RNA M6 A ریڈر YTHDF2 NK سیل اینٹی ٹیومر اور اینٹی وائرل امیونٹی کو کنٹرول کرتا ہے حصہ 6

میٹاسٹیٹک میلانوما ماڈل اور ایم سی ایم وی چیلنج

B16F10 خلیات (105) چوہوں میں iv انجیکشن لگائے گئے تھے۔ انجیکشن کے 14 دن بعد، چوہوں کو پوسٹ مارٹم تجزیہ کے لیے ایتھانائز کیا گیا۔ پھیپھڑوں میں میٹاسٹیٹک نوڈولس کا میکروسکوپی تجزیہ کیا گیا اور گنتی گئی۔ B16F10 سیل لائن Hua Yu (City of Hope، لاس اینجلس، CA) نے فراہم کی تھی۔ Ythdf2ΔNK اور Ythdf2WT چوہے اسمتھ سٹرین MCMV (2.5 × 104 PFU) کے آئی پی انجیکشن سے متاثر ہوئے، جو امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن (VR-1399) سے خریدا گیا تھا۔ پیریفرل خون کے نمونے سب مینڈیبلر پنکچر کے ذریعے انفیکشن کے بعد 0، 4 اور 7 دنوں میں حاصل کیے گئے تھے۔

پلمونری میٹاسٹیسیس نوڈولس دوسرے سائٹس سے مہلک ٹیومر خلیوں کے ذریعہ بننے والے نوڈولس کا حوالہ دیتے ہیں جو خون یا لمفیٹک نظام کے ذریعے پھیپھڑوں میں منتقل ہوتے ہیں۔ بہت سے مریضوں کے لیے، یہ پھیپھڑوں کے کینسر کا ایک عام مظہر ہے۔

تاہم، اگرچہ پھیپھڑوں کے میٹاسٹیسیس نوڈولس مریضوں کی جسمانی صحت کے لیے خطرہ ہیں، لیکن اس کے اور یادداشت کے درمیان کوئی براہ راست تعلق نہیں ہے۔ لہذا، ہمیں پھیپھڑوں کے کینسر اور پھیپھڑوں کے میٹاسٹیسیس نوڈولس کے چیلنجوں کا فعال طور پر سامنا کرنا چاہیے، اور منفی جذبات اور اضطراب کو اپنی جسمانی اور ذہنی صحت پر اثر انداز نہیں ہونے دینا چاہیے۔

اس کے ساتھ ساتھ ہم کچھ مثبت طریقوں کے ذریعے یادداشت کو برقرار اور بہتر بنا سکتے ہیں۔ مثال کے طور پر، یادداشت کی کچھ تربیت کریں، جیسے کہ ریاضی کا حساب لگانا، پڑھنا، موسیقی سننا، گیم کھیلنا وغیرہ۔ اس کے علاوہ زندگی گزارنے کی اچھی عادات، جیسے کہ باقاعدگی سے ورزش، کافی نیند لینا، صحت بخش کھانا وغیرہ وغیرہ، بھی انجام دے سکتے ہیں۔ ہماری یادداشت کو بہتر بنائیں۔

سب سے اہم چیز مثبت رویہ رکھنا ہے۔ اس سے کوئی فرق نہیں پڑتا ہے کہ آپ کو جو بھی مشکلات درپیش ہیں، آپ کو اپنی طاقت اور اپنے اعصابی نظام کی لچک پر یقین رکھنا چاہیے، اور مثبت ایڈجسٹمنٹ اور ردعمل کے ذریعے، آپ بالآخر مشکلات پر کامیابی سے قابو پا لیں گے۔

