میلانوسم بایوجنسیس، منتقلی اور انحطاط کو ریگولیٹ کرکے ناول پیپٹائڈ مرکب کا سفید کرنے کا اثر حصہ 1

خلاصہ

پیپٹائڈز امینو ایسڈ کی مختصر زنجیریں ہیں جو پیپٹائڈ بانڈز سے منسلک ہوتی ہیں۔ وہ کاسمیٹک انڈسٹری میں بڑے پیمانے پر موثر اور بایو مطابقت پذیر فعال اجزاء کے طور پر استعمال ہوتے ہیں۔ اس مطالعہ میں، ہم نے ایک نیا پیپٹائڈ مرکب تیار کیا اور میلانوسائٹس اور کیراٹینوسائٹس پر اس کے اینٹی پگمنٹیشن اثر کی نشاندہی کی۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ پیپٹائڈ مرکب نے مائیکرو فیتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن عنصر کے ضابطے کے ذریعے میلانوسوم بائیوجنسیس کو روکا، جو میلانوسائٹس میں میلانوجینیسیس کا ایک اہم عنصر ہے۔ اور ہم نے مشاہدہ کیا کہ پیپٹائڈ مرکب نے پروٹیز ایکٹیویٹڈ ریسیپٹر 2 کی کمی کے ذریعے میلانوسوم اپٹیک کو روکا، جو کیراٹینوسائٹس میں فگوسیٹوس سے متعلق رسیپٹر ہے۔ مزید برآں، پیپٹائڈ مکسچر نے آٹوفیجی سسٹم کو چالو کیا جس کے نتیجے میں کیراٹینوسائٹس میں منتقل شدہ میلانوسومز کا انحطاط ہوتا ہے۔ ملٹی ٹارگٹنگ پیپٹائڈ مکسچر کے اینٹی پگمنٹیشن اثر کا اندازہ انسانی جلد کے مساوی ماڈل (MelanoDerm) میں کیا گیا۔ ایپیڈرمل پرت میں میلانین کے مواد کو پیپٹائڈ مرکب کے حالات کے علاج سے نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا، یہ تجویز کرتا ہے کہ اسے ایک نئے کاسمیٹکس مواد کے طور پر لاگو کیا جا سکتا ہے۔سفید کرنافنکشن.

متعلقہ مطالعات کے مطابق،cistancheایک عام جڑی بوٹی ہے جسے "معجزہ جڑی بوٹی جو زندگی کو طول دیتی ہے" کے نام سے جانا جاتا ہے۔ اس کا بنیادی جزو ہے۔cistanoside، جس کے مختلف اثرات ہیں جیسے اینٹی آکسیڈینٹ، اینٹی سوزش، اور مدافعتی فنکشن کو فروغ دینا۔ cistanche اور کے درمیان میکانزمجلد کی سفیدیکے اینٹی آکسیڈینٹ اثر میں مضمر ہے۔cistancheglycosides. انسانی جلد میں میلانین کے آکسیکرن سے پیدا ہوتا ہے۔ٹائروسینکی طرف سے اتپریرکٹائروسینیز دیآکسیجن کے رد عمل میں آکسیجن کی شرکت کی ضرورت ہوتی ہے، لہذا جسم میں آکسیجن فری ریڈیکلز میلانین کی پیداوار کو متاثر کرنے والا ایک اہم عنصر بن جاتے ہیں۔ Cistanche میں cistanoside ہوتا ہے، جو کہ ایک اینٹی آکسیڈنٹ ہے اور جسم میں آزاد ریڈیکلز کی پیداوار کو کم کر سکتا ہے، اس طرحمیلانین کی پیداوار کو روکتا ہے۔.

