انگور اور شراب کے آکسیڈیشن کے ممکنہ مارکر کے طور پر (پلس) کیٹیچن—لاکیس ڈائمرک ری ایکشن پروڈکٹس کا غیر مبہم NMR ساختی تعین

مزید تفصیلات کے لیے رابطہ کریں:tina.xiang@wecistanche.com

خلاصہ:( پلس) -کیٹیچن —لاکیسآکسیکرنdimeric معیارات trametes Versicolor سے laccase کا استعمال کرتے ہوئے Hemi-synthesized تھے pH 3.6 پر ایک واٹر ایتھنول حل ہے۔ آٹھ ممکنہ آکسیکرن ڈائمرک مصنوعات کے مساوی آٹھ حصوں کا پتہ چلا۔ فریکشن پروفائلز کا موازنہ دو دیگر oxidoreductases کے ساتھ حاصل کردہ پروفائلز سے کیا گیا:پولیفینول آکسیڈیسBotrytis cinerea سے انگور اور laccase سے نکالا گیا۔ پروفائلز بہت ملتے جلتے تھے، حالانکہ کچھ معمولی اختلافات نے ان انزائمز کے رد عمل میں ممکنہ تفاوت کا مشورہ دیا تھا۔ اس کے بعد 1D اور 2D NMR سپیکٹروسکوپی کے ذریعے پانچ حصوں کو الگ تھلگ اور تجزیہ کیا گیا۔ ایسٹون میں حل ہونے والے نمونوں میں کیڈمیم نائٹریٹ کے نشانات کے اضافے سے فینولک پروٹون کے NMR سگنل مکمل طور پر حل ہو گئے، جس سے چھ رد عمل کی مصنوعات کے غیر مبہم ساختی تعین کی اجازت دی گئی، جن میں سے ایک حصہ دو enantiomers پر مشتمل ہے۔ ان مصنوعات کو مزید آکسیڈیشن مارکر کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے تاکہ وائن میکنگ اور وائن ایجنگ کے دوران وائن میں ان کی موجودگی اور ارتقاء کی تحقیقات کی جا سکیں۔

مطلوبہ الفاظ: آکسیکرن مارکر؛(پلس)کیٹیچن؛ فینولک NMR سگنلز؛ کمی کیڈیمیم نائٹریٹ؛ پولیفینول آکسیڈیس

مزید معلومات حاصل کرنے کے لیے کلک کریں۔

1. تعارف

پولیفینولکیمیائی مرکبات کا ایک خاندان ہے جو فطرت میں وسیع پیمانے پر موجود ہے۔ یہ چائے [1]، کوکو [2,3]، بلیو بیری [4]، انگور [5l] اور خمیر شدہ مصنوعات جیسے شراب [6] میں کافی مقدار میں پائے جاتے ہیں۔ بنیادی آکسیکرن اہداف J7,8] ہونے کے ناطے، پولیفینول کی کیمیائی ساخت مسلسل تیار ہوتی رہتی ہے۔ یہ تبدیلیاں کئی قسم کے کھانے کی آرگنولیپٹک خصوصیات کو متاثر کرتی ہیں۔ وہ فوڈ براؤننگ [9] اور شراب کی حسی خصوصیات میں ترمیم [10,11] جیسے مظاہر کے ذمہ دار ہیں۔ علمیات میں، یہ آکسیکرن رجحان انگور یا شراب میں ہوتا ہے۔ انزیمیٹک آکسیکرن کے بارے میں، براؤننگ کے لیے ذمہ دار اہم انزائمز oxidoreductases ہیں، زیادہ واضح طور پر،پولیفینول آکسیڈیسBotrytis cinerea کے ذریعہ تیار کردہ انگور اور laccase میں موجود ہے [12]۔

انزیمیٹکآکسیکرنبنیادی طور پر انگور مسٹ میں پایا جاتا ہے، لیکن مزید وائن براؤننگ کیمیائی آکسیڈیشن ری ایکشن کی وجہ سے ہو سکتی ہے |7,13]یا Botrytis cinerea laccase جو کہ شراب کی عمر کے دوران بہت مستحکم ہو سکتی ہے۔ فینولک سبسٹریٹس پر دو آکسیڈیشن انزیمیٹک سرگرمیاں ہو سکتی ہیں: مونوفینول آکسیڈیز سرگرمی جو کہ موجودہ ہائیڈروکسیل گروپ سے ملحقہ پوزیشن کے ہائیڈروکسیلیشن کی خصوصیت ہے اور آرتھو-ڈائی ہائیڈروکسی بینزینس کے آرتھو-بینزوکوئنز کے آکسیڈیشن کے مطابق ڈیفینول آکسیڈیز سرگرمی۔

بین الاقوامی یونین آف بائیو کیمسٹری اینڈ مالیکیولر بائیولوجی (NC-IUBMB) کی نام سازی کمیٹی کے مطابق، یہ انزائیمیٹک سرگرمیاں EC1-کلاس انزائمز کے ذریعے اتپریرک ہوتی ہیں جو آکسیڈوریکٹیسز سے مطابقت رکھتی ہیں۔ ان میں، پولی فینول آکسیڈیشن کو اتپریرک کرنے والے oxidoreductases کی تین اہم کلاسیں EC1.14.18.1 (monophenol monooxygenase)، EC1.11.1 (peroxidase/POD)، اور EC1.10.3 (oxidoreductases diphenols پر کام کرتی ہیں) ہیں۔

اس آخری طبقے کو مختلف ذیلی طبقات میں تقسیم کیا گیا ہے، اور ان میں سے دو اس مطالعے کے لیے خاص طور پر دلچسپ نظر آئے: EC1.10.3.1(polyphenol oxidase/PPO) اور EC1.10.3.2 (laccase) (ضمنی مواد کی شکل S1 دیکھیں)۔

PPO، laccase، اور peroxidase oxidoreductases ہیں جو بنیادی طور پر انگور کی پروسیسنگ کے دوران بھوری ہونے کے لیے ذمہ دار ہیں [13]۔ پھلوں میں POD کی وجہ سے براؤننگ نہ ہونے کے برابر ہے لیکن PPO[15] کے ساتھ مل کر فینول کے انحطاط کو بڑھا سکتا ہے۔ پی پی او قدرتی طور پر انگوروں میں موجود ہوتا ہے اور مونوفینول کے آکسیڈیشن کو کیٹیکولز اور کیٹیکولز سے بھورے رنگ کے روغن [8,13,16] کو متحرک کرنے کے قابل ہے۔ Botrytis سے متاثرہ انگوروں میں پائے جانے والے Laccases میں وسیع تر ایکشن سپیکٹرم ہوتا ہے اہم laccases کے آکسیکرن اہداف 1-2 اور 1-4 dihydroxybenzene باقی ہیں۔

