرڈ اسسیس اور امینو ایسڈ سائٹ سے متعلق اتپریورتن نے اشارہ کیا کہ MsWAK16 کے ساتھ MaCFEM85 کے تعامل کے لئے CFEM ڈومین اور 52th cysteine ​​کی خاص طور پر ضرورت تھی۔ ڈیفنس فنکشن اسسیس نے ظاہر کیا کہ JA کو اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا، لیکن Botrytis cinerea lesion size اور Myzus persicae reproduction کو ماڈل میزبان پلانٹ Nicotiana benthamiana میں MaCFEM85 اور MsWAK16 کے عارضی اظہار سے دبا دیا گیا تھا۔ اجتماعی طور پر، یہ نتائج میزبان پودوں کے ساتھ M. anisopliae کے بنیادی تعامل کے مالیکیولر میکانزم کے بارے میں نئی ​​بصیرت فراہم کرتے ہیں۔

cistanche سپلیمنٹ کے فوائد - قوت مدافعت میں اضافہ

مطلوبہ الفاظ: دیوار سے منسلک کناز؛ CFEMs؛ Metahizium anisopliae؛ پودوں کی قوت مدافعت؛ Medicago sativa

1. تعارف

پودوں اور جرثوموں کے درمیان تعاملات وسیع ہیں اور یہ ماضی اور جاری شریک ارتقاء کا نتیجہ ہیں۔ ان تعاملات کے ہر شریک [1-3] کے لیے یا تو فائدہ مند، غیر جانبدار یا منفی نتائج ہو سکتے ہیں۔ فائدہ مند rhizospheric microbiota پودوں کی نشوونما کو بڑھا سکتا ہے اور مٹی سے پیدا ہونے والی بیماریوں سے بچا کر یا غذائی اجزاء کی مقدار کو بڑھا کر مجموعی صحت کو بہتر بنا سکتا ہے [4,5]۔ فائدہ مند جرثوموں کی ایک وسیع رینج پودوں کی صلاحیتوں کو بڑھا سکتی ہے جیسے کہ غذائی اجزاء کی مقدار، نشوونما، اور پیتھوجین اور کیڑوں کے دفاع [6,7]۔ Metarhizium Sorok¯ın پودوں کو نوآبادیاتی بنانے کی صلاحیت کے ساتھ اینٹوموپیتھوجینک فنگس کی ایک اہم جینس ہے [8]، لیکن اس بات کے شواہد بھی موجود ہیں کہ جینس کے ارکان پودوں کے روگزنق مزاحمت کو بڑھا سکتے ہیں۔ مثال کے طور پر، ایک لیبارٹری مطالعہ میں Fusarium solani (Mart.) Sacc کی 60% روک تھام پائی گئی۔ M. robertsii کے بغیر کنٹرول کے مقابلے میں Metarhizium robertsii (پہلے M. anisopliae کے نام سے جانا جاتا تھا) کی موجودگی میں [9]۔ کچھ Metarhizium strains پودوں کے دفاعی جینوں کے اظہار کو تبدیل کرکے کیڑوں کے کیڑوں اور بیماریوں کے خلاف پودوں کی مزاحمت کو بہتر بنانے کی صلاحیت رکھتی ہے۔ ایم رابرٹس کے ساتھ اینڈو فیٹک کالونائزیشن مکئی کے پتوں میں جیسمونک ایسڈ (JA) اور سیلیسیلک ایسڈ (SA) دفاعی راستوں دونوں کے اظہار کو متحرک کرتی ہے۔ مزید برآں، اس طرح کی نوآبادیات کا تعلق پودوں کی نشوونما کے فروغ اور ایگروٹیس ایپسیلون (ہفنیجیل) لاروا کی نشوونما کے دبانے سے ہے [10]۔ Metarhizium guizhouense نے Lansium parasiticum کے پھلوں کے چھلکے میں -1,3-glucanase اور chitinase کو چالو کیا جس کے نتیجے میں Botrytis sp کی نشوونما روکتی ہے۔ اور Fusarium sp. Aglaia dookkoo Griff کے پھل پر [11]. مزید برآں، جب M. anisopliae کو مونگ پھلی کے بیجوں پر لاگو کیا گیا تو متعدد نقلی عوامل بشمول WRKYs، MYCs، TGAs، اور ethylene-responsive transcription factors کو چالو کیا گیا، جبکہ نائٹریٹ ٹرانسپورٹرز اور پروٹین بائنڈنگ ڈی ہائیڈریشن کے ردعمل کے عناصر کو بھی مختلف انداز میں ظاہر کیا گیا [12] . اس سے پتہ چلتا ہے کہ M. anisopliae پودوں کے دفاعی جین کو کنٹرول کرتا ہے کیونکہ یہ پودے کو نوآبادیات بناتا ہے۔ تاہم، Metarhizium کے انفیکشن کے بعد پودوں کے دفاعی ردعمل کے بنیادی میکانزم کے بارے میں نسبتاً کم معلومات ہیں۔ اثرات ایک عام ذریعہ ہیں جن کے ذریعے مائکروجنزم پودوں کی مزاحمت کو منظم کرتے ہیں [13]۔ پودوں کی مزاحمت کو چالو کرنے کی خصوصیت عام طور پر آکسیڈیٹیو برسٹ اور ہارمونز، میٹابولائٹس اور دیگر سگنلز کی شمولیت سے ہوتی ہے [13]۔ پودوں کے ہارمونز SA اور JA پودوں کی مزاحمت پیدا کرنے میں اہم کردار ادا کرتے ہیں، دو الگ الگ دفاعی سگنلنگ راستوں میں ثالثی کرتے ہیں [14]۔ SA سگنلنگ پاتھ وے بنیادی طور پر پودوں کے الرجک ردعمل اور پیتھوجینز کے خلاف نظامی طور پر حاصل شدہ مزاحمت میں کام کرتا ہے، لیکن یہ بالواسطہ پودوں کے دفاعی ردعمل میں بھی شامل ہو سکتا ہے جو کیڑوں کی خوراک کے ڈنک سے پیدا ہوتا ہے [15]۔ SA کا جمع ہونا لپڈ ٹرانسفر پروٹینز (LTPs) اور phenylalanine ammonia-lyase (PAL) [16] کو انکوڈنگ کرنے والے جینوں کے بڑھتے ہوئے اظہار سے منسلک ہے، جو کہ فلیوونائڈز اور لگنن جیسے بہاو خصوصی میٹابولائٹس کی ترکیب اور جمع میں ثالثی کرتا ہے۔ JA سگنلنگ پاتھ وے مکینیکل نقصان، فنگل پیتھوجینز، اور کیڑے مکوڑوں کے براہ راست اور بالواسطہ ردعمل میں کام کرتا ہے۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ JA سگنلنگ کا خصوصی میٹابولائٹس جیسے terpenoids، phenylpropanoids، اور alkaloids کی ترکیب پر ایک ریگولیٹری اثر پڑتا ہے، جس میں حیاتیاتی افعال کی ایک وسیع رینج ہوتی ہے [18]۔ میتھائل جے اے (MeJA) کے ساتھ علاج کے بعد پودوں کے خلیوں میں کچھ خصوصی میٹابولائٹس جمع ہوتے ہوئے دکھائے گئے ہیں، بشمول ٹیکسس پرجاتیوں [19,20] میں پیلیٹیکسیل، Centella Asiatica (L.) اربن [21] میں terpenoids، اور ginseng [22] میں saponins۔ . SA اور chitosan (CHT) کو بطور ایلیکیٹرز استعمال کرنے سے ٹماٹروں میں لگنن کے جمع ہونے اور دفاعی انزائم کے رد عمل کی حوصلہ افزائی ہوتی ہے، جس نے Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi انفیکشن کے واقعات کو کم کیا [23]۔ اس کے علاوہ، گندم میں JA اور SA کی سطحیں نمایاں طور پر ایلیسیٹر پی اے ٹی کے استعمال سے جمع ہوئیں، جئ افیڈ Sitobion avenae (Fabricius) [24] کے دفاعی ردعمل کو بڑھاتی ہیں۔ اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ پودوں کی قوت مدافعت کو ان اثرات کے ذریعے پلانٹ ہارمونز اور میٹابولائٹس کے ذریعے منظم کیا جا سکتا ہے۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

فنگل ایکسٹرا سیلولر میمبرین (CFEM) پروٹین میں عام فنگس کی ایک وسیع رینج میں موجود ہوتے ہیں۔ وہ ایسے ڈومینز کو انکوڈ کرتے ہیں جن کی لمبائی عام طور پر 60 امینو ایسڈ (AA) ہوتی ہے اور اس میں آٹھ خصوصیت سے فاصلہ والے سسٹینز ہوتے ہیں [25]۔ سی ایف ای ایم ڈومینز ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر (ای جی ایف) جیسے ڈومینز سے ملتے جلتے ہیں، جو ایکسٹرا سیلولر ریسیپٹرز، سگنل ٹرانسڈیوسرز، یا میزبان – پیتھوجین تعاملات میں آسنجن مالیکیولز کے طور پر کام کرتے ہیں [26]۔ سی ایف ای ایم ڈومینز پر مشتمل پروٹینز اثر کرنے والے کے طور پر کام کر کے پودوں کے مزاحمتی ردعمل کو جوڑ سکتے ہیں۔ گندم کے پتوں کی زنگ آلود فنگس Puccinia triticina Erikas میں، CFEM اثر کرنے والے امیدوار PTTG_08198 نے سیل کی موت کی پیشرفت کو تیز کیا اور ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کے جمع ہونے کو فروغ دیا [27]۔ اینتھراکنوز فنگس Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils میں پانچ اثر کرنے والے (CgCFEM6, 7, 8, 9, اور 15) ہوتے ہیں جو نکوٹیانا بینتھامیانا ڈومین [28] میں BAX سے متاثرہ پروگرام شدہ سیل کی موت کو دبانے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ phytosymbiotic mycorrhizal fungus Laccaria bicolor (Maire) PDOrton کو متعدد CFEM پروٹینز، جیسے Lac310796، Lac296573، اور Lac296572، symbiotic ٹشوز میں خارج کرنے کی اطلاع دی گئی تھی [29]۔ اگرچہ ان پروٹینوں کے پیچیدہ افعال کا مزید مطالعہ مائیکورریزل سمبیوسس میں نہیں کیا گیا ہے، لیکن پہلے کے نتائج بتاتے ہیں کہ CFEM پروٹین فنگی اور پودوں کے درمیان سگنلنگ میں کام کر سکتے ہیں۔ M. anisopliae میزبان پودے [30] میں اینٹوموپیتھوجینک یا اینڈوفائٹک فنگس کے طور پر کام کر سکتا ہے۔ تاہم، ابھی تک CFEM پروٹین کے کردار کی اطلاع نہیں دی گئی ہے۔ ہم نے پہلے M. anisopliae، MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31] میں ایک CFEM ڈومین پر مشتمل پروٹین کی نشاندہی کی تھی۔ یہاں، ہم MaCFEM85 اور Medicago sativa وال سے وابستہ kinase MsWAK16 کے درمیان تعلق کی اطلاع دیتے ہیں۔ ہم نے MaCFEM85 ترتیب کا تجزیہ کیا اور اس بات کا تعین کرنے کے لیے تجربات کیے کہ MsWAK16 کے ساتھ تعامل کے لیے کون سی باقیات اہم ہیں۔ آخر میں، N. benthamiana کو اپنے ماڈل پلانٹ کے طور پر استعمال کرتے ہوئے، ہم نے MaCFEM85 اور MsWAK16 کے عارضی اظہار کے ساتھ اور بغیر Botrytis cinerea اور aphid Myzus persicae کے لیے پودوں کے دفاعی ردعمل کا جائزہ لیا۔

cistanche tubulosa کے فوائد- مدافعتی نظام کو مضبوط کرنا

Cistanche Enhance Immunity مصنوعات دیکھنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

