اتپریورتی KRAS (G12C) 3D پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں ٹرانسپوز ایبل عنصر آر این اے ڈیس ریگولیشن

خلاصہ

Mutant KRAS ٹرانسپوز ایبل عنصر (TE) RNA اور interferon-stimulated gene (ISG) اظہار کو منظم کرتا ہے، لیکن یہ واضح نہیں ہے کہ KRAS میں متنوع تغیرات پورے جینوم میں مختلف TE RNAs کو متاثر کرتے ہیں۔ ہم نے 3D انسانی پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز کے ٹرانسکرپٹومز کا تجزیہ کیا جو KRAS (G12C) اتپریورتنوں کو بندرگاہ کرتے ہیں تاکہ اتپریورتی KRAS (G12C) کے ذریعہ ریگولیٹ شدہ TE RNAs کی زمین کی تزئین کا تعین کیا جاسکے۔ ہم نے پایا کہ LINE- اور LTR سے ماخوذ TE RNAs کے اظہار کے لیے KRAS(G12C) سگنلنگ درکار ہے جو کہ TE RNAs سے مختلف ہیں جو پہلے اتپریورتی KRAS(G12D) یا KRAS(G12V) کے ذریعے ریگولیٹ ہوتے دکھائے گئے ہیں۔ مزید برآں، KRAS(G12C) روکنا خاص طور پر سب سے کم عمر Alu ذیلی فیملی AluY سے SINE سے ماخوذ TE RNAs کو اپ گریڈ کرتا ہے۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ KRAS سے چلنے والے پھیپھڑوں کے کینسر کے خلیوں میں TE RNA dysregulation اتپریورتن پر منحصر ہے، جبکہ نوجوان، Alu سے ماخوذ TE RNAs کے ذیلی سیٹ کو بھی اجاگر کرتا ہے جو KRAS (G12C) کی روک تھام پر پیدائشی مدافعتی جین کے ساتھ مربوط طور پر متحرک ہوتے ہیں۔

cistanche tubulosa-antitumor کے فوائد

تعارف

ٹرانسپوز ایبل عنصر (TE) RNAs کینسر کے تناظر میں بار بار غیر منظم ہوتے ہیں 1. اتپریورتی KRAS پھیپھڑوں کے کینسر کے خلیات میں، KRAB زنک فنگر (KZNF) جینز کو بڑے پیمانے پر کم کیا جاتا ہے، جس کی وجہ سے TE RNAs کی غیر معمولی اپ گریجولیشن ہوتی ہے جو LINE اور SINE سے حاصل ہوتی ہے۔ LTR عناصر 2,3۔ TE RNAs کے علاوہ، لمبے نان کوڈنگ RNAs (lncRNAs) کو بھی RAS سگنلنگ جین 4 کے ساتھ مربوط طریقے سے ریگولیٹ کیا جاتا ہے، اور ان کے اظہار کے پیٹرن کو اسی طرح بہت سے کینسروں میں تبدیل کیا جاتا ہے 5-8۔ TE RNAs کے لیے، کینسر میں ان کا اپ گریجولیشن وائرل مِیکری کی حالت کو جنم دیتا ہے، جس کے نتیجے میں فطری قوت مدافعت والے جینز جیسے کہ انٹرفیرون محرک جینز (ISGs) 3,9,10 کی اندرونی سرگرمی ہوتی ہے۔ خاص طور پر، SINEs کا Alu خاندان امیونوجینک TE RNAs 11 کا ایک اہم ذریعہ ہے، جو DNA methyltransferase inhibitors (DNMTi) یا اتپریورتی KRAS-ثالثی KZNF روک 3,9,10 کی وجہ سے ہونے والی ایپی جینیٹک تبدیلیوں کی وجہ سے ہوتا ہے۔

یہ جاننے کے لیے کہ کس طرح KRAS میں ایک عام تغیر پھیپھڑوں کے کینسر کے خلیوں میں TE RNA زمین کی تزئین کو متاثر کرتا ہے، ہم نے 3D پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز کے ٹرانسکرپٹوم کی خصوصیت کی جو کہ KRAS(G12C) اتپریورتنوں کو اتپریورتی KRAS(G12C) inhibitor 12 کی موجودگی یا غیر موجودگی میں روکتے ہیں۔ کہ KRAS(G12C) سگنلنگ لائن اور LTR سے ماخوذ TE RNAs کے اظہار کے لیے درکار ہے، جب کہ KRAS(G12C) روکنا خاص طور پر SINE سے ماخوذ TE RNAs اور انٹرفیرون (IFN) سے متعلق جین کے ذیلی سیٹ کو اپ گریڈ کرتا ہے۔ ہماری دریافتوں سے پھیپھڑوں کے کینسر کے خلیوں میں اتپریورتی KRAS سگنلنگ اور TE dysregulation کے درمیان پیچیدہ تعامل کا پتہ چلتا ہے، جہاں نوجوان AluY عناصر کے ایک متعین سیٹ کو اتپریورتن پر منحصر انداز میں الگ کیا جاتا ہے۔