مختصراً، اگرچہ پھیپھڑوں میں میٹاسٹیٹک نوڈولس جسمانی صحت کے لیے خطرہ ہیں، لیکن ان کا براہ راست یاداشت سے کوئی تعلق نہیں ہے۔ ہمیں اس کا مثبت انداز میں سامنا کرنا چاہئے اور اپنے طرز زندگی کو ایڈجسٹ کرکے اور اچھا رویہ برقرار رکھتے ہوئے اپنی یادداشت کو برقرار رکھنا اور بہتر بنانا چاہئے۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے، اور Cistanche deserticola نمایاں طور پر یادداشت کو بہتر بنا سکتا ہے، کیونکہ Cistanche deserticola نیورو ٹرانسمیٹر کے توازن کو بھی کنٹرول کر سکتا ہے، جیسے کہ acetylcholine کی سطح میں اضافہ اور ترقی کے عوامل۔ یہ مادے یادداشت اور سیکھنے کے لیے بہت اہم ہیں۔ اس کے علاوہ، Cistanche deserticola خون کے بہاؤ کو بھی بہتر بنا سکتا ہے اور آکسیجن کی ترسیل کو فروغ دے سکتا ہے، جو اس بات کو یقینی بنا سکتا ہے کہ دماغ کو کافی غذائی اجزاء اور توانائی ملے، اس طرح دماغی قوت اور برداشت کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے، اور Cistanche deserticola نمایاں طور پر یادداشت کو بہتر بنا سکتا ہے، کیونکہ Cistanche deserticola نیورو ٹرانسمیٹر کے توازن کو بھی کنٹرول کر سکتا ہے، جیسے کہ acetylcholine کی سطح میں اضافہ اور ترقی کے عوامل۔ یہ مادے یادداشت اور سیکھنے کے لیے بہت اہم ہیں۔ اس کے علاوہ، Cistanche deserticola خون کے بہاؤ کو بھی بہتر بنا سکتا ہے اور آکسیجن کی ترسیل کو فروغ دے سکتا ہے، جو اس بات کو یقینی بنا سکتا ہے کہ دماغ کو کافی غذائی اجزاء اور توانائی ملے، اس طرح دماغی قوت اور برداشت کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔

یادداشت کو بڑھانے کے لیے سپلیمنٹس جانیں پر کلک کریں۔

پردیی خون، تلی اور جگر میں وائرل بوجھ کی پیمائش کریں، ڈی این اے کو QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit for QPCR تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ درج ذیل پرائمر استعمال کیے گئے: MCMV-IE1،59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (آگے) اور MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACACAACTC-39 (الٹ)۔

IL-15 کے ساتھ Vivo ماؤس کے علاج میں

IL-15 کے ساتھ Vivo ماؤس کے علاج کے لیے Ythdf2ΔNK اور Ythdf2WTmice کو 2 µg ip recombinant human IL-15 (cat.no. 745101؛ نیشنل کینسر انسٹی ٹیوٹ) کے ساتھ 5 دن تک انجکشن لگایا گیا۔ اس کے بعد علاج شدہ اور کنٹرول چوہوں کو فلو سائٹومیٹرک تجزیہ کے لئے ایتھانائز کیا گیا۔

بہاؤ سائٹوومیٹری

سنگل سیل معطلی BM، خون، تللی، جگر، اور Ythdf2ΔNK اور Ythdf2WT چوہوں کے پھیپھڑوں سے تیار کی گئی تھی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (وانگ ایٹ ال۔، 2018b)۔ فلو سائٹومیٹری تجزیہ اور سیل ترتیب بالترتیب LSRFortessa X-20 اور FACSAriaFusion Flow Cytometer (BD Biosciences) پر کی گئی۔

NovoExpress سافٹ ویئر (Agilent Technologies) کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔

بی ڈی بائیو سائنسز، بائیو لیجنڈ، انویٹروجن، یا سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی سے درج ذیل فلوروسینس ڈائی لیبل والی اینٹی باڈیز استعمال کی گئیں: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 )TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7), CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70), CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1), KLRG1 (2F1), CD45 ({{46) }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), گرینزیم B (QA16A02), پرفورین (S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226(TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), annexin V, Ki67 (b56), Tbet (4b10), اور Eomes (WD1928), phospho-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101), فاسفو-اکٹ (Ser473, #5315), فاسفو-S6 رائبوسومل پروٹین ,phospho-Stat3 (Tyr705, #9145)، اور phospho-Stat5 (Tyr694, #9539)۔

NK سیل کے پھیلاؤ کی تشخیص کے لیے، سیلز کو وصول کنندہ میں منتقل کرنے سے پہلے مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق 5 µM CTV (انویٹروجن) کا لیبل لگا ہوا تھا۔ Ki67، Tbet، اور Eomes کے انٹرا سیلولر سٹیننگ کو Foxp3/Transcription Factor Staining Kit (eBioscience) کے ساتھ فکسنگ اور پارمیبلائز کرکے انجام دیا گیا۔