سفیدی کے لیے cong rong Cistanche پر کلک کریں۔

مزید کے لیے پوچھیں:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

کلیدی الفاظ

آٹوفیجی · میلانوسوم · مائیکرو فیتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن عنصر · PAR-2 · پیپٹائڈ

تعارف

میلانین جلد کے خلیوں کو نقصان دہ بیرونی ایجنٹوں سے بچانے کے لیے ایپیڈرمس کی بنیادی تہہ میں واقع میلانوسائٹس کے ذریعے تیار کیا جاتا ہے، بشمول الٹرا وایلیٹ (UV) شعاعوں، باریک دھول اور مختلف کیمیائی مرکبات [1]۔ بنیادی طور پر UV شعاع ریزی کے ذریعے keratinocytes سے چھپنے والے عوامل، جن میں الفا میلانوسائٹ محرک ہارمون (MSH)، adrenocorticotropic ہارمون، اسٹیم سیل فیکٹر، endothelin 1، hepatocyte گروتھ فیکٹر، بنیادی fibroblast گروتھ فیکٹر، اور granulocyte-stimulating stimulating factor-macroblocyte-macrostimulate شامل ہیں۔ melanocytes اور melanin کی سطح پر ہر ایک رسیپٹر lysosome سے متعلق organelle میں پیدا ہوتا ہے جسے melanosome [2-7] کہتے ہیں۔ ان عوامل میں سے، MSH ایک چھوٹا پیپٹائڈ ہارمون ہے جو pro-opiomelanocortin سے ماخوذ ہے۔ -MSH کو melanocortin 1 رسیپٹر سے منسلک کرنے سے سائکلک اڈینوسین مونو فاسفیٹ (cAMP) کی سطح بڑھ جاتی ہے جو پروٹین کناز A (PKA) [8,9] کو متحرک کرتی ہے۔ PKA پھر فاسفوریلیٹس cAMP-responsive عنصر بائنڈنگ پروٹین (CREB) اور مائکروفتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن فیکٹر (MITF) کی نقل فاسفو-CREB [10] کے ذریعہ حوصلہ افزائی کرتا ہے۔ MITF tyrosinase، tyrosinase-related protein 1 (TYRP1)، اور dopachrome tautomerase (Dct یا TYRP2)، melanogenesis میں کلیدی انزائمز کے لیے ٹرانسکرپشن عنصر کے طور پر کام کرتا ہے، اور ان کے اظہار کی حوصلہ افزائی کرتا ہے [11]۔ پختہ میلانوزوم ڈینڈرائٹ ٹپ کی طرف بڑھتا ہے، اور میلانوسم موٹر پروٹین کمپلیکس جس میں Rab27a، Melanophilin، اور Myosin Va شامل ہیں اس عمل میں ایک کردار ادا کرتا ہے [12-14]۔ میلانوفیلن، جو Rab27a، Myosin Va، اور actin کے لیے پابند ڈومینز رکھتا ہے، بیک وقت میلانوزوم سطح پر Rab27a اور ایکٹین فلیمینٹ کے ساتھ تعامل کرتے ہوئے Myosin Va سے منسلک ہوتا ہے۔ ایکٹین فلیمینٹ [15- 19] کے ساتھ ڈینڈرائٹ ٹپس تک میلانوسم ٹرانسپورٹ کے لیے ان موٹر پروٹینوں کی اسمبلی کی ضرورت ہوتی ہے۔ اس کے بعد، میلانوسومس میلانوسائٹس کے ڈینڈرائٹ ٹپس سے ہمسایہ کیراٹینوسائٹس میں منتقل ہوئے اور شامل میلانوسومز کیراٹینوسائٹس [20,21] کے پیرینوکلیئر علاقے میں پائے جاتے ہیں۔ اگرچہ میلانین کی مناسب تشکیل عام خلیات کے تحفظ کے لیے اہم ہے، میلانین کی ضرورت سے زیادہ پیداوار ہائپر پگمنٹیشن کو جنم دیتی ہے، بشمول میلاسما، فریکلز، اور سولر لینٹگو، جو ذہنی تناؤ اور زندگی کے خراب معیار کا باعث بن سکتے ہیں [22,23]۔ اس طرح، جلد کی جلن، الرجی انڈکشن، اور سرطان پیدا کرنے جیسے مضر اثرات کے بغیر تسلی بخش سفید کرنے والے ایجنٹوں کی نشوونما کے مطالبات ہیں، اور سفید کرنے کے مختلف میکانزم کو نشانہ بنانے والے بہت سے مطالعات کیے گئے ہیں [24,25]۔

