HepaRG سیلز میں MiRNA-mRNA پروفائلز پر Naringenin کے اثرات

مزید تفصیلات کے لیے رابطہ کریں:tina.xiang@wecistanche.com

خلاصہ: Naringenin، ایک قدرتیflavonoidلیموں کے پھلوں میں بڑے پیمانے پر پائے جاتے ہیں، یہ بتایا گیا ہے کہ قدرتی غذائی ضمیمہ کے طور پر اینٹی آکسیڈینٹ، اینٹی سوزش، اور ہیپاٹو پروٹیکٹو خصوصیات ہیں۔ تاہم، انسانی جگر میں نارنجینن کا ریگولیٹری طریقہ کار واضح نہیں ہے۔ موجودہ مطالعے میں، میسنجر آر این اے سیکوینسنگ (mRNA-seq)، مائیکرو آر این اے سیکوینسنگ (miRNA-seq)، اور ریئل ٹائم qPCR کو کنٹرول اور نارنجینن ٹریٹڈ HepaRG سیلز کے درمیان اظہار کے فرق کو فرق کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ہم نے 1037 امتیازی طور پر ظاہر کیے گئے mRNAs اور 234 miRNAs حاصل کیے ہیں۔ سلیکو میں ہدف کی پیشن گوئی اور انضمام کے تجزیے کے مطابق، ہمیں 20 ممکنہ miRNA-mRNA جوڑے شامل ہوئےجگرمیٹابولزم یہ مطالعہ ہیپا آر جی سیلز میں mRNA-seq اور miRNA-seq کے مربوط تجزیہ کے ذریعے naringenin کے ریگولیشن میں miRNA-mRNA تعاملات کا ایک نقطہ نظر فراہم کرنے والا پہلا مطالعہ ہے، جو کہ مزید ایک فوڈ ایڈیٹیو کے طور پر naringenin کی غذائیت کی قدر کو نمایاں کرتا ہے۔

مطلوبہ الفاظ: naringenin mRNA-seq؛ miRNA-seq؛ ہیپا آر جی سیل

مزید مصنوعات کی معلومات حاصل کرنے کے لیے کلک کریں۔

1. تعارف

نارنگیننایک قدرتی فلیوونائڈ، کھٹی پھلوں اور دیگر خوردنی پھلوں میں وافر مقدار میں پایا جاتا ہے، جیسے چکوترا، نارنگی، برگاموٹ، ٹماٹر اور انجیر [1]۔ زبانی انتظامیہ کے بعد، نارنجینین معدے اور جگر میں وسیع پیمانے پر تقسیم ہوتا ہے [2,3] اور اس کی مالیکیولر ساخت کی وجہ سے آزاد ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمی کے ذریعے براہ راست اینٹی آکسیڈینٹ خصوصیات کی نمائش کرتا ہے، اور جگر میں اینڈوجینس اینٹی آکسیڈینٹ نظام کو اکساتا ہے [4]۔ وٹرو اور ویوو دونوں مطالعات سے بڑھتے ہوئے شواہد نے نارینجنن کی مختلف حفاظتی صلاحیتوں کی نشاندہی کی ہے، جیسےغیر سوزشی[5]، اینٹی آکسیڈینٹ [6]، اینٹی فبروسس [Z]، اور ہیپاٹوپروٹیکٹو 4,8| سرگرمیاں ان صلاحیتوں سے پتہ چلتا ہے کہ میٹابولک سنڈروم اور مہلک بیماریوں کو روکنے کے لیے غذائی نارنجینن کا استعمال کیا جا سکتا ہے، بشمول مکمل ہیپاٹائٹس، فیٹیجگر کی بیماری، فائبروسس وغیرہ 19,10]۔ تاہم، جگر کے مجموعی جینوں پر نارنجینن کے ریگولیٹری اثرات کے بارے میں کچھ تفصیلی مطالعات موجود ہیں [4]۔

مائیکرو آر این اے (miRNAs) نان کوڈنگ، سنگل سٹرینڈڈ RNA مالیکیولز کی ایک کلاس ہے جس کی لمبائی 18-26 نیوکلیوٹائڈز ہیں جو اینڈوجینس جینز کے ذریعے انکوڈ کیے گئے ہیں، جو فائیلوجنی، تفریق، پھیلاؤ، اور اپوپٹوسس میں حیاتیاتی ریگولیٹری افعال کی ایک وسیع رینج کو ظاہر کرتے ہیں۔ [11]۔ miRNA، بائنڈنگ میسنجر RNAs (mRNAs) ترتیب سے مخصوص شناخت کے ذریعے، ٹارگٹ mRNAs [12] کے انحطاط کے ذریعے ٹرانسکرپشن کے بعد کی سطح پر جین کے اظہار کو منفی طور پر منظم کرتا ہے۔ خارجی محرک کے تحت، miRNA اظہار کو تبدیل کیا جاتا ہے، اور پھر ہدف mRNA اظہار کو منظم کیا جاتا ہے۔ بالآخر، exogenous محرک [13] کی وجہ سے پیدا ہونے والے چیلنجوں سے نمٹنے کے لیے وسیع جسمانی افعال کو تبدیل کیا جاتا ہے۔ miRNA-mRNA ہدف کے تعلقات کی پیشن گوئی کرنے کا ایک زیادہ قابل اعتماد طریقہ یہ ہے کہ بیک وقت mRNA-seq تجزیہ کو miRNA-seq تجزیہ کے ساتھ سلیکو میں ایک خاص پروسیسنگ سیاق و سباق کا استعمال کرتے ہوئے مربوط کیا جائے [14]۔