cistanche tubulosa-antitumor کے فوائد

نتائج

KRAS(G12C) روکنا کوڈنگ اور نان کوڈنگ ٹرانسکرپٹوم کو تبدیل کرتا ہے۔

اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ کس طرح آنکوجینک KRAS(G12C) سگنلنگ کوڈنگ اور نان کوڈنگ ٹرانسکرپٹوم کو منظم کرتا ہے، ہم نے 3D اتپریورتی KRAS(G12C) پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز پر RNA سیکوینسنگ (RNA-seq) انجام دیا۔ RNA-seq کے لیے، ہم نے PCR ایمپلیفیکیشن تعصبات 13 (شکل 1A) کو کم کرتے ہوئے عین RNA گنتی کو قابل بنانے کے لیے 5' منفرد مالیکیولر آئیڈینٹیفائرز (UMIs) کے ساتھ ایک مکمل طوالت کا پروٹوکول استعمال کیا۔ ہم نے H358 پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز کے ٹرانسکرپٹوم کا موازنہ KRAS(G12C) inhibitor ARS-1620 (ARS) سے کیا تاکہ اسفیرائڈز کو کنٹرول کیا جا سکے (DMSO-treated) (Figure S1A) اور دیکھا کہ ARS کے علاج نے فاسفوریلیٹڈ ERK کی سطح کو کافی حد تک کم کیا۔ (p-ERK) (شکل S1B)، اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ ARS کا علاج نیچے کی طرف سے KRAS (G12C) سگنلنگ کو روک رہا ہے۔ اے آر ایس کے علاج کے ذریعہ KRAS (G12C) سگنلنگ کو دبانے کا ثبوت اسفیرائڈ سائز اور سیل کی قابل عملیت (فگر S1C اور S1D) میں کمی سے بھی ہوا۔

RNA کی سطح پر، ہم نے ARS- یا DMSO سے علاج شدہ 3D پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں مختلف بائیو ٹائپس اور TE سپر فیملیز کی نسبتا کثرت کا اندازہ کیا، جس نے KRAS (G12C) کی روک تھام (شکل 1B) پر TE RNA کی ساخت میں متحرک تبدیلیوں کا انکشاف کیا۔ جب کہ ہم نے صرف 32% GENCODE- تشریح شدہ پروٹین کوڈنگ جینز اور 15% lncRNA جینز کا پتہ لگایا، ہمارے UMI ٹیگ میں % TE سپر فیملیز (92% LTR، 95% SINE، 96% LINE) کی نمائندگی کی گئی RNA-seq ڈیٹا، KRAS (G12C) سے چلنے والے ٹرانسکروم میں TE RNAs کی وسیع بے ضابطگی کو ظاہر کرتا ہے۔ اے آر ایس سے علاج شدہ پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں پائے جانے والے تمام آر این اے مالیکیولز میں سے ایک چوتھائی تک TEs سے اخذ کیے گئے تھے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ TE RNAs اتپریورتی KRAS (G12C) پھیپھڑوں کے کینسر کے خلیوں کی نقل کی پیداوار کے ایک بڑے حصے کی نمائندگی کرتے ہیں۔

مردوں کے لئے cistanche فوائد - مدافعتی نظام کو مضبوط

Cistanche Enhance Immunity مصنوعات دیکھنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

【مزید پوچھیں】 ای میل:cindy.xue@wecistanche.com / واٹس ایپ: 0086 18599088692 / وی چیٹ: 18599088692

اس کے بعد ہم نے حیاتیاتی عمل کی نشاندہی کرنے کے لیے ARS- اور DMSO سے علاج شدہ 3D پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز کے درمیان نمایاں طور پر ظاہر کردہ جین کا تعین کیا جو oncogenic KRAS (G12C) سگنلنگ کے ذریعے ریگولیٹ کیے گئے تھے۔ برقرار KRAS (G12C) سگنلنگ کے ساتھ پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز G2M چیک پوائنٹ، E2F اہداف، MYC اہداف، اور mitotic spindle (شکل 1C) میں شامل جینوں کے لیے نمایاں طور پر افزودہ تھے۔ KRAS(G12C) کی روک تھام پر، تاہم، پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز نے آکسیڈیشن فاسفوریلیشن، تکمیلی، اور IFN الفا اور گاما ردعمل (شکل 1C) میں شامل جینوں کی نمایاں طور پر اعلی سطح کا اظہار کیا، جو کہ ضابطے میں KRAS سگنلنگ کی شمولیت کے لیے مزید معاون ثبوت فراہم کرتے ہیں۔ IFN سے متعلقہ جینز 2,3۔

KRAS(G12C) روکنا ہم آہنگی سے ISGs اور نوجوان AluY عناصر کی حوصلہ افزائی کرتا ہے

KRAS (G12C) کی روک تھام پر ISGs کے اندرونی اپ گریجولیشن کو مزید واضح کرنے کے لئے، ہم نے شناخت کیا کہ بالترتیب ہر جین سیٹ اور TE سپر فیملی میں کون سے جین اور TE نمایاں طور پر فرق ظاہر کیے گئے تھے۔ IFN الفا اور IFN گاما رسپانس جینز دونوں میں، پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں KRAS(G12C) کی روک تھام پر سب سے زیادہ مضبوطی سے حوصلہ افزائی کرنے والا جین RTP4 (Figure 2A) تھا، ایک رسیپٹر ٹرانسپورٹر پروٹین جو TBK1 سگنلنگ 14 کو منفی طور پر کنٹرول کرتا ہے۔ مزید برآں، MHC کلاس I کمپلیکس۔ جین بیٹا-2-مائکروگلوبلین (B2M)، جو پھیپھڑوں کے کینسر 15 میں بار بار غیر فعال ہوتا ہے، ARS سے علاج شدہ پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز (شکل 2A) میں IFN سے متعلقہ دونوں جین سیٹوں میں بھی نمایاں طور پر اپ گریڈ کیا گیا تھا۔