پیپٹائڈز امینو ایسڈ کی چھوٹی زنجیریں ہیں، پروٹین کی سب سے چھوٹی اکائی، پیپٹائڈ بانڈز کے ذریعے ایک دوسرے سے جڑی ہوئی ہے۔ حال ہی میں، کاسمیٹکس اور دواسازی کی صنعتوں میں فعال اجزاء کے طور پر پیپٹائڈس کے بارے میں وسیع تحقیق اور ترقی ان کی اعلی حیاتیاتی مطابقت اور پروٹین کی نقل کرنے کی صلاحیت کی وجہ سے کی گئی ہے [26,27]۔

ہم نے اپنی پیپٹائڈ لائبریری کی اسکریننگ کی اور چار پیپٹائڈز ملے جو میلانین کی ترکیب، ہجرت، اور منتقلی کے ساتھ ساتھ میلانوسم انحطاط کو فروغ دینے والی سرگرمی کو متاثر کرتے ہیں۔ اس کے بعد، اس مطالعے کا مقصد ایک پیپٹائڈ مرکب کی سفیدی کی سرگرمی کی تحقیقات کرنا تھا جس میں ایک ہی داڑھ کے تناسب کے ساتھ چار پیپٹائڈس شامل تھے۔

طریقے

مواد

2-پیپٹائڈ کی ترکیب میں استعمال ہونے والی CTC رال BeadTech (سیول، کوریا) سے خریدی گئی تھی۔ Fmoc-amino acid، hydroxy benzotriazole (HOBt)، اور N, N, N´, N´-tetramethyl-O-(1H-benzotriazole- 1-yl) uronium hexafluorophosphate (HBTU) CS Bio Co. سان فرانسسکو، CA، USA)۔ ترکیب میں استعمال ہونے والے ری ایجنٹس، بشمول dimethylformamide (DMF)، N، N-diisopropylethylamine (DIEA)، piperidine، trifluoroacetic acid (TFA)، thioanisole، phenol، ethane dithiol (EDT)، triisopropylsilane (TIS)، اور diethyl ether، شامل تھے۔ Daejung Chemical & Metal Co., Ltd. (Seul, Korea) سے خریدا گیا۔

میلانوسائٹس اور فیٹل بووائن سیرم (ایف بی ایس) کے لیے ڈلبیکو کا موڈیفائیڈ ایگل میڈیم (ڈی ایم ای ایم) پاؤڈر تھرمو فشر سائنٹیفک (والتھم، ایم اے، یو ایس اے) سے خریدا گیا تھا، اور مائع ڈی ایم ای ایم میڈیا اور پینسلن/اسٹریپٹومائسن ویلجین انکارپوریشن، کوریا (گیونگسن) سے خریدے گئے تھے۔ . سوڈیم بائی کاربونیٹ، سوڈیم ہائیڈرو آکسائیڈ، آربوٹین، 3-[4،5-ڈائمتھائلتھیازول-2-ایل]-2،5-ڈفینیلٹیٹرازولیم برومائڈ (ایم ٹی ٹی)، 3،{{ 7}} dihydroxy-L-phenylalanine (LDOPA)، ٹرپسن، اور rapamycin سگما-Aldrich (سینٹ لوئس، MO، USA) سے خریدے گئے تھے، اور Solvable کو PerkinElmer (والتھم، MA، USA) سے خریدا گیا تھا۔ Rab27A، Melanophilin، MITF، Tyrosinase، اور Actin کے خلاف اینٹی باڈیز Santa Cruz Biotechnology (Dalas, TX, USA) سے خریدی گئیں، اور بیکلن کے خلاف اینٹی باڈیز-1, LC3, p62, p-CREB، اور p-ERK1/2 سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی (ڈینورس، ایم اے، یو ایس اے) سے خریدا گیا تھا۔ پرائمر ترکیب Cosmo GENETECH (سیول، کوریا) میں کی گئی تھی اور مزید تجربے میں استعمال کی گئی تھی (ٹیبل 1)۔