لہذا، ہمارا مقصد عالمی جینز پر نارنجینن کے اثرات کا مطالعہ کرنا اور جگر میں miRNA-mRNA جوڑوں کے ممکنہ ریگولیٹری میکانزم کو اجاگر کرنا تھا۔ موجودہ مطالعے میں، ہیپا آر جی سیلز میں ایم آر این اے ایکسپریشن تبدیلیوں اور ایم آر این اے ایکسپریشن پروفائلز کی تحقیقات mRNA-seq، miRNA-seq، بایو انفارمیٹک تجزیوں، اور ریئل ٹائم کیو پی سی آر کے ذریعے کی گئیں تاکہ قدرتی غذائی ضمیمہ کے طور پر نارنجینن کی صلاحیت کا ثبوت فراہم کیا جا سکے۔

2. نتائج

2.1. نارینجنن کے جواب میں ٹرانسکرپٹوم کی ترتیب کا تجزیہ

کی mRNA اظہار کی تبدیلیوں کی نشاندہی کرنے کے لیےہیپا آر جی سیلنارنجینن کے جواب میں، کنٹرول گروپ (CK-1، CK-2، CK-3، اور CK-4) اور تجرباتی گروپ میں آٹھ تکمیلی DNA(cDNA) لائبریریاں (T-1، T-2، T-3، اور T-4) کو کل RNA کے ساتھ بنایا گیا تھا اور Illumina HiSeq2500 کی ترتیب سے مشروط کیا گیا تھا (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou) ، چین)۔ کنٹرول گروپ اور تجرباتی گروپ کے لیے ترتیب اور اسمبلی کے نتائج کا جائزہ ٹیبل 1 میں دکھایا گیا ہے۔ جین کے اظہار کی تبدیلیوں کا علاج اور کنٹرول گروپس کا موازنہ کرکے تجزیہ کیا گیا۔ جیسا کہ شکل لا میں دکھایا گیا ہے، نارنجینن بے نقاب گروپ نے کنٹرول گروپ کے مقابلے میں 1037 مختلف جینز (DEGs) کا اظہار کیا۔ 1037 ڈی ای جی کے ہیٹ میپ نے کنٹرول گروپ اور نارنجینن گروپ کا کلسٹر تجزیہ دکھایا (شکل 1b؛ 381 اوپر اور 656 نیچے ریگولیٹڈ جین؛ ٹیبل S1، ضمنی مواد)۔

جین آنٹولوجی (GO) درجہ بندی کے نظام کے مطابق، 1037 DEGs کو تین بڑے فنکشنل زمروں (حیاتیاتی عمل، سیلولر جزو، اور مالیکیولر فنکشن) اور 61 ذیلی زمرہ جات (شکل 2) میں درجہ بندی کیا گیا تھا۔ حیاتیاتی عمل میں، سیلولر عمل (731) سب سے زیادہ عام طور پر نمائندگی کرتا تھا، اس کے بعد واحد حیاتیاتی عمل (672) اور حیاتیاتی ضابطہ (595)۔ سیلولر جزو کے زمرے میں، کلسٹرز کا ایک اہم تناسب سیل (727)، سیل حصہ (721)، اور آرگنیل (580) کو تفویض کیا گیا تھا۔ بائنڈنگ (666) اور اتپریرک سرگرمی (238) گروپوں میں شامل جین خاص طور پر مالیکیولر فنکشن کے زمرے میں نمائندگی کرتے تھے۔

کیوٹو انسائیکلوپیڈیا آف جینز اینڈ جینومز (KEGG) کی درجہ بندی 1037 DEGs کے لیے پائی گئی تھی جنہیں سب سے چھوٹی کیو ویلیو اور پاتھ وے تشریح میں سب سے بڑا جین نمبر (شکل 3) کے مطابق ٹاپ بیس بائیو کیمیکل راستوں میں مزید درجہ بندی کیا گیا تھا۔ سرفہرست پانچ راستوں کے جین نمبر اور تشریح شدہ جینوں کا تناسب سیسٹیمیٹک لیوپس ایریٹیمیٹوسس (33,8.4 فیصد)، شراب نوشی (38,9.67 فیصد)، کینسر میں نقل کی غلط ضابطگی (22، 5.6 فیصد)، PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے (34،34 فیصد) 8.65 فیصد )، اور تکمیلی اور جمنے والے جھرنے (12، 3.05 فیصد o)۔ پانچ راستوں میں 10 سے زیادہ افزودہ جین تھے۔ مجموعی طور پر، نارینجینن کے علاج سے ہیپا آر جی سیلز کے عالمی جین ایکسپریشن پروفائل پر نمایاں اثر پڑا۔ ان نتائج سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ ان راستوں میں شامل جین نارنجینن ریگولیشن میں اہم کردار ادا کر سکتے ہیں۔