【مزید پوچھیں】 ای میل:cindy.xue@wecistanche.com / واٹس ایپ: 0086 18599088692 / وی چیٹ: 18599088692

2. نتائج

2.1 MaCFEM85 غیر پیتھوجینک فنگل CFEMs سے زیادہ قریب سے متعلق تھا اور پلازما جھلی میں مقامی تھا۔

پیتھوجینک اور نان پیتھوجینک ماڈل فنگس سے MaCFEM85 اور دیگر CFEM پروٹین کے درمیان تعلقات کا تجزیہ کرنے کے لیے ایک فائیلوجنیٹک درخت بنایا گیا تھا۔ ان میں Magnaporthe oryzae، Fusarium oxysporum (Schl)، Neurospora crassa Shear & BODodge، اور Beauveria bassiana (Bals.) (سیکشن 4 دیکھیں) شامل تھے۔ MaCFEM85 B. bassiana میں CFEM پروٹین کے ساتھ سب سے زیادہ قریب سے متعلق تھا، اور اس وجہ سے، ارتقائی طور پر پیتھوجینک فنگس (شکل 1a) کی نسبت غیر پیتھوجینک کے زیادہ قریب ہے۔

شکل 1a

2.2 M. sativa کے ساتھ تعامل کے دوران MaCFEM85 کو اپ گریڈ کیا گیا تھا۔

وال سے وابستہ ریسیپٹر نما کناز (WAKs) ریسیپٹر نما پروٹین کنازس (RLKs) کے اندر ایک ذیلی گروپ کی نمائندگی کرتے ہیں اور اس میں ایک ایکسٹرا سیلولر ڈومین، ایک ٹرانس میمبرن ہیلکس، اور ایک انٹرا سیلولر کناز ڈومین شامل ہیں۔ وہ پودوں کی نشوونما، نشوونما، تناؤ کے ردعمل، اور پیتھوجین مزاحمت کے سگنلنگ راستوں کو منظم کرنے میں اہم کردار ادا کرتے ہیں [32]۔ RNA کو M. anisopliae hyphae اور M. sativa جڑوں سے MaCFEM85 اور MsWAK16 کے اظہار کے نمونوں کی چھان بین کے لیے شریک انکیوبیشن کے بعد نکالا گیا تھا۔ MaCFEM85 اور MsWAK16 دونوں کو 12 سے 60 گھنٹہ (شکل 1c،d) تک شریک انکیوبیشن کے دوران نمایاں طور پر اعلیٰ سطحوں پر ظاہر کیا گیا تھا۔ 0 سے 36 گھنٹے تک، MaCFEM85 اظہار آہستہ آہستہ بڑھتا گیا، 36 گھنٹے تک پہنچ گیا۔ M. anisopliae اور M. sativa کے امتزاج میں اکیلے اگائے جانے والے M. anisopliae کے مقابلے میں یہ × 593 گنا زیادہ اظہار تھا۔ اگرچہ 48-60 گھنٹے کی مدت میں MaCFEM85 اظہار میں قدرے کمی واقع ہوئی تھی، لیکن پھر بھی یہ اکیلے اگائے جانے والے M. anisopliae کے مقابلے میں نمایاں طور پر اعلیٰ سطح پر ظاہر کیا گیا تھا۔ MsWAK16 کو بھی نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا، جس کا اظہار 36 گھنٹے پر تھا۔ M. anisopliae سے متاثرہ M. sativa میں M. anisopliae کے بغیر M. sativa کی نسبت MsWAK16 × 89.06 گنا زیادہ اظہار کیا گیا تھا۔ 36 سے 60 گھنٹے تک، MsWAK16 کی سطح میں قدرے کمی واقع ہوئی، لیکن اس کا اظہار اب بھی غیر منقولہ پودوں کی نسبت نمایاں طور پر زیادہ تھا۔

2.3 MaCFEM85 MsWAK16 In Vitro اور In Vivo کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔

M. anisopliae علاج کے جواب میں MaCFEM85 کے ممکنہ فنکشنل میکانزم کی چھان بین کرنے کے لیے، ابتدائی طور پر میزبان پروٹینوں کی شناخت کرنے کے لیے ایک خمیر دو ہائبرڈ (Y2H) اسکرین لگائی گئی جو MaCFEM85 کے ساتھ تعامل کرتے ہیں۔ MsWAK16 (MsWAK16-ED) اور MaCFEM85 کے ایکسٹرا سیلولر ڈومین کے درمیان تعامل کو pGBKT7 میں MaCFEM85 کو BD ویکٹر کے طور پر اور pGADT7 میں MsWAK16 کو AD ویکٹر کے طور پر استعمال کرتے ہوئے ایک سے ایک خمیری دو ہائبرڈ پرکھ کے ساتھ جانچا گیا۔ تمام تبدیل شدہ خمیر SD-T/L کی کمی والے میڈیم پر اچھی طرح بڑھے، اور مثبت کنٹرول گروپ اور تجرباتی گروپ SD-T/L/H/A + X- -گیل کی کمی والے میڈیم پر کامیابی سے بڑھے۔ اس نے اشارہ کیا کہ MaCFEM85 MsWAK16-ED (شکل 2a) کے ساتھ تعامل کر سکتا ہے۔

شکل 2. MaCFEM85 اور MsWAK16 کے درمیان تعامل کی توثیق۔

وٹرو کی توثیق کے لیے، glutathione-S-transferase (GST)-ٹیگ شدہ MsWAK16-ED (60 kDa کے پروڈکٹ کو انکوڈنگ) pGEX6-P2 میں داخل کیا گیا تھا، اور پولی ہسٹیڈائن (اس کے) ٹیگ شدہ MaCFEM85 ( 17 kDa) کے پروڈکٹ کو انکوڈنگ پی ای ٹی-21ب میں داخل کیا گیا تھا۔ اس کے اور جی ایس ٹی اینٹی باڈیز کے ساتھ امیونوبلوٹنگ نے یہ ظاہر کیا کہ دوبارہ پیدا ہونے والے پروٹین میک ایف ای ایم85-اس نے GST-MsWAK16-ED شکار کے ساتھ بات چیت کی لیکن اکیلے GST کے ساتھ نہیں اور GST-MsWAK16- ED نے اس کے ساتھ تعامل کیا۔ -MaCFEM85 (شکل 2b)۔ MaCFEM85 اور MsWAK16 کے درمیان تعامل کی مزید تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے MaCFEM85-YFPN اور MsWAK16-YFPC تعمیرات کے ساتھ ایک بائیمولیکولر فلوروسینس کمپلیمینٹیشن (BiFC) پرکھ کی۔ تمباکو کے پتوں میں MaCFEM85-YFPN اور MsWAK16-YFPC کے مشترکہ اظہار نے پیلے رنگ کا فلوروسینس سگنل پیدا کیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ MaCFEM85 نے MsWAK16 (شکل 2c) کے ساتھ تعامل کیا۔

2.4 MaCFEM85 اور MsWAK16 تعاملات کے لیے کلیدی سائٹس

MaCFEM85 کے علاقے کی وضاحت کرنے کے لیے جو MsWAK16-ED کے ساتھ تعامل کے لیے درکار ہے، آن لائن سافٹ ویئر SMART (شکل 3a) کے ساتھ پروٹین ڈومینز کی پیش گوئی کی گئی تھی۔ MaCFEM85 19-86 aa خطے میں ایک CFEM ڈومین پر مشتمل ہے۔ ترتیری ڈھانچے کی بھی پیش گوئی کی گئی تھی (شکل 3b)۔ اس ڈومین میں آٹھ سسٹینوں کے نتیجے میں چار ڈسلفائیڈ بانڈز (CYS26 اور CYS69، CYS30 اور CYS64، CYS43 اور CYS50، اور CYS52 اور CYS85) پیدا ہوئے، پروٹین کے استحکام کو برقرار رکھتے ہوئے (شکل 3b)۔ MaCFEM85 میں پوٹیٹیو انٹرایکشن سائٹ (سائٹس) کی توثیق کرنے کے لیے، پروٹین کے سات تبدیل شدہ ورژن بنائے گئے اور پی جی بی کے ٹی 7 میں بیت پروٹین کے طور پر داخل کیے گئے۔ ہر ریکومبیننٹ ویکٹر کو Y2H گولڈ سٹرین میں AD-MsWAK{19}ED کے ساتھ باہم منتقل کیا گیا تھا۔ CYS52 تبدیل شدہ کے ساتھ تناؤ سلیکٹیو میڈیا پر نہیں بڑھتا تھا (شکل 3c، سرخ رنگ میں بیان کیا گیا ہے)، یہ بتاتا ہے کہ MsWAK16-ED کے ساتھ MaCFEM85 کے تعامل کے لیے CYS52 کی ضرورت ہے۔

2.5 MsWAK16 کے ساتھ MaCFEM85 کا تعامل پودوں کے مدافعتی ردعمل کو متحرک کرتا ہے

2.5.1 B. cinerea کے خلاف بیماریوں کے خلاف مزاحمت میں MaCFEM85 اور MsWAK16 کے کردار کا جائزہ

پیتھوجین دفاعی ردعمل میں MaCFEM85 اور MsWAK16 کی ممکنہ شمولیت کو دریافت کرنے کے لیے، ہم نے جانچا کہ آیا MaCFEM85، MsWAK16، یا MaCFEM85 اور MsWAK16 کی حد سے زیادہ کارکردگی B. cinerea کے خلاف مزاحمت کو بڑھا سکتی ہے۔ ہم نے ان ویکٹروں کو عارضی طور پر N. benthamiana کے پتوں میں ظاہر کیا۔ ایک مغربی بلٹ پرکھ سے پتہ چلتا ہے کہ MaCFEM85 اور MsWAK16 کا موازنہ سطحوں پر اظہار کیا گیا تھا جب وہ اکیلے یا ایک ساتھ اظہار کرتے تھے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ MaCFEM85 اور MsWAK16 کا تمباکو میں کامیابی کے ساتھ اظہار کیا گیا تھا (شکل 4a)۔ MaCFEM85، MsWAK16، MaCFEM85+MsWAK16، یا GFP کنٹرول کے ساتھ N. benthamiana infiltrated کا استعمال کرتے ہوئے بیماری کی جانچ بھی کی گئی۔ کنٹرول پلانٹس (شکل 4b) کے مقابلے MaCFEM85، MsWAK16، یا MaCFEM85+MsWAK16 کے ساتھ گھسنے والے پتوں پر گھاو نمایاں طور پر چھوٹے تھے (ٹیکہ لگانے کے بعد 2 d پر ~ 30%)۔ یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ N. benthamiana میں MaCFEM85 کے عارضی اظہار نے B. cinerea کے خلاف مزاحمت میں اضافہ کیا اور MaCFEM85 اور MsWAK16 نے B. cinerea کے خلاف دفاعی ردعمل کو مثبت طور پر منظم کیا۔

شکل 3. MaCFEM5 اور MsWAK16 کے درمیان تعامل کی جگہ کی شناخت۔

شکل 4. MaCFEM85 اور MsWAK16 کے عارضی اظہار کے ذریعے پودوں کی مزاحمت کو شامل کرنا۔