پیپٹائڈ ترکیب

0.84 mmol/g کی صلاحیت کے ساتھ CTC رال کو DMF سالوینٹ پر مشتمل ری ایکٹر میں سوجن کے رد عمل کا نشانہ بنایا گیا۔ پھر، Fmoc-C ٹرمینل امینو ایسڈ کے 2 مساوی اور DIEA کے 2.5 مساوی DMF میں ری ایکٹر میں شامل کیے گئے اور مزید 2 گھنٹے کے لیے رد عمل کا نشانہ بنایا گیا۔ رد عمل کے خاتمے کی تصدیق کیزر ٹیسٹ کٹ (سگما-الڈرچ) سے کی گئی، اور رال کو ڈی ایم ایف سے دھویا گیا۔ ایف ایم او سی کو دھوئے ہوئے رال میں دو بار 20 فیصد پائپریڈین/ڈی ایم ایف شامل کرکے ہٹا دیا گیا۔ رد عمل کے خاتمے کی تصدیق کیزر ٹیسٹ کٹ کے ساتھ کی گئی تھی، اور رال کو ڈی ایم ایف سے دھویا گیا تھا۔ اس کے بعد، درج ذیل عمل کو C ٹرمینل سے N ٹرمینل سمت میں امینو ایسڈ کی ترتیب کے مطابق دہرایا گیا۔ DMF میں Fmoc-amino acid کے 2 مساوی، HBTU کے 2 مساوی، HOBt کے 2 مساوی، اور DIEA کے 2.5 مساوی شامل کیے جانے کے بعد، رد عمل 2 گھنٹے کے لیے کیا گیا۔ رد عمل کے خاتمے کی تصدیق کیزر ٹیسٹ کٹ کے ساتھ کی گئی تھی، اور رال کو ڈی ایم ایف سے دھویا گیا تھا۔ ایف ایم او سی کو دھوئے ہوئے رال میں دو بار 20 فیصد پائپریڈین/ڈی ایم ایف شامل کرکے ایک امینو ایسڈ سے ہٹا دیا گیا۔ رد عمل کے خاتمے کی تصدیق کیزر ٹیسٹ کٹ کے ساتھ کی گئی تھی، اور رال کو ڈی ایم ایف سے دھویا گیا تھا۔ Pep-3 کی صورت میں، Ferulic acid conjugation مندرجہ ذیل طریقہ کار کے ذریعے انجام دیا گیا تھا۔ DMF میں فیرولک ایسڈ کے 2 مساوی، HBTU کے 2 مساوی، HOBt کے 2 مساوی، اور DIEA کے 2.5 مساوی شامل کیے جانے کے بعد، رد عمل 2 گھنٹے کے لیے کیا گیا۔ رد عمل کے خاتمے کی تصدیق کیزر ٹیسٹ کٹ کے ساتھ کی گئی تھی، اور رال کو ڈی ایم ایف سے دھویا گیا تھا۔ حتمی ترکیب مکمل ہونے کے بعد، پیپٹائڈ کو رال سے الگ کرنے کے لیے ایک کلیویج محلول (TFA:H2O: Ohioans ole:phenol:EDT: TIS=81.5:5:5:5:2.5:1) شامل کیا گیا۔ . اس کے بعد پیپٹائڈ کو ڈائیتھائل ایتھر کا استعمال کرتے ہوئے تیز کیا گیا اور پانچ بار دھویا گیا۔ اس کے بعد، حتمی پیپٹائڈ مصنوعات کی وصولی کے لئے خشک کرنے والی کارکردگی کا مظاہرہ کیا گیا تھا.

ترکیب شدہ پیپٹائڈ کی پاکیزگی کی شناخت HPLC (تھرمو فشر سائنٹیفک/U{{0}}) کے تجزیہ سے کی گئی تھی، اور موبائل مرحلے کے تحت 1 ملی لیٹر فی منٹ کی بہاؤ کی شرح کے تحت UV 214 nm پر اس کا پتہ چلا تھا {{ 5}} پانی میں 1 فیصد TFA/ acetonitrile میں 0.1 فیصد TFA C18 (Agilent, Pursuit XRs, 250 × 4.6 mm, 5 m, 100Å) کالم کا استعمال کرتے ہوئے۔

مالیکیولر وزن کی شناخت کے لیے، LC-MS/MS (AB SCIEX, 3200 Q-trap) تجزیہ کیا گیا، اور اس کا پتہ MS/MS کے ذریعے {{7 کی بہاؤ کی شرح پر لگایا گیا۔ }}.25 ملی لیٹر/منٹ موبائل فیز کے تحت 0.1 فیصد فارمک ایسڈ پانی میں/0.1 فیصد فارمک ایسڈ ایسٹونائٹریل گریڈینٹ میں C18 (Agilent, Pursuit XRs, 100 × 2.0 mm, 5 m, 100Å) کالم کا استعمال کرتے ہوئے . MS/MS تجزیہ کی شرائط میں ESI مثبت موڈ، ماخذ/گیس: CUR=20، CAD=ہائی، IS=5500، TEM=350، GS1=50 شامل ہیں۔ , GS2=50/کمپاؤنڈ DP=50–80, EP=10, CE=10–50, اور CES=1–10 (ٹیبل 2)۔