2.2 Naringenin کے جواب میں miRNA ٹرانسکرپٹ لیولز کا تجزیہ

اس مطالعہ میں، ہم نے اس بات کا تعین کرنا تھا کہ آیاnaringeninنمائش HepaRG خلیوں میں miRNAs کے اظہار کی سطح کو تبدیل کرتی ہے۔ نمائش کے بعد، ہم نے چھوٹے RNAs اکٹھے کیے اور Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou, China) کا استعمال کرتے ہوئے ان کی نسبتا کثرت کی پیمائش کی۔ جیسا کہ جدول 2 میں دکھایا گیا ہے، آلودگی والے ریڈز کو ہٹانے کے بعد بالترتیب آٹھ نمونوں کی کلین ریڈز تیار کی گئیں۔ خام ڈیٹا سے لے کر اعلیٰ کوالٹی تک اور معیاری فلٹرنگ کے ساتھ چھوٹے آر این اے کی ترتیب کے لیے پڑھنے کا ایک جائزہ جدول 2 میں فراہم کیا گیا ہے۔ )۔

تمام چھوٹے RNAs کو جین بینک ڈیٹا بیس (ریلیز 2090) اور Rfam ڈیٹا بیس (11.0) میں ربوسومل RNA (rRNA)، چھوٹے مشروط RNA (scRNA) کی شناخت اور ہٹانے کے لیے منسلک کیا گیا تھا۔ چھوٹے نیوکلیولر (snoRNA)، چھوٹے نیوکلیئر (snRNA)، اور منتقلی RNA (tRNA)۔ حوالہ جینوم کے مطابق، یہ چھوٹے RNAs کو exons، introns، اور دہرائی جانے والی ترتیبوں میں نقشہ بنا دیا گیا تھا۔ miRNAs کی شناخت کے لیے فلٹرنگ چھوٹے RNAs کو miRBase ڈیٹا بیس (Release 21) کے خلاف تلاش کیا گیا۔ 3373 miRNAs کا گرمی کا نقشہ شکل 5a میں کنٹرول گروپ اور نارنجینن گروپ کا کلسٹر تجزیہ دکھاتا ہے۔ 3373 miRNAs کی Illumina HiSeq2500 پروفائلنگ کا تجزیہ کیا گیا naringenin exposure بمقابلہ کنٹرول کے نمونوں میں یہ ظاہر ہوا کہ مجموعی طور پر 234 مختلف انداز میں ظاہر کیے گئے miRNAs (DEMs، 174up-اور 60 down-regulated؛ Table S2، سپلیمنٹری مواد کا پتہ لگانے والے سیلز) .

2.3. Naringenin کے جواب میں mRNA اور miRNA ایکسپریشن پروفائلز کے ہدف کی پیشن گوئی اور انضمام کا تجزیہ

ٹرانسکرپشن کے بعد کی سطح پر عمل کرتے ہوئے، miRNAs خاموشی اور/یا سیلولر mRNA جین کے اظہار کو ٹارگٹ RNA کلیویج کے ذریعے ریگولیٹ کرتے ہیں۔ 234 DEMs کے ٹارگٹ جینز کی پیشن گوئی کرنے کے لیے، ہم نے RNAhybrid(v2.1.2) پلس اسکائی لائٹ کا استعمال کرتے ہوئے کمپیوٹیشنل تجزیہ کیا 01)، مرانڈا (v3.3a)، اور TargetScan (ورژن:7.0)۔ سلیکو میں 234 ڈی ای ایم اور 1037 ڈی ای جی لیولز کی بیک وقت پروفائلنگ ایم آر این اے کے ممکنہ ہدف ایم آر این اے کی شناخت کر سکتی ہے۔ ہم نے ڈی ای جی اور ڈی ای ایم کے ٹارگٹ جینوں کے چوراہے کا انتخاب کیا اور پھر ان چوراہا جینوں پر بائیو انفارمیٹکس تجزیہ کیا۔ 216 ڈی ای ایم اور 681 ڈی ای جی (ٹیبل ایس 3، سپلیمنٹری میٹریلز) کی شمولیت کے ساتھ نارینجنن ٹریٹمنٹ کے لیے کل 5607 منفی miRNA-mRNA جوڑے حاصل کیے گئے۔ GO درجہ بندی کے نظام کے مطابق، 681 DEGs کو 58 ذیلی زمروں میں درجہ بندی کیا گیا تھا (شکل 6)۔ ٹرانسکرپٹوم سیکوینسنگ تجزیہ (اعداد و شمار 2 اور 6) کے مقابلے میں پہلی تین ذیلی زمرہ جات تین بڑے فنکشنل زمروں میں تبدیل نہیں ہوئے تھے۔

5607 منفی miRNA-mRNA جوڑوں میں سے 681 DEGs کے لیے پاتھ وے کی افزودگی کے تجزیے نے سب سے چھوٹی q-value کے مطابق ٹاپ بیس راستوں کی نشاندہی کی اور naringenin exposure کے بعد پاتھ وے تشریح میں سب سے بڑا GeneNumber (شکل 7): PI3K-Akt سگنلنگ (way26) کے ساتھ۔ فیصد ) آٹھواں راستہ اور دوسرا سب سے زیادہ پرچر۔

2.4.جگر میٹابولزم اور ممکنہ ریگولیٹری miRNA-mRNA جوڑوں میں نارینجنن ریگولیشن کی ریئل ٹائم qPCR کی توثیق