2.5.2 N. benthamiana میں Aphid Defence میں MaCFEM85 اور MsWAK16 کے کردار کا جائزہ

MaCFEM85 اور MsWAK16 کے کردار کی مزید چھان بین کرنے کے لیے، N. benthamiana پودوں کو عارضی طور پر MaCFEM85 اور MsWAK16 کا اظہار کرنے والے M. persicae سے متاثر ہوئے، اور آبادی کا اندازہ لگایا گیا۔ اس تجربے کے لیے، ہر N. benthamiana کے پتے کے ایک بڑے حصے کو MaCFEM85 اور MsWAK16 پر مشتمل ریکومبیننٹ بائنری ویکٹر pYBA1132 کے ساتھ ایگرو انفلٹر کیا گیا تھا۔ GFP کو بطور کنٹرول استعمال کیا گیا۔ دراندازی کے 12 گھنٹے بعد، ہر پتے پر 20 M. persicae بالغوں کو پنجرے میں بند کیا گیا، جس سے دراندازی والے علاقے کو افڈس کے سامنے لایا گیا۔ مندرجہ ذیل تین دنوں میں، بالغ افیڈ کی اموات اور اپسروں کی تعداد ریکارڈ کی گئی۔ اس کے بعد اپسروں کو ہٹا دیا گیا۔ M. persicae آبادیوں کے درمیان اموات کے خطرے میں کوئی خاص فرق نہیں تھا جو MaCFEM85، MsWAK16، یا MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p <0.30081 کا اظہار کرنے والے پودوں پر کھانا کھاتے ہیں۔ ) (شکل 4c)۔ تاہم، 24، 48، اور 72 گھنٹے میں، N. benthamiana پر GFP کنٹرول کا اظہار کرنے والے MaCFEM85، MsWAK16، یا MaCFEM85+MsWAK16 (شکل) کے مقابلے میں ہر بالغ افیڈ کے ذریعہ پیدا ہونے والی نسل کی اوسط تعداد نمایاں طور پر زیادہ تھی۔ 4d)۔

2.5.3 ہارمون کے جمع ہونے اور ہارمون سے متعلقہ جین اظہار میں MaCFEM85 اور MsWAK16 کے کردار کا جائزہ

EGFP، MaCFEM85، MsWAK16، اور MaCFEM85+MsWAK16 کا اظہار کرنے والے N. benthamiana پودوں کے دفاعی ردعمل کے درمیان فرق کا تجزیہ کرنے کے لیے، ہم نے JA, SA، اور کل flavonoid کی سطحوں، اور متعلقہ جینوں کے اظہار کی پیمائش کی۔ نتائج سے ظاہر ہوا کہ JA اور SA کی سطحیں eGFP، MaCFEM85، MsWAK16، اور MaCFEM85+MsWAK16 (شکل 5a) کو ظاہر کرنے والے پودوں کے درمیان مختلف ہیں۔ EGFP کا اظہار کرنے والوں کے مقابلے میں، JA کی سطح MaCFEM85 کا اظہار کرنے والے پودوں میں نمایاں طور پر کم تھی۔ SA کی سطح میں قدرے اضافہ کیا گیا تھا، لیکن فرق اہم نہیں تھے۔ اس کے برعکس، MsWAK16 کا اظہار کرنے والے پودوں نے JA کی سطحوں میں eGFP کنٹرول کے مقابلے میں کوئی خاص فرق نہیں دکھایا، جبکہ SA کی سطح کنٹرول کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم تھی (شکل 5a)۔ JA اور SA کی سطحوں میں بالترتیب نمایاں طور پر اضافہ اور کمی واقع ہوئی تھی، eGFP کے مقابلے میں MaCFEM85+MsWAK16 کا اظہار کرنے والے پودوں میں۔

شکل 5۔ ہارمون کی سطح اور ہارمون ردعمل جین اظہار

دیگر تمام ٹریٹمنٹ گروپس (شکل 5a) کے مقابلے MaCFEM85+MsWAK16 کا اظہار کرنے والے پودوں میں کل flavonoid مواد نمایاں طور پر زیادہ تھا۔ MsWAK16 اور MaCFEM85+MsWAK16 کا اظہار کرنے والے پودوں میں بائیو سنتھیٹک جین کے اظہار کی سطحیں یکساں تھیں۔ مثال کے طور پر، JA ردعمل سے متعلق جین، یعنی COI1، MYC2، اور PDF1.2، GFP (شکل 5b) کا اظہار کرنے والے پودوں کے مقابلے میں نمایاں طور پر اپ گریڈ کیے گئے تھے۔ اسی طرح، SA سے متعلقہ جینز NPR1، WRKY70، اور PR1 نمایاں طور پر MsWAK16 اور MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 کو اپ گریڈ کیا گیا تھا، جبکہ WRKY70 اور PR1 کو کنٹرول کے مقابلے میں کم کیا گیا تھا (شکل 5b)۔ ہم نے شکیمک ایسڈ اور فینیلپروپینائڈ ترکیب کے راستوں میں کلیدی جینوں کے اظہار کا بھی جائزہ لیا، جو دونوں فلیوونائڈ ترکیب سے متعلق ہیں۔ عام طور پر، اکیلے MaCFEM85 کے اظہار نے تمباکو میں ان جینوں کے نمایاں طور پر زیادہ اظہار نہیں کیا۔ تاہم، GFP کنٹرول (شکل 5c) کے مقابلے میں MsWAK16 یا MsWAK16+MaCFEM85 کو ظاہر کرنے والے تمباکو میں ان جینز کو الگ کر دیا گیا تھا۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

3. بحث

3.1 محفوظ شدہ CFEM پروٹین موٹف کوکیی انواع میں متعدد افعال انجام دیتا ہے۔

CFEM ڈومین فنگس کے لیے منفرد ہے اور عام طور پر فنگل ایکسٹرا سیلولر جھلی پروٹین میں پایا جاتا ہے۔ ڈومین کی ابتدا Ascomycota اور Basidiomycota [33] کے حالیہ مشترکہ اجداد سے ہوئی ہے۔ حالیہ تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ فنگل پیتھوجینز میں سی ایف ای ایم پروٹین پودوں کے مدافعتی ریگولیٹرز کے طور پر کام کر سکتے ہیں، جس کی وجہ سے میزبان پودوں کی قوت مدافعت کو دبانے یا فعال کرنے کا سبب بنتا ہے جو انفیکشن کی قسم پر منحصر ہوتا ہے [28,34,35]۔ M. anisopliae میں CFEM ڈومین پر مشتمل پروٹین کے بارے میں کچھ رپورٹس سامنے آئی ہیں، صرف دیگر فنگس کے ساتھ ارتقائی موازنہ کے تناظر میں [36]۔ اس مطالعے میں، ہم نے M. anisopliae CFEM پروٹین کا موازنہ پیتھوجینک اور نان پیتھوجینک فنگس دونوں میں دیگر معلوم CFEM پروٹینوں سے کیا۔ ہم نے تصدیق کی کہ MaCFEM85 کا قریب ترین ہومولوگ Cfem5 ہے جو Beauveria bassiana میں پایا جاتا ہے، جو اس نوع کے 12 CFEM پروٹینوں میں سے ایک ہے (ضمنی اعداد و شمار S1)۔ BbCfem5 لوہے کے حصول کے لیے ضروری ہے [37]۔ مزید برآں، پیش گوئی شدہ ترتیری ساخت کی بنیاد پر، MaCFEM85 میں CFEM ڈومین، Candida albicans (CPRobin) Berkhout میں پائے جانے والے Surface Antigen Protein 2 (CSA2) سے بہت ملتا جلتا ہے، جس میں 65 باقیات (96% ترتیب) کو 99.8 کے ساتھ ماڈل بنایا گیا ہے۔ % اعتماد [31]. Candida albicans ایک حیوانی روگزنق ہے۔ CSA2 ہیموگلوبن سے ہیم نکال کر اور خلیے کی دیوار سے پلازما [38–40] تک ہیم لے کر ترقی اور روگجنکیت میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ ہم قیاس کرتے ہیں کہ MaCFEM85 کیڑوں کے میزبانوں کے M. anisopliae وائرس میں ملوث ہوسکتا ہے۔ جانوروں کے روگجنک انفیکشن میں MaCFEM85 کے یہ مشترکہ افعال اور پودوں کی قوت مدافعت کو چالو کرنا پروٹین کو مستقبل کی تحقیق کا ایک دلچسپ مرکز بناتا ہے۔

3.2 ڈسلفائیڈ بانڈز پروٹین کے کام کے لیے اہم ڈھانچے ہیں۔

پروٹین کے ڈھانچے کی تعمیری سالمیت کا براہ راست تعلق اس کے کام کرنے کی صلاحیت سے ہے۔ سیسٹین کے جوڑوں کے ذریعہ بنائے گئے ڈسلفائڈ بانڈز پروٹین فولڈنگ اور تعمیری استحکام کو فروغ دیتے ہیں اور مخصوص ریسیپٹرز یا لیگنڈس کی شناخت اور پابند ہونے کے لئے کلیدی سائٹس کے طور پر سمجھا جاتا ہے [41]۔ مثال کے طور پر، پودوں کے پیتھوجین Cladosporium fulvum effector پروٹین AVR4 میں تین محفوظ شدہ ڈسلفائیڈ بانڈز میں سے کسی ایک میں خلل ڈالنے کے نتیجے میں پروٹیز کی حساسیت اور چٹن بائنڈنگ کی صلاحیت میں کمی واقع ہوتی ہے [42]۔ تین دیگر C. fulvum پروٹینز (ECP1, ECP2، اور ECP5) میں، سسٹینز کے لیے الانائنز کا واحد متبادل ٹماٹر کے انتہائی حساس ردعمل کو کم کرتا ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ سسٹینز استحکام کو برقرار رکھنے اور انتہائی حساس ردعمل پیدا کرنے والی سرگرمی [43] کے لیے اہم ہیں۔ مزید برآں، Magnaporthe oryzae کے بالغ پروٹین MC69 میں، دو محفوظ شدہ سسٹین کی باقیات (Cys36 اور Cys46) کی mutagenesis MC69 کے فنکشن کو بغیر رطوبت کو متاثر کیے خراب کر سکتی ہے، خاص طور پر MC69 کی روگجنکیت میں ڈسلفائیڈ بانڈ کی اہمیت کو بتاتا ہے۔ سی ایف ای ایم ڈومین سائز میں اور سیسٹین کی باقیات کے پیٹرن میں EGF جیسے ڈومینز سے ملتا جلتا دکھائی دیتا ہے، جس میں ڈسلفائیڈ بانڈز کے تین یا چار جوڑے ہوتے ہیں۔ ای جی ایف پروٹین میزبان – پیتھوجین تعاملات میں سیل سطح کے رسیپٹرز، سگنل ٹرانسڈیوسرز، یا آسنجن مالیکیولز کے طور پر کام کر سکتے ہیں [45]۔ اس مطالعے میں، ہم نے نہ صرف یہ پایا کہ MaCFEM85 کے CFEM ڈومین میں آٹھ محفوظ شدہ سسٹینز ہیں جنہوں نے ڈسلفائیڈ بانڈز کے چار جوڑے بنائے (شکل 3b)، بلکہ ہم نے یہ بھی توثیق کی کہ CFEM MaCFEM85 اور MsWAK16 کے درمیان تعامل کے لیے اہم ڈومین تھا۔ مزید برآں، الانائن میں سسٹین کی اوشیشوں کی سائٹ سے ہدایت کردہ تبدیلی کے ذریعے، ہم نے پایا کہ پوزیشن 52 پر موجود سسٹین کی باقیات تعامل کے لیے درکار بنیادی سائٹ تھی (شکل 3c)۔ یہ نتائج CFEM85-WAK16 تعامل کے جسمانی افعال کے مزید مطالعے کی بنیاد فراہم کرتے ہیں۔