شراب میں، آکسیڈیشن (PPO یا laccases) کے ذریعہ تیار کردہ benzoquinone اپنی ریڈوکس خصوصیات اور الیکٹرانک وابستگیوں کے لحاظ سے آسانی سے مزید ردعمل سے گزر سکتے ہیں [15]۔ وہ یا تو الیکٹرو فائلز کے طور پر کام کر سکتے ہیں اور امینو ڈیریویٹوز [18] کے ساتھ رد عمل ظاہر کر سکتے ہیں یا آکسیڈنٹ کے طور پر کام کر سکتے ہیں اور فینولک سبسٹریٹس کے ساتھ، دوسروں کے درمیان رد عمل ظاہر کر سکتے ہیں۔ ان کی کیمیائی ساخت (کوئنون یا سیمی کوئنون) پر منحصر ہے، بینزوکوئنون مختلف آکسیکرن رد عمل کی مصنوعات کا باعث بن سکتی ہے۔ غیر جانبدار پی ایچ پر، (پلس) -کیٹچن کو A-رنگ پوزیشن C5 یا C7 پر کوئینون میں آکسائڈائز کیا جائے گا اور چھ ممکنہ ڈائمرک آئیسومرز کی تشکیل کا باعث بنے گا جو B-رنگ پوزیشن C2', C5'، یا کے درمیان تعلق کا اشارہ دے گا۔ اوپری کیٹیچن یونٹ کا C6 اور نچلی یونٹ کی A-ring پوزیشن C6 یا C8 [19,20]۔ Dehydrodicatechin اس جوڑے کی ایک معروف پیداوار ہے [21]۔ ڈھانچے کی لیبلنگ پوزیشنز کو شکل 1 میں دکھایا گیا ہے۔ تیزابی حالات میں، سیمی کوئنون کی شکلیں B-رنگ (پوزیشن OH3'یا OH4') پر بھی موجود ہو سکتی ہیں اور اس کے ساتھ چار ممکنہ dimeric isomers [20,22] کا باعث بنتی ہیں۔ اوپری کیٹیچن یونٹ اور نچلے یونٹ کی A-رنگ (پوزیشن C6 یا C8)۔ پچھلے مطالعات [22,23] میں کیٹیچن انزیمیٹک آکسیکرن کی چھان بین کی گئی تھی، اور اس سے وابستہ آکسیکرن مصنوعات کی خصوصیات HPLC [24] کی گئی تھی، حالانکہ زیادہ شاذ و نادر ہی الگ تھلگ اور کبھی بھی NMR کی طرف سے مکمل طور پر خصوصیت نہیں کی گئی تھی۔

اس کام کا مقصد سب سے پہلے UHPLC-MS کی طرف سے dimeric(plus)-catechin آکسیڈیشن پروڈکٹس پروفائلز کا موازنہ کرنا تھا جو کہ تین آکسیڈورڈکٹیس ایکسٹریکٹس کی موجودگی میں، یعنی انگور سے نکالے گئے PPO، بوٹریٹائزڈ میٹھی شرابوں میں موجود فنگس Botrytis cinerea سے laccase۔ [14]، اور Trametes Versicolor سے laccase.

دوسرا مقصد NMR سپیکٹروسکوپی کے ذریعے کچھ ڈائمرک آکسیڈیشن مصنوعات کے ڈھانچے کو hemisthesize اور خصوصیت کرنا تھا جو Trametes Versicolor سے laccase کے ساتھ حاصل کیا گیا تھا۔

2. نتائج اور بحث

2.1 Dimeric Reaction پروڈکٹس پروفائلز کا موازنہ تین مختلف Oxydoreductases اور (plus)-Catechin کے ساتھ

(پلس) -کیٹیچن کو پہلے ماڈل شراب کے محلول میں pH3.6 پر Trametes Versicolor سے laccase کی موجودگی میں آکسائڈائز کیا گیا تھا۔ بقایا (پلس) -کیٹیچن اور دیگر پولیمرک فریکشنز سے ڈائمرک فریکشن کو الگ کرنے کے بعد، UHPLC-UV-MS کے ذریعہ آٹھ بڑے فریکشنز کو اکٹھا کیا گیا اور ان کا تجزیہ کیا گیا، N1 سے N8 کو برقرار رکھنے کے ٹائم آرڈر میں اضافہ میں نوٹ کیا گیا (ٹیبل 1)۔ مثبت موڈ میں الیکٹرو سپرے ماس سپیکٹرا نے N1 سے N6 کے لیے m/z 579 پر آئن کی چوٹیوں [M plus H] پلس کو دکھایا، جو فرضی طور پر دو کیٹیچن اکائیوں کے درمیان ایک بانڈ سے بننے والے ڈائمر سے مطابقت رکھتا ہے، اور [M پلس H] جمع m/577 N7 اور N8 کے لیے، فرضی طور پر ایک اضافی ربط کی تشکیل کی تجویز کرتا ہے۔

یہ آٹھآکسیکرنپچھلے کاموں [25,26] میں ٹینن فریکشن کی کیمیائی ڈیپولیمرائزیشن کے بعد ممکنہ طور پر مختلف حصوں کا مشاہدہ کیا گیا تھا اور ممکنہ طور پر وہی ہوسکتا ہے جیسا کہ Guyot et al نے پہلے ہی بیان کیا ہے۔ [20]، چاہے تجرباتی حالات قدرے مختلف ہوں۔ درحقیقت، اس پچھلے مطالعہ میں، ایک خام پی پی او نچوڑ pH3 اور 6 پر آٹھ حصوں کو حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ موجودہ مطالعہ میں، ماڈل شراب کے حل میں پی ایچ 3.6 پر تین مختلف انزائمز کا موازنہ کیا گیا۔ تین مختلف خامروں (Trametes Versicolor سے laccase، Botrytis cinerea سے lac-case، اور انگور سے نکالا polyphenol oxidase) کے ساتھ حاصل کردہ بڑے آکسیڈیشن فریکشنز کا LC-MS تقابلی تجزیہ ٹیبل 2 میں پیش کیا گیا ہے۔ آٹھ حصوں میں سے ہر ایک کے لیے، برقرار رکھنے کے اوقات مختلف خامروں کے ساتھ تقریبا ایک جیسے تھے، اور اسی طرح کے m/z کا تعین MS تجزیہ کے ساتھ کیا گیا تھا۔ یہ نتائج اس مفروضے کی تائید کرتے ہیں کہ ہر ایک انزائم کے لیے ایک ہی حصے حاصل کیے گئے تھے، جس میں گائیوٹ ایٹ ال کے قیاس کردہ ڈھانچے سے ملتی جلتی مصنوعات شامل تھیں۔ [20]۔ Lopez-Serrano اور Ros Barcel6 [27] نے دو مختلف انزائمز کے ساتھ کیٹیچن آکسیڈیشن پروڈکٹس کا تقابلی مطالعہ بھی کیا: پیرو آکسیڈیز اور پولیفینول آکسیڈیز، دونوں اسٹرابیریوں سے نکالے گئے ہیں۔ انہوں نے یہ نتیجہ اخذ کیا کہ دو خامروں کے ساتھ حاصل کردہ مصنوعات معیار کے لحاظ سے ایک جیسی تھیں۔ M/z=578 Th اور Rt=15.66 منٹ کے ساتھ N4' نامی ایک اضافی مرکب Botrytis cinerea سے laccase کے ساتھ تجربات میں دیکھا گیا اور PPO نکالا گیا لیکن Trametes Versicolor سے laccase کے ساتھ نہیں، جو ممکنہ فرق بتاتا ہے۔ ان انزائمز کے رد عمل میں۔

2.2 1H-NMR Phenolic اور Aliphatic OH سگنلز پر فزیک کیمیکل پیرامیٹرز کا مطالعہ اور اصلاح