عالمی جین فنکشن تشریحات، ادب کا جائزہ، اور naringenin-responsive miRNAs کے ساتھ ان کے ممکنہ تعلق کے مطابق، 19 DEGs(ALOX15, CA9, TH, HKDC1, NDUFA4L2, RRM2, ACSL5, PLA2G4C, LIPT2, UGDH, FTAST2, FT, FT, , FT,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ، B4GALT6، GUSB، DCT، ALAS2، اور MAT1A) کو دستی طور پر جگر کے میٹابولزم میں ان کے ممکنہ کردار کے لیے نمائندوں کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔ اس کے علاوہ، PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے کو نمایاں طور پر افزودہ کیا گیا تھا (RNA-seq تجزیہ کے KEGG میں چوتھا، شکل 3؛ miRNA-RNA-seq تجزیہ کے KEGG میں آٹھواں، شکل 7)؛ لہذا PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے میں سے 11 DEGs (PDGFRB. CSF1R. FGFR2, IL2RG, IL7R, ITGB4, GNG4, PCK1, CREB3L3, CREB3L1, اور NFkB1) کی اسکریننگ کی گئی۔

ہم نے یہاں 30 DEGs اور 11 انسانی miRNAs (hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR{{9 کے درمیان تعامل کو بیان کیا ہے۔ }}p, hsa-miR-6837-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR{{19} }a-3p، hsa-miR-7-5p، اور hsa-miR-200a-5p، بشمول 20 منفی miRNA-mRNA تعاملات (شکل 9)۔ جیسا کہ شکل 9 میں دکھایا گیا ہے، ایک واحد miRNA متعدد ٹارگٹ mRNAs کو ریگولیٹ کر سکتا ہے اور اس کے برعکس (مثال کے طور پر، ABAT HS6ST3، B4GALT6، اور DCT کو ممکنہ طور پر بیک وقت hsa-miR-429 کے ذریعے ریگولیٹ کیا جا سکتا ہے؛ HS6ST3 کو بیک وقت hsa-miR کے ذریعے ریگولیٹ کیا جا سکتا ہے۔ -429، hsa-miR-100-3p,hsa-miR-519a-3p, hsa-miR-676-3p, hsa-miR-7-5 p، اور hsa-miR-194-5p؛ کچھ DEG میں کوئی جوڑا DEM نہیں تھا)۔ PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے میں جگر کے میٹابولزم سے متعلق 19 DEGs اور 11 DEGs کے ایکسپریشن پروفائلز کو ریئل ٹائم کیو پی سی آر (فگر 9a، b) کا استعمال کرتے ہوئے مزید توثیق کیا گیا۔ 11 انسانی miRNAs (دو اوپر اور نو نیچے ریگولیٹڈ) کے اظہار کی سطح کا مزید اندازہ ریئل ٹائم کیو پی سی آر کے ذریعہ نارنجینن حوصلہ افزائی کی جانے والی تبدیلیوں کے لئے ترتیب کے نتائج (شکل 9c) کے مطابق کیا گیا۔ اگرچہ دو تجزیاتی پلیٹ فارمز کے درمیان کچھ مقداری فرق موجود تھے، لیکن RNA-seq ڈیٹا اور ریئل ٹائم PCR کے درمیان مماثلت نے تجویز کیا کہ RNA-seq ڈیٹا دوبارہ پیدا کرنے کے قابل اور قابل اعتماد تھا۔

3. بحث اور نتیجہ

یہاں زیر بحث نتائج سے HepaRG خلیوں میں متوازی mRNA اور miRNA اظہار کی تبدیلیوں کے بارے میں پہلی تفصیلی معلومات کا پتہ چلتا ہے۔naringenin. ہم نے ان اعداد و شمار کا ایک مربوط تجزیہ کیا جس میں 234 ڈی ای ایم اور 1037 ڈی ای جی شامل ہیں جن میں نارینجنن شامل ہیں، جو ریگولیٹری میکانزم میں نارینجن کے miRNA-mRNA تعاملات کی عالمی بصیرت فراہم کرتے ہیں۔ جین فنکشن تشریحات اور لٹریچر ریویو کے مطابق، میٹابولزم سے متعلق 19 ڈی ای جیز کی اسکریننگ کی گئی۔ خاص طور پر، PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے کو ٹرانسکرپٹوم سیکوینسنگ (تیسرا سب سے زیادہ وافر، اور چوتھا درجہ) اور miRNA-mRNA ایکسپریشن پروفائلز کے انضمام کے تجزیہ (دوسرے سب سے زیادہ پرچر، اور آٹھویں نمبر پر) دونوں میں نمایاں طور پر افزودہ کیا گیا تھا۔ naringenin کے جوابات میں. اس کے علاوہ، PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے میں 11 ڈی ای جیز کو ریئل ٹائم کیو پی سی آر تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے مزید درست کیا گیا۔ اس کام میں، ہم نے ڈی ای ایم اور ڈی ای جی ڈیٹاسیٹس اور ایم آر این اے کو نشانہ بنانے والی معلومات کے مطابق ایک miRNA-mRNA ریگولیٹری نیٹ ورک بنایا۔ کچھ مطالعات نے یہ ظاہر کیا ہے کہ miRNA-mRNA ریگولیٹری نیٹ ورک جواب دیتا ہے۔جگر کا نقصان، بشمول ہیپاٹوسیولر کارسنوما اور آکسیڈیٹیو تناؤ [15]۔ اگرچہ متعدد miRNA سے حوصلہ افزائی والے RNA ایکٹیویشن مظاہر کی نشاندہی کی گئی تھی [16]، زیادہ تر حالات میں، miRNAs اور ان کے ہدف mRNAs کے درمیان منفی ارتباط کو اکثر miRNA کو نشانہ بنانے کی حمایت سمجھا جاتا ہے [17]۔ بالآخر، 20 miRNA-mRNA منفی ارتباط کے جوڑوں کی شناخت جگر کے میٹابولزم اور PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے کے ساتھ کی گئی۔