TE RNA ریگولیشن 3 میں oncogenic KRAS سگنلنگ کے لیے براہ راست کردار کو دیکھتے ہوئے، ہم نے تفتیش کی کہ TE RNAs کے کون سے ذیلی خاندان اتپریورتی KRAS (G12C) پر منحصر تھے۔ برقرار KRAS (G12C) سگنلنگ کے ساتھ پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں، ہم نے پایا کہ لائن ذیلی فیملیز L1M6B اور L1PA12 انتہائی اظہار اور KRAS (G12C) پر منحصر ہیں، جیسا کہ ARS (شکل 2B) کے ساتھ علاج کیے جانے والے پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں ان کی کمی کا ثبوت ہے۔ مزید برآں، جبکہ صرف ایک DNA ذیلی فیملی MER44D KRAS(G12C) سگنلنگ پر منحصر تھی، ایک درجن سے زیادہ LTR ذیلی فیملیز کو اتپریورتی KRAS(G12C) کے ذریعے منظم کیا گیا، بشمول MLT1A0-int, LTR51, MER50B ، اور LTR1B0 (شکل 2B)۔ اس کے برعکس، SINE ذیلی فیملیز کو KRAS (G12C) کی روک تھام پر نمایاں طور پر اپ گریڈ کیا گیا تھا اور پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں مخصوص ISG جینز (شکل 2A) کے ساتھ ہم آہنگی کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی تھی۔ یہ SINE TE RNAs سبھی AluY ذیلی فیملی (شکل 2B) سے اخذ کیے گئے تھے، جو اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ KRAS(G12C) کی روک تھام نوجوان AluY عناصر کے ایک مخصوص ذیلی سیٹ کو غیر منظم کرتی ہے۔

KRAS(G12C) روکنا طویل نان کوڈنگ RNAs کو کم کرتا ہے۔

ٹرانسکرپٹوم پر KRAS (G12C) کی روک تھام کے اثرات کو مزید واضح کرنے کے لئے، ہم نے ARS یا DMSO کنٹرول کے ساتھ علاج کیے جانے والے پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں نمایاں طور پر ظاہر کردہ lncRNAs کی جانچ کی۔ ہم نے پایا کہ lncRNAs کی ایک بڑی تعداد اپنے اظہار کے لئے KRAS (G12C) سگنلنگ پر منحصر تھی، کیونکہ ان میں سے بہت سے lncRNAs کو KRAS (G12C) کی روک تھام (شکل 3A) پر نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا۔ ان میں سے تین نیچے lncRNAs، AC114546.3، NCMAP-DT، اور AC073575.2، کے کوئی معروف فنکشن نہیں ہیں لیکن بالترتیب ZNF770، RCAN3، اور ERP29 کوڈنگ جینز کو اینٹی سینس واقفیت میں اوورلیپ کرتے ہیں۔ نان کوڈنگ آر این اے کی ایک کلاس کے طور پر، ہم نے پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز (شکل 3B) میں اے آر ایس کے علاج پر lncRNAs کی وسیع کمی کو دیکھا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ بہت سے lncRNAs اپنے اظہار کے لیے KRAS (G12C) سگنلنگ پر منحصر ہیں۔

مردوں کے لئے cistanche فوائد - مدافعتی نظام کو مضبوط

بحث

یہاں ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ مخصوص TE سپر فیملیز کے اظہار کے لیے آنکوجینک KRAS(G12C) سگنلنگ درکار ہے، یعنی LINE اور LTR عناصر کے ساتھ ساتھ lncRNAs کا ایک ذیلی سیٹ، مزید یہ ظاہر کرتا ہے کہ RAS سگنلنگ نان کوڈنگ ٹرانسکرپٹوم 2-4 کو کیسے منظم کرتی ہے۔ ہم نے اپنے KRAS(G12C) روکنے والے تجربات کے لیے ایک 3D پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈ ماڈل کا بھی استعمال کیا کیونکہ 2D کلچر ماڈلز 16 کے مقابلے میں 3D ماڈلز کو زیادہ دیانتداری کے ساتھ ان ویوو دوائیوں کے ردعمل کو دوبارہ بیان کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے۔ مزید برآں، UMI پر مبنی ہماری درخواست -لمبائی RNA-seq تکنیک 13 نے ہمیں اپنے RNA-seq ڈیٹا میں PCR ڈپلیکیٹس کو ہٹا کر ہمارے پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں TE RNA کی ساخت اور حرکیات کو زیادہ درست طریقے سے پکڑنے کی اجازت دی۔