3.3 MsWAK16 ایکٹیویٹڈ پلانٹ ڈیفنس کے ساتھ MaCFEM85 کا تعامل

مائکروبیل – پلانٹ کے تعامل میں، پودوں کے دفاعی ردعمل کو عام طور پر مائکروبیل انفیکٹر پروٹینز کے ذریعے چالو کیا جاتا ہے۔ حوصلہ افزائی دفاع مزاحمت کو فروغ دینے کے لیے حیاتیاتی کیڑوں پر قابو پانے کا ایک اہم ذریعہ بنتا جا رہا ہے۔ CFEM پروٹینوں کی شناخت پودوں کی مدافعتی ایکٹیویشن یا روکنا [28,46] کے ضابطے میں ملوث اثرات کے طور پر کی گئی ہے۔ تاہم، ان مدافعتی عوامل کے ضابطے کو پودوں کی بیماری اور کیڑوں کے خلاف مزاحمت میں ان کے مخصوص کردار سے جوڑنے والی شائع شدہ تحقیق کی کمی ہے۔ اس مطالعہ میں، ہم نے M. sativa میں MaCFEM85 اور سیل وال سے وابستہ کناز، MsWAK16، کے درمیان تعامل کی نشاندہی کرنے کے لیے ایک اینٹوموپیتھوجینک اور اینڈو فیٹک فنگس، M. anisopliae کا استعمال کیا۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ اس تعامل نے B. cinerea (شکل 4b) کے ساتھ ٹیکہ لگانے کے بعد گھاووں کے تناسب کو کم کیا اور M. persicae (Figure 4d) کی آبادی میں اضافے کی شرح کو کم کیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ MaCFEM85 اور MsWAK16 کے درمیان تعامل نے aphids کے خلاف M. sativa مزاحمت میں اضافہ کیا۔ JA، SA، اور ethylene (ET) کی سطحوں میں تبدیلیوں کو پودوں کی مزاحمت [47,48] کی شمولیت کا اندازہ کرنے کے لیے مارکر کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ یہاں، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ MaCFEM85 نے MsWAK16 کے ساتھ بات چیت کی تاکہ ہارمونل ریگولیشن کے ذریعے پودوں کی مزاحمت کو متاثر کیا جا سکے اور M. persicae (شکل 4d) کی تولیدی شرح کو روکا جا سکے۔ اسی طرح کے مطالعات پہلے بھی رپورٹ کیے گئے ہیں۔ مثال کے طور پر، Brevibacillus laterosporus effector پروٹین PeBL1 کو ٹماٹروں میں JA اور SA کے جمع ہونے اور M. persicae کی دوسری اور تیسری نسل کی آبادی کی شرح نمو کو کم کرنے کے لیے دکھایا گیا تھا جو ان پودوں کو کھلاتے ہیں۔ مزید برآں، ٹماٹر کے پودے جو ایفیکٹرز کے ساتھ اسپرے کیے جاتے ہیں M. persicae [49] پر مہلک اثر ڈالتے ہیں۔ ایلیسٹر پروٹین PeBC1 کا عام بین (Phaseolus vulgaris L.) پر استعمال سبز آڑو کے افڈس پر واضح اور اہم ذیلی مہلک اثرات کا باعث بنتا ہے۔ پی ای بی سی 1 کے ساتھ علاج کیے جانے والے پودے JA اور SA [50] سے متعلق جین کی نمایاں اپ گریجشن کو ظاہر کرتے ہیں۔ Beauveria bassiana elicitor PeBb1 تمباکو پر M. persicae کی افزائش کو کم کرتا ہے اور JA اور ET سے متعلق جینز کے اظہار کو اکساتا ہے [51]۔ موجودہ مطالعے میں، تمباکو میں MaCFEM85 اور MsWAK16 کے عارضی اظہار نے JA ردعمل سے متعلق جین COI1، MYC2، اور PDF1.2 (شکل 5b) کو نمایاں طور پر اپ گریڈ کیا اور JA اور کل flavonoid مواد (شکل 5a) میں اضافہ کیا، جو کہ نتائج کے مقابلے کے قابل تھا۔ ادب میں جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔ تاہم، ہم نے دراندازی کے 12 گھنٹے بعد تمباکو میں SA کی اعلی سطح کا پتہ نہیں لگایا، اور MsWAK16 یا MaCFEM85+MsWAK16 کو عارضی طور پر ظاہر کرنے والے پودوں نے SA کی سطح کو نمایاں طور پر کم کیا اور SA ردعمل میں شامل جینوں کی کمی کو ظاہر کیا (شکل 5a,b) . اس نے یہ ظاہر کیا کہ پودوں کے مختلف ہارمونز کا محرک نہ صرف ہم آہنگی کی سرگرمیوں کا باعث بن سکتا ہے بلکہ کراسسٹالک اور فیڈ بیک کا باعث بھی بن سکتا ہے، جس سے پودوں کو مختلف محرکات کا مناسب جواب دینے کی اجازت ملتی ہے۔ JA کی سطح میں اضافہ لیکن SA کی کم سطح پہلے پودوں میں رپورٹ کی گئی ہے۔ مثال کے طور پر، SA جمع کرنے کے لیے خراب A. thaliana میں، JA کی سطحیں جنگلی قسم کے A. thaliana کے مقابلے میں 25-گنا زیادہ تھیں، اور JA- جوابی جینز کو چالو کیا گیا تھا [52]۔ یہ بھی بتایا گیا ہے کہ کچھ بیکٹیریا SA کی وجہ سے ہونے والے نقصان سے بچنے کے لیے SA کے جمع ہونے کو روکنے کے لیے پودوں میں JA کی سطح کو بڑھا سکتے ہیں۔ مثال کے طور پر، Pseudomonas syringae ایک ٹاکسن، کورونیٹائن کے ذریعے COI1 ریسیپٹر کو نشانہ بناتا ہے، جو JA کے راستے کو منفی طور پر منظم کرتا ہے [53]۔ یہ MYC2-ٹرانسکرپشن عوامل ANAC019، ANAC055، اور ANAC072 [54] کی حوصلہ افزائی کو فروغ دیتا ہے، ICS1 (SA کی ترکیب کے لیے ایک کلیدی جین) کی نقل کو روکتا ہے اور اس طرح SA کی پیداوار اور سگنل کی نقل و حمل کو کم کرتا ہے۔ موجودہ مطالعے میں، MaCFEM85 اور MsWAK16 کے درمیان تعامل کے نتیجے میں JA کے جمع ہونے اور JA- جوابی جینوں کی اپ گریجولیشن میں اضافہ ہوا لیکن SA کے جمع ہونے اور SA سے متعلقہ جینوں کی نقل کی روک تھام ہوئی۔ اس نے اشارہ کیا کہ MaCFEM85 اور MsWAK16 کے درمیان تعامل نے JA کی حوصلہ افزائی کی، اس طرح پودوں کی افڈس کے خلاف مزاحمت کو بہتر بنایا۔

N. benthamiana میں عارضی طور پر MaCFEM85 اور MsWAK16 کا اظہار کرتے ہوئے، JA کی سطح میں اضافہ کیا گیا تھا اور B. cinerea گھاووں کے سائز کو کم کیا گیا تھا (شکل 4b)، پچھلے مطالعات کے مطابق۔ JA کیڑوں اور نیکروٹروفک پیتھوجینز [52,55] کے خلاف پودوں کی مزاحمت میں شامل ہے۔ ایک necrotrophic روگزنق کے طور پر، B. cinerea کو JA اور ET کے جمع ہونے سے روکا گیا تھا [56]۔ A. thaliana ET-deficient mutant ein2-1 اور JA-response mutant coi1-1 میں، نیچے کی طرف دفاعی جین کی سطح، PDF1.2 کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا اور B. cinerea کے لیے حساسیت کو بڑھایا گیا تھا۔ 57]۔ ہم نے یہاں پایا کہ JA سے متعلق جینوں کے JA جمع اور نقل میں نمایاں اضافہ ہوا ہے N. benthamiana میں عارضی طور پر MaCFEM85 اور MsWAK16 کا اظہار کیا گیا ہے، جبکہ SA کے جمع ہونے اور SA سے متعلقہ جینوں کی نقل کو روک دیا گیا تھا۔ MaCFEM85 اور MsWAK16 اظہار نے بھی B. cinerea پر روکا اثر دکھایا۔ اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ JA کو MaCFEM85 اور MsWAK16 نے چالو کیا اور B. cinerea کے خلاف پودوں کی مزاحمت میں اہم کردار ادا کیا۔

4. مواد اور طریقے

4.1 فنگل تناؤ، پودوں کا مواد، اور کلچرنگ کے طریقے

Metarhizium anisopliae isolate strains Ma 9 کو آلو-شوگر-اگر (PSA) میڈیم (200 g چھلکے ہوئے آلو کے عرق کو پانی میں اُبالا ہوا، 20 g sucrose، اور 15 g agar/L) پر تیار کیا گیا۔ تازہ اسپورنجیم پاؤڈر 10 دن کے بعد جمع کیا گیا تھا۔ Nicotiana benthamiana کے پودے ایک مصنوعی آب و ہوا کے چیمبر میں 14/10 گھنٹے روشنی/تاریک چکر (27/25 ◦C) کے ساتھ اگائے گئے تھے۔ Agrobacterium ثالثی تبدیلی کے ذریعے جین کے عارضی اظہار کے لیے، Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 کو Luria Broth (LB) میڈیم (10 g tryptone، 5 g yeast extract، اور 10 g NaCl/L) میں کلچر کیا گیا تھا۔ خمیری تناؤ گولڈ (OE بایوٹیک کمپنی لمیٹڈ، شنگھائی، چین) کو خمیر کے عرق پیپٹون ڈیکسٹروز (YPDA) میڈیم (10 جی خمیر کا عرق، 20 جی پیپٹون، 20 جی گلوکوز، اور 0.03 جی ایڈنائن ہیمسلفیٹ/L) پر کلچر کیا گیا تھا۔ ہر ایک ویکٹر اور تناؤ کے لیے، مناسب اینٹی بایوٹک استعمال کی گئیں، یعنی رفیمپین، کانامائسن، یا ایمپسلن (بالترتیب 25، 50، یا 50 µg/mL)۔ اس مطالعے میں استعمال ہونے والے تناؤ اور پلازمیڈس کو ضمنی جدول S1 میں درج کیا گیا ہے۔ میڈیکاگو سیٹیوا کے بیجوں کو 1 منٹ کے لیے 75% ایتھنول کے ساتھ جراثیم سے پاک کیا گیا، اس کے بعد 50% NaClO (5.5%) 15 منٹ کے لیے۔ بیجوں کو اچھی طرح ملایا گیا اور پھر جراثیم سے پاک پانی میں تین بار 5 منٹ تک دھویا گیا۔ بیجوں کو 24 گھنٹے سے زیادہ اندھیرے میں 4 ◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا، پھر رات بھر کمرے کے درجہ حرارت پر 1% واٹر ایگر پلیٹوں پر انکرن کیا گیا۔ انکرن کے تین دن بعد، ترقی پذیر پودوں کو 20 پودے فی ڈش کے ساتھ 9-سینٹی میٹر جراثیم سے پاک پیٹری ڈشز پر فلٹر پیپر میں منتقل کر دیا گیا۔ علاج اور کنٹرول بالترتیب 15 پکوانوں میں مختص کیے گئے تھے۔ اس کے بعد پودوں کو 10 ملی لیٹر M. anisopliae spore suspension کے ساتھ سیراب کیا گیا جس میں 107/mL تھا، اور کنٹرول کو 10 mL جراثیم سے پاک پانی سے سیراب کیا گیا۔ 0، 12، 24، 48، اور 60 گھنٹے پر، ہر بار کے وقفے کے لیے تین پیٹری ڈشوں سے بیجوں کا بے ترتیب انتخاب لیا گیا۔ نمونے مائع نائٹروجن میں منجمد کیے گئے تھے اور −80 ◦C پر محفوظ کیے گئے تھے۔