عالمی جینز کے حوالے سے، ہم نے فنکشنل کلسٹرز سے متعلق 19 ڈی ای جیز کو اجاگر کرنے کے لیے پاتھ وے تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے اپنے مخصوص تحقیقی سوال کو حل کیا: میٹابولزم، بشمول لپڈ میٹابولزم (ALOX15، ACSL5، PLA2G4C، اور B4GALT6)، انرجی میٹابولزم (CA9 اور NDUL2) کوفیکٹرز اور وٹامنز کا میٹابولزم (TH، LIPT2، اور FTCD)، امینو ایسڈ میٹابولزم (RRM2، AZIN2، DCT، ALAS2، اور MAT1A)، گلائکن بایو سنتھیسز اور میٹابولزم (HS6ST3 اور GUSB)، اور کاربوہائیڈریٹ میٹابولزم"(HKDC1, UGDH، اور ABAT۔ میٹابولزم کے لیے افزودہ یہ 19 ڈی ای جی بنیادی طور پر انسولین کی حساسیت، لپڈ جمع، گلائکوجن ذخیرہ کرنے، اور توانائی کے اخراجات میں شامل ہیں۔ پچھلی مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ الکحل کی وجہ سے چوہوں کے جگر کے نقصان میں ALOX15 کے ڈاون ریگولیشن[18]، BALB/C چوہوں میں CA9 [19]، Thin nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD)[20]، HKDC1[21]، اور UGDH [22] کا اپ ریگولیشن نمایاں طور پر آکسیڈیٹیو تناؤ، لپڈ جمع، اور جگر کے نقصان کو دور کرسکتا ہے۔ NDUFA4L2 کی ناک آؤٹ ROS جمع کو دبا دیا گیا۔ ہیپاٹو سیلولر کارسنوما (ایچ سی سی) خلیوں میں tion اور apoptosis [23]۔ RRM2 کی خاموشی نے NCI-H929 سیل کے پھیلاؤ کو روکا [24]، اور FTCD اوور ایکسپریشن نے DNA کو پہنچنے والے نقصان کو فروغ دے کر سیل کے پھیلاؤ کو دبایا اور HCC خلیوں میں سیل apoptosis کو دلایا [25]۔ ACSL5 کے خاتمے سے انسولین کی حساسیت میں بہتری آئی، توانائی کے اخراجات میں اضافہ ہوا، اور چوہوں میں ٹرائگلیسرائڈ جذب میں تاخیر ہوئی [26]۔ ڈی سی ٹی ضمیمہ نے عمر سے وابستہ جگر کی سٹیٹوسس اور سوزش کو بہتر بنایا [27]۔ PLA2G4C دستک ڈاؤن خلیوں میں فیٹی ایسڈ اور ہیپاٹائٹس سی وائرس کے محرک پر لپڈ بوندوں کی تشکیل خراب تھی [28]۔ LIPT2 کے ڈاون ریگولیشن نے فیٹی ایسڈ کی ترکیب کو روکا [29]۔ ABAT [30]، AZIN2 [31]، B4GALT6 [32]، HS6ST3 [33]، اور GUSB [34] کا اپ ریگولیشن فیٹی ایسڈ اور گلائکوجن ڈی کمپوزیشن کو فروغ دے سکتا ہے۔ ALAS2 اوور ایکسپریشن جگر کی ہیماٹوپوائٹک صلاحیت کو بہتر بنا سکتا ہے [35l، اور MAT1A نے ہیپاٹوسائٹس میں ظاہر کیا ہے ان خلیوں کی مختلف حالت کو برقرار رکھا [36]۔ اوپر بیان کردہ نتائج سے ہم آہنگ، ہمارے نتائج میں ان میٹابولک جینوں کا ضابطہ نارینجن کے جواب میں میٹابولزم کو بہتر بنانے کے لیے سازگار ہو سکتا ہے۔

PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے میٹابولزم، سوزش، اور آکسیڈیٹیو تناؤ میں شامل مالیکیولر میکانزم کے لیے سراغ دے سکتا ہے [37]، جو نارینجن کے ردعمل میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے کے سیلولر میٹابولزم پر متنوع بہاو اثرات ہیں یا تو نیوٹرینٹ ٹرانسپورٹرز اور میٹابولک انزائمز کے براہ راست ریگولیشن یا ٹرانسکرپشن عوامل کے کنٹرول کے ذریعے جو میٹابولک پاتھ ویز [38,39] کے کلیدی اجزاء کے اظہار کو منظم کرتے ہیں، بشمول گلوکوز میٹابولزم، بائیو میٹابولزم۔ میکرو مالیکیولز، اور ریڈوکس بیلنس کی بحالی۔ یہ اطلاع دی گئی ہے کہ PDGFRB خاموشی سے ہیپاٹک سٹیلٹ سیلز کی ایکٹیویشن اور پھیلاؤ کو روکتا ہے اور جگر کے فبروسس کو بہتر بناتا ہے [40]۔ CSF1R اور FGFR2 کے باہمی تعاون سے ٹیومر مائکرو ماحولیات [41] میں مدافعتی چوری اور انجیوجینیسیس کو نشانہ بناتے ہوئے اینٹیٹیمر اثرات کو بڑھانے کی توقع ہے۔ کینسر سے وابستہ فائبرو بلاسٹس میں آئی ٹی جی بی 4 کو دبانے والے گلائکولیسس کو دستک کرنا [42]۔ PCK1 کے جینیاتی دستک نے آکسیڈیٹیو فلوکس، آکسیڈیٹیو تناؤ، اور سوزش میں فیٹی ایسڈ کی حوصلہ افزائی میں اضافے کو روکا [43]، جو کہ انسولین کے زیر انتظام سگنلنگ راستوں سے بھی منسلک تھا [44]۔ یہ دکھایا گیا تھا کہ جوہری CREB3L3 کی حد سے زیادہ کارکردگی نے توانائی کے بڑھتے ہوئے اخراجات کے ساتھ سیسٹیمیٹک لیپولائسز، ہیپاٹک کیٹوجینیسیس، اور انسولین کی حساسیت کو متاثر کیا [45]۔ CREB3L1 کی روک تھام نے مبینہ طور پر کینسر کے حملے اور میٹاسٹیسیس کو روک دیا [46]۔ NFkB مدافعتی نشوونما، مدافعتی ردعمل، سوزش اور کینسر کا کلیدی ریگولیٹر ہے [47]۔ یہ اچھی طرح سے قائم کیا گیا ہے کہ NFkB کو دبانے سے سوزش کے اشارے کم ہوتے ہیں اور سوزش کم ہوتی ہے [48]۔ PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے میں، ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ naringenin نے PDGFRB، PCK1، CREB3L1، اور NFkB1 کے mRNA اظہار کو متعلقہ miRNAs (has-miR-1306-5p اور hsa-miR{{40} کے ساتھ نمایاں طور پر نیچے ریگولیٹ کیا ہے۔ }p) نمایاں طور پر نیچے ریگولیٹ ہونا۔ لہذا، ہمارے اعداد و شمار نے تجویز کیا ہے کہ PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے کی روک تھام کے ذریعے نارنگینن سوزش، اینٹی آکسیڈیٹیو تناؤ، اور بہتر میٹابولزم میں ایک اہم کردار ادا کر سکتا ہے۔

یہ مطالعہ نرینجین کے جواب میں جگر میں mRNA-seq اور miRNA-seq کے تجزیے کو مربوط کرنے والا پہلا مطالعہ تھا اور naringenin ریگولیشن میں میٹابولزم کا نقطہ نظر فراہم کرتا ہے۔ میٹابولزم اور PI3K-Akt سگنلنگ پاتھ وے کے لحاظ سے، 11 DEMs، 30 DEGs، اور 20 miRNA-mRNA جوڑوں کو نارنجینن کی سرگرمیوں کے لیے مزید تحقیق کی ضرورت ہے۔ اس تحقیق کی کچھ حدود ہیں۔ مثال کے طور پر، miRNA-mRNA تعاملات میں naringenin کے خوراک پر منحصر اور وقت پر منحصر اثرات ابھی تک واضح نہیں تھے۔ اگرچہ سلیکو تجویز کردہ ریگولیٹری صلاحیتوں میں تجزیہ کیے گئے miRNAs، ان کے افعال کو نظام زندگی کے اندر ایک مخصوص تناظر میں مزید تصدیق کرنے کی ضرورت ہے۔ خلاصہ طور پر، ہم نے mRNA اور miRNA اظہار اور میٹابولزم کی پروفائلنگ کا تجزیہ کرنے والی ابتدائی تحقیق فراہم کی۔ miRNA-mRNA جوڑوں کا ریگولیٹری میکانزم naringenin کی نیوٹراسیوٹیکل قدر کی تشریح کے لیے اضافی ممکنہ ثبوت ہو سکتا ہے۔

4. مواد اور طریقے

4.1 کیمیکل اور ری ایجنٹس

HepaRG سیل لائن اصل میں Biopredic International (Rennes, France) سے خریدی گئی تھی۔ RPMI-1640 میڈیم اور پینسلن-اسٹریپٹومائسن-گلوٹامین محلول Gibco (Gaithersburg, MD, USA) سے حاصل کیے گئے تھے۔ فیٹل بووائن سیرم (ایف بی ایس) کارننگ (آکلینڈ، نیوزی لینڈ) سے خریدا گیا تھا۔ Naringenin اور dimethyl sulfoxide (DMSO) سگما-Aldrich (St.Louis, MO, USA) سے تھے۔ TRIzolTM ریجنٹ Thermo Fisher (Carlsbad, CA, USA) نے فراہم کیا تھا۔ الٹرا پیور پانی کو ملی-او اکیڈمک واٹر پیوریفیکیشن سسٹم (ملی پور، بیڈفورڈ، ایم اے، یو ایس اے) کے ذریعے صاف کیا گیا تھا۔ دیگر تمام ریجنٹس دستیاب اعلی ترین تجزیاتی گریڈ کی تجارتی مصنوعات تھے۔