NMR تجزیہ کے ذریعہ procyanidins dimers کی ساختی خصوصیات حاصل کی جا سکتی ہیں۔ خاص طور پر، HMBC اور/یا ROESY کوریلیشن سپیکٹرا [28,29] (اعداد و شمار S2 اور S3) کا استعمال کرتے ہوئے یونٹس کے درمیان قطع تعلقی کی پوزیشن کا تعین کیا جا سکتا ہے۔ ایتھر قسم (COC) بانڈ کی صورت میں، ہائیڈروکسیل سگنل پروٹون کا انتساب ضروری ہے۔ یہ CC ربط کے معاملے میں بھی اہم ہو سکتا ہے اگر کچھ aliphatic یا aromatic protons overlap ہو جائیں یا اگر کچھ کلیدی ارتباط غائب ہوں۔ تاہم، ایک اپروٹک سالوینٹ میں بھی، پولیفینول کے ہائیڈروکسیل پروٹون اکثر وسیع سگنل کے طور پر ظاہر ہوتے ہیں جن سے کوئی ساختی معلومات حاصل نہیں کی جا سکتی ہیں [30]۔ کے نشانات کے اضافے سے اس مسئلے کو عارضی طور پر حل کیا گیا تھا۔

نمونے کے حل میں Cd(NO3)2۔ درحقیقت، 'OH گروپوں کے H وسیع سگنل ان OH پروٹانوں اور سالوینٹ یا محلول میں دوسرے پروٹون کے درمیان بین سالماتی تبادلے کی وجہ سے ہیں۔ بین مالیکیولر بانڈز کو کم کرنے سے، نمونوں میں کیڈیمیم نائٹریٹ کی موجودگی ان تبادلوں کو کم کر سکتی ہے، اس طرح OH پروٹون سگنلز کی نفاست کو بہتر بنا سکتی ہے۔

2.2.1.کیڈیمیم کے اضافے کا اثر

منجمد خشک ہونے کے بعد، پانچ حصوں N2، N3، N4، N6، اور N8 کو ایسیٹون-dg میں حل کیا گیا۔ پھر، 1D پروٹون NMR سپیکٹرا 25 ڈگری سے پہلے (شکل 2A) اور تھوڑی مقدار میں کیڈیمیم (شکل 2B) کے اضافے کے بعد حاصل کیا گیا۔ خالص ایسیٹون ڈی میں، تمام حصوں کے فینولک OH پروٹون وسیع چوٹیوں کے طور پر نمودار ہوئے۔ کیڈیمیم کے اضافے کے بعد، ان پروٹونوں نے فریکشن N6 اور N8 کے معاملے میں انتہائی حل شدہ سگنلز دکھائے، جب کہ فریکشن N2، N3، اور N4 کے لیے سگنلز کچھ زیادہ ہی تیز تھے۔ یہ بھی ذکر کیا جانا چاہئے کہ سی ڈی کے مواد میں اضافہ کا OH سگنل ریزولوشن پر کوئی اثر نہیں پڑا، کیونکہ جب نمونوں میں سی ڈی کی لگاتار چھوٹی مقدار شامل کی گئی تھی (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا) تو چوٹی کی لائن وڈتھ کی کوئی نفاست یا وسعت نہیں دیکھی گئی۔

مصنوعات N2، N3، اور N4 سے انتہائی حل شدہ فینولک OH سگنل اضافی خشک کرنے اور حل کرنے کی بدولت حاصل کیے گئے (شکل 2C، D)۔

مختلف حصوں کے درمیان Cd کے اضافے پر رویے کے فرق کی وضاحت مالیکیولر تعامل کی طاقت سے کی جا سکتی ہے: N2، N3، اور N4 کے معاملے میں N6 اور N8 کے مقابلے میں زیادہ مضبوط، ان بانڈز کو توڑنے کے لیے ایک اور قدم ضروری ہے۔

یہ اضافی مرحلہ کلیدی قدم ہو سکتا ہے جب کسی بھی صورت حال میں انتہائی حل شدہ فینولک OH سگنلز حاصل کرنے کے لیے Cd کا استعمال کرتے ہوئے، نمونوں کی اصل، ترکیب کا رد عمل، یا قدرتی پولی فینولک مصنوعات کچھ بھی ہوں۔

کی غیر مبہم ساختی خصوصیات سے نمٹنے والا ایک پچھلا کامپولیفینولکیڈیمیم نائٹریٹ کے اضافے کی بدولت انتہائی حل شدہ OH فینولک NMR سگنلز کا استعمال کرتے ہوئے dimers 1996[30] میں شائع ہوئے۔ ہمارے علم کے مطابق، اس طریقہ کار کو استعمال کرنے والا کوئی دوسرا تحقیقی مقالہ تب سے شائع نہیں ہوا۔ اس مقصد تک پہنچنے کے لیے بعد میں دیگر تحقیقات کی گئیں، یا تو پکرک ایسڈ کی مقدار میں اضافے کے ذریعے [31] یا کم حصول درجہ حرارت [32] کا استعمال کرکے۔ جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، Cd کے اضافے کے ساتھ OH چوٹی کی نفاست پر فیصلہ کن اثر حاصل کرنے کے لیے ضروری مزید قدم سے اس کی وضاحت کی جا سکتی ہے۔ تاہم، ایسا لگتا ہے کہ کیڈیمیم بہت اہمیت کا حامل ہے، کیونکہ کم درجہ حرارت پر پکرک ایسڈ یا NMR سپیکٹرا کے حصول کے برعکس، انتہائی حل شدہ سگنلز درست مقدار میں اضافے کی ضرورت کے بغیر حاصل کیے جا سکتے ہیں۔

2.2.2 درجہ حرارت کا اثر

درجہ حرارت میں 25 ڈگری سینٹی گریڈ سے 15 ڈگری تک کمی کا فینولک OH یا aliphatic OH سگنلز کی نفاست پر کوئی اثر نہیں پڑا۔ اس کے باوجود، قابل تبادلہ پروٹون چوٹیوں کی ڈاون فیلڈ شفٹوں نے ہمیں کچھ اوور لیپنگ فینولک اور ایلیفیٹک OH سگنلز کو الگ کرنے کی اجازت دی، جس سے ان کی شناخت زیادہ واضح ہو گئی (شکل 3)۔ درجہ حرارت کو کم کرنے سے، پروٹون کے تبادلے کی شرح کم ہو گئی، اور کسی کو تیز الفاٹک OH چوٹیوں کی توقع ہو سکتی ہے [31]۔ 15 ڈگری کا درجہ حرارت واضح طور پر اتنا کم نہیں ہے کہ اچھی طرح سے حل شدہ الیفاٹک OH سگنل حاصل کر سکے۔ تاہم، اس نے ہمیں نمونے N3 اور N6 میں دو aliphatic OH پروٹون کی گونج کو واضح طور پر شناخت کرنے کی اجازت دی اور ایک نمونہ N8 میں۔ نمونہ N2 کے سپیکٹرم میں دو OH الیفاٹک پروٹون سگنلز بھی دکھائے گئے، جو کہ 15 ڈگری (شکل 2E) کے مقابلے 25 ڈگری سینٹی گریڈ پر زیادہ ممتاز تھے۔ سپیکٹرا، چاہے درجہ حرارت 25 ڈگری پر سیٹ کیا گیا ہو یا 15 ڈگری سینٹی گریڈ پر، مسلسل اوورلیپنگ کی وجہ سے (شکل 2E)۔

2.3. Dimeric معیارات کی ساختی خصوصیات—NMR سپیکٹرم تجزیہ

فریکشن N2، N3، N4، N6، اور N8 کے NMR سپیکٹرا سے پتہ چلتا ہے کہ آکسیڈیشن پروڈکٹس اعلیٰ پاکیزگی کے حامل تھے کیونکہ دیگر دریافت شدہ مرکبات کے سگنل کی شدت ان مصنوعات کے مقابلے میں 10 فیصد سے کم تھی۔