ہمارے نتائج KRAS(G12C) کی روک تھام کے پچھلے مطالعات سے مطابقت رکھتے ہیں، جہاں IFN الفا اور گاما رسپانس جینز کو ARS سے علاج شدہ H358 پھیپھڑوں کے کینسر کے خلیات 17 میں اپ گریڈ کیا گیا تھا۔ Alu سے ماخوذ RNAs 11 کی معلوم امیونوجینک خصوصیات کی بنیاد پر، ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ KRAS(G12C) کی روک تھام پر نوجوان AluY عناصر کی مخصوص اپ گریجشن کم از کم جزوی طور پر ARS سے علاج شدہ پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں ISGs کی مضبوط اپ گریجشن کے لیے ذمہ دار ہے۔ خاص طور پر، KRAS(G12C) روکنے والے علاج کے جواب میں IFN سے متعلقہ جینوں کی نمایاں افزودگی میں RNA سینسر ISGs جیسے MDA-5، RIG-I، یا PKR کی مزید اپ گریجشن شامل نہیں ہے، جو کہ ابتدائی طور پر اس میں اپ گریجوٹ ہو جاتے ہیں۔ آنکوجینک KRAS سگنلنگ 2,3 کے جواب میں پھیپھڑوں کے خلیات۔

ہم نے پہلے دکھایا ہے کہ اتپریورتی KRAS سگنلنگ انسانی پھیپھڑوں کے خلیوں میں TE RNA اپ گریجولیشن کو دلانے کے لئے کافی ہے جو وٹرو 2,3 میں تبدیل ہو چکے ہیں، اور ہمارے یہاں بیان کردہ نتائج ان مشاہدات کو پھیپھڑوں کے کینسر کے خلیوں تک پھیلاتے ہیں جس میں ایک مختلف فعال KRAS اتپریورتن ہے۔ KRAS(G12D) یا KRAS(G12V) اتپریورتن دونوں پھیپھڑوں کے تبدیل شدہ خلیات 3 میں LTR12C ذیلی فیملی کی نمایاں اپ گریجشن کو آمادہ کرتے ہیں، لیکن ہم نے اپنے KRAS (G12C) پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں LTR12C سے ماخوذ TE RNAs کی نمایاں افزودگی نہیں دیکھی۔ اس کے بجائے، ہم نے LTR51، LTR1B0، LTR14B، اور LTR28B کو اپ گریجولیشن دیکھا، جو تجویز کرتا ہے کہ KRAS میں مختلف فائن آف فنکشن میوٹیشنز TE RNA ٹرانسکرپٹوم کے مختلف پہلوؤں کو منظم کرتی ہیں۔

ہمارا کام اس بات کا ایک جامع جائزہ فراہم کرتا ہے کہ نان کوڈنگ/TE RNA ٹرانسکروم متحرک طور پر KRAS(G12C) کی روک تھام کا جواب کیسے دیتا ہے۔ مستقبل کے مطالعے KRAS(G12C) روکنے والے مزاحمت کے میکانزم میں نان کوڈنگ/TE RNAs کے ممکنہ کردار کے بارے میں نئی ​​بصیرت فراہم کر سکتے ہیں۔ مزید برآں، TE RNAs جو KRAS کی روک تھام پر کینسر کے خلیات سے چھپے ہوتے ہیں وہ ایکسٹرا سیلولر RNA بائیو مارکر 2,3,5,18,19 کے ردعمل اور/یا KRAS inhibitor علاج 20 کے خلاف مزاحمت کے طور پر کام کر سکتے ہیں۔

مواد اور طریقے

سیل لائنز

H358 پھیپھڑوں کے کینسر کی سیل لائنیں جن میں KRAS(G12C) میوٹیشن شامل ہے کو RPMI 1640 میڈیم (انویٹروجن) میں 37 ڈگری پر 10% فیٹل بوائن سیرم (سگما) کے ساتھ مل کر مرطوب انکیوبیٹر میں 5% CO2 کے ساتھ کلچر کیا گیا تھا۔ تمام سیل لائنوں کا مائکوپلاسما کے لیے منفی تجربہ کیا گیا۔ سیل لائنیں امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن (اے ٹی سی سی) سے خریدی گئیں۔

سیل وابستگی کی جانچ

اسفیرائڈ وائبلٹی اسسیس کے لیے، 10،000 خلیات/کنویں کو کم چپکنے والی گول نیچے 96-کنویں پلیٹوں میں سیڈ کیا گیا تھا اور 24 گھنٹے کے لیے 37 ڈگری، 5% CO2 پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ پھر سلیری طور پر پتلا ہوا ARS- 1620 یا DMSO سیلوں میں شامل کیا گیا، اور پلیٹوں کو 72 گھنٹے تک معیاری ثقافتی حالات میں انکیوبیٹ کیا گیا، روزانہ تازہ ARS اور DMSO میڈیا کو تبدیل کیا گیا۔ مینوفیکچرر پروٹوکول کے مطابق سیل ٹائٹر-گلو® Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega) کا استعمال کرتے ہوئے سیل کی عملداری کی پیمائش کی گئی۔ ARS کے علاج شدہ نمونوں کے luminescence سگنل کو DMSO کنٹرول میں معمول بنایا گیا تھا۔ Luminescence ایک SpectraMax iD3 مالیکیولر ڈیوائس پر ماپا گیا۔