4.2 ہیپا آر جی سیلز کلچر

HepaRG خلیات کو 5×10*cells/cm- میں چھ کنویں پلیٹوں میں سیڈ کیا گیا اور RPMI-1640 میڈیم میں اگایا گیا، 48 گھنٹے تک 100 uM نارینجینن کے ساتھ یا اس کے بغیر کلچر کیا گیا، اور 10 فیصد FBS اور 1 فیصد اینٹی بائیوٹکس کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا۔ (100 U/mL پینسلن اور 100 ug/mLstrepto-mycin) 37 ڈگری پر نمی والے 5 فیصد CO، انکیوبیٹر میں۔ CK-1، CK-2، CK-3، اور CK-4 کنٹرول چیک گروپ کا حوالہ دیتے ہیں؛ T-1، T-2، T-3، اور T-4 100 μM نارینجنین ٹریٹمنٹ گروپ کا حوالہ دیتے ہیں۔ نمبر 1، 2، 3، اور 4 چار آزاد بار بار کیے گئے تجربات کے نمونوں کی نمائندگی کرتے ہیں۔

4.3 کل RNA نکالنا

HepaRG خلیوں کو آئس کولڈ فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) کے ساتھ دو بار دھویا گیا اور مینوفیکچرر کے ذریعہ تجویز کردہ TRIzolTM ریجنٹ کے ساتھ کاٹا گیا۔ Thermo Scientific NanoDropTM2000 c Spectrophotometers (Wilmington, DE, USA) کا استعمال کارخانہ دار کے پروٹوکول کے مطابق ہر نمونے کے RNA معیار اور مقدار کی پیمائش کے لیے کیا گیا تھا۔

4.4.RNA کی ترتیب

ایم آر این اے کو اولیگو (ڈی ٹی) موتیوں کے ذریعہ افزودہ کیا گیا تھا، پھر افزودہ ایم آر این اے کو اویا اوک پی سی آر ایکسٹرکشن کٹ (کیجین، وینلو، نیدرلینڈز) کے ذریعہ بے ترتیب پرائمر کے ساتھ سی ڈی این اے میں بکھرا اور الٹا نقل کیا گیا تھا۔ RNA مالیکیولز 18-30 nt کی سائز کی حد میں پولی کریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس کے ذریعہ افزودہ تھے۔ 3'اور 5'ایڈاپٹر شامل کیے گئے، پھر افزودہ RNAs کو مینوفیکچرر کی ہدایات (کیجین، وینلو، نیدرلینڈز) کے مطابق، QiaQuick PCR ایکسٹرکشن کٹ کے ذریعے ریورس ٹرانسکرپٹ کیا گیا۔ لیگیشن مصنوعات کو ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعہ سائز کے مطابق منتخب کیا گیا تھا۔ نارنجینن گروپ میں چار نمونے اور کنٹرول گروپ میں چار نمونے تھے۔ ہر نمونے نے دو cDNA لائبریریاں تیار کیں: ایک mRNA-seq کے لیے اور دوسری miRNA-seg کے لیے۔ PCR ایمپلیفائیڈ پروڈکٹس کو بالترتیب 16 cDNA لائبریریاں بنانے کے لیے افزودہ کیا گیا تھا اور Genedenovo Biotechnology Co. (Guangzhou, China) کے ذریعے Ⅲlumina HiSeq2500 کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دی گئی تھی۔ آر این اے اور چھوٹے آر این اے سیکوینسنگ ڈیٹا کو این سی بی آئی سیکوینس ریڈ آرکائیو (ایس آر آر 13675952 سے ایس آر آر 13675963 تک الحاق نمبرز) میں جمع کیا گیا تھا۔

4.5 ریئل ٹائم کیو پی سی آر

کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق، mRNA کی cDNA میں نقل GoScriptTM ریورس ٹرانسکرپشن سسٹم (Promega, Madison, WI, USA) کے ساتھ کل RNA کے 3 ugs سے کی گئی۔ miRNA تجزیہ کے لیے، cDNA-synthesis miRNA First Strand cDNA Synthesis (Telling Reaction, Sangon Biotech, Shanghai, China) کے ساتھ کل RNA کے 2 ugs سے انجام دیا گیا تھا۔

GoTaq® qPCR ماسٹر مکس کے ساتھ(Promega, Madison, WI, USA) LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Germany) پر، جیسا کہ مینوفیکچرر نے تجویز کیا ہے۔ تھرمل سائیکلنگ کا طریقہ کار 10 منٹ کے لیے 95C پر ابتدائی ڈینیچریشن کے ساتھ شروع ہوا۔ اس کے بعد 95 ڈگری پر 10 سیکنڈ کے لیے ڈینیچریشن کے 45 سائیکل، 60 ڈگری پر 20 سیکنڈ کے لیے پرائمر بائنڈنگ، اور 20 سیٹ 72 ڈگری پر لمبا ہونا تھا۔ طریقہ کار 5s کے لیے 95 ڈگری، 1 منٹ کے لیے 65 ڈگری سینٹی گریڈ، ایک منحنی خطوط کے اسٹیپ کے اضافے، اور کولنگ سٹیپ کے ساتھ اختتام پذیر ہوا۔ پرائمر سنگون بائیوٹیک (شنگھائی، چین) سے خریدے گئے تھے۔ دستخط کی توثیق کے لیے استعمال ہونے والے پرائمر جوڑے کی ترتیب کو جدول 3 اور 4 میں بیان کیا گیا ہے۔ Ct-values ​​کا حساب -actin یا U6 کے حوالے سے کیا گیا تھا۔