سیل کلچر

اس تجربے میں استعمال ہونے والے B16F10 میلانوما سیلز ATCC (ماناساس، VA، USA) سے خریدے گئے تھے۔ B16F10 خلیوں کو DMEM میڈیا میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا جس میں 10 فیصد حرارت سے غیر فعال FBS، 1 فیصد پینسلن/اسٹریپٹومائسن، اور 1.5 g/L سوڈیم بائی کاربونیٹ 37 ڈگری پر اور 5 فیصد CO2 کی حالت میں تھا۔

HaCaT keratinocytes CLS (Eppelheim، Germany) سے خریدے گئے تھے۔ HaCaT خلیات DMEM میڈیا میں انکیوبیٹ کیے گئے تھے جن میں 10 فیصد حرارت سے غیر فعال FBS اور 1 فیصد پینسلن/سٹریپٹومائسن 37 ڈگری پر اور 5 فیصد CO2 کی حالت میں تھے۔

سیل کی عملداری

B16F10 خلیوں کو 8 × 103 خلیات کی کثافت پر 48-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا اور 16 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد ان کا علاج 3 دن تک 2 فیصد ایف بی ایس پر مشتمل میڈیا میں پیپٹائڈ مرکب کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ انکیوبیشن کے بعد، 20 l 4 mg/ml MTT کا ہر کنویں میں 4 گھنٹے تک علاج کیا گیا اور میڈیا کو ہٹا دیا گیا۔ اس کے بعد، خلیوں کو فارمازان کو تحلیل کرنے کے لیے 500 l DMSO کے ساتھ علاج کیا گیا۔ اسپیکٹرو فوٹومیٹر (سالماتی آلات، سان جوس، CA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے جذب کو 570 nm پر ماپا گیا۔

میلانین مواد پرکھ

B16F10 خلیات کو 5 × 104 خلیات کی کثافت پر 6-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا تھا اور 16 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد ان کا علاج 3 دن تک 2 فیصد ایف بی ایس پر مشتمل میڈیا میں پیپٹائڈ مرکب کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ میلانین کی پیداوار کو دلانے کے لیے، 100 ng/ml -MSH کو شریک علاج کیا گیا اور 200 M arbutin کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ خلیوں کو 200 l 1 M NaOH کے ساتھ علاج کرکے جمع کیا گیا تھا اور 490 nm پر lysate کے جذب کو سپیکٹرو فوٹومیٹر سے ماپا گیا تھا۔

ٹائروسینیز سرگرمی ٹیسٹ

B16F10 خلیات کو 5 × 104 خلیات کی کثافت پر 6-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا تھا اور 16 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد ان کا علاج 3 دن تک 2 فیصد ایف بی ایس پر مشتمل میڈیا میں پیپٹائڈ مرکب کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ میلانین کی پیداوار کو آمادہ کرنے کے لیے، 100 ng/ml-MSH کو شریک علاج کیا گیا اور 200 M arbutin کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ لیسیٹ کو جمع کرنے کے لیے ہر کنویں کا 200 لیٹر لیسس بفر (سگما-الڈرچ) سے علاج کیا گیا۔ BCA کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کی مقدار کا تعین کرنے کے بعد، ہر گروپ سے 90 گرام پروٹین کو 20 l 10 mM L-DOPA کے ساتھ 96- کنویں کی پلیٹ میں 30 منٹ کے لیے 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ 475 nm پر مرکب کے جذب کو سپیکٹرو فوٹومیٹر سے ماپا گیا۔