4.2 کیو آر ٹی پی سی آر اور پلاسمڈ کنسٹرکشن

مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے کل RNA M. anisopliae (hyphae) اور M. sativa (roots) سے TRIzol reagent (Invitrogen, CA, USA) سے نکالا گیا تھا۔ نتیجے میں آر این اے کے معیار اور کثرت کو نینو فوٹومیٹر® (Implen، Münich، Germany) سے ماپا گیا۔ مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے فرسٹ اسٹرینڈ سی ڈی این اے کی ترکیب (2ug RNA تک) 5× آل ان ون RT ماسٹر مکس (Applied Biological Material Inc., Vancouver, BC, Canada) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ qRT-PCR کو مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے US EVER BRIGHT ® INC. اور ABI QuantStudio 5 سسٹم کے 2×SYBR گرین qPCR ماسٹر مکس کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ ہر جین کے لیے استعمال ہونے والے پرائمر کو ضمنی جدول S2 میں درج کیا گیا ہے۔ Maury [58]، Msactin [59]، اور Nbactin [60] کو اظہار کے اعداد و شمار کو معمول پر لانے کے لیے اندرونی حوالہ جین کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ رد عمل مندرجہ ذیل شرائط کے تحت انجام دیا گیا: 95 ◦C پر 5 منٹ، اس کے بعد 15 s کے لیے 95 ◦C پر 40 سائیکل اور 40 s کے لیے 60 ◦C پر۔ ہر نمونے کے لیے تین تکنیکی نقلیں تھیں۔ متعلقہ اظہار کا حساب 2−∆∆Ct طریقہ [61] کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ شماریاتی اہمیت کا تعین SPSS v20.0 (SPSS) میں تغیرات (ANOVA) اور ڈنکن کے متعدد رینج ٹیسٹ کے یک طرفہ تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔

4.3 N. benthamiana میں پروٹین کا عارضی اظہار

MaCFEM85 کوڈنگ ترتیب (CDS) کو الٹرا فیڈیلیٹی DNA پولیمریز کے ساتھ cDNA کو بطور ٹیمپلیٹ استعمال کرتے ہوئے بڑھا دیا گیا تھا۔ سب سیلولر لوکلائزیشن اسیسز کے لیے، MaCFEM85 کے لیے CDS پر مشتمل PCR مصنوعات کو بالترتیب pYBA1132-eGFP (EcoRI اور SaI کے ساتھ ہضم کیا جاتا ہے) اور pcambia1300-cherry (EcoRI اور SacI) میں کلون کیا گیا تھا۔ تمام تعمیرات کی توثیق ترتیب کے ساتھ کی گئی تھی (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. بیجنگ، چین)۔ اس مطالعے میں استعمال ہونے والے پرائمر کو ضمنی جدول S2 میں درج کیا گیا ہے۔ N. benthamiana میں MaCFEM85-eGFP اور MaCFEM85-mCherry کے عارضی اظہار کے لیے، A. tumefaciens strain GV3101 کو ہر پلاسمڈ کے ساتھ تبدیل کیا گیا اور PCR سے تصدیق کی گئی۔ ایگرو بیکٹیریم کو راتوں رات 28 ◦C پر ہلچل کے ساتھ کلچر کیا گیا۔ سیلز کو کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ 5000 rpm سینٹرفیوگریشن کے ذریعے اکٹھا کیا گیا، جراثیم سے پاک ڈبل آست پانی سے تین بار دھویا گیا، اور 10 ایم ایم ایم جی سی ایل 2 بفر (جس میں 10 ایم ایم ایم ای ایس اور 10 ایم ایم ایسیٹوسیرنگون، پی ایچ 5.7 پر مشتمل ہے) میں دوبارہ جمع کیا گیا۔ سیل معطلی کو 0.5 کے OD600 میں ایڈجسٹ کیا گیا، پھر اسے 4- سے 5-ہفتہ پرانا N. بینتھامیانا ایک 1-mL سرنج کے ساتھ چھوڑتا ہے۔ ہر پتے کو 50 µL A. tumefaciens کے ساتھ گھسایا گیا تھا۔ ہر پودے میں تین پتیوں کا علاج کیا گیا اور ہر علاج گروپ میں تین پودے تھے۔ علاج شدہ پتیوں کو 30 گھنٹے کے بعد اکٹھا کیا گیا اور ذیلی سیلولر لوکلائزیشن کا تعین کرنے کے لئے زیس LSM980 کنفوکل مائکروسکوپ (کارل زیس، جرمنی) کے ساتھ تصور کیا گیا۔

مردوں کے مدافعتی نظام کو مضبوط بنانے کے لیے cistanche کے فوائد

4.4 فائیلوجنیٹک تجزیہ

MEGA X میں پڑوسی سے جڑنے کا طریقہ استعمال کرتے ہوئے ایک فائیلوجنیٹک درخت بنایا گیا تھا۔ 1000 بوٹسٹریپ کی نقلیں P-فاصلہ ماڈل استعمال کر رہی تھیں۔ درخت کو پیدا کرنے کے لیے استعمال ہونے والے امینو ایسڈ کی ترتیبیں متعلقہ فنگس کے NCBI ڈیٹا بیس کے خلاف BLASTP کی تلاش کے ساتھ حاصل کی گئی تھیں (مثال کے طور پر، Magnaporthe oryzae، Botrytis cinerea، Fusarium gramaminearum، Colletotrichum graminicola، Fusarium oxysporum، Neurospora crazy crausia, Labrouss, Labros, Lastium) گلاب , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana, and Paecilomyces lilacinus) MaCFEM85 کو بطور استفسار استعمال کرتے ہوئے۔

4.5 خمیر دو ہائبرڈ Assays

MaCFEM85 اور MsWAK16 کے درمیان تعامل کی تصدیق کے لیے Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc.؛ اب Takara Bio USA, Inc.) استعمال کیا گیا تھا۔ بغیر سگنل پیپٹائڈ کے MaCFEM85 کو pGBKT7 میں بیت کے طور پر متعارف کرایا گیا تھا اور MsWAK16 (MsWAK16-ED) کا ایکسٹرا سیلولر ڈومین pGADT7 میں بطور شکار داخل کیا گیا تھا۔ خمیر کے قابل سیل کی تیاری اور تبدیلیاں فروزن-EZ یسٹ ٹرانسفارمیشن II Kit™ (ZYMO Research, CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے مینوفیکچرر کی ہدایات کے بعد کی گئیں۔ بیت اور شکار کے پلاسمڈ کو خمیری تناؤ سونے میں باہم تبدیل کیا گیا تھا۔ پروٹین – پروٹین کے تعاملات کا تجزیہ SD ڈبل ڈراپ آؤٹ میڈیم (DDO, SD/-Trp-Leu) اور SD کواڈرپل ڈراپ آؤٹ میڈیم (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade) پلیٹوں پر نمو کی بنیاد پر کیا گیا۔

4.6 بی ایف سی پرکھ

BiFC تعمیرات پیدا کرنے کے لیے، pUC-SPYNE اور pUC-SPYCE ویکٹرز کو بام ایچ آئی کے ساتھ ہاضمہ کے ذریعے لکیری بنایا گیا تھا۔ MaCFEM85 اور MsWAK16 کی مکمل لمبائی والے CDSs ہر ایک کو کلون کیا گیا اور MaCFEM85-YFPN اور MsWAK16-YFPC تعمیرات حاصل کرنے کے لیے ایک ریکومبیننٹ انزائم کا استعمال کرتے ہوئے لکیری پلاسمیڈ میں داخل کیا گیا۔ MaCFEM85 اور MsWAK16 پر مشتمل پلازمیڈز کو خالی ویکٹر کے ساتھ منفی کنٹرول کے طور پر تبدیل کیا گیا تھا (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE، MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE، اور pUC-SPYNE + pUC-SPY) . جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے تمام ویکٹرز کو Agrobacterium-mediated Transformation کے ذریعے N. benthamiana میں متعارف کرایا گیا تھا۔ زیس LSM980 کنفوکل مائکروسکوپ (کارل زائس، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے پتی کے ایپیڈرمل خلیوں میں فلوروسینس سگنل دیکھے گئے۔ ویکٹر کی تعمیر کے لیے استعمال ہونے والے پرائمر کو ضمنی جدول S2 میں درج کیا گیا ہے۔

4.7 جی ایس ٹی پل ڈاون پرکھ

جی ایس ٹی پل-ڈاؤن اسسیس کے لیے، MsWAK16-ED کو pGEX-6P-2 ویکٹر میں داخل کیا گیا تھا اور MaCFEM85 کو پی ای ٹی-21b میں داخل کیا گیا تھا۔ پیوریفائیڈ فیوژن پروٹین (GST- MsWAK16- ED) اور pGEX-6P-2 نو لوڈ پروٹین (GST) کو بیت پروٹین اور پیوریفائیڈ پی ای ٹی کے طور پر استعمال کیا گیا تھا-21 b-MaCFEM85 فیوژن پروٹین (His-MaCFEM85) بطور شکار استعمال ہوتا تھا۔ مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے جی ایس ٹی پل ڈاون اسیس میگ بیڈس جی ایس ٹی فیوژن پروٹین پیوریفیکیشن سسٹم (سنگون بائیوٹیک، شنگھائی، چین) کے ساتھ انجام دیا گیا۔ مختصراً، الکحل محافظ کو چھوڑنے کے لیے میگ بیڈز کو 1× فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS, pH 7.4) سے پانچ بار دھویا گیا اور پھر 10 mL GST یا GST-MsWAK16-ED شامل کیا گیا۔ موتیوں کو 30 منٹ تک کمرے کے درجہ حرارت پر الٹا ملایا گیا تھا۔ سپرنٹنٹ کو ہٹانے کے بعد، میگ موتیوں کو 1× PBS کے ساتھ پانچ بار دھویا گیا۔ His-MaCFEM85 کو پہلے سے GST کے ساتھ پابند میگ بیڈس میں شامل کیا گیا تھا، اور مکسچر کو راتوں رات 4 ◦C پر گردش کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد موتیوں کو 1× PBS کے ساتھ پانچ بار دھویا گیا تاکہ ان باؤنڈ پروٹین کو ہٹایا جا سکے۔ اس کے بعد، موتیوں پر متحرک پروٹین کو SDS-PAGE کے ذریعے الگ کیا گیا، ایک نائٹروسیلوز جھلی (100 V، 1 h) میں منتقل کیا گیا، اور مغربی دھبے کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ جھلیوں کو PBS + Tween (PBST) کے ساتھ 10 منٹ کے لئے تین بار دھویا گیا۔ 5% سکمڈ دودھ کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر جھلیوں کو 2 گھنٹے کے لیے بلاک کر دیا گیا، پھر پروٹین فائنڈ اینٹی ہز ماؤس مونوکلونل اینٹی باڈی (ٹرانسجن بائیوٹیک، بیجنگ، چائنا) (1:3000 پتلا) یا پروٹین فائنڈ اینٹی جی ایس ٹی ماؤس مونوکلونل اینٹی باڈی کے ساتھ 2 گھنٹے تک بلاک کر دیا گیا۔ h 4 ◦C پر۔ اس کے بعد جھلیوں کو ProteinFind بکری اینٹی خرگوش IgG(H+L) (HRP) اینٹی باڈی (TransGen Biotech، بیجنگ، چین) (1:5000 پتلا) میں کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ تک ڈبو دیا گیا۔ مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے EasySee® ویسٹرن بلاٹ کٹ (TransGen Biotech، بیجنگ، چین) کے ساتھ جھلیوں کا تصور کیا گیا۔

