ٹرانسکرپٹوم اسمبلی اور جین کی دریافت Cistanche Deserticola Fleshy Stem-Ⅰ

پس منظر

Cistanche deserticola ایک مکمل طور پر غیر فوٹو سنتھیٹک پرجیوی پودا ہے جس کی دواؤں کی قدر ہوتی ہے اور یہ بنیادی طور پر شمال مغربی چین کے صحرا میں تقسیم ہوتا ہے۔ اس کا خشک مانسل تنا ایک اہم ٹانک ہے۔روایتی چینی ادویاتبنیادی طور پر مردانہ جنسی فعل کو بہتر بنانے اور قوت مدافعت کو مضبوط کرنے کے کردار کے ساتھ، لیکن جینومک اور ٹرانسکرپٹومک وسائل کی کمی کی وجہ سے جزوی طور پر کچھ میکانکی مطالعہ کیے گئے ہیں۔

Natural CISTANCHE TUBULOSA چینی روایتی میڈیسن PHGS75% ECH 30% ایکٹ 12%

نتائج

اس مطالعہ میں، ہم نے C. deserticola کے مانسل تنے میں گہرے ٹرانسکرپٹوم کی ترتیب کو انجام دیا، اور HiSeq2000 پلیٹ فارم پر Illumina پیئر اینڈ سیکوینسنگ کا استعمال کرتے ہوئے تقریباً 80 ملین ریڈز تیار کیے گئے۔ تثلیث جمع کرنے والے کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے 200bp سے لے کر 15,698bp تک کے ٹرانسکرپٹ کی لمبائی کے ساتھ 95,787 ٹرانسکرپٹ سیکونس حاصل کیے، جن کی اوسط لمبائی 950 بیسز اور N50 کی لمبائی 1,519 بیسز ہے۔ 63,957 ٹرانسکرپٹس کی شناخت FPKM سے 0.5 سے زیادہ یا اس کے برابر کے ساتھ فعال طور پر کی گئی تھی، جس میں 30,098 ٹرانسکرپٹس کو جین کی تفصیل یا جین آنٹولوجی کی اصطلاحات کے ساتھ کئی عوامی ڈیٹا بیس (Uniprot, NR, اور KEGNC، اور Nt) کے خلاف ترتیب مماثلت کے تجزیوں کے ذریعے بیان کیا گیا تھا۔ . مزید برآں، ہم نے lignin اور phenylethanoid glycosides (PhGs) کے بائیو سنتھیسز میں شامل کلیدی انزائم جینوں کی نشاندہی کی جو بنیادی فعال اجزاء کے طور پر جانا جاتا ہے۔ چار فینی لالینین امونیا لائز (پی اے ایل) جین، لگنن اور پی ایچ جی بائیو سنتھیسس میں پہلا کلیدی انزائم ترتیب کے موازنہ اور فائیلوجنیٹک تجزیہ کی بنیاد پر شناخت کیا گیا۔ پہلی بار پی ایچ جی کے دو بائیو سنتھیسز راستے بھی تجویز کیے گئے تھے۔

نتائج

مجموعی طور پر، ہم نے RNA-seq ٹیکنالوجی کا استعمال کرتے ہوئے C. deserticola fleshy stem transscriptome کا عالمی تجزیہ مکمل کیا۔ لیگنن اور فینی لیتھانائڈ گلائکوسائیڈز کے بائیو سنتھیسس سے متعلق انزائم جینوں کے ایک مجموعہ کی شناخت جمع شدہ اور تشریح شدہ نقلوں سے کی گئی تھی، اور PAL کے جین فیملی کی بھی پیش گوئی کی گئی تھی۔ اس مطالعہ سے حاصل کردہ ترتیب کے اعداد و شمار اس اہم دواؤں کے پودے میں مستقبل میں فینی لیتھانائڈ گلائکوسائیڈز بائیو سنتھیسس ریسرچ اور فنکشنل جینومک اسٹڈیز کے انعقاد کے لیے ایک قیمتی وسیلہ فراہم کریں گے۔