تمام سپیکٹرا میں، کیٹیچن اکائیوں کے چار lH کیمیکل شفٹ والے علاقوں کو الگ کیا جا سکتا ہے (شکل 2C): pyran rings (C rings) کے aliphatic protons کے سگنل اس خطے میں 2.3 سے 5 تک پائے جاتے ہیں۔0 ppm، اور resorcinol رِنگز (A rings) اور catechol rings (Brings) کے خوشبودار سگنل پروٹونز بالترتیب 5.5 سے 6.3 ppm اور 6.3 سے 7.1 ppm تک ہیں۔ A اور B دونوں حلقوں کے OH فینول سگنلز 7.1 سے 10 ppm تک ظاہر ہوئے۔ دونوں حصوں کے NMR سپیکٹرا نے ایک مستقل شدت کے تناسب میں کیٹیچن یونٹس کے الگ الگ سگنل سیٹوں کی موجودگی کو ظاہر کیا: دو حصوں کے سگنلز N2، N3، N6، اور N8 کے سپیکٹرا میں dimers کی موجودگی کے مطابق دیکھے گئے، اور N4 سپیکٹرا میں چار سیٹ، جو ایک ٹیٹرمر، دو ڈائمرز، یا مختلف اولیگومر کے مرکب سے مطابقت رکھتے ہیں، یعنی ایک ٹرامر جمع ایک مونومر۔ فریکشن N4 میں موجود مصنوعات کی oligomerization کی ڈگری کا تعین کرنے کے لیے، 'H DOSY تجربہ ایک مرکب کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا جس میں N4 اور N2 دونوں حصوں کے aliquots تھے۔ تمام سگنلز کے ڈفیوژن گتانکوں نے ایک جیسی قدریں ظاہر کیں (شکل 4)، جو کہ کسر N4 میں کیٹیچن کے دو ڈائمر کی موجودگی کو ظاہر کرتی ہے۔

مکمل طور پر حل شدہ OH فینول سگنلز کی بدولت جو قابل اعتماد مقداری نتائج فراہم کرتے ہیں، کیٹیچن یونٹس کے درمیان تعلق کی قسم براہ راست چوٹی کی سطح کے انضمام سے نکالی جا سکتی ہے۔ اس طرح، دونوں حصوں، N3 اور N6 کے لیے، ایک OHphenol کی کمی (یا تو resorcinol یا catechol ring سے تعلق رکھتی ہے) اور ایک resorcinol ارومیٹک پروٹون کی کمی ایتھر قسم کے ایک interflavanic linkage (IFL) کی نشاندہی کرتی ہے جو کہ A میں اپوزیشن کا اشارہ کرتی ہے۔ یا B رنگ اور A رنگ میں C6 یا C8 پوزیشن۔ نمونہ N2 کے معاملے میں، دو خوشبودار پروٹون کی کمی تھی، ایک B رنگ اور ایک A رنگ، جس کا مطلب CA-CB IFL ہے۔ فریکشن N4 کے 1D 'H سپیکٹرم نے ظاہر کیا کہ B رنگ کے دو پروٹونوں کی کمی تھی، ساتھ ہی A رنگ کے دو پروٹون بھی۔ فریکشن N4 کی ڈائمر اکائیوں کے درمیان بانڈز اس طرح دونوں قسم کے CC ہیں۔ فریکشن N8 کا سپیکٹرا چار دیگر سے کافی مختلف تھا۔ کچھ سگنل کیٹیچن اکائیوں کے مخصوص تھے، جن میں تین OH فینول، ایک خوشبودار A رنگ، اور ایک B رنگ پروٹون کی کمی تھی، اسی طرح ایک aliphatic OH۔ دوسری طرف، کچھ دوسرے NMR سگنلز کیٹیچن یونٹ کے غیر معمولی ہیں: میتھیلین جس میں 13C کیمیکل شفٹ (~40 ppm) اور ایک کیٹون گروپ (~192 ppm) ہے۔

C، A، اور B رنگوں کے پروٹون اسپن سسٹم کا تعین 'H 1D اور 1H 2D TOCSY سپیکٹرا (نہیں دکھایا گیا) دونوں کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ دو ABMX C-رنگ اسپن سسٹم (کیٹیکن کی مخصوص) فریکشن N2، N3، N6، اور N8 کے سپیکٹرا میں اور چار فریکشن N4 کے لیے دیکھے گئے۔ فریکشنز N2، N3، N6، اور N8 کے سپیکٹرا میں، دو میٹا کپلڈ ڈبلٹس (J~2Hz) اور خوشبو والے A رنگ کے علاقے میں ایک سنگل کو بالترتیب، غیر منسلک کیٹیچن یونٹ کے A رنگ پروٹون کو تفویض کیا گیا تھا۔ اور C6-یا C8- سے منسلک کیٹیچن یونٹ کے ایک انگوٹھی کے بقایا پروٹون کو۔ N4 کے سپیکٹرا میں، دو ڈائمرز کی موجودگی کی وجہ سے، چار میٹا کپلڈ ڈبلٹس اور دو سنگلٹس کا پتہ چلا اور جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے تفویض کیا گیا۔ ان سپیکٹرا سے B رنگ کے پروٹون سسٹم کا بھی آسانی سے تعین کیا گیا اور ہمیں فریکشن N3 اور N6 کے ڈائمر کے لیے دو ABM پروٹون اسپن سسٹمز کی شناخت کرنے کی اجازت دی، جبکہ ایک ABM اور ایک AB پروٹون اسپن سسٹم کا پتہ لگایا گیا dimer N2 کے لیے، اور ایک ABM اور ڈائمر N4 کے لیے ایک AM پروٹون اسپن سسٹم۔ ڈائمر N8 نے صرف ایک ABM B-ring اسپن سسٹم کی نمائش کی جو کیٹیچن مونومر کی طرح ہے۔

2.3.1. فریکشنز N2، N3، N4، اور N6 کے ڈائمرز کے IFL کی انگوٹھی کی پوزیشن کا تعین

ڈائمرز کے A رنگ (یعنی C6A-یا C8A-پوزیشن) پر واقع پل کے قیام کے لیے CA سے منسلک کیٹیچن یونٹ کے بقایا HA پروٹون کی انتساب کی ضرورت ہوتی ہے۔ انتہائی حل شدہ فینولک OH سگنلز کی بدولت، ایک آسان نقطہ آغاز A رنگ سے منسلک اکائیوں کے دو OHphenol پروٹونز کی شناخت تھا، یعنی A رنگ جو

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm) جو آسانی سے بالترتیب C7A اور C8A سے منسوب تھے۔ ایک بار جب C6A اور C8A کو تفویض کیا جاتا ہے، بقایا HA پروٹون کو براہ راست HSQC سپیکٹرا سے منسوب کیا جا سکتا ہے۔ اس طرح یہ پایا گیا کہ یہ بقایا HA پروٹون تمام حصوں N2، N3، N4، N6 کے لیے H6A تھا۔ catechin یونٹس کے درمیان IFL اس طرح تمام dimers کے لیے C8A پوزیشن کا تقاضا کرتا ہے۔