فاسفوریلیٹڈ پروٹین کی کھوج کے لیے، پیوریفائیڈ سپلینک این کے سیلز کو 1 گھنٹہ کے لیے دوبارہ پیدا ہونے والے انسانی IL-15 (50 ng/ml) کے ساتھ پہلے سے علاج کیا گیا اور پھر Phosflow Fix Buffer I کے ساتھ طے کیا گیا جس کے بعد Phosflow Perm Buffer III (BD بایوسینسز) کے ساتھ پارمیبلائزیشن اور اسٹیننگ اینٹی باڈیز

اپنانے والے سیل کی منتقلی

NK سیل کی پختگی پر Ythdf2 کی کمی کے اثر کا اندازہ لگانے کے لیے، CD45.1 یاYthdf2ΔNK CD45.2 چوہوں سے 1:1 تناسب پر 5 × 106 BM خلیات کا مرکب Rag2−/−Il2rg−/− چوہوں میں منتقل کیا گیا۔ وصول کنندگان کی تشکیل نو کا اندازہ ٹرانسپلانٹیشن کے بعد فلو سائٹومیٹری 8 ہفتہ سے کیا گیا۔

لیمفوپینیا سے متاثرہ ہومیوسٹیٹک پھیلاؤ کے تجربات کے لیے، CD45.1 یا Ythdf2ΔNK CD45.2 چوہوں سے مساوی تعداد میں پیوریفائیڈ splenicNK خلیات کو Rag2−/−Il2rg−/− چوہوں میں منتقل کیا گیا تھا جس کے بعد منتقل شدہ WT2 اور YΔNle سیل کے متعلقہ فیصد کا اندازہ لگایا گیا تھا۔ Rag2−/−Il2rg−/− وصول کنندگان کا بہاؤ سائٹوومیٹری کے ذریعے اشارہ کردہ ٹائم پوائنٹس پر۔

میٹاسٹیٹک میلانوما ماڈل کے لیے، Ythdf2ΔNK یا Ythdf2WTmice سے 106 IL-2–توسیع شدہ NK خلیات Rag2−/−Il2rg−/− چوہوں میں iv لگائے گئے تھے۔ 1 دن بعد، B16F10cells (105) کو چوہوں میں iv انجکشن لگایا گیا۔ انجیکشن کے 14 دن بعد، پوسٹ مارٹم کے تجزیے کے لیے چوہوں کو موت کے گھاٹ اتار دیا گیا۔ کچھ تجربات میں، خلیات کو CTV (5 µM، Invitrogen) کے ساتھ لیبل لگایا گیا تھا تاکہ منتقلی سے پہلے سیل کے پھیلاؤ کا پتہ لگایا جا سکے۔

Vivo کی اسمگلنگ پرکھ میں

BM سے پیریفرل خون میں NK سیل کی اسمگلنگ کا پتہ لگانے کے لیے، 1 µg iv APC- لیبل والا اینٹی CD45 اینٹی باڈی C57BL/6 چوہوں میں لگایا گیا تھا۔ اینٹی باڈی کے انجیکشن کے دو منٹ بعد، تھیمیز کو فوری طور پر ایتھانائز کیا گیا، اور BM سیلز کو فلو سائٹومیٹری کے لیے جمع کیا گیا جب سیلز CD3 اور NK1.1 اینٹی باڈیز سے داغدار ہو گئے۔ پیرینچیمل این کے خلیوں کی شناخت سی ڈی 45 داغ کی کمی کی وجہ سے کی گئی تھی ، جبکہ سینوسائڈل این کے خلیوں کی شناخت سی ڈی 45 لیبلنگ کی موجودگی سے ہوئی تھی۔ لہذا، سینوسائڈز (CD45+) میں NKcells کا تناسب پیرانچیمل علاقوں (CD45−) میں ایک مستحکم حالت میں BM ٹوپیری فیرل خون سے NK سیل کی اسمگلنگ کی نشاندہی کرتا ہے۔