تعارف

C. deserticola Orobanchaceae خاندان سے تعلق رکھنے والے بارہماسی صحرائی پودوں کی ایک عالمی نسل ہے اور یہ مکمل طور پر غیر فوٹو سنتھیٹک نسل ہے اور عام طور پر زیر زمین ہولوپراسٹک پودا اگتا ہے۔ یہ psammophyte Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) کی جڑوں پر طفیلی ہے، جو خشک سالی اور نمکینیت کو زیادہ برداشت کرنے کی وجہ سے بنیادی طور پر صحراؤں اور نیم صحراؤں میں آباد ہے۔ C. deserticola سخت ماحولیاتی حالات کے خلاف سخت مزاحمت ظاہر کرتا ہے اور بنیادی طور پر شمال مغربی چین میں تقسیم کیا جاتا ہے، خاص طور پر اندرونی منگولیا، گانسو اور سنکیانگ میں۔ حالیہ برسوں میں انسانوں کی طرف سے کھپت میں اضافے کی وجہ سے اسے ایک خطرے سے دوچار جنگلی انواع سمجھا جاتا ہے۔ C. deserticola جسے اکثر صحرائی ginseng کہا جاتا ہے اسے عام طور پر صحرائی جھاڑو کے نام سے جانا جاتا ہے اور خشک مانسل تنا کئی سالوں سے چین اور جاپان میں روایتی طور پر اہم ٹانک کے طور پر بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا رہا ہے۔ یہ ابتدائی طور پر تقریباً 1800 سال قبل شین نونگ بین کاو جِنگ (چائنیز میٹیریا میڈیکا کی لغت، 1977) میں درج کیا گیا تھا اور اسے اس کے اہم ذرائع میں سے ایک سمجھا جاتا تھا۔چینی دواؤں کی جڑی بوٹی Cistanche.

جنسی فعل کو بہتر بنانے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ACT 12%

C. deserticola کے نچوڑوں میں وسیع پیمانے پر دواؤں کے افعال ہوتے ہیں، خاص طور پر جنسی فعل کو بہتر بنانے، گردوں کو ٹانیفائی کرنے، جگر کی حفاظت، aperient سرگرمی، یادداشت کو بڑھانے، امیونوموڈولیٹری، اینٹی آکسیڈیٹیو سرگرمی، اینٹی سوزش، اینٹی وائرل سرگرمی وغیرہ میں استعمال کرنے کے لیے۔ C. deserticola کے اہم بایو ایکٹیو اجزاء فینی لیتھانائڈ گلائکوسائیڈز (PheGs, PhGs) ہیں۔ آج تک، C.deserticola کے رسیلی تنے سے 20 سے زیادہ phenylethanoid glycosides کو الگ کر دیا گیا ہے۔ ان میں،ایکٹیوسائیڈ اور ایچیناکوسائیڈاہم فارماسولوجیکل سرگرمیوں کے ساتھ دو اہم اجزاء ہیں اور چینی فارماکوپیا (2005 اور 2010 ایڈیشن) میں C. deserticola کے معیار کے معیار کے طور پر دستاویزی ہیں۔ PhGs کے تین کیمیائی اجزا آرگینک ایسڈ، سیکرائیڈ، اور phenylethanoid ہیں، تاہم، phenylethanoid biosynthetic pathways سے متعلق تفصیلات C.deserticola میں اچھی طرح سے سمجھی نہیں جاتی ہیں۔

C.deserticola کی تجارتی اور دواؤں کی اہمیت کے باوجود، اس نوع کے جینومک اور ٹرانسکرپٹومک ڈیٹا بہت محدود ہیں۔ NCBI ڈیٹا بیس میں کوئی ESTs دستیاب نہیں ہیں اور کلوروپلاسٹ جینوم کی ترتیب کے علاوہ اس نوع کے لیے مکمل جینوم کی معلومات دستیاب نہیں ہے۔ محدود ٹرانسکرپٹومک ڈیٹا پی ایچ جی بائیو سنتھیٹک میکانزم کے مطالعہ میں رکاوٹ ہے۔ RNA-seq ٹکنالوجی ہدف شدہ جینوم کے ظاہر کردہ حصوں کی ترتیب تیار کر سکتی ہے اور NGS ٹیکنالوجی پلیٹ فارمز (جیسے Applied Biosystems SOLiD، Illumina HiSeq، اور Roche 454) کا استعمال کرتے ہوئے جینز [18] کی شناخت کر سکتی ہے۔ یہ ٹرانسکرپٹوم ڈی نوو اسمبلی میں تیزی سے مقبول ہوتا جا رہا ہے، کیونکہ یہ اعلی ریزولیوشن اور وسیع ڈائنامک رینج کے ساتھ ایک سرمایہ کاری مؤثر اور طاقتور طریقہ ہے، خاص طور پر چونکہ اس میں کم کثرت والی ٹرانسکرپٹس کو تلاش کرنے کا فائدہ ہے۔ مختلف فوائد کی وجہ سے، RNA-seq محدود جینیاتی وسائل کے ساتھ غیر ماڈل جانداروں کے لیے خاص طور پر پرکشش ہے۔ تاہم، RNA-seq کے ذریعے C. deserticola transscriptome پر کوئی تفصیلی تحقیق نہیں ہے۔