میلانوزوم تنہائی

B16F1{{10}} خلیات کو ایک 6-کنویں پلیٹ میں 5 × 104 خلیات کی کثافت پر سیڈ کیا گیا اور 16 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ میلانین کی ترکیب کو آمادہ کرنے کے لیے سیلز کا 100 ng/ml-MSH کے ساتھ 72 گھنٹے تک علاج کیا گیا اور ٹرپسن/EDTA علاج کے ذریعے کٹائی گئی۔ اس کے بعد خلیوں کو 10 ملی لیٹر 0.25 ایم سوکروز (10 ایم ایم ایچ ای پی ای ایس بفر میں) سے دھویا گیا اور 0.25 ایم سوکروز کے 10 ملی لیٹر میں دوبارہ معطل کیا گیا۔ اس کے بعد، مائع نائٹروجن کے ساتھ منجمد ہونے کے بعد، 37 ڈگری پر پگھلایا گیا، جسے 10 بار دہرایا گیا۔ 1،000 جی پر 10 منٹ کے لیے سینٹرفیوگیشن کے بعد، سپرنٹنٹ کو اکٹھا کیا گیا اور مزید 45 منٹ کے لیے 20,630 جی اور 4 ڈگری پر سینٹرفیوگیشن کیا گیا۔ اس کے بعد، گولی کو DPBS کے ساتھ دوبارہ معطلی کا نشانہ بنایا گیا اور استعمال سے پہلے -80 ڈگری پر محفوظ کیا گیا۔

میلانوسم اپٹیک ٹیسٹ

HaCaT خلیات کو 1 × 105 خلیات / کنویں کی کثافت پر 6-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا تھا اور 16 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد ان کا سیرم فری میڈیا میں پیپٹائڈ مکسچر کے ساتھ 1 گھنٹے تک علاج کیا گیا اور مزید 40 گھنٹے کے لیے الگ تھلگ میلانوسومز کے ساتھ علاج کیا گیا۔ خلیوں کو 200 l 1 M NaOH کے ساتھ علاج کرکے لیس کیا گیا تھا اور 490 nm پر lysate کے جذب کو سپیکٹرو فوٹومیٹر سے ماپا گیا تھا۔ مزید برآں، فونٹانا-میسن اسٹین کٹ (ScyTek لیبارٹریز، لوگن، UT، USA) کا استعمال کرتے ہوئے میلانوسوم سٹیننگ کی گئی تھی اور ہلکی خوردبین کے ذریعہ خلیوں کی تصاویر کا پتہ لگایا گیا تھا۔

میلانوسم انحطاط ٹیسٹ

HaCaT خلیات کو 1 × 105 خلیات / کنویں کی کثافت پر 6-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا تھا اور 16 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ ان کا 48 گھنٹے تک سیرم فری میڈیا میں الگ تھلگ میلانوسومز کے ساتھ علاج کیا گیا اور اس کے علاوہ پیپٹائڈ مکسچر کے ساتھ 72 گھنٹے تک علاج کیا گیا۔ ریپامائسن کا ایک مائکرومول مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ خلیوں کو 200 l 1 M NaOH کے ساتھ علاج کرکے لیس کیا گیا تھا اور 490 nm پر lysate کے جذب کو سپیکٹرو فوٹومیٹر سے ماپا گیا تھا۔ مزید برآں، فونٹانا-میسن اسٹین کٹ کا استعمال کرتے ہوئے میلانوسوم سٹیننگ کی گئی تھی، اور ہلکی خوردبین کے ذریعہ خلیوں کی تصاویر کا پتہ لگایا گیا تھا۔

جین اظہار تجزیہ (RT-PCR)

B16F10 خلیات کو 5 × 104 خلیات کی کثافت پر 6-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا تھا اور 16 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد ان کا علاج 3 دن تک 2 فیصد ایف بی ایس پر مشتمل میڈیا میں پیپٹائڈ مرکب کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ میلانین کی پیداوار کو آمادہ کرنے کے لیے، 100 ng/ml-MSH کو شریک علاج کیا گیا اور 200 M arbutin کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ RNA کو RNA نکالنے والی کٹ (کیجین، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے خلیوں سے الگ تھلگ کیا گیا تھا، اور RT-PCR پریمکس (iNtRON بائیو ٹیکنالوجی، Seongnam، Korea) کا استعمال کرتے ہوئے cDNA کی ترکیب کی گئی تھی۔ PCR پریمکس (iNtRON بائیوٹیکنالوجی) اور ہر ایک جین کے لیے پرائمر کے ساتھ رد عمل کے مرکب کی تیاری کے بعد، PCR کو PCR مشین