2.3.2 IFL کی B رنگ پوزیشن کا تعین

فریکشن N2 اور N4 کے ڈائمر۔ فریکشن N2 کے سپیکٹرا نے دو مختلف قسم کے B رنگ پروٹون اسپن سسٹم دکھائے: ایک AMX غیر منسلک یونٹ کے B رنگ سے مطابقت رکھتا ہے، اور ایک AM تقریباً 8 Hz کے جوڑے کے مستقل کے ساتھ، H6'B اور H5' کی خصوصیت۔ C2'B سے منسلک یونٹ کا B۔ N2 dimer کی اکائیوں کے درمیان ربط اس طرح C2'B-C8A ہے۔ فریکشن N4 کے NMR سپیکٹرا نے مختلف B سپن سسٹمز بھی دکھائے: دو AMX، غیر منسلک B-رنگ سے مماثل، اور دو AXspin سسٹم، دونوں تقریباً 2 Hz کے کپلنگ کنسٹنٹ دکھاتے ہیں، جو H2'B اور H6' کی خصوصیت رکھتے ہیں۔ C5'B سے منسلک اکائیوں کے B پروٹون۔ H6'Band C8A کے درمیان لانگ رینج'H/13C ارتباط کی موجودگی، جو دو dimers کے HMBC سپیکٹرا میں دیکھی گئی، C5/'B-C8A ربط (شکل 5) کے مطابق ہے۔

فریکشن N3 اور N6 کے ڈائمر۔ فریکشن N3 اور N6 کے سپیکٹرا نے دو AMX B-ring پروٹون سسٹم کی موجودگی اور ایک OH فینول سگنل کی کمی کو ظاہر کیا۔ چونکہ ڈائمر یونٹس کے تمام OHA فینولک پروٹون کی شناخت کی گئی تھی (جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے)، غائب OH فینولک سگنل یا تو OH3'B یا OH4'B کا ہوسکتا ہے۔

OH پوزیشن (3'B یا 4'B) کا تعین بالترتیب H2'Bor H5'B کے ساتھ ROE ارتباط کے ذریعے، یا طویل فاصلے تک HMBC ارتباط کا استعمال کرتے ہوئے کیا جا سکتا ہے جیسا کہ شکل 5 میں دکھایا گیا ہے۔

B رِنگز کے بقایا OH کا انتساب یا تو لمبی رینج HMBC یا ROESY ارتباط کا استعمال کرتے ہوئے آسانی سے انجام دیا گیا، جیسا کہ شکل 5 میں دکھایا گیا ہے۔ dimer N3 کی صورت میں، H5'B اور بقایا OH کے درمیان ایک ROE ارتباط دیکھا گیا تھا۔ کیٹیچن یونٹ کا 'B اپنی B انگوٹھی سے جڑا ہوا ہے۔ اس طرح اس OH کی شناخت OH4'B کے طور پر کی گئی۔ کسر N6 کی صورت میں، بقایا OH'B OH3'B کو تفویض کیا گیا تھا، کیونکہ اس OH اور H2'B کے درمیان ایک ROE ارتباط دیکھا گیا تھا۔ طویل فاصلے تک HMBC کے ارتباط ان انتسابات کے مطابق ہیں۔ اس کے بعد ان دو ڈائمرز کے ربط کی پوزیشن کا تعین اس طرح کیا گیا: CO3'B-C8A اور CO4'B-C8A N3 اور N6 کے لیے۔ بالترتیب

فریکشن N8. ڈائمر N8 کے سپیکٹرم تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ اس ڈائمر کی ایک اکائی کیٹیچن ہے جس میں دو ربط کی پوزیشنیں ہیں ایک A رنگ، ایک C8A پر اور دوسری C-O7A پوزیشن پر، کیونکہ پروٹون H8A اور OH7A ہیں۔ لاپتہ اس ڈائمر کی دوسری اکائی نے واحد سپیکٹرل خصوصیات کی نمائش کی، جو B رنگ کی خوشبو کے نقصان اور B اور C دونوں رنگوں پر متعدد ربط کی پوزیشنوں کی موجودگی کی نشاندہی کرتی ہے۔

B رنگ سے پیدا ہونے والے 'H NMR سگنلز 2.49 اور 2.71 پی پی ایم پر دو ڈبلٹ تھے، جو ایک میتھیلین گروپ کے مخصوص ~ 15 ہرٹز (12.03 پی پی ایم) کے جیمینل کپلنگ اور ایتھیلینک پروٹون سے پیدا ہونے والے 6.38 پی پی ایم پر سنگلٹ کو ظاہر کرتے ہیں۔ چونکہ یہ میتھیلین اور ایتھیلین پروٹون جوڑے نہیں تھے، اس لیے ان کے 2'B اور 5'B پوزیشن میں ہونے کا امکان ہے۔ HIMBC سپیکٹرم نے تمام ارتباطات دکھائے، جس سے ان B رنگ کاربن کے درست انتساب کی اجازت دی گئی، جیسا کہ شکل 5 میں دکھایا گیا ہے۔ اس یونٹ کے H2C نے B رنگ کاربن کے ساتھ تین ارتباطات دیے ہیں: ایک میتھیلین کاربن ~ 45 ppm پر ہے، جو اس طرح منسوب کیا گیا تھا۔ C2'B، اور باقی دو، کاربن ~90 ppm اور ~162 ppm پر گونجتے ہیں، جو C1'B اور C6'B.H5'B کو تفویض کیے جا سکتے ہیں، اس B رنگ کے دو کواٹرنری کاربن کے ساتھ صرف مضبوط 3J ارتباط دیتے ہیں۔ : ایک کاربن ہے جو پہلے C3'B (~95 ppm) کو تفویض کیا گیا تھا، اور دوسرا، جو ~90 ppm پر گونجتا تھا، اس طرح C1'B سے منسوب کیا جا سکتا ہے۔ ~ 162 پی پی ایم پر کاربن کو پھر C6'B سمجھا گیا۔

C3'B پوزیشن (~ 95 ppm) پر ایک aliphatic OH (~ 5.8 ppm) کی موجودگی کا تعین اس کے ROE دونوں H2'B پروٹون کے ساتھ ارتباط کے ذریعے کیا گیا تھا۔ مزید برآں، OH3/B نے ~192.5 ppm پر ایک کواٹرنری کاربن کے ساتھ HMBC کا ارتباط دیا، C4'B پوزیشن پر کیٹون گروپ کی خصوصیت۔

تقریباً 40 پی پی ایم کے اس C1'B کی شیلڈنگ B رنگ کی خوشبو کے نقصان کے مطابق ہے۔ مزید برآں، دوسرے یونٹ کی C7A پوزیشن پر OH کی کمی ایک ایتھر لنکیج C1'BO-C7A کے ساتھ متفق ہے۔

NMR ڈیٹا سے پتہ چلتا ہے کہ اس یونٹ کے C رنگ میں کوئی OH3C نہیں ہے۔ C3C-O-C3'B ربط کی موجودگی تقریباً 1.5ppm کی C3C کی حفاظت کے ساتھ ساتھ C3'B کی کیمیائی شفٹ کے مطابق ہے جو ہیمیکیٹل کاربن (95 پی پی ایم) کی مخصوص ہے۔

مجموعی طور پر، NMR سپیکٹرل ڈیٹا ہمیں یہ نتیجہ اخذ کرنے کی اجازت دیتا ہے کہ یہ dimer dehydrocatechin A سے مطابقت رکھتا ہے جسے پہلے Winges et al نے بیان کیا ہے۔[33] اور پھر Guyot et al کی طرف سے [20].