اس مطالعہ میں، ہم نے Illumina Hiseq2000 پلیٹ فارم کا استعمال کرتے ہوئے C. deserticola کے لیے اسٹیم ٹرانسکرپٹوم کو عالمی سطح پر ترتیب دیا اور 7.9G خام ڈیٹا حاصل کیا۔ اسمبلی اور تشریح کے ذریعے، ہم نے پی ایچ جی کے بائیو سنتھیسز میں شامل جینز اور پورے لگنن بائیو سنتھیسز کے لیے ذمہ دار جینز کی کان کنی کی۔ ہمارے RNA-seq کے تجزیے نے پہلا C. deserticola consensus transscriptome تیار کیا اور C. deserticola کی طبی قدر کی جامع تفہیم کے لیے نئی بصیرتیں فراہم کیں۔ مزید برآں، یہاں بیان کردہ طریقہ کو پروفائل ٹرانسکرپٹومز پر وسیع پیمانے پر لاگو کیا جا سکتا ہے تاکہ انتہائی محدود جینومک وسائل کے ساتھ دوسرے دواؤں کے پودوں میں مخصوص دواؤں کے اجزاء کے بائیو سنتھیسز کے راستوں میں شامل جینوں کی دریافت کو آسان بنایا جا سکے۔

مواد اور طریقے

پودوں کا مواد جمع کرنا

کھدائی کے مرحلے میں C. deserticola کے لیے تازہ رسیلا تنے کو شمال مغربی چین میں اندرونی منگولیا میں Alxa League کے BayanHot شہر میں پودوں کے اڈے سے اکٹھا کیا گیا تھا۔ جمع کرنے کا اجازت نامہ پلانٹ بیس کے مالک (HongKui CongRong Group) سے حاصل کیا گیا تھا۔ واؤچر کا نمونہ بیجنگ انسٹی ٹیوٹ آف جینومکس، چائنیز اکیڈمی آف سائنسز میں کور جینومک سہولت میں جمع کیا گیا تھا۔ صفائی کے بعد، رسیلی تنے کے ٹشوز کو چھوٹے ٹکڑوں میں کاٹا گیا اور فوری طور پر مائع نائٹروجن میں منجمد کر دیا گیا، اور پھر مزید پروسیسنگ تک -80 ڈگری پر محفوظ کر لیا گیا۔

آر این اے نکالنا، سی ڈی این اے لائبریری کی تعمیر، اور ایلومینا کی ترتیب

کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق TRIzol Reagent (Invitrogen Inc.، California، USA) کا استعمال کرتے ہوئے رسیلی تنے سے ٹوٹل RNA نکالا گیا تھا۔ کسی بھی جینومک ڈی این اے کو ہٹانے کے لیے نتیجے میں آنے والے نمونوں کا DNase I کے ساتھ علاج کیا گیا۔ نکالے گئے RNAs کو Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کیا گیا اور ایتھیڈیم برومائڈ سٹیننگ کے ساتھ ڈینیچرنگ ایگروز جیل الیکٹروفورسس کا استعمال کرتے ہوئے سالمیت کی جانچ کی گئی۔ 1.9 اور 2.1 کے درمیان A260/A280 تناسب والے RNA نمونے، RNA 28S:18S تناسب 1.0 سے زیادہ، اور RNA انٹیگریٹی نمبرز (RINs) -8.5 بعد کے تجزیوں میں استعمال کیے گئے۔