4.6. بایو انفارمیٹک تجزیہ اور شماریات

DEGs اور DEMs کی شناخت R-based سافٹ ویئر پیکج کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ DEGs اور DEMs کے انتخاب کے لیے حد کی قدر q-value (ایڈجسٹڈ p-value) 0 سے کم یا اس کے برابر تھی۔{6}}5 اور فولڈ تبدیلی (FC) 2 یا اس سے کم 0.5 سے زیادہ یا اس کے برابر۔ KEGG اور GO کی درجہ بندی بشمول مالیکیولر افعال، حیاتیاتی عمل، اور سیلولر اجزاء کو DEGs اور DEMs کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔

حیاتیاتی پرکھ کے نتائج گراف پیڈ پرزم 8 میں چار آزاد تجربوں کی بنیاد پر اوسط ± SD کی شکل میں پیش کیے گئے ہیں۔

ضمنی مواد: مندرجہ ذیل https://www.mdpi.com/1422-0 067/22/5/2292/s1 پر آن لائن دستیاب ہیں: ٹیبل S1، naringenin کے جواب میں 1037 متفرق ایم آر این اے کی شناخت؛ ٹیبل S2، نارنجینن کے جواب میں 234 مختلف انداز میں اظہار کردہ miRNAs کی شناخت؛ ٹیبل S3، نارینجینن کے جواب میں 5607 منفی miRNA-mRNA جوڑوں کی شناخت، جس میں مجموعی طور پر 216 DEMs اور 681 DEGs شامل ہیں۔

حوالہ جات

1. صالحی، بی. فوکو، پی وی ٹی نارینجنن کی علاج کی صلاحیت: کلینیکل ٹرائلز کا ایک جائزہ۔ فارماسیوٹیکلز 2019, 12, 11۔ [CrossRef] [PubMed]

2. بائی، وائی؛ پینگ، ڈبلیو. یانگ، سی. زو، ڈبلیو. لیو، ایم؛ وو، ایچ. فین، ایل. لی، پی. زینگ، ایکس؛ چوہوں، کتوں، انسانوں میں نارنگین اور ایکٹو میٹابولائٹ نارینجنن کا ایس یو، ڈبلیو فارماکوکینیٹکس اور میٹابولزم اور پرجاتیوں کے درمیان فرق۔ سامنے والا۔ فارماکول۔ 2020، 11، 364۔ [کراس ریف]

3. جوشی، آر. کلکرنی، YA؛ ویرکر، ایس فارماکوکینیٹک، فارماکوڈینامک اور فارمولیشنز آف نارینجنن: ایک اپ ڈیٹ۔ لائف سائنس. 2018، 215، 43–56۔ [کراس ریف]

4. Hernández-Aquino, E.; موریل، پی جگر کی بیماریوں میں نارنجینن کے فائدہ مند اثرات: مالیکیولر میکانزم۔ ورلڈ جے گیسٹرو انٹرول۔ 2018، 24، 1679–1707۔ [کراس ریف]

5. وانگ، Q.؛ Ou, Y.; گلے.؛ وین، سی؛ یو، ایس. چن، سی. Xu, L.; Xie, J.; ڈائی، ایچ. Xiao, H.; ET رحمہ اللہ تعالی. Naringenin چوہوں میں NLRP3/NF-κB راستے کو نیچے ریگولیٹ کرکے غیر الکوحل فیٹی جگر کی بیماری کو کم کرتا ہے۔ Br جے فارماکول۔ 2020، 177، 1806–1821۔ [کراس ریف]

6. خان، ٹی ایچ؛ Ganaie، MA Naringenin Wistar چوہوں میں آکسیڈیٹیو اور سوزش کی توہین کو منظم کرکے گردے کے ٹشوز میں doxorubicin کی حوصلہ افزائی زہریلا کو روکتا ہے۔ محراب فزیول بائیو کیم۔ 2020، 126، 300–307۔ [کراس ریف]

7. وانگ، جے؛ ڈنگ، وائی۔ Zhou, W. SPARC پر منحصر راستوں کے ذریعے ہیپاٹک فائبروسس کے علاج کے لیے البومن سیلف موڈیفائیڈ لیپوسومز۔ انٹر جے فارم۔ 2020، 574، 118940۔ [کراس ریف]

8. کومیٹسی، ایل۔ گویندر، کے. Mofo Mato, EP; ہرچنڈ، آر. اویرا، پی ایم او آکسیڈیٹیو تناؤ کو کم کرکے، نارینجنن ہیپاٹک نیوکلیئر فیکٹر اریتھرایڈ 2-متعلقہ فیکٹر 2 پروٹین کے ہائپرگلیسیمیا کی وجہ سے اپ گریجولیشن کو کم کرتا ہے۔ جے فارم۔ فارماکول۔ 2020، 72، 1394–1404۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

9. Rossino, MG; Casini، G. ذیابیطس ریٹینوپیتھی کے علاج کے لیے نیوٹراسیوٹیکلز۔ غذائی اجزاء 2019, 11, 771۔ [CrossRef] [PubMed]

10. Hernández-Aquino, E.; Quezada-Ramírez, MA; Silva-Olivares, A.; Casas-Grajales, S.; راموس ٹوور، ای. Flores-Beltrán, RE; Segovia, J.; شیبایاما، ایم. موریل، پی نارنگینن جگر کے فائبروسس کے بڑھنے کو ہیپاٹک اسٹیلیٹ سیلز اور پروفائیبروجینک راستے کو غیر فعال کرنے کے ذریعے کم کرتا ہے۔ یور جے فارماکول۔ 2019، 865، 172730۔ [کراس ریف] [پب میڈ]