ان NMR تجزیوں کے ذریعے طے شدہ چھ ڈائمرک مرکبات کے ڈھانچے کو شکل 6 میں دکھایا گیا ہے، N2، N3، N6، اور N8 خالص مصنوعات ہیں، اور N4 دو isomers کا مرکب ہیں۔

3. مواد اور طریقے

3.1.کیمیکل

(پلس)کیٹیچن ہائیڈریٹ 98 فیصد سے زیادہ یا اس کے برابر؛ Trametes Versicolor سے laccase(0.94 U·mg-1)؛ سوڈیم فاسفیٹ dibasic dihydrate 98 فیصد سے زیادہ یا اس کے برابر؛ سائٹرک ایسڈ (ACS reagent، cadmium nitrate tetrahydrate 99.997 فیصد؛ فارمک ایسڈ اور Amberlite XAD7HP سگما-الڈرچ) (سینٹ لوئس، MO، USA) سے حاصل کیے گئے تھے۔ Acetone-dgwas کو Euriso-top (Saarbrüicken)، Germanyfluicken اور Germanyfluicken سے خریدا گیا تھا۔ ایسڈ (TFA) Roth Labo(Karlsruhe, Germany) سے۔Water LC-MS, acetonitrile LC-MS(ACN), اور methanol LC-MS (MeOH) سبھی VWR (Radnor, PA, USA) سے تھے۔

3.2 ماڈل شراب کے حل کی تیاری

ماڈل شراب کا محلول ایتھنول/پانی کا محلول (12/88;o/o) تھا جس میں 0.033 M ٹارٹارک ایسڈ تھا، جسے NaOH 1 M [34] کے ساتھ pH 3.6 میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔

3.3 خام انگور پی پی او کے عرق

پی پی او اقتباس تیار کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے سنگلٹن وغیرہ نے بیان کیا تھا۔ [35]۔ منجمد انگور سب سے پہلے ایک ایسیٹیٹ بفر (1.5 M، pH5؛ 10 gL-I ascorbic acid) میں ملا دیے گئے۔ اس کے بعد مرکب کو فلٹر اور سینٹرفیوج کیا گیا (3000 گرام؛ 10 منٹ)۔ باقیات کو آخر کار ایسیٹون (80 فیصد) سے دھو کر ہوا سے خشک کیا گیا۔

Botrytis Cinerea سے 3.4.Laccase

Botrytis cinerea سے Laccase حاصل کیا گیا جیسا کہ Quijada-Morin et al نے بیان کیا ہے۔[36]۔ یہ VA612 تناؤ سے تیار کیا گیا تھا (2005 میں Hautvillers، Champagne، فرانس میں ایک انگور کے باغ میں Pinot Noir cultivar سے جمع کیا گیا تھا)۔ مختصراً، ٹھوس مالٹ خمیر میڈیم پر ثقافتوں کو نیلی روشنی میں 24 ڈگری پر ایک ہفتے کے لیے چھوڑ دیا گیا تھا۔ اس کے بعد بیضوں کو کھرچ کر 500 mL Erlenmeyer فلاسک میں ٹیکہ لگایا گیا جس میں 125 mL کلچر میڈیم (4{{30}} gL-1گلوکوز، 7 gL{{10}}گلیسرول، 0.5 g·L-1L-histidine,0.1 g:L-1 CuSO,1.8gL-1 NaNO3,0.5g:L -1 KCl,0.5gL-1 CaCl2·H2O,0.05g:L-1 FeSO4.7H2O,1.0g L-1KH2PO4, اور 0.7 gL-1 MgSO 4-7H2O۔ انکیوبیشن کے 3 دن اور اسی پچھلے میڈیم میں 2 دن کی افزائش کے بعد، گیلک ایسڈ (2 gL-1) کو پری کلچرز میں شامل کیا گیا۔ 5 دن کے بعد، مائع میڈیم کو فلٹر کیا گیا، اور سپرنٹنٹ کو کوئیکس اسٹینڈ فلٹریشن سسٹم (GE Healthcare UK، Little Chalfont، England) میں ٹینجینٹل فلٹریشن کے لیے جمع کرایا گیا جس میں 30 kDa- سالماتی وزن سے لیس جھلی کو کاٹ دیا گیا۔ ارتکاز کو آخر کار ڈسٹل واٹر کے خلاف ڈائی فلٹریشن کا نشانہ بنایا گیا، اور صرف ان حصوں کو رکھا گیا جو ABTS کے خلاف آکسیڈینٹ سرگرمی پیش کرتے ہیں (-80 ڈگری )۔

3.5۔آکسیڈیشن کا طریقہ کار

فاسفیٹ سائٹریٹ بفر میں ایک لیکیس محلول (1 gL-1) پہلے تیار کیا گیا تھا اور اسے 6g.L-1( پلس)کیٹیچن محلول (ماڈل وائن) میں شامل کیا گیا تھا تاکہ { {6}}.3 جی ایل-1۔ حاصل شدہ محلول کو پھر آہستہ آہستہ ہلایا گیا (180 rpm) کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے۔ ارتکاز کو پہلے بہتر بنایا گیا تھا، اور تجربہ سہ رخی میں کیا گیا تھا۔

3.6۔ رال Amberlite XAD7HP پر رد عمل روکنا

ایک امبر لائٹ کالم کو ایتھنول (مطلق) کے ساتھ مشروط کیا گیا تھا اور اسے دو کالم والیوم ملی-او پانی سے دھویا گیا تھا۔ پچھلا laccase/(plus)-کیٹیچن ری ایکشن میڈیم کو کالم پر گرا دیا گیا تھا اور پہلے ملی-Qwater کے دو کالم والیوم کے ساتھ ایلوٹ کیا گیا تھا [37]۔ اس کے بعد کالم کو ایتھنول کے ساتھ ایلوٹ کیا گیا جب تک کہ جمع شدہ حصہ بے رنگ نہ ہو جائے۔ صرف ایتھنول کے حصوں کو رکھا گیا تھا، بخارات بنائے گئے تھے اور لائو فلائز کیے گئے تھے۔ پاؤڈر استعمال ہونے تک -80 ڈگری پر محفوظ کیا گیا تھا۔

3.7. فلیش کرومیٹوگرافی کا استعمال کرتے ہوئے ڈائمرک فریکشن کو صاف کرنے کا طریقہ کار

لائوفیلائزڈ پاؤڈر کو سب سے پہلے فلیش کرومیٹوگرافی سسٹم puriflash430 کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیا گیا تھا جو 280 nm پر سیٹ UV ڈیٹیکٹر اور Puriflash diol 50 um f0025 کالم سے لیس تھا۔ بائنری موبائل فیز ایسٹونائٹرائل (سالوینٹ اے) اور میتھانول (سالوینٹ بی) پر مشتمل ہوتا ہے، دونوں 0.1 فیصد TFA کے ساتھ تیزابیت والے ہوتے ہیں۔ انجیکشن کا ایک سلسلہ 20 mL·min-1 کی مستقل بہاؤ کی شرح پر انجام دیا گیا، درج ذیل گریڈینٹ کا استعمال کرتے ہوئے: 4.4 منٹ کے لیے 100 فیصد A؛ 0-10 فیصد B 10 منٹ میں؛ 10 فیصد B 5 منٹ میں؛ 5 منٹ میں 10-90 فیصد B؛ 3 منٹ کے لیے 90 فیصد B؛90-10 فیصد B 2 منٹ میں؛ 10 فیصد B 10 منٹ کے لیے۔ انجیکشن کا حجم 1mL تھا (300 mg lyophilized پاؤڈر 1 mL سالوینٹ A میں تحلیل ہوا)۔ ہر بار تین الگ الگ حصے جمع کیے گئے۔ پہلا ایک بقایا ( جمع) کیٹیچن سے مطابقت رکھتا تھا، اور تیسرا اعلی مالیکیولر-وزن پولی فینول کا مرکب تھا۔ دوسرا ایلیوٹڈ فریکشن، جس میں ڈائمرک آکسیڈیشن پروڈکٹس کا مرکب ہوتا ہے، کو صاف کرنے کے دوسرے مرحلے سے پہلے بخارات بنا کر لائوفائلائز کیا گیا تھا۔