RNA-seq لائبریریوں کو Illumina Truseq RNA نمونہ تیاری کٹس کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا۔ پولی (A) + RNA کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق Dynal ligo (dT) 25 موتیوں کا استعمال کرتے ہوئے کل RNA سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ طہارت کے بعد، mRNA کو چھوٹے ٹکڑوں میں توڑنے کے لیے ایک فریگمنٹیشن بفر شامل کیا گیا۔ سپر اسکرپٹ III ریورس ٹرانسکرپٹیس اور N6 رینڈم ہیکسامر پرائمر کے ساتھ ان مختصر حصوں کو ٹیمپلیٹس کے طور پر استعمال کرتے ہوئے فرسٹ اسٹرینڈ سی ڈی این اے کی ترکیب کی گئی۔ سیکنڈ اسٹرینڈ cDNA کو پھر بفر، dNTPs، RNaseH، اور DNA پولیمریز I کا استعمال کرتے ہوئے ترکیب کیا گیا۔ نتیجے میں ڈبل پھنسے ہوئے cDNA کو T4 DNA پولیمریز، DNA پولیمریز I Klenow ٹکڑا، اور T4 polynucleotide kinase کا استعمال کرتے ہوئے اختتامی مرمت کا نشانہ بنایا گیا۔ T4 DNA ligase استعمال کرنے والے اڈاپٹر۔ اڈاپٹر سے منسلک ٹکڑوں کو QiaQuick PCR ایکسٹرکشن کٹ کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیا گیا تھا اور EB بفر کے ساتھ تیار کیا گیا تھا۔ ایگروز جیل الیکٹروفورسس کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کرنے کے بعد، پی سی آر پروردن کے لیے ٹیمپلیٹس کے طور پر مناسب ٹکڑوں کا انتخاب کیا گیا۔ نتیجے میں آنے والی سی ڈی این اے لائبریری کی ترتیب ایلومینا ہائی سیک 2000 سسٹم کے ساتھ کی گئی۔

ٹرانسکرپٹس ڈی نوو اسمبلی اور جین ایکسپریشن کوانٹیفیکیشن

ترتیب سے تیار کردہ خام ریڈز کو اندرون خانہ طریقہ استعمال کرتے ہوئے اڈاپٹر کی ترتیب (ATCTCGTATGCCGTC) کو ہٹا کر صاف کیا گیا۔ اس کے بعد ہم نے کم معیار کی فلٹرنگ کا سخت عمل کیا۔ سب سے پہلے، 20 سے کم فریڈ کوالٹی اسکور والے اڈوں کو ترتیب کے 3' آخر سے تراش دیا جائے گا، جب تک کہ ایک اعلیٰ معیار (20 سے بڑا یا اس کے برابر) کے ساتھ ایک بیس میں نہ چلے جائیں۔ اگر پڑھنے کی لمبائی 50bp سے کم تھی، تو اسے مسترد کر دیا جائے گا۔ دوم، ریڈز کو اس معیار کے مطابق مزید فلٹر کیا جائے گا کہ ایک پڑھنے میں 70% بیسز کے اسکور اعلیٰ معیار کے ہوتے ہیں (20 سے زیادہ یا اس کے برابر)۔ تیسرا، مزید اسمبلی کے لیے صرف پیئرڈ اینڈ ریڈز استعمال کیے گئے۔ ڈی نوو ٹرانسکرپٹ اسمبلی کا انعقاد تثلیث ریلیز کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اسمبلی کے پیرامیٹرز کو ذیل میں ترتیب دیا گیا تھا:-seqType fq-JM 300G -min_contig_length 200-CPU 20-inchworm_cpu {{21} }bflyCPU 20۔

ٹرانسکرپٹ کی کثرت کا اندازہ لگانے کے لیے، ترتیب وار جوڑے کے آخر میں پڑھنے کو تثلیث میں اسکرپٹ کا استعمال کرتے ہوئے اسمبل شدہ ٹرانسکرپٹس کے ساتھ دوبارہ منسلک کیا گیا۔ میپڈ ریڈز کو RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization) سافٹ ویئر کے ذریعے مقدار درست کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ جین یا آئسفارم کی کثرت کی نمائندگی فی ملین فی ملین فریگمنٹ میپڈ (FPKM) ویلیو کے فی کلو بیس کے ٹکڑے کے ذریعہ کی گئی تھی، وہ ٹرانسکرپٹس جن کی FPKM ویلیو 0.05 کے مساوی یا اس سے بڑی تھی بطور اظہار بیان کی گئی تھی۔

اظہار شدہ نقلوں کی فنکشنل تشریح

کلوروپلاسٹ جینوم [1] کے علاوہ C. deserticola کے کوئی جین تشریحی سیٹ نہیں ہیں۔ ہم نے BLAST پروگرام (E< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.