ریئل ٹائم RT-qPCR اور امیونو بلوٹنگ

RNA کو RNeasy Mini Kit (QIAGEN) کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ کیا گیا اور پھر مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق پرائم اسکرپٹ RT ریجنٹ کٹ کے ساتھ gDNA ایریزر (Takara Bio) کے ساتھ cDNA میں نقل کیا گیا۔ mRNA اظہار کی سطحوں کا تجزیہ SYBRGreen PCR ماسٹر مکس اور QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR سسٹم (دونوں تھرمو فشر سائنٹیفک سے) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ پرائمر کے سلسلے ٹیبل S1 میں درج ہیں۔

امیونوبلوٹنگ معیاری طریقہ کار کے مطابق انجام دی گئی تھی، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (ڈینجیٹ ال۔، 2015؛ یو ایٹ ال۔، 2006)۔ درج ذیل اینٹی باڈیز کا استعمال کیا گیا تھا: METTL3 (بلی نمبر 15073-1-AP؛ Proteintech)، METTL14 (cat. no.{5}}AP; Proteintech), YTHDF1 (بلی نمبر 17479-1-AP ; Proteintech), YTHDF2 (cat. no. RN123PW; MBL)، YTHDF3 (بلی نمبر۔{11}}AP; پروٹینٹیک)، ALKBH5 (بلی نمبر ab195377؛ Abcam)،FTO (بلی نمبر ab124892؛ ابکم)، MDM2 (بلی نمبر 33-7100؛ انویٹروجن)، ٹی ڈی پی-43 (بلی نمبر PA5-29949؛ انویٹروجن)، اور ایکٹین (بلی نمبر {{20) } آئی جی؛ پروٹینٹیک)۔

siRNA دستک ڈاؤن پرکھ

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90% جیسا کہ بہاؤ سائٹومیٹری سے ماپا جاتا ہے۔ جینیک ناک ڈاؤن کی کارکردگی کا تعین کیو پی سی آر اور امیونو بلوٹنگ کے ذریعے کیا گیا تھا۔ منتقلی کے بعد 3 ڈی، سیل اپوپٹوسس، اور پھیلاؤ کا تجزیہ بہاؤ سائٹوومیٹری کے ذریعے کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔

لوسیفریز رپورٹر پرکھ

TSS کے –2,000 bp سے +100 bpop کے Ythdf2 پروموٹر کے علاقے کو murine NK خلیات سے بڑھایا گیا تھا اور apGL میں کلون کیا گیا تھا4-بنیادی Luciferase رپورٹر ویکٹر (Promega) تاکہ apGL تیار کیا جا سکے۔ {5}Ythdf2 رپورٹر پلاسمیڈ۔ اے ٹی سی سی سے خریدے گئے HEK293T خلیے pGL4-Ythdf2 رپورٹر پلازمیڈاس کے ساتھ ساتھ STAT5a یا STAT5b اوور ایکسپریشن پلاسمیڈ یا اینیمپٹی ویکٹر کے ساتھ، ایک pRL-TK رینیلا رپورٹر پلازمیڈ (پرومیگا) کے ساتھ ٹرانسفیکشن کو معمول پر لانے کے لیے منتقل کیے گئے تھے۔ خلیوں کو منتقلی کے 24 گھنٹے بعد لیسز کے لئے کاٹا گیا تھا، اور ڈوئل-لوسیفریز سسٹم (پرومیگا) کے ساتھ فلوریمیٹرک طور پر لوسیفریز ایکٹیویٹی کی مقدار طے کی گئی تھی۔ Ythdf2promoter اور STAT5a اور STAT5b اوور ایکسپریشن پلاسمڈ کی کلوننگ کے لیے پرائمر سیکونسز ٹیبل S1 میں درج ہیں۔

ChIP tejs

پیئرس میگنیٹک چِپ کٹ (بلی نمبر 26157؛ تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق ChIP اسسیس کیے گئے تھے۔ مختصراً، مساوی مقدار میں ananti–anti-phospho-Stat5 (Tyr694, cat. No. 9351; Cell Signaling Technologies) یا متعلقہ کنٹرول نارمل خرگوش IgG کو 5 × سے اخذ کردہ کراس سے منسلک ڈی این اے – پروٹین کمپلیکس کو تیز کرنے کے لیے الگ سے استعمال کیا گیا تھا۔ 106 پیوریفائیڈ ماؤس پرائمری NK سیل جو 1 گھنٹے کے لیے IL-15 (50 ng/ml) کے ساتھ پہلے سے تیار کیے گئے تھے۔ کراس لنکنگ کے الٹ جانے کے بعد، اشارہ شدہ اینٹی باڈی کے ذریعہ مدافعتی ڈی این اے کا QPCR کے ذریعہ تجربہ کیا گیا۔ تمام پرائمرز کے سلسلے ٹیبل S1 میں درج ہیں۔