3.8۔ نیم تیاری کے کرومیٹوگرافک نظام کا استعمال کرتے ہوئے ڈائمرک فریکشن سے آکسیڈیشن مصنوعات کی پیوریفیکیشن کا طریقہ کار

dimeric آکسیڈیشن پروڈکٹس پر مشتمل فریکشن کو ایک نیم تیاری والے Bio-Rad NGC 10 میڈیم پریشر کرومیٹوگرافی سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے صاف کیا گیا تھا جو ریورسڈ فیز ویرین ڈائنامیکس C18 مائکروسورب کالم (250 × 21.2 ملی میٹر؛ 3um) سے لیس تھا۔ بائنری موبائل فیز میں ملی-او واٹر (سالوینٹ اے) اور 80 فیصد ایسٹونائٹرائل، 20 فیصد ملی-کیو واٹر （سالوینٹ بی）، دونوں 0.05 فیصد ٹی ایف اے کے ساتھ تیزابیت پر مشتمل تھے۔ انجیکشنز کی ایک سیریز （300 μL） lyophilized پاؤڈر (20 mg سالوینٹ A کے 200 uL اور ACN کے 100 uL میں تحلیل کیا گیا) مندرجہ ذیل اخراج کی شرائط کے تحت انجام دیا گیا: 100 فیصد A 4 منٹ کے لئے؛ 0-35 فیصد B 46 منٹ میں؛35-100 فیصد B 2 منٹ میں؛ 100 فیصد B 5 منٹ کے لیے۔ 280 nm پر خالص UPLC سگنلز کے مطابق ہر بار آٹھ الگ الگ حصے جمع کیے گئے۔ NMR تجزیہ سے پہلے ہر ایک حصہ کو بخارات بنا کر لائفائلائز کیا گیا تھا۔

3.9.NMR تجزیہ کے لیے نمونہ کی تیاری

ایپنڈورف ٹیوبوں میں وزن والے ہر لائوفیلائزڈ پاؤڈر کا تقریبا 1 ملی گرام ایسٹون ڈی جی کے 500 μL میں حل کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، acetone-d میں کیڈمیم نائٹریٹ کے مرتکز محلول کا 10 uL، نمونوں میں شامل کیا گیا، اور نتیجے میں حل کو NMR تجزیہ کے لیے 5 ملی میٹر NMR ٹیوبوں میں منتقل کر دیا گیا۔ کچھ نمونوں کے لیے ایک اضافی مرحلہ انجام دیا گیا: کیڈمیم کے نشانات کی موجودگی میں ایسٹون-ڈی جی میں لائوفیلائزڈ پاؤڈروں کو گھلنشیل کرنے کے بعد، نمونے خشک ہو کر بخارات بن گئے اور پھر سی ڈی کے مزید اضافے کے بغیر ایسٹون ڈی میں دوبارہ گھلنشیل ہو گئے۔

3.10۔آلہ کی تفصیلات

UPLC-MS تجزیہ۔ دو UPLC-MS سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے رد عمل کی نگرانی کی گئی۔ پہلا ایک طویل میلان طریقہ استعمال کرتے ہوئے مصنوعات کو برقرار رکھنے کے اوقات کی ٹھیک ٹھیک شناخت کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ یعنی، واٹرس ریورسڈ فیز الٹرا ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی کو ماس اسپیکٹرومیٹری (UHPLC-MS) سے جوڑا جاتا ہے۔ مائع کرومیٹوگرافی کا نظام ایک ایکویٹی یو پی ایل سی (واٹرس، ملفورڈ، ایم اے، یو ایس اے) تھا جو فوٹوڈیوڈ سرنی ڈیٹیکٹر سے لیس تھا۔ ہم نے ایکویٹی UPLC HSS T3 کالم (1.8 um,2.1 ×150 mm) استعمال کیا۔ کالم کا درجہ حرارت 25 ڈگری تھا۔ بائنری موبائل فیز پانی میں 0.1 فیصد فارمک ایسڈ (سالوینٹ A) اور ایسٹونیٹرائل (سالوینٹ B) پر مشتمل تھا۔ علیحدگی مندرجہ ذیل گریڈینٹ کا استعمال کرتے ہوئے 0.25mL·min-1 کی مستقل بہاؤ کی شرح پر کی گئی تھی:8-11 فیصد B 2 منٹ میں؛ 8 منٹ کے لیے 11 فیصد B؛ 15 منٹ میں 11-25 فیصد B؛25-55 فیصد بن 5 منٹ؛55-99 فیصد بن 1 منٹ؛ 99 فیصد B 4 منٹ میں؛99-8 فیصد بن 1 منٹ؛ 8 فیصد B 4 منٹ کے لیے انجیکشن کا حجم 5 μL تھا۔ ماس اسپیکٹومیٹر واٹرس ایکویٹی QDa الیکٹرو سپرے آئنائزیشن (ESI) سادہ کواڈروپول (واٹرس، ملفورڈ، ایم اے، یو ایس اے) تھا۔ کیپلیری وولٹیج 0.8 kV پر سیٹ کیا گیا تھا۔ بڑے پیمانے پر سپیکٹرا کو 200-900 پتلی مثبت آئن موڈ کے بڑے پیمانے پر حاصل کیا گیا تھا۔

دوسرا UHPLC-MS سسٹم، جو تطہیر کے مراحل کے دوران تیزی سے تصدیق کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، وہی تھا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا، جس میں ایکویٹی UHPLC HSS T3 کالم （1.8 μm، 2.1×100 mm） گرم تھا۔ 38 ڈگری پر علیحدگی کو 0.55 mL·min-1 کی مستقل بہاؤ کی شرح پر انجام دیا گیا، درج ذیل فاسٹ گریڈینٹ کا استعمال کرتے ہوئے:0{12}} فیصد B 5 منٹ میں؛ 2 منٹ میں 40-99 فیصد B؛ 1 منٹ کے لیے 99 فیصد B؛ 99-0.1 فیصد B 1 منٹ میں۔ انجیکشن کا حجم 2 μL تھا۔ ماس اسپیکٹومیٹر ایک Bruker Amazon X electrospray ionization (ESI) آئن ٹریپ (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) تھا۔ کیپلیری وولٹیج -5.5 kV پر سیٹ کیا گیا تھا۔ بڑے پیمانے پر سپیکٹرا کو 50-2000 پتلی مثبت آئن موڈ کے بڑے پیمانے پر حاصل کیا گیا تھا۔