جین اونٹولوجی اور کے ای جی جی پاتھ وے تشریح یونی پروٹ ڈیٹا بیس کی ترتیب سے مماثلت کے مطابق ( تمام اسمبل شدہ ٹرانسکرپٹس کی جین اونٹولوجی (GO) تشریح (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/ سے ڈاؤن لوڈ کی گئی ایسوسی ایشن فائل کا استعمال کرکے حاصل کی گئی تھی۔ ڈیٹابیس/GO/goa/UNIPROT/gene_ association goa_uniprot.gz) کو اپنی مرضی کے مطابق اسکرپٹ کا استعمال کرتے ہوئے جینز کی تشریح کی گئی۔ CC، BP، اور MF کے زمرے الگ الگ۔

آن لائن ٹول KAAS (KEGG آٹومیٹک اینوٹیشن سرور) [34] کا استعمال کرتے ہوئے تمام پیش گوئی شدہ پروٹین کی ترتیبوں کے لیے KEGG پاتھ وے کی معلومات تفویض کی گئی تھی۔ فاسٹا فارمیٹ میں ترتیب کو KAAS کی درخواست پر جمع کرایا گیا، اور C. deserticola stem transscriptome سے متعلق تمام راستوں کی معلومات کے نتیجے میں فائلیں ڈاؤن لوڈ کی گئیں۔ KEGG میں 13 پودوں کے جانداروں کے جین ڈیٹا سیٹ BBH (دو طرفہ بہترین ہٹ) طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے تشریح کے لیے استعمال کیے گئے۔

نیچرل CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE EXTRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

RT-qPCR تجزیہ

DNase I کے ساتھ عمل انہضام کے بعد، oligo (dT) 15 پرائمر اور GoScript ریورس ٹرانسکرپشن سسٹم (پرومیگا) کے ساتھ ریورس ٹرانسکرپشن ری ایکشن کے ذریعے کل RNA کے تقریباً 5ug کو فرسٹ اسٹرینڈ cDNA میں تبدیل کر دیا گیا۔ اس کے بعد cDNA مصنوعات کو ریئل ٹائم پی سی آر میں بطور ٹیمپلیٹ استعمال کرنے سے پہلے نیوکلیز فری ڈیونائزڈ پانی سے 10-گڑھا دیا گیا۔ مخصوص cDNAs کو GoTaq 2-Step RT-qPCR سسٹم (Promega) کے ذریعے 20 ul کے حجم میں بڑھا دیا گیا تھا۔ مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق 7500 ریئل ٹائم پی سی آر ڈیٹیکشن سسٹم (اپلائیڈ بایو سسٹم) کے ساتھ پی سی آر ایمپلیفیکیشن 60 ڈگری کے اینیلنگ درجہ حرارت پر انجام دیا گیا۔ 7500 مینیجر سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے، متعلقہ ٹرانسکرپٹ کی کثرت کا حساب ایک داخلی معیار کے طور پر جین "comp10579_c0" کے ساتھ تقابلی سائیکل تھریشولڈ طریقہ سے کیا گیا۔

RT-PCR کے لیے پرائمر جوڑے آن لائن سافٹ ویئر (http://primer3.ut.ee/) کی بنیاد پر ڈیزائن کیے گئے تھے اور S1 ڈیٹا سیٹ میں درج ہیں۔