4.8 MaCFEM85 میں کلیدی سائٹ کی شناخت

MsWAK16 کے ساتھ MaCFEM85 کے تعامل کے لیے درکار سائز کا تعین کرنے کے لیے، PCR ایمپلیفیکیشن کو MaCFEM85 کی متعدد کٹی ہوئی شکلیں بنانے کے لیے انجام دیا گیا۔ CFEM ڈومین (MaCFEM85-CFEM؛ aa باقیات 19–86) اور C ٹرمینل بغیر CFEM ڈومین کے (MaCFEM85-C, aa باقیات 87-170) کو ویکٹر میں داخل کیا گیا تھا۔ pGBKT7 بطور بیت پروٹین (ضمنی جدول S1)۔ 26، 30، 43، 52، اور 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8530, ∆CFEM8530, ∆CFEM8526, ∆CFEM8526/64/69/85 پوزیشنوں پر سسٹین کو الانائن میں تبدیل کرنے کے لیے پولی پیپٹائڈ ترکیب کا استعمال کرتے ہوئے مزید پانچ قسمیں بنائی گئیں۔ CFEM8552، اور ∆CFEM858 سبھی، بالترتیب)۔ یہ متغیرات MsWAK16-ED کے ساتھ Y2H تجربات کرنے کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ تبدیل شدہ خمیر کے خلیوں کو مصنوعی ڈراپ آؤٹ SD/- Trp-Leu پلیٹوں اور SD/-Trp-Leu-His-Ade پلیٹوں پر نمو کے لیے جانچا گیا جس میں X- -Galactosidase (X- -Gal) شامل ہیں۔

4.9 پلانٹ ریزسٹنس اسیسز

Myzus persicae کو Henan Quanying Biological Co., Ltd. سے حاصل کیا گیا تھا۔ بائیوسیز کے آغاز سے ایک ہفتہ قبل، 150 بالغ افڈس تین N. benthamiana پودوں پر (50 aphids فی پودے) پر رکھے گئے تھے۔ 72 گھنٹے کے بعد، تمام بالغوں کو ایک نرم آرٹسٹ کے برش سے ہٹا دیا گیا، اور اپسروں کو افیڈ پرفارمنس اسسیس کے لیے N. benthamiana منتقل کرنے سے پہلے مزید چار دن کے لیے کھانا کھلانے کی اجازت دی گئی۔

4.10 افڈ پرفارمنس اسیسز

نکوٹیانا بینتھامیانا ڈومین۔ (Solanales: Solanaceae) کا استعمال M. persicae کی کارکردگی، B. cinerea کے خلاف پودوں کی بیماری کی مزاحمت، اور ہارمون سے متعلقہ جینز کے اظہار کا جائزہ لینے کے لیے کیا گیا تھا۔ PYBA-eGFP، pYBA-MaCFEM85، pYBA-MsWAK16، یا pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 کو لے جانے والے ایگروبیکٹیریم کو LB میں 28 ◦C پر 36 گھنٹے کے لیے مناسب اینٹی بائیوٹکس کے ساتھ بڑھایا گیا تھا۔ خلیوں کو تین بار دھویا گیا، پھر انفلٹریشن بفر (10 mM MgCl2، 10 mM MES، اور 100 µM acetosyringone، pH 5.6) میں دوبارہ 0.6 کے OD600 پر معطل کر دیا گیا۔ مشترکہ انفیکشن کے لیے، MaCFEM85 اور MsWAK16 لے جانے والے بیکٹیریا کو 1.2 کے OD600 میں ایڈجسٹ کیا گیا، اور پھر مساوی مقدار میں ملایا گیا۔ مکمل طور پر پھیلے ہوئے پتوں کو 1-mL بغیر سوئی والی سرنجوں کا استعمال کرتے ہوئے بیکٹیریا کے ساتھ گھسایا گیا۔ ہر پودے پر تین پتے گھس گئے تھے اور ہر ایک ٹریٹمنٹ کو تین پودوں پر کل 12 پودوں کے لیے لاگو کیا گیا تھا۔

افیڈ پرفارمنس اسسیس کے لیے، ایگروبیکٹیریم لگانے کے 12 گھنٹے بعد 20 بالغ افڈز ہر پتے کے دراندازی والے حصے پر لگائے گئے۔ افڈس کو 5 ملی میٹر قطر کے کلپ پنجروں کا استعمال کرتے ہوئے قید کیا گیا تھا۔ ہر علاج کو پانچ بار دہرایا گیا۔ بالغ افیڈ کی شرح اموات اور نئی پیدا ہونے والی اپسرا کی تعداد تین دن تک روزانہ ریکارڈ کی گئی۔ B. Cinerea کو PDAY پر پانچ دنوں تک کلچر کیا گیا۔ ایگروبیکٹیریم کی دراندازی کے 12 گھنٹے بعد، نئی کاشت شدہ B. سینیریا کو ایک 5-mm فنگس کیک میں ٹھونس دیا گیا، اور مائیسیلیم کی افزائش کی سطح کو پتے کی سطح پر دراندازی کے علاقے سے جوڑ دیا گیا۔ بیماری کی نشوونما کو آسان بنانے کے لیے، پودوں کو ٹرے میں پلاسٹک کی فلم سے ڈھانپ کر مرطوب رکھا گیا تاکہ بیماری کے بڑھنے میں آسانی ہو سکے۔ 48 گھنٹے کے بعد، زخموں کے سائز کی پیمائش کرکے ٹیکے لگائے گئے پتوں میں بیماری کی پیشرفت کا اندازہ لگایا گیا۔ متعلقہ جینوں کے متعلقہ اظہار کی مقدار کے لیے، دراندازی کے 12 گھنٹے بعد ہر پودے سے تین دراندازی شدہ پتے اکٹھے کیے گئے، پھر مائع نائٹروجن میں منجمد کر کے −80 ڈگری پر محفوظ کر لیے گئے۔ کل آر این اے نکالنے، سی ڈی این اے کی ترکیب، اور کیو آر ٹی پی سی آر کئے گئے جیسا کہ سیکشن 3.2 میں بیان کیا گیا ہے۔ سیلیسیلک ایسڈ (SA)، جیسمونک ایسڈ (JA)، اور flavonoid کی سطح 15 ان فلٹرڈ N. benthamiana پتوں میں ہر علاج میں ناپی گئی۔ پتیوں کو جمع کیا گیا، مائع نائٹروجن میں منجمد کیا گیا، پھر −80 ڈگری پر ذخیرہ کیا گیا۔ پلانٹ کے ہارمونز کی مقدار پلانٹ سیلیسیکلک ایسڈ اور پلانٹ جیسمونک ایسڈ ELISA Kits (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی، اور flavonoids کی مقدار مائیکرو پلانٹ Flavonoids Assay Kit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) کے بعد کی گئی تھی۔ کارخانہ دار کی ہدایات.

4.11۔ شماریاتی تجزیہ

ڈیٹا کا تجزیہ SPSS v20 میں کیا گیا۔{7}}۔ MaCFEM85 اور MsWAK16 کے اظہار کی سطحوں میں نمایاں فرق کا تعین طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کے ذریعے کیا گیا تھا۔ SA، JA، اور flavonoid کی سطحوں میں نمایاں فرق p <0.05 کی حد کے ساتھ یک طرفہ ANOVA اور Duncan کے متعدد رینج ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے طے کیے گئے تھے۔

5. نتائج

اس مطالعہ میں، ہم نے M. anisopliae میں ایک ناول سیکریٹڈ پروٹین، MaCFEM85 کی نشاندہی کی اور اس کی خصوصیت کی۔ یہ ایک محفوظ اثر کرنے والا پایا گیا جو MsWAK16 کے ساتھ تعامل کر سکتا ہے اور N. benthamiana دفاعی ردعمل کو چالو کر سکتا ہے۔ ہم نے دکھایا کہ CFEM ڈومین اور MaCFEM85 میں پوزیشن 52 پر سسٹین کی باقیات تعامل کے لئے اہم تھے۔ یہ تعامل JA سے متعلق مدافعتی ردعمل اور پودوں میں بیماریوں سے بچنے والے اور کیڑوں سے بچنے والے میکانزم کو چالو کر سکتا ہے۔

حوالہ جات

1. Paulucci, NS; انت، جی جی؛ Gallarato, LA; ویکاریو، جے سی؛ Cesari, AB; ریگویرا، وائی بی؛ کلمورے، سی۔ بیوینو، ایم اے؛ گارسیا، ایم بی؛ ڈارڈینیلی، ایم ایس پلانٹ – مائکروب پارٹنرشپس: نمو اور پودوں کی صحت کے لیے مضمرات۔ پلانٹ مائکروب سمبیوسس میں: بنیادی باتیں اور پیشرفت؛ اسپرنگر: برلن/ہائیڈلبرگ، جرمنی، 2013؛ صفحہ 105-117۔ [کراس ریف]

2. شینک، پی ایم؛ کاروالہائس، ایل سی؛ کازان، K. بے ترتیب پلانٹ – مائکروب کے تعاملات: کیا کثیر انواع کی نقلیں مدد کر سکتی ہیں؟ ٹرینڈز بائیو ٹیکنالوجی۔ 2012، 30، 177–184۔ [کراس ریف]

3. ساسے، جے؛ Martinoia, E.; نارتھن، ٹی۔ اپنے دوستوں کو کھانا کھلانا: کیا پلانٹ کے اخراج جڑ مائکروبیوم کو شکل دیتے ہیں؟ رجحانات پلانٹ سائنس. 2018، 23، 25–41۔ [کراس ریف]

4. Lugtenberg, B.; کاملووا، ایف۔ پودوں کی نشوونما کو فروغ دینے والا ریزوبیکٹیریا۔ انو Rev. Microbiol. 2009، 63، 541–556۔ [کراس ریف]

5. شورش، ایم. حرمین، جی ای؛ مستوری، F. فنگل بائیو کنٹرول ایجنٹوں کے لیے نظامی مزاحمت اور پودوں کے ردعمل۔ انو Rev. Phytopathol. 2010، 48، 21–43۔ [کراس ریف]

6. وین ڈی مورٹیل، جے ای؛ ڈی ووس، آر سی؛ ڈیکرز، ای. Pineda, A.; گیلوڈ، ایل۔ Bouwmeester, KJ; وین لون، جے؛ ڈک، ایم؛ رائج میکرز، جے ایم میٹابولک اور ٹرانسکرپٹومک تبدیلیاں جو ریزوبیکٹیریم سیوڈموناس فلوروسینس ایس ایس 101 کے ذریعہ عربیڈوپسس میں شامل ہیں۔ پلانٹ فزیول۔ 2012، 160، 2173–2188۔ [کراس ریف]