تمام UPLC-MS تجزیے سہ رخی میں کیے گئے تھے۔

این ایم آر انسٹرومینٹیشن۔ تمام NMR سپیکٹرا ایک Agilent DD{{0}} میگاہرٹز سپیکٹرومیٹر (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) پر ریکارڈ کیے گئے تھے، جو پروٹون اور کاربن کے مرکز کے لیے 500.05 اور 125.74 MHz پر کام کرتے ہیں، بالترتیب، ایک 5 ملی میٹر بالواسطہ کھوج کی جانچ کا استعمال کرتے ہوئے جو ایک گریڈینٹ کوائل سے لیس ہے۔ 1D'H اور 13C، 2Dhomonuclear1H TOCSY اور ROESY، اور heteronuclear lH/13C HSQC اور HMBC تجربات کلاسیکی پلس سیکوینس اور VMRyzed42 اور VMRyzed4 کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے۔ .1 (Mestrelab ریسرچ، سپین) سافٹ ویئر۔ DOSY پیمائش حاصل کی گئی اور اس پر کارروائی کی گئی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے 38]۔ DgcsteSL نبض کی ترتیب کے حصول کے پیرامیٹرز حسب ذیل تھے: بازی میں تاخیر کا وقت اور تدریجی پلس کی چوڑائی بالترتیب 50 ms اور 2 ms پر سیٹ کی گئی تھی، تدریجی طاقت (g) کو 16 مراحل میں بڑھایا گیا تھا جس میں 0.3 سے مساوی g2 وقفہ کیا گیا تھا۔ 32G·cm-I مرحلے کی اصلاح کے بعد، VNMRJ4.2 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے چوٹی کی اونچائی کی پیمائش سے 2D DOSY سپیکٹرا بنایا گیا۔

تمام سپیکٹرا کا حوالہ سالوینٹ ایسٹون-ڈی جی سگنلز (2.05 پی پی ایم پر ایچ بقایا سگنل اور 29.92 پی پی ایم پر 13 سی سگنل) کا حوالہ دیا گیا تھا۔

4. نتائج

تین مختلف oxidoreductases کی کارروائی (انگور سے نکالا گیا پولیفینول آکسیڈیز، Botrytis cinerea سے laccase، اور Trametes Versicolor سے laccase) (plus) -catechin پر تحقیق کی گئی، اور LC-UV-MS کے نتیجے میں پروفائلز بہت ملتے جلتے تھے، حالانکہ کچھ معمولی اختلافات تھے۔ ان انزائمز کی رد عمل میں ممکنہ تفاوت کی تجویز پیش کی۔

چھ catechin-laccase آکسیڈیشن مصنوعات کے ڈھانچے (Trametes Versicolor سے laccase کا استعمال کرتے ہوئے) مخصوص NMR دستخطوں کی بنیاد پر حاصل کیے گئے تھے (چار خالص مصنوعات، یعنی N2، N3، N6، اور N8، اور N4، کے مرکب کے مطابق۔ دو آئیسومر)۔ فینولک OH سگنلز کا مکمل انتساب نمونے کی تیاری کے طریقہ کار کے ساتھ کیڈمیم نائٹریٹ کے اضافے کی بدولت ممکن ہوا جس نے دلچسپی کے کچھ مرکبات کے لیے کیٹیچن یونٹس کے درمیان روابط کے غیر واضح انتساب کی اجازت دی۔ یہ طریقہ کار پولی فینول مرکبات کے NMR تجزیہ کو بہت آسان بنا دے گا، یا تو مصنوعی یا قدرتی مصنوعات سے نکالا گیا ہے۔

اس کام میں حاصل کردہ معیاروں کو مستقبل میں انگور کے پکنے اور شراب کی عمر بڑھنے کے دوران ان کی موجودگی اور ارتقاء کی تحقیقات کے لیے آکسیڈیشن مارکر کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ کیٹیچن کے علاوہ، دیگر پولی فینول مرکبات، بشمول flavonoids اور non-flavonoids، کو اضافی نئے معیارات حاصل کرنے کے لیے laccase کے ذیلی ذخیرے کے طور پر بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔

مخففات

NMR: جوہری مقناطیسی گونج،

سی ڈی: کیڈیمیم،

TOCSY: کل ارتباط سپیکٹروسکوپی،

روزی: گھومنے والے فریم جوہری اوور ہاؤسر اثر سپیکٹروسکوپی،

HSQC: ہیٹرونوکلیئر سنگل کوانٹم ارتباط کا تجربہ،

HMBC: heteronuclear ملٹی بینڈ کنیکٹوٹی،

DOSY: بازی کا حکم دیا سپیکٹروسکوپی۔

حوالہ جات

1. خان، این. مختار، ایچ ٹی پولی فینول برائے صحت کے فروغ۔ لائف سائنس. 2007، 81، 519-533۔ [کراس ریف]

2. فییول، این. Vallverdu-Queralt, A.; میوڈیک، ای. ہیو، سی. بولانجر، آر. Cheynier، V.؛ سومرر، این. خمیر شدہ کوکو بینز میں نئے فلاوان-3-Ol ڈیریویٹوز کی خصوصیت۔ فوڈ کیم۔ 2018، 259، 207–212۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

3. Rimbach، G.؛ میلچن، ایم؛ موہرنگ، جے؛ ویگنر، کوکو اور ویسکولر ہیلتھ سے AE پولیفینول - ایک تنقیدی جائزہ۔ انٹر جے مول سائنس 2009، 10، 4290–4309۔ [کراس ریف]

4. Avram, AM; مورین، پی. براؤن ملر، سی۔ ہاورڈ، ایل آر؛ سینگپتا، اے. وکراماسنگھے، نینو فلٹریشن کا استعمال کرتے ہوئے بلیو بیری پومیس ایکسٹریکٹ سے پولیفینول کی SR ارتکاز۔ فوڈ بائیو پروڈ۔ عمل 2017، 106، 91–101۔ [کراس ریف]

5. انتونیولی، اے. فونٹانا، اے آر؛ Piccoli، P.؛ Bottini, R. پولیفینول کی خصوصیات اور Cv کے انگور کے پومیس میں اینٹی آکسیڈینٹ کی صلاحیت کا اندازہ۔ مالبیک۔ فوڈ کیم۔ 2015، 178، 172–178۔ [کراس ریف]

6. Saucier، C. وائن ایجنگ کے دوران وائن پولیفینول کیسے تیار ہوتے ہیں؟ Cerevisia 2010, 35, 11-15. [کراس ریف]

7. اولیویرا، سی ایم؛ فریرا، ACS؛ ڈی فریٹاس، وی. سلوا، شراب میں ہونے والے AMS آکسیڈیشن میکانزم۔ خوراک Res. انٹر 2011، 44، 1115–1126۔ [کراس ریف]

8. سنگلٹن، وی ایل آکسیجن مع فینولز اور مسٹس، وائنز اور ماڈل سسٹمز میں متعلقہ رد عمل: مشاہدات اور عملی مضمرات۔ ایم۔ جے اینول وٹک 1987، 38، 69-77۔

9. میتھیو، اے جی؛ پارپیا، ایچ اے بی فوڈ براؤننگ بطور پولیفینول رد عمل۔ فوڈ ریسرچ میں پیشرفت؛ چیچیسٹر، سی او، مراک، ای ایم، سٹیورٹ، جی ایف، ایڈز؛ اکیڈمک پریس: کیمبرج، ایم اے، امریکہ، 1971؛ جلد 19، صفحہ 75-145۔ [کراس ریف]

10۔ گمبوٹی، اے۔ رینالڈی، اے. Ugliano، M. Moio, L. ریڈ وائن کی عمر بڑھنے کے دوران فینولک مرکبات کا ارتقاء: بوٹلنگ سے پہلے اور بعد میں آکسیجن کی نمائش کا اثر۔ جے ایگرک فوڈ کیم۔ 2013، 61، 1618–1627۔ [کراس ریف] [پب میڈ]