سابق Vivo cytotoxicity پرکھ

NK خلیوں کی سابق vivo cytotoxicity کا اندازہ معیاری 51Crrelease Assays کے ذریعے کیا گیا۔ ماؤس لیمفوما سیل لائنز RMA-S (MHC کلاس Ideficient) اور RMA (MHC کلاس I کافی) خلیات، آندرے ویللیٹ (میک گل یونیورسٹی، مونٹریال، کینیڈا) کا تحفہ، ستارے کے خلیات استعمال کیے گئے تھے۔ چوہوں کا علاج پولی نوسینک کے آئی پی انجیکشن سے کیا گیا: پولی سائیٹائیڈلک ایسڈ [پولی (I: C)؛ 200 µg/چوہوں] 18 گھنٹے کے لیے۔ EasySepMouse NK سیل آئسولیشن کٹ (STEMCELL ٹیکنالوجیز) کا استعمال کرتے ہوئے پولی (I: C) سے متحرک NK خلیات کو تلی سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ پیوریفائیڈ این کے سیلز 5:1، 2.5:1، اور 1.25:1 کے تناسب سے IL-2 (50 U/ml) کی موجودگی میں ہدف والے خلیوں کے ساتھ مل کر بنائے گئے تھے۔

m6A-seq

Purified splenic NK خلیات کو IL-2 (1,000 U/ml,cat. No. Bulk Ro 23-6019; National Cancer Institute) کے ذریعے 7 d کے لیے وٹرو میں بڑھایا گیا۔ کل RNA کو TRIzol reagent (Thermo FisherScientific) کے ذریعے 50 ملین IL-2–توسیع شدہ NK خلیات سے الگ کیا گیا تھا۔ پولیڈینیلیٹڈ آر این اے کو ڈائنابیڈس ایم آر این اے پیوریفیکیشن کٹ (انویٹروجن) کا استعمال کرکے کل آر این اے سے مزید افزودہ کیا گیا تھا۔ mRNA نمونے RNA فریگمینٹیشن ریجنٹس (انویٹروجن) کے ساتھ 100- این ٹی لمبے ٹکڑوں میں بکھرے ہوئے تھے۔

بکھرے ہوئے mRNA (5 µgmRNA) کو m6Aantibody (202003؛ Synaptic) کا استعمال کرتے ہوئے m6A امیونوپریسیپیٹیشن کے لیے میگنا MeRIP m6A Kit (Merck Millipur) کے معیاری پروٹوکول کے بعد استعمال کیا گیا تھا۔ RNA کو RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) کے ذریعے ایک KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche) کے ساتھ لائبریری کی نسل کے لیے افزودہ کیا گیا تھا۔ سیکوینسنگ سٹی آف ہوپ جینومکس کی سہولت میں ایک Illumina HiSeq 2500 مشین پر سنگل ریڈ 50-bp موڈ کے ساتھ انجام دی گئی۔ HISAT2 v101 سافٹ ویئر (Kim et al.

R پیکیج exomePeak (Meng et al. m6Apeaks کو انٹیگریٹیو جینومکس ویور سافٹ ویئر (http://www.igv.org) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا تھا۔ MEME (https://meme-suite.org) اور HOMER(http://homer.ucsd.edu/homer/motif) کے ذریعے m6A- بائنڈنگ شکل کا تجزیہ کیا گیا۔ Rpackage ChIPseeker (Yu et al.، 2015) کا استعمال کرتے ہوئے کہلائی گئی چوٹیوں کو جین فن تعمیر کے ساتھ تقطیع کے ذریعے تشریح کیا گیا تھا۔

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2 (فولڈ تبدیلی)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP-seq