7. لارین، اے. برٹن، ایف. شیفر، پی. جڑ مائکرو بایوم کی تشکیل میں پلانٹ روٹ مائکروب مواصلات۔ پلانٹ مول. بائول 2016، 90، 575–587۔ [کراس ریف]

8. ساسن، آر کے؛ Bidochka, MJ کیڑے روگ پیدا کرنے والی فنگس Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) بھی ایک اینڈوفائٹ ہے جو پودوں کی جڑوں کی نشوونما کو متحرک کرتی ہے۔ ایم۔ جے بوٹ 2012، 99، 101–107۔ [کراس ریف]

9. ساسن، آر کے؛ Bidochka، MJ Endophytic کیڑے پیتھوجینک فنگس Metarhizium robertsii کی بین پلانٹ روگزنق Fusarium solanif کے خلاف دشمنی. ایس پی فیزولی کر سکتے ہیں۔ J. پلانٹ پاتھول۔ 2013، 35، 288–293۔ [کراس ریف]

10. احمد، I.؛ جمینیز-گاسکو، ایم ڈی ایم؛ لوتھ، ڈی ایس؛ شکیل، ایس این؛ باربرچیک، ME Endophytic Metarhizium robertsii مکئی کی افزائش کو فروغ دیتا ہے، کیڑوں کی افزائش کو روکتا ہے، اور پودوں کے دفاعی جین کے اظہار کو تبدیل کرتا ہے۔ بائول کنٹرول 2020, 144, 104167۔ [کراس ریف]

11. چیرین، ٹی. پیٹچارٹ، V. ہانگ کانگ کے پھلوں میں دفاعی ردعمل کی شمولیت (Aglaia dookkoo Griff.) Metarhizium guizhouense کے ذریعے پھلوں کے سڑنے والے فنگی کے خلاف۔ بائول کنٹرول 2017، 111، 40–44۔ [کراس ریف]

12. ہاؤ، K.؛ وانگ، ایف. نونگ، ایکس۔ McNeill, MR; لیو، ایس. وانگ، جی؛ کاو، جی؛ Zhang، Z. ٹرانسکرپٹوم تجزیہ کے ذریعہ فائدہ مند اور روگجنک فنگس کی موجودگی پر مونگ پھلی کے آراچس ہائپوگیا جڑوں کا ردعمل۔ سائنس Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]

13. پٹیل، زیڈ ایم؛ مہاپاترا، آر. جمپالا، SSM باب 11—پودوں کے دفاعی طریقہ کار میں فنگل ایلیسیٹرز کا کردار۔ زراعت میں پودوں کے فائدہ مند جرثوموں کے مالیکیولر پہلوؤں میں؛ شرما، وی، سلوان، آر، العنی، ایل، ایڈز؛ اکیڈمک پریس: کیمبرج، ایم اے، یو ایس اے، 2020؛ صفحہ 143-158۔ [کراس ریف]

14. ڈونگ، ایکس۔ سا، جے اے ایتھیلین، اور پودوں میں بیماری کے خلاف مزاحمت۔ کرر رائے۔ پلانٹ بائیول۔ 1998، 1، 316–323۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

15. تھوما، بی پی؛ Eggermont, K.; Penninckx، IA؛ موچ منی، بی۔ ووگلسنگ، آر. Cammue، BP؛ بروکرٹ، ڈبلیو ایف عربیڈوپسس میں جیسمونیٹ پر منحصر اور سیلیسیلیٹ پر منحصر دفاعی ردعمل کے راستے الگ الگ مائکروبیل پیتھوجینز کے خلاف مزاحمت کے لیے ضروری ہیں۔ پروک ناٹل اکاد۔ سائنس USA 1998, 95, 15107–15111۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

16. پنت، ایس آر؛ Irigoyen, S.; لیو، جے؛ بیدرے، آر۔ کرسٹینسن، SA؛ Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; منڈاڈی، کے کے بریچیپوڈیم فینی لیلانائن امونیا لائز (پی اے ایل) پینکم موزیک وائرس اور اس کے سیٹلائٹس کے خلاف اینٹی وائرل دفاع کو فروغ دیتا ہے۔ mBio 2021، 12، e03518-20۔ [کراس ریف]

17. لیو، آر. Xu, S.; لی، جے؛ Hu, Y.; Astragalus membranaceus var سے PAL جین کا لن، زیڈ ایکسپریشن پروفائل۔ منگولیکس اور فلیوونائڈ بائیو سنتھیسس میں بہاؤ میں اس کا اہم کردار۔ پلانٹ سیل ریپ. 2006، 25، 705–710۔ [کراس ریف]

18. ڈی گیٹر، این. غلامی، اے۔ Goormachtig, S.; Goossens, A. جیسمونیٹ سے پیدا شدہ پلانٹ کے ثانوی میٹابولزم میں نقلی مشینری۔ رجحانات پلانٹ سائنس. 2012، 17، 349–359۔ [کراس ریف]

19. مرجلی، ن. لنڈن، ٹیکسس کسپیڈاٹا کی معطلی ثقافتوں پر جے سی گیس فیز کمپوزیشن کے اثرات۔ بائیو ٹیکنالوجی بائیوانگ 1995، 48، 123–132۔ [کراس ریف]

20. لی، ST؛ ژانگ، پی. ژانگ، ایم؛ فو، CH؛ زاؤ، سی ایف؛ ڈونگ، وائی ایس؛ Guo, AY; یو، میتھائل جیسمونیٹ کے جواب میں ٹیکسس چنینسیس سیلز کا ایل جے ٹرانسکرپشن پروفائل۔ بی ایم سی جینوم۔ 2012، 13، 295۔ [کراس ریف]

21. تغزیمانہ، ایف. Ncube, EN; Steenkamp، PA؛ ڈوبیری، IA میٹابولومکس سے ماخوذ بصیرتیں میتھائل جیسمونیٹ کے ذریعہ سینٹیلا ایشیاٹیکا خلیوں میں ٹیرپینائڈ ترکیب کی ہیرا پھیری میں۔ پلانٹ بائیو ٹیکنالوجی۔ Rep. 2015, 9, 125–136. [کراس ریف]

22. لو، ایم؛ وونگ، ایچ. Teng, W. Panax ginseng کے سیل کلچر میں saponin کی پیداوار پر ایلیٹیشن کے اثرات۔ پلانٹ سیل ریپ. 2001، 20، 674–677۔ [کراس ریف]

23. منڈل، ایس. کار، آئی۔ مکھرجی، اے کے؛ آچاریہ، P. ایلیسٹر کی حوصلہ افزائی سے سولانم لائکوپرسیکم میں رالسٹونیا سولاناسیرم کے خلاف دفاعی ردعمل۔ سائنس ورلڈ جے 2013، 25، 561056۔ [کراس ریف]

24. لی، ایل. وانگ، ایس. یانگ، ایکس؛ فرانسس، ایف. Qiu, D. پروٹین ایلیسٹر PeaT1 نے گندم میں افیڈ (Sitobion avenae) کے خلاف مزاحمت کو بڑھایا۔ پیسٹ میناگ۔ سائنس 2020، 76، 236–243۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

25. بوجالوسکی، ڈبلیو۔ ہیکسامریک ڈی این اے بی ہیلیکیس کے جسمانی کردار کو بڑھانا۔ ٹرینڈز بائیو کیم۔ سائنس 2003، 28، 116-118۔ [کراس ریف]

26. وکنین، وائی. شادکچن، وائی۔ Levdansky, E.; موروزوف، ایم. رومانو، جے؛ Osherov, N. تین Aspergillus fumigatus CFEM-ڈومین GPI-anchored پروٹین (CfmA-C) سیل کی دیوار کے استحکام کو متاثر کرتے ہیں لیکن فنگل وائرس میں کوئی کردار ادا نہیں کرتے۔ فنگل جینیٹ بائول 2014، 63، 55–64۔ [کراس ریف]

27. زاؤ، ایس. شانگ، ایکس؛ Bi, W. یو، ایکس؛ لیو، ڈی. کانگ، زیڈ؛ وانگ، ایکس؛ Wang, X. گندم کے پتوں کے زنگ والے فنگس Puccinia triticina سے محفوظ شکلوں کے ساتھ اثر کرنے والے امیدواروں کی جینوم وسیع شناخت۔ سامنے والا۔ مائکروبیول 2020، 11، 1188۔ [کراس ریف]

28. گونگ، اے. جِنگ، زیڈ۔ ژانگ، K.؛ تان، ق. وانگ، جی؛ لیو، ڈبلیو. بائیو انفارمیٹک تجزیہ اور مکئی کے اینتھراکنوز فنگس کولیٹوٹریچم گرامینیکولا میں سی ایف ای ایم پروٹینز کی فنکشنل خصوصیات۔ J. انٹیگر زرعی۔ 2020، 19، 541–550۔ [کراس ریف]

29. مارٹن، ایف. Aerts, A.; احرین، ڈی۔ برون، اے. Danchin, EG; Duchaussoy, F.; گبن، جے؛ کوہلر، اے. Lindquist, E.; پریڈا، وی. ET رحمہ اللہ تعالی. Laccaria bicolor کا جینوم mycorrhizal symbiosis کے بارے میں بصیرت فراہم کرتا ہے۔ فطرت 2008، 452، 88-92۔ [کراس ریف]

30. سٹیفن، وی. لارا، RJ Entomopathogenic fungi as endophytes: Plant-endophyte-herbivore تعاملات اور حیاتیاتی کنٹرول میں استعمال کے امکانات۔ کرر سائنس 2015، 109، 46–54۔

31. Cai، N.؛ لیو، آر. یان، ڈی. ژانگ، این. Zhu, K.; ژانگ، ڈی. نونگ، ایکس۔ ٹو، ایکس۔ ژانگ، Z. وانگ، جی بائیو انفارمیٹکس کا تجزیہ اور میٹارہیزیم انیسوپلیا کے سی ایف ای ایم پروٹین کی فنکشنل خصوصیات۔ J. فنگی 2022، 8، 661۔ [کراس ریف]

32. سٹیفنز، سی.؛ Hammond-Kosack, KE; اور کنیوکا، K. WAKsing پودوں کی قوت مدافعت، کمزور ہوتی بیماریاں۔ J. Exp. بوٹ 2022، 73، 22–37۔ [کراس ریف]

33. ژانگ، زیڈ این؛ وو، کیو وائی؛ ژانگ، جی زیڈ؛ Zhu, YY; مرفی، آر ڈبلیو؛ لیو، زیڈ؛ Zou، CG نظامی تجزیہ فنگس میں CFEM ڈومین کی انفرادیت اور اصلیت کو ظاہر کرتا ہے۔ سائنس Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]

34. فینگ، اے. گاو، ایچ. ژانگ، این. زینگ، ایکس؛ Qiu, S.; لی، وائی۔ چاؤ، ایس. Cui، F.؛ Sun, W. ایک نیا اثر کرنے والا جین SCRE2 چاول میں Ustilaginoidea virens کے مکمل وائرس میں حصہ ڈالتا ہے۔ سامنے والا۔ مائکروبیول 2019، 10، 845۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

35. زو، ڈبلیو. وی، ڈبلیو؛ وو، وائی؛ Zhou, Y.; پینگ، ایف۔ Zhang, S.; چن، پی. Xu, X. BcCFEM1، ایک CFEM ڈومین پر مشتمل پروٹین جس میں پوٹیٹیو GPI- لنگر والی سائٹ ہے، بوٹریٹیس سینیریا میں روگجنکیت، کنڈیئل پروڈکشن، اور تناؤ برداشت میں ملوث ہے۔ سامنے والا۔ مائکروبیول 2017، 8، 1807۔ [کراس ریف]