نتائج

آر این اے کی ترتیب اور ڈی نوو ٹرانسکرپٹوم اسمبلی آف سی ڈیزرٹیکولا مانسل تنے

C. deserticola کا تنا کئی سالوں سے چین اور جاپان میں روایتی طور پر اہم ٹانک کے طور پر بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا رہا ہے۔ C. deserticola مانسل تنے میں جین کے اظہار کا عالمی جائزہ حاصل کرنے کے لیے، ہم نے بالترتیب 2013 اور 2014 میں اسی پودے کی بنیاد کے C. deserticola اسٹیم کے نمونے جمع کیے تھے۔ کل آر این اے نکالے گئے اور پولی اے + آر این اے کو پیئرڈ اینڈ آر این اے سیک لائبریریوں کی تعمیر کے لیے پاک کیا گیا۔ 79,433,734 اور 86,019,176 پیئر اینڈ ریڈز جو ترتیب کے تقریباً 8 بلین اور 8.6 بلین بیسز کے مطابق ہیں Illumina HiSeq 2000 کی ترتیب کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے گئے تھے۔

پلیٹ فارم 2013-سال اور 2014-سال کے نمونے (ٹیبل 1)۔ اڈاپٹر کی ترتیب کو ہٹانے اور کم کوالٹی ریڈز کو فلٹر کرنے کے بعد (طریقوں میں تفصیلات دیکھیں)، 2013-سال کے نمونے میں 64,831,040 اعلی معیار کے پیئر اینڈ ریڈز ڈی نوو ٹرانسکرپٹوم اسمبلی کے لیے استعمال کیے گئے۔ تثلیث ترتیب جمع کرنے والے [30] کا استعمال کرتے ہوئے، 51,719 جینز اور 95,787 ٹرانسکرپٹ سیکوینسز 200 bp سے لے کر 15,698 bp تک کے ٹرانسکرپٹ کی لمبائی کے ساتھ بنائے گئے۔ اسمبل شدہ ٹرانسکرپٹس کی اوسط لمبائی 950 بیسز اور N50 کی لمبائی 1,519 بیسز ہے۔ مختلف طوالت میں نقلوں کی تعداد نے انکشاف کیا کہ جمع شدہ نقلوں میں سے 57.32% تقریباً 500 bp یا اس سے زیادہ تھی (تصویر 1A)۔ 2014-سال کے نمونے میں اعلیٰ معیار کے جوڑے کے آخر میں پڑھنے کو اسمبل شدہ ٹرانسکرپٹوم میں نقش کیا گیا تھا۔ اس کے علاوہ، ہم نے پایا کہ ہر جمع شدہ جین کا ٹرانسکرپٹ نمبر مختلف ہوتا ہے اور 69٪ جین ایک اظہار شدہ آئسوفارم کے ساتھ ہوتے ہیں جبکہ 31٪ جینوں نے دو یا زیادہ ٹرانسکرپٹس کا اظہار کیا تھا (تصویر 1B)۔

جمع شدہ نقلوں کی اظہار کی مقدار اور فنکشنل تشریح

RSEM پیکیج کا استعمال کرتے ہوئے جین یا ٹرانسکرپٹ کی کثرت کی مقدار درست کی گئی تھی، جس میں ترتیب شدہ ریڈز کو بوٹی کا استعمال کرتے ہوئے اسمبل شدہ جینز یا ٹرانسکرپٹس کی ترتیب کے ساتھ دوبارہ منسلک کیا گیا تھا، اور ان میپڈ ریڈز کو مقدار درست کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ہر ایک جین یا ٹرانسکرپٹ کے لیے FPKM ویلیو کا حساب لگایا گیا، اور آخر کار، ہم نے 63,957 اور 52,857 فعال طور پر ظاہر کردہ ٹرانسکرپٹس (FPKM ویلیو 0.5 سے زیادہ یا اس کے برابر) کی شناخت کی۔ بالترتیب 13 اور 2014۔ 44,776 ٹرانسکرپٹس (2013-سال کے نمونے میں 70.01%، 2014-سال کے نمونے میں 84.71%) کو عام طور پر دو نقلوں میں ظاہر کیا گیا تھا، اور ان کے اظہار کے اعداد و شمار کا باہمی ربط (پیئرسن کے ارتباط کا گتانک: 0.91979) تھا۔ S1 تصویر میں دکھایا گیا ہے۔ ترتیب دینے والا خام ڈیٹا NCBI SRA ڈیٹا بیس پر اپ لوڈ کیا گیا تھا (الحاق نمبر: SRX857402 اور SRX858938)۔ ہم نے مزید تجزیہ کے لیے 2013-سال کے نمونے میں شناخت کیے گئے جینز کا استعمال کیا۔ تمام اظہار شدہ نقلوں کے لیے فنکشنل تشریحی معلومات دو طریقوں سے حاصل کی گئیں۔ سب سے پہلے، تمام ظاہر شدہ ٹرانسکرپٹس کو BLAST الگورتھم کے ذریعے علیحدہ علیحدہ نیوکلیوٹائڈ (GenBank nt) اور پیپٹائڈ سیکوینس ڈیٹا بیس (GenBank nr اور Arabidopsis peptide) کے ساتھ منسلک کیا گیا تھا۔ 63,957 میں سے ظاہر کردہ نقلیں،