50 ملین IL-2–توسیع شدہ NK خلیات کو ٹھنڈے پی بی ایس کے ساتھ دو بار کاٹا گیا اور دھویا گیا، اور سیل پیلٹ کو 2 والیوم آفلیسس بفر (10 ایم ایم ہیپس، پی ایچ 7.6، 150) کے ساتھ لیس کیا گیا۔ mM KCl، 2 mM EDTA، 0.5% NP-40، 0.5 mM dithiothreitol، 1:100 protease inhibitorcocktail [Thermo Fisher Scientific]، اور 400 U/ml SUPERase-In RNase Inhibitor [Thermo Fisher Scientific])۔

لیسیٹ کو برف پر 5 منٹ کے لئے انکیوبیٹ کیا گیا تھا اور لیسیٹ کو صاف کرنے کے لئے 15 منٹ کے لئے سینٹرفیوج کیا گیا تھا۔ سیل لیسیٹ کا دسواں حجم بطور ان پٹ محفوظ کیا گیا تھا۔ سیل لیسیٹ کا باقی حصہ 5 µg اینٹی YTHDF2 (cat.no. RN123PW؛ MBL) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا جو کہ پروٹین A میگنیٹک بیڈز (بلی نمبر 10001D؛ انویٹروجن) کے ساتھ ملا ہوا تھا۔ 4 ڈگری پر 2 گھنٹے کے ساتھ ہلکی گردش کے ساتھ۔ اس کے بعد، موتیوں کو 1 ملی لیٹر آئس کولڈ واشنگ بفر (50 mM HEPES، pH 7.6,200 mM NaCl، 2 mM EDTA، 0.05% NP-40، 0.5 mM dithiothreitol، اور 200 RNase U/ml) سے پانچ بار دھویا گیا۔ روکنے والا)۔

مدافعتی نمونوں کو 1% SDS اور 2 mg/ml Proteinase K (ThermoFisher Scientific) کے ساتھ واش بفرز میں Proteinase K کے عمل انہضام کا نشانہ بنایا گیا جس میں 1,200 rpm پر 55 ڈگری پر 1 گھنٹے تک ہلایا گیا۔ کل RNA ان پٹ اور امیونوپریسیپیٹیٹڈ RNA دونوں سے 5 والیوم TRIzol ریجنٹ اور اس کے بعد Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research) کو شامل کرکے نکالا گیا تھا۔

cDNA لائبریری ایک KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche) کے ساتھ تیار کی گئی تھی اور Illumina HiSeq 2500 پلیٹ فارم پر ترتیب دی گئی تھی۔ R پیکج RIPSeeker (Li et al. HOMER کو چوٹی والے خطوں میں ڈیٹا کی تقسیم کے نقشوں کو تلاش کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ChIPpeakAnno (Zhu et al.، 2010) کا استعمال کرتے ہوئے جین اور ٹرانسکرپٹ فن تعمیر کے ساتھ تقطیع کے ذریعے کہلائی گئی چوٹیوں کی تشریح کی گئی تھی۔

mRNA استحکام پرکھ

Ythdf2ΔNK اور Ythdf2WT چوہوں سے پیوریفائیڈ سپلینک NK سیلز IL-15 (50 ng/ml) کے ساتھ کلچر کیے گئے تھے۔ کلچر کے 3 دن بعد، خلیوں کا علاج ایکٹینومائسن D (5 µg/ml، بلی نمبر A9415؛ سگما) کے ساتھ کیا گیا۔ علاج کے بغیر خلیات 0 h پر استعمال کیے گئے تھے۔ سیلز کو اشارہ کردہ وقت پر جمع کیا گیا تھا، اور qPCR کے لیے خلیوں سے کل RNA نکالا گیا تھا۔ ایم آر این اے نصف زندگی کا حساب پہلے وینگ ایٹ ال (2018) کے ذریعہ بیان کردہ طریقہ استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ پرائمر کے سلسلے ٹیبل S1 میں درج ہیں۔

آن لائن ڈیٹا بیس کا تجزیہ

ہم نے آن لائن وسائل BioGPS (http://biogps.org) کو Ythdf2 کے ٹشو سے متعلق اظہار کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا۔ RNA-seqdata سیٹ الحاق نمبر کے تحت GEO سے تھے۔ GSE106138, GSE113214, اور GSE25672۔ RNA-seq کے تجزیوں سے معمول کے مطابق ڈیٹا برآمد کیا گیا، اور Gplots Rlibrary کے اندر Heatmap.2 فنکشن کے ساتھ جین ایکسپریشن زیڈ سکور کا تصور کیا گیا۔