36. سو، ایکس۔ لی، جی؛ لی، ایل. Su, Z.; چن، سی. پیزیزومائکوٹینا سے تعلق رکھنے والی فنگس میں پوٹیٹو Pth11-متعلقہ G پروٹین کے ساتھ مل کر ریسیپٹرز کا جینوم وسیع تقابلی تجزیہ۔ بی ایم سی مائکروبیول۔ 2017، 17، 166۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

37. پینگ، وائی جے؛ ہو، جے؛ ژانگ، ایچ. لی، جے ایچ؛ Lin, HY; ڈنگ، جے ایل؛ فینگ، ایم جی؛ ینگ، ایس ایچ سی ایف ای ایم ڈومین کی منظم شراکتیں جس میں آئرن کے حصول کے لیے پروٹین موجود ہیں، فلیمینٹس پیتھوجینک فنگس بیوویریا باسیانا کے بین النسل تعامل کے لیے ضروری ہیں۔ ماحولیات۔ مائکروبیول 2022، 24، 3693–3704۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

38. رائے، یو۔ Cornitzer, D. فنگس میں ہیم آئرن کا حصول۔ کرر رائے۔ مائکروبیول 2019، 52، 77–83۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

39. Okamoto-Shibayama, K.; کیکوچی، وائی۔ کوکوبو، ای. ساتو، وائی۔ Ishihara, K. Csa2، Rbt5 پروٹین فیملی کا ایک رکن، Candida albicans hyphal نمو کے دوران انسانی ہیموگلوبن سے لوہے کے استعمال میں شامل ہے۔ FEMS خمیر ریس. 2014، 14، 674–677۔ [کراس ریف]

40. پیریز، اے. پیڈروس، بی. مرگوئی، اے. Casanova، M.؛ لوپیز ریبوٹ، جے ایل؛ مارٹینز، جے پی بائیو فلم کی تشکیل کینڈیڈا البیکنز اتپریورتیوں کے ذریعے جینز کوڈنگ کرنے والے فنگل پروٹینز جو آٹھ سسٹین پر مشتمل CFEM ڈومین کی نمائش کرتے ہیں۔ FEMS خمیر ریس. 2006، 6، 1074–1084۔ [کراس ریف]

41. ہاگ، پی جے ڈسلفائیڈ بانڈز پروٹین فنکشن کے لیے سوئچ کے طور پر۔ ٹرینڈز بائیو کیم۔ سائنس 2003، 28، 210-214۔ [کراس ریف]

42. وین ڈین برگ، HA؛ ویسٹرنک، این۔ Francoijs, KJ; روتھ، آر. ووسٹیننک، ای. Boeren, S.; ڈی وٹ، پی جے؛ جوسٹن، ایم ایچ؛ Vervoort, J. ٹماٹر پیتھوجین Cladosporium fulvum کے AVR4 کے قدرتی ڈسلفائیڈ بانڈ میں خلل پیدا کرنے والے اتپریورتی پروٹولیسس کے لیے حساس ہوتے ہیں، Cf-4- ثالثی مزاحمت کو روکتے ہیں، لیکن اپنی چٹن بائنڈنگ کی صلاحیت کو برقرار رکھتے ہیں۔ J. Biol کیم 2003، 278، 27340–27346۔ [کراس ریف] 43. Hu, K.; کاو، جے؛ ژانگ، جے؛ زیا، ایف۔ چابی.؛ ژانگ، ایچ. Xie, W. لیو، ایچ. Cui, Y.; Cao, Y.; ET رحمہ اللہ تعالی. سیل وال کمک کے ذریعے بیماری کے خلاف مزاحمتی جین کے ذریعہ متعدد زرعی خصلتوں کی بہتری۔ نیٹ پودے 2017، 3، 17009۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

44. سیتوح، ایچ. Fujisawa, S.; مٹسوکا، سی۔ Ito, A.; ہیرابوچی، اے. Ikeda, K.; ایریڈا، ایچ. یوشینو، کے؛ یوشیدا، کے. ماتسمورا، ایچ. ET رحمہ اللہ تعالی. Magnaporthe oryzae میں بڑے پیمانے پر جین میں خلل MC69 کی نشاندہی کرتا ہے، ایک خفیہ پروٹین جو مونوکوٹ اور ڈیکوٹ فنگل پیتھوجینز کے انفیکشن کے لیے ضروری ہے۔ پی ایل او ایس پیتھوگ۔ 2012، 8، e1002711۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

45. کلکرنی، آر ڈی؛ کیلکر، ایچ ایس؛ ڈین، آر۔ ایک آٹھ سسٹین پر مشتمل سی ایف ای ایم ڈومین جو فنگل میمبرین پروٹین کے گروپ سے منفرد ہے۔ ٹرینڈز بائیو کیم۔ سائنس 2013، 28، 118–121۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

46. ​​پینگ، جے؛ وو، ایل۔ ژانگ، ڈبلیو. ژانگ، Q. زنگ، Q. وانگ، ایکس؛ لی، ایکس۔ یان، J. Lasiodiplodia theobromae میں فنگل ایکسٹرا سیلولر جھلی پروٹین میں کامن کی سیسٹیمیٹک شناخت اور فنکشنل خصوصیات۔ سامنے والا۔ پلانٹ سائنس 2021، 12، 804696۔ [کراس ریف]

47. باری، آر. جونز، JD پودوں کے دفاعی ردعمل میں پودوں کے ہارمونز کا کردار۔ پلانٹ مول. بائول 2009، 69، 473–488۔ [کراس ریف]

48. ورما، وی. رویندرن، پی. کمار، پی پی پلانٹ ہارمون ثالثی تناؤ کے ردعمل کا ضابطہ۔ بی ایم سی پلانٹ بائیول۔ 2016، 16، 86۔ [کراس ریف]

49. جاوید، کے. بریویباسیلس لیٹروسپورس کا کیو، ڈی پروٹین ایلیسٹر PeBL1 ٹماٹر میں Myzus persicae کے خلاف مزاحمت کو بڑھاتا ہے۔ پیتھوجینز 2020، 9، 57۔ [کراس ریف]

50. باسط، A.؛ حنان، اے. نذیر، ٹی. مجید، ایم زیڈ؛ Qiu, D. عام پھلیاں (Phaseolus vulgaris L.) میں سبز آڑو aphid (Myzus persicae) کے خلاف مزاحمت کو شامل کرنے میں ملوث Botrytis cinerea سے نکالے گئے elicitor PeBC1 کی مالیکیولر اور فعال خصوصیات۔ کیڑے 2019، 10، 35۔ [کراس ریف]

51. نذیر، ٹی. حنان، اے. باسط، اے. مجید، ایم زیڈ؛ انور، ٹی. نواز، آئی۔ کیو، ڈی. براسیکا ریپا ایس ایس پی میں بیوویریا باسیانا اے آر ایس ای ایف 2860 اسٹرین کے خلاف مائیزس پرسیکا (ہوموپٹیرا: ایفیڈیڈی) سے ماخوذ ایک ابھی تک غیر مخصوص پروٹین ایلیسٹر PeBb1 کا کردار۔ pekinensis پیتھوجینز 2020, 9, 111۔ [کراس ریف]

52. Spoel, SH; کورنیف، اے. Claessens, SM; Korzelius, JP; وین پیلٹ، جے اے؛ مولر، ایم جے؛ بوچالا، اے جے؛ میٹروکس، جے پی؛ براؤن، آر. کازان، K.؛ ET رحمہ اللہ تعالی. NPR1 سائٹوسول میں ایک نئے فنکشن کے ذریعے سیلیسیلیٹ- اور جیسمونیٹ پر منحصر دفاعی راستوں کے درمیان کراس ٹاک کو ماڈیول کرتا ہے۔ پلانٹ سیل 2003، 15، 760–770۔ [کراس ریف]

53. Xin, XF; وہ، SY Pseudomonas syringae pv. ٹماٹر DC3000: پودوں میں بیماری کی حساسیت اور ہارمون سگنلنگ کی جانچ کے لیے ایک ماڈل پیتھوجین۔ انو Rev. Phytopathol. 2013، 51، 473–498۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

54. ژانگ، ایکس۔ وانگ، سی. Zhang, Y.; سورج، Y. Mou, Z. عربیڈوپسس ثالثی کمپلیکس subunit16 مثبت طور پر سیلیسیلیٹ میڈیٹڈ سیسٹیمیٹک حاصل شدہ مزاحمت اور جیسمونیٹ/ایتھیلین سے متاثرہ دفاعی راستوں کو منظم کرتا ہے۔ پلانٹ سیل 2012، 24، 4294–4309۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

55. Doares, SH; نارویز-واسکویز، جے؛ کونکونی، اے. ریان، سی اے سیلیسیلک ایسڈ ٹماٹر کے پتوں میں پروٹینیز انحیبیٹرز کی ترکیب کو روکتا ہے جو سسٹمین اور جیسمونک ایسڈ کے ذریعے پیدا ہوتا ہے۔ پلانٹ فزیول۔ 1995، 108، 1741–1746۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

56. پیٹرس، سی ایم؛ Leon-Reyes, A.; وان ڈیر اینٹ، ایس؛ وین ویس، پودوں کی قوت مدافعت میں چھوٹے مالیکیول ہارمونز کے ذریعے ایس سی نیٹ ورکنگ۔ نیٹ کیم بائول 2009، 5، 308–316۔ [کراس ریف]

57. Penninckx، IA؛ تھوما، بی پی؛ بوچالا، اے. میٹروکس، جے پی؛ Broekaert، WF عربیڈوپسس میں پلانٹ ڈیفینسن جین کی شمولیت کے لیے جیسمونیٹ اور ایتھیلین رسپانس پاتھ ویز کی ایکٹیویشن کی ضرورت ہے۔ پلانٹ سیل 1998، 10، 2103–2113۔ [کراس ریف]

58. فینگ، ڈبلیو. Bidochka، MJ مقداری ریئل ٹائم RT-PCR کا استعمال کرتے ہوئے Metarhizium anisopliae میں انکرن، conidiogenesis اور pathogenesis میں شامل جینوں کا اظہار۔ مائکول۔ Res. 2006، 110، 1165–1171۔ [کراس ریف]

59. Guerriero, G.; لیگے، ایس. ہاسمین، JF الفافہ سیلولوز سنتھیس جین ایکسپریشن انڈر ابیوٹک سٹریس: RT-qPCR نارملائزیشن کے لیے ایک ہچ ہائیکر گائیڈ۔ PLOS ONE 2014, 9, e103808۔ [کراس ریف]

60. یانگ، وائی. Zhang, Y.; لی، بی؛ یانگ، ایکس؛ ڈونگ، Y. Qiu, D. A Verticillium dahliae pectate lyase پودوں کے مدافعتی ردعمل کو ابھارتا ہے اور وائرلیس میں حصہ ڈالتا ہے۔ سامنے والا۔ پلانٹ سائنس 2018، 9، 1271۔ [کراس ریف]

61. لیوک، کے جے؛ شمٹجن، ریئل ٹائم مقداری PCR اور 2(-Delta Delta C(T)) طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے متعلقہ جین کے اظہار کے اعداد و شمار کا TD تجزیہ۔ طریقے 2001، 25، 402–408۔ [کراس ریف]