آر این اے تنہائی

مینوفیکچرر پروٹوکول کے مطابق Quick-RNA Mini-Prep kit (Zymogen) کا استعمال کرتے ہوئے کل بلک RNA کو تقریباً 100 H358 spheroids (فی شرط) سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ RNA کی مقدار نینو ڈراپ-8000 سپیکٹرو فوٹومیٹر کے ذریعے طے کی گئی۔

RNA-seq لائبریری کی تیاری

ایک موافقت پذیر Smart-seq3 پروٹوکول 13 کا استعمال کل RNA سے RNA-seq لائبریریوں کو بنانے کے لیے کیا گیا تھا تاکہ پوری لمبائی والے RNA مالیکیولوں کو شمار اور اندازہ کیا جا سکے۔ مختصراً، کل RNA کا 10ng بار کوڈ شدہ oligoDT پرائمر (125nM) کا استعمال کرتے ہوئے ریورس ٹرانسکرائب کیا گیا جس کے بعد بار کوڈ شدہ ٹیمپلیٹ سوئچ اولیگو (125nM) کے ساتھ ٹیمپلیٹ سوئچنگ کی گئی۔ یہ اولیگو تسلسل پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے لیے پرائمر کے طور پر کام کرتے ہیں۔ Nextera HT کٹ (Illumina) کا استعمال cDNA لائبریریوں کو UMI- مخصوص پرائمر کے اضافے کے ساتھ ترتیب والی لائبریریوں میں تبدیل کرنے کے لیے کیا گیا تھا تاکہ سالماتی بارکوڈز پر مشتمل cDNA سروں کو بڑھایا جا سکے جیسا کہ Smart-seq3 پروٹوکول میں بیان کیا گیا ہے۔ سی ڈی این اے اور لائبریری کے معیار کا اندازہ Agilent bioanalyzer DNA ہائی سنسیٹیویٹی چپ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا اور Qubit 3.0 پر ہائی حساسیت DNA پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئی۔

مغربی دھبہ

ARS یا DMSO علاج کے بعد تقریباً 100 H358 spheroids (فی شرط) کو الگ تھلگ کر دیا گیا تھا۔ اس کے بعد Spheroids کو RIPA بفر میں برف پر 15 منٹ تک پروٹیز انحیبیٹر کے ساتھ ملایا گیا۔ اس کے بعد لائسیٹس کو 10،000 RCF پر 10 منٹ تک کاتا گیا۔ اس کے بعد سپرنٹنٹ کو لیملی بفر میں SDS-PAGE نمونے کی تیاری کے لیے ایک نئی ٹیوب میں منتقل کیا گیا، 1mg/ml کی حتمی حراستی کے لیے 95 C پر 5 منٹ کے لیے ابالا گیا۔ ایس ڈی ایس پیج کو سائز کے لحاظ سے پروٹین کو الگ کرنے کے لئے انجام دیا گیا تھا جس کے بعد پی وی ڈی ایف جھلی میں منتقلی کی گئی تھی۔ جھلیوں کو پرائمری p-ERK (CST) اور HSP90 (CST) اینٹی باڈیز کے ساتھ راتوں رات 4 C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ ثانوی اینٹی باڈیز (Abcam) کو بعد میں امیجنگ کے لیے بلاکنگ بفر میں 3 بار TBST سے دھوئی گئی جھلیوں پر انکیوبیٹ کیا گیا۔

مردوں کے لئے cistanche فوائد - مدافعتی نظام کو مضبوط

UMI ڈپلیکیشن

پیئرڈ اینڈ ایلومینا ریڈز کو ڈیفالٹ سیٹنگز کے ساتھ فاسٹ پی 21 کا استعمال کرتے ہوئے اڈاپٹر کو تراشا گیا تھا۔ UMIs کو پڑھنے سے نکالا گیا تھا اور umi_tools_UMI-tools پیکیج 22 سے اقتباس کا استعمال کرتے ہوئے ریڈ نام میں منتقل کیا گیا تھا جس میں بارکوڈ پیٹرن "NNNNNNNN" پر سیٹ کیا گیا تھا۔ UMI ہٹائے گئے ریڈز کو GENCODE v38 تشریح سیٹ کے ساتھ STAR الائنر کا استعمال کرتے ہوئے HG38 کے خلاف منسلک کیا گیا تھا۔ الائنڈ ریڈز کو ڈیفالٹ سیٹنگز کے ساتھ "UMI-tools dedup" کا استعمال کرتے ہوئے نقل کیا گیا تھا۔

RNA-seq تجزیہ

تمام فاسٹ کیو فائلوں کو Trimmomatic 2 (0.38) 23 کے ساتھ تراشا گیا تھا اور نتیجے میں تراشی ہوئی فائلوں کا اندازہ FastQC 24 کے ساتھ کیا گیا تھا اور پھر مندرجہ ذیل تجزیاتی پائپ لائن کے ساتھ کارروائی کی گئی تھی: سالمن (1.3۔{7}}): RNA کی pseudoalignment -seq مندرجہ ذیل دلائل کا استعمال کرتے ہوئے سالمن 25 کے ساتھ پرفارم کیا گیا: {{1{{20}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 کا استعمال کرتے ہوئے GENCODE ورژن 35 ٹرانسکرپٹوم فاسٹا فائل سے تیار کردہ ایک انڈیکس انتخابی سیدھ کو فعال کرنے کے لیے decoy sequences کا استعمال کرتے ہوئے۔ اسی طرح کے انداز میں ایک اضافی، TE- آگاہ انڈیکس بنایا گیا تھا لیکن UCSC Repeat Masker ٹریک سے تیار کردہ ترتیبوں کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا تھا۔ DESeq2 (1.32.0): سالمن آؤٹ پٹ کو tximport 26 کا استعمال کرتے ہوئے DESeq آبجیکٹ میں درآمد کیا گیا تھا اور معیاری دلائل 27 کے ساتھ امتیازی اظہار کا تجزیہ کیا گیا تھا۔ تمام نتائج کو padj <0.05 رکھنے کے لیے فلٹر کیا گیا تھا۔ جہاں گنتی کا ڈیٹا استعمال کیا گیا تھا، اسے DESeq کا استعمال کرتے ہوئے تمام نمونوں میں معمول بنایا گیا تھا۔