شماریات

غیر جوڑی والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ (دو دم والے) گراف پیڈ پرزم سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے کئے گئے۔ ایک طرفہ یا دو طرفہ ANOVA کو اس وقت انجام دیا گیا جب تین یا زیادہ آزاد گروپوں کا موازنہ کیا گیا۔ P قدروں کو Holm-Sˇ´ıdak طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے متعدد موازنہ کے لیے ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ P < 0۔{8}}5 کو اہم سمجھا جاتا تھا۔ *، P < {{10}}.05; **، پی <0.01؛ اور ***، پی <0.001۔

آن لائن اضافی مواد

تصویر. S1 مدافعتی خلیوں میں YTHDF2 کے پروٹین کی سطح کو ظاہر کرتا ہے، بشمول IL-15 محرک، MCMV انفیکشن، اور ٹیومر کے بڑھنے کے جواب میں NK خلیات؛ NKcell کے ساتھ چوہوں کی نسل – Ythdf2 کے مخصوص حذف۔ تصویر میں S2 MCMV سے متاثرہ چوہوں کی تلی اور جگر میں وائرل ٹائٹرز اور MCMV سے متاثرہ چوہوں میں Ly49H+ اور/یا Ly49D+ NKcells کی فیصد اور مطلق تعداد کو ظاہر کرتا ہے۔ انجیر۔ S3 Ythdf2WT اور Ythdf2ΔNK چوہوں سے NK خلیوں کے پھیلاؤ، بقا، پختگی، اور فعال ہونے اور روکنے والے ریسیپٹرز کے اظہار کو ظاہر کرتا ہے۔ تصویر S4 IL-15-STAT5signaling اور IL-15 ریسیپٹرز، PI3K–AKT پاتھ وے، اور Ythdf2WT اور Ythdf2WT سے NK سیلوں میں MEK–ERK پاتھ وے کے اجزاء کے اظہار کے ذریعہ YTHDF2 اظہار کے ضابطے کو ظاہر کرتا ہے۔ چوہوں. انجیر. S5 NK سیلز میں ٹرانسکرپٹوم وسیع RNA-seq، m6A-seq، اور RIP-seq اسسز دکھاتا ہے۔ ٹیبل S1 مطالعہ میں استعمال ہونے والے پرائمر کی فہرست دیتا ہے۔

ڈیٹا کی دستیابی

RNA-seq، m6A-seq، اور RIP-seq ڈیٹا کو الحاق نمبر کے تحت نیشنل سینٹر فار بائیو ٹیکنالوجی انفارمیشن GEO میں جمع کیا گیا تھا۔ جی ایس ای 174027۔ باقی ڈیٹا جو اس مطالعہ کے نتائج کی حمایت کرتا ہے درخواست پر متعلقہ مصنفین سے دستیاب ہیں۔

اعترافات

اس کام کو نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458, اور CA210087)، لیوکیمیا اینڈ لیمفوما سوسائٹی (1364-19)، دی انسٹی ٹیوٹ برائے کیلیف ڈی آئی سی او ({7}})، دی انسٹی ٹیوٹ برائے کیلیف ڈی آئی سی او 9}})، اور بریسٹ کینسر الائنس 2021 غیر معمولی پروجیکٹ ایوارڈ۔ یہ کام جزوی طور پر USDAaward (USDA/NIFA 2020-67017-30843) کے ذریعے بھی تعاون یافتہ تھا۔

مصنفین کی شراکتیں: S. Ma, J. Yu، اور MA Caligiuri نے اس منصوبے کا تصور اور ڈیزائن کیا۔ S. Ma, J. Yan, J. Zhang, and J. یو نے تجربات اور/یا ڈیٹا کا تجزیہ کیا۔ Z. چن، L.-S.Wang، JC Sun، اور J. Chen نے ری ایجنٹس اور مادی مدد فراہم کی۔ S. Ma, J. Yu, J. Chen, اور MA Caligiuri نے کاغذ لکھا، جائزہ لیا، اور/یا نظر ثانی کی۔ تمام مصنفین نے نتائج پر تبادلہ خیال کیا اور مخطوطہ پر تبصرہ کیا۔