29,220 (45.7%) کی تشریح کی گئی اور E-value cutoff 1e-20 کے ساتھ تین مضامین کے ڈیٹا بیس میں سے کسی ایک میں ترتیب کو ہم آہنگی دکھائی گئی۔ دریں اثنا، ٹرانس ڈیکوڈر سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے تمام اظہار شدہ ٹرانسکرپٹ سیکوینسز کے لیے امیدوار کوڈنگ والے علاقوں کی پیش گوئی کی گئی تھی، اور ہر ٹرانسکرپٹ کے لیے سب سے طویل ORFs Pfam ڈومین سرچ کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ نتیجے کے طور پر، Pfam ڈیٹا بیس کی بنیاد پر 21,358 (33.4%) ٹرانسکرپٹس کی تشریح کی گئی۔ مجموعی طور پر، 30,098 (47.1%) ٹرانسکرپٹس کو مذکورہ بالا دو طریقوں کو ملا کر عوامی ڈیٹا بیس میں معلوم جینوں سے نمایاں طور پر ملایا گیا تھا۔ فنکشن تشریح کے ساتھ مکمل اظہار شدہ ٹرانسکرپٹس کی فہرست کو ضمنی ڈیٹا (S2 ڈیٹاسیٹ) میں دکھایا گیا تھا۔

ہم نے سرفہرست 20 سب سے زیادہ اظہار شدہ ٹرانسکرپٹس (ٹیبل 2) کا سروے کیا جو تمام ترتیب وار پڑھنے کے 18.99٪ کے مساوی ہے، اور پتہ چلا کہ ان میں سے زیادہ تر جینز ہیں جو ابیوٹک کا جواب دیتے ہیں۔

کشیدگی کی حوصلہ افزائی. ڈی ہائیڈرن (DHNs)، ہائیڈرو فیلک اور تھرموسٹیبل سٹریس پروٹینز کا ایک طبقہ جس میں چارج شدہ امینو ایسڈز کی ایک بڑی تعداد ہے جو کہ گروپ II لیٹ ایمبریوجینیسیس ایبنڈنٹ (LEA) فیملی سے تعلق رکھتی ہے، سب سے زیادہ اظہار شدہ جین ہے۔ تین مختلف Dehyrin ٹرانسکرپٹس (comp28713_c0_seq1/2/4) کا پتہ لگایا گیا ہے جیسا کہ گوشت والے تنوں میں بہت زیادہ اظہار کیا گیا ہے جو خشکی کے تناؤ کی وجہ سے خلیوں کی حفاظت میں شامل ہو سکتے ہیں۔ تناؤ سے متعلق دیگر جینز جیسے ہیٹ شاک پروٹین، پیتھوجین سے متعلق پروٹین، اور میٹالوتھیونین میں بھی بہت زیادہ اظہار پایا گیا، جس کا تعلق اس کے شدید بقا کے ماحول سے ہوسکتا ہے۔ مزید برآں، کچھ تشکیلاتی جین جن میں 26S رائبوسومل RNA جین (comp22329_c2_seq1)، auxin-repressed/ dormancy سے وابستہ پروٹین (comp20999_c0_seq1)، ADP-ribosylation عنصر (comp20499_ c0_seq1) کو بھی بہت زیادہ نقل کیا گیا تھا۔

PHGS75% ECH 30% ACT 12% قوت مدافعت کو بہتر بنانے کے لیے قدرتی CISTANCHE TUBULOSA