جین سیٹ افزودگی کا تجزیہ

DESeq2 کے ذریعہ تیار کردہ سکڑتے ہوئے log2FoldChange قدروں کے ذریعہ امتیازی طور پر ظاہر کردہ جینوں کی درجہ بندی کی گئی۔ جین سیٹ R پیکیج msigdbr (7.4.1) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے گئے تھے اور صرف 'ہال مارک' اسٹیٹس والے جین سیٹ پر مشتمل ہونے کے لیے فلٹر کیے گئے تھے۔ R پیکیج fgsea (1.18۔{7}}) کا استعمال جین سیٹ افزودگی کے تخمینے بنانے کے لیے کیا گیا تھا جو کہ ایڈجسٹ شدہ pvalues ​​< 0.05 کے ساتھ نتائج میں فلٹر کیے گئے تھے۔

حوالہ جات

1. برنس، کے ایچ (2017)۔ کینسر میں ٹرانسپوز ایبل عناصر۔ نیٹ ریو کینسر 17، 415-424۔ 10.1038/nrc.2017.35.

2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., ET رحمہ اللہ تعالی. (2020)۔ اتپریورتی KRAS کے ذریعہ دہرائے جانے والے نان کوڈنگ RNAs اور IFN محرک جینوں کی ایپی جینومک ری پروگرامنگ۔ bioRxiv، 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.

3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L .، ET رحمہ اللہ تعالی. (2022)۔ اتپریورتی KRAS ٹرانسپوز ایبل عنصر RNA اور KRAB زنک فنگر جینز کے ذریعے پیدائشی قوت مدافعت کو منظم کرتا ہے۔ سیل رپورٹس 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.

4. Kim, DH, Marinov, GK, Pepke, S., Singer, ZS, He, P., Williams, B., Schroth, GP, Elowitz, MB, and Wold, BJ (2015)۔ سنگل سیل ٹرانسکرپٹوم تجزیہ ری پروگرامنگ کے دوران lncRNA اظہار میں متحرک تبدیلیوں کو ظاہر کرتا ہے۔ سیل سٹیم سیل 16، 88-101۔ 10.1016/j.stem.2014.11.005.

5. Reggiardo, RE, Maroli, SV, and Kim, DH (2022)۔ سوزش اور کینسر کے LncRNA بائیو مارکر۔ Adv Exp Med Biol 1363، 121-145۔ 10.1007/978-3-030-92034-0_7۔

6. Schmitt, AM, and Chang, HY (2016)۔ کینسر کے راستے میں طویل نان کوڈنگ RNAs۔ کینسر سیل 29، 452-463۔ 10.1016/j.ccell.2016.03.010

7. رِن، جے ایل، اور چانگ، ایچ وائی (2020)۔ لانگ نان کوڈنگ آر این اے: آرگنزم کے افعال کے لیے مالیکیولر موڈیلیٹیز۔ Annu Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem- 062917-012708.

8. Slack, FJ, and Chinnaiyan, AM (2019)۔ آنکولوجی میں نان کوڈنگ آر این اے کا کردار۔ سیل 179، 1033-1055۔ 10.1016/j.cell.2019.10.017۔

9. Chiappinelli, Katherine B., Strissel, Pamela L., Desrichard, A., Li, H., Henke, C., Akman, B., Hein, A., Rote, Neal S., Cope, Leslie M. ، Snyder، A.، et al. (2015)۔ ڈی این اے میتھیلیشن کو روکنا dsRNA بشمول اینڈوجینس ریٹرو وائرس کے ذریعے کینسر میں انٹرفیرون ردعمل کا سبب بنتا ہے۔ سیل 162، 974-986۔ 10.1016/j.cell.2015.07.011.

10. Roulois, D., Loo Yau, H., Singhania, R., Wang, Y., Danesh, A., Shen, Shu Y., Han, H., Liang, G., Jones, Peter A., پگ، ٹریور جے، وغیرہ۔ (2015)۔ DNA-Demethylating ایجنٹ اینڈوجینس ٹرانسکرپٹس کے ذریعے وائرل مِمکری کو آمادہ کرکے کولوریکٹل کینسر کے خلیوں کو نشانہ بناتے ہیں۔ سیل 162، 961-973۔ 10.1016/j.cell.2015.07.056.