انکشافات: J. چن نے Genovel BiotechCorp سے "دیگر" کی اطلاع دی۔ جمع شدہ کام سے باہر اور جینوول بائیوٹیک کارپوریشن کے سائنسی بانی اور ریس آنکولوجی کے سائنسی مشیر ہیں۔ کسی دوسرے انکشاف کی اطلاع نہیں دی گئی۔

حوالہ جات

1.Arase، H.، ES Mocarski، AE Campbell، AB ہل، اور LL Lanier۔ 2002. NKcell ریسیپٹرز کو چالو کرنے اور روک کر سائٹومیگالو وائرس کی براہ راست پہچان۔ سائنس 296:1323–1326۔

2.Ayala, YM, T. Misteli, and FE Baralle. 2008. TDP-43 سائکلن پر منحصر کناز 6 اظہار کے جبر کے ذریعے ریٹینوبلاسٹوما پروٹین فاسفوریلیشن کو منظم کرتا ہے۔ پروک ناٹل اکاد۔ سائنس امریکا. 105:3785–3789۔

3.Barbieri, I., K. Tzelepis, L. Pandolfini, J. Shi, G. Millan-Zambrano, SC Robson, ´D. Aspris, V. Migliori, AJ Bannister, N. Han, et al. 2017. پروموٹر-باؤنڈ METTL3 m6A پر منحصر ٹرانسلیشن کنٹرول کے ذریعے مائیلوڈ لیوکیمیا کو برقرار رکھتا ہے۔ فطرت 552:126–131۔

4. بیکنیل، بی، اور ایم اے کیلیگیوری۔ 2005. Interleukin-2، interleukin-15، اور انسانی قدرتی قاتل خلیوں میں ان کے کردار۔ Adv. امیونول۔ 86:209–239۔

5.برٹولی، سی.، جے ایم سکوتھیم، اور آر اے ڈی بروئن۔ 2013. G1 اور S مراحل کے دوران سیل سائیکل ٹرانسکرپشن کا کنٹرول۔ نیٹ Rev. Mol. سیل بائیول۔ 14:518–528۔

6.Bezman, NA, CC Kim, JC Sun, G. Min-Oo, DW Hendricks, Y. Kamimura, JA Best, AW Goldrath, اور LL Lanier۔ امیونولوجیکل جینوم پروجیکٹ کنسورشیم۔ 2012. قدرتی قاتل خلیوں کی شناخت اور ایکٹیویشن کی مالیکیولر ڈیفینیشن۔ نیٹ امیونول۔ 13:1000–1009۔

کارسن، ڈبلیو ای، جے جی گری، ایم جے لنڈمین، ایم ایل لینیٹ، ایم احدیہ، آر پیکٹن، ڈی اینڈرسن، جے آئزن مین، کے گریبسٹین، اور ایم اے کیلیگیوری۔ 1994. Interleukin (IL) 15 ایک ناول سائٹوکائن ہے جو IL-2 ریسیپٹر کے اجزاء کے ذریعے انسانی قدرتی قاتل خلیوں کو متحرک کرتا ہے۔ J. Exp. میڈ. 180:1395–1403۔

کارسن، WE، TA Fehniger، S. Haldar، K. Eckhert، MJ Lindemann، CF Lai، CM Croce، H. Baumann، اور MA Caligiuri. 1997. انسانی قدرتی قاتل سیل کی بقا کے ضابطے میں انٹرلییوکن-15 کے لیے ایک ممکنہ کردار۔ جے۔ کلین سرمایہ کاری کریں۔ 99:937–943۔

9.Chan, CJ, MJ Smyth, and L. Martinet. 2014. سیلولر تناؤ کے جواب میں قدرتی قاتل سیل ایکٹیویشن کے مالیکیولر میکانزم۔ سیل ڈیتھ ڈیفر۔ 21:5-14۔

10. چن، ایکس، جے ہان، جے چو، ایل ژانگ، جے ژانگ، سی چن، ایل چن، وائی وانگ، ایچ وانگ، ایل یی، وغیرہ۔ 2016. چھاتی کے کینسر کے دماغی میٹاسٹیسیس کے لیے EGFR-CAR NK سیلز اور آنکولیٹک ہرپس سمپلیکس وائرس 1 کی مشترکہ تھراپی۔ آنکوٹارگٹ۔ 7:27764–27777۔

For more information:1950477648nn@gmail.com