11. مہدی پور، پی.، مارہون، ایس اے، ایتابی، آئی.، چکرورتی، اے، حسینی، اے، وانگ، وائی، ڈی کاسترو، ایف اے، لو یاؤ، ایچ، اسحاق، سی، ایبلسن، ایس .، ET رحمہ اللہ تعالی. (2020)۔ ایپی جینیٹک تھراپی الٹی SINEs اور ADAR1 انحصار کی نقل کی حوصلہ افزائی کرتی ہے۔ فطرت 588، 169-173۔ 10.1038/s41586-020-2844-1۔

12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA, and Shokat, KM (2013)۔ K-Ras(G12C) inhibitors allosterically GTP وابستگی اور اثر کرنے والے تعاملات کو کنٹرول کرتے ہیں۔ فطرت 503، 548- 551۔ 10.1038/Nature12796.

13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR, and Sandberg, R. (2020)۔ Smart-seq3 کا استعمال کرتے ہوئے ایلیل اور آئسفارم ریزولوشن پر سنگل سیل RNA کی گنتی۔ نیٹ بائیو ٹیکنالوجی 38، 708-714۔ 10.1038/s41587-020- 0497-0۔

14. He, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK, et al. (2020)۔ RTP4 IFN-I ردعمل کو روکتا ہے اور تجرباتی دماغی ملیریا اور نیوروپیتھولوجی کو بڑھاتا ہے۔ Proc Natl Acad Sci USA 117، 19465- 19474۔ 10.1073/pnas.2006492117.

15. Pereira, C., Gimenez-Xavier, P., Pros, E., Pajares, MJ, Moro, M., Gomez, A., Navarro, A., Condom, E., Moran, S., Gomez- لوپیز، جی، وغیرہ۔ (2017)۔ پھیپھڑوں کے کینسر کے لیے مریض سے ماخوذ زینوگرافٹس کی جینومک پروفائلنگ B2M غیر فعال ہونے کی نشاندہی کرتی ہے جو مدافعتی نظام کو متاثر کرتی ہے۔ کلین کینسر ریس 23، 3203-3213۔ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946۔

16. Sen, C., Freund, D., and Gomperts, BN (2022)۔ پھیپھڑوں کے تین جہتی ماڈل: ماضی، حال اور مستقبل: ایک چھوٹا جائزہ۔ بائیو کیم سوک ٹرانس 50، 1045-1056۔ 10.1042/BST20190569۔ 17. Mugarza, E., van Maldegem, F., Boumelha, J., Moore, C., Rana, S., Llorian Sopena, M., East, P., Ambler, R., Anastasiou, P., Romero -Clavijo، P.، et al. (2022)۔ علاج کے KRAS (G12C) روکنا امیونوجینک پھیپھڑوں کے کینسر میں موثر انٹرفیرون ثالثی اینٹیٹیمر استثنیٰ کو چلاتا ہے۔ Sci Adv 8, eabm8780۔ 10.1126/sciadv.abm8780۔

18. Khojah, R., Reggiardo, RE, Ozen, M., Maroli, SV, Carrillo, D., Demirci, U., and Kim, DH (2022)۔ اتپریورتی KRAS (G12C) پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما خلیوں کے ایکسٹرا سیلولر آر این اے دستخط۔ bioRxiv، 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.

19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF, اور Demirci, U. (2021)۔ ٹیومر تھراپی کے لئے مائکرو فلائیڈک پر مبنی Exosome تنہائی اور پتہ لگانے کی طرف۔ نینو ٹوڈے 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.

20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F., and Malek, S. (2021)۔ RAS سے ھدف شدہ علاج۔ نیٹ ریو ڈرگ ڈسکو۔ 10.1038/s41573-021-00220-6۔

21. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., and Gu, J. (2018)۔ فاسٹ پی: ایک الٹرا فاسٹ آل ان ون FASTQ پری پروسیسر۔ بایو انفارمیٹکس 34، i884-i890۔ 10.1093/bioinformatics/bty560.

22. Smith, T., Heger, A., and Sudbery, I. (2017)۔ UMI-tools: منفرد مالیکیولر آئیڈینٹیفائرز میں ماڈلنگ کی ترتیب کی غلطیاں تاکہ مقدار کی درستگی کو بہتر بنایا جا سکے۔ جینوم ریس 27، 491- 499۔ 10.1101/gr.209601.116.

23. Bolger, AM, Lohse, M., and Usadel, B. (2014)۔ ٹرمومیٹک: ایلومینا سیکوینس ڈیٹا کے لیے ایک لچکدار ٹرمر۔ بایو انفارمیٹکس 30، 2114-2120۔ 10.1093/bioinformatics/btu170۔

24. Brown, J., Pirrung, M., and McCue, LA (2017)۔ FQC ڈیش بورڈ: FastQC کے نتائج کو ویب پر مبنی، انٹرایکٹو، اور قابل توسیع FASTQ کوالٹی کنٹرول ٹول میں ضم کرتا ہے۔ بایو انفارمیٹکس۔ 10.1093/bioinformatics/btx373۔

25. Patro, R. Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, and Kingsford, C. (2017)۔ سالمن ٹرانسکرپٹ اظہار کی تیز رفتار اور تعصب سے آگاہ مقدار فراہم کرتا ہے۔ نیٹ طریقے 14، 417-419۔ 10.1038/nmeth.4197.

26. سونسن، سی، محبت، ایم آئی، اور رابنسن، ایم ڈی (2015). RNA-seq کے لیے مختلف تجزیے: نقل کی سطح کے تخمینے جین کی سطح کے تخمینے کو بہتر بناتے ہیں۔ F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.

27. Love, MI, Huber, W., and Anders, S. (2014). DESeq2 کے ساتھ RNA-seq ڈیٹا کے لیے فولڈ تبدیلی اور بازی کا معتدل تخمینہ۔ جینوم بائیول 15، 550. 10.1186/s13059-014- 0550-8۔

اعترافات

ہم مفید بات چیت کے لیے کم لیب کے اراکین کا شکریہ ادا کرتے ہیں۔ اس کام کو باسکن سکول آف انجینئرنگ (ڈی ایچ کے) کے فنڈز سے تعاون حاصل تھا۔ DC کو تمباکو سے متعلق بیماریوں کے تحقیقی پروگرام (T30DT0997) کی طرف سے پریڈاکٹرل فیلوشپ ایوارڈ کے ذریعے تعاون حاصل تھا، RER کو نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ (1F99DK {7}})، اور VP کو تمباکو سے متعلقہ بیماریوں کے تحقیقی پروگرام (T32DT4904) کی طرف سے پریڈاکٹرل فیلوشپ ایوارڈ سے تعاون حاصل تھا۔

مصنف کی شراکتیں۔

DHK تصوراتی تحقیق، DC اور DHK نے ڈیزائن کردہ تحقیق، DC، JL، اور GM نے تجربات کیے، RER اور VP نے ڈیٹا کا تجزیہ کیا، اور DC اور DHK نے مصنفین کے ان پٹ کے ساتھ مقالہ لکھا۔

اعداد و شمار

شکل 1. KRAS(G12C) روکنا کوڈنگ اور نان کوڈنگ ٹرانسکرپٹوم A. تجرباتی اسکیمیٹک کو تبدیل کرتا ہے۔ B. GENCODE کوڈنگ، lncRNA، اور TE/repeat superfamilies کو ARS-treated (ars) یا DMSO-treated (dmso) پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈ RNA-seq لائبریریوں میں شمار کی تقسیم، جہاں ہر کالم حیاتیاتی نقل کی نمائندگی کرتا ہے۔ C. اہم جین سیٹ افزودگی کے تجزیہ کے نتائج جن کا مشاہدہ DMSO-علاج شدہ (دائیں، مثبت NES) یا ARS-علاج شدہ (بائیں، منفی NES) پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز میں کیا گیا ہے جن کی درجہ بندی نارملائزڈ افزودگی سکور (NES) سے ہوتی ہے۔

شکل 2. KRAS(G12C) روکنا ہم آہنگی سے ISGs اور نوجوان AluY عناصر کو آمادہ کرتا ہے

A. آتش فشاں پلاٹ جو DMSO-علاج شدہ (دائیں، مثبت فولڈ چینج) یا ARS-علاج شدہ (بائیں، منفی تہہ کی تبدیلی) پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز کے درمیان کلیدی جین سیٹوں میں مشاہدہ کرنے والے اہم تفریق اظہار کو ظاہر کرتے ہیں۔ B. آتش فشاں پلاٹ جو TE سپر فیملیز میں DMSO-علاج شدہ (دائیں، مثبت تہہ میں تبدیلی) یا ARS-علاج شدہ (بائیں، منفی فولڈ چینج) پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز کے درمیان نمایاں تفریق اظہار کو ظاہر کرتے ہیں۔

شکل 3. KRAS(G12C) روکنا طویل نان کوڈنگ RNAs کو کم کرتا ہے۔

A. GENCODE پروٹین کوڈنگ RNAs اور lncRNAs کے DMSO-علاج شدہ (دائیں، مثبت فولڈ چینج) یا ARS-علاج شدہ (بائیں، منفی فولڈ چینج) پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز کے درمیان نمایاں تفریق اظہار کا آتش فشاں پلاٹ۔ B. GENCODE پروٹین کوڈنگ RNAs اور lncRNAs کے DMSO-علاج شدہ (اوپر، مثبت فولڈ چینج) یا ARS-علاج شدہ (نیچے، منفی فولڈ چینج) پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز (ولکوکسن) کے درمیان نمایاں امتیازی اظہار کا باکس پلاٹ۔

سپلیمنٹری فگر

شکل S1۔

A. H358 3D پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز کا علاج ARS یا DMSO سے کیا جاتا ہے۔ B. P-ERK اور HSP90 کے لیے ویسٹرن بلاٹ H358 3D پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز کا استعمال کرتے ہوئے جن کا علاج ARS یا DMSO سے کیا جاتا ہے۔ C. قطر کی پیمائش (مائیکرو میٹرز میں) (بائیں پلاٹ) اور سیل وائبلٹی (سیل ٹائٹر-گلو® لیومینیسنٹ سیل وائبلٹی) رشتہ دار فلوروسینس یونٹس میں (دائیں پلاٹ) H358 3D پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز کے بعد ARS یا DMSO کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے۔ علاج کے 3 یا 5 دن (500 nM ARS-1620 یا DMSO)۔ D. H358 3D پھیپھڑوں کے کینسر کے اسفیرائڈز کے قطر کی پیمائش (مائیکرو میٹرز میں) جس کا علاج 7 دنوں تک ARS-1620 (nM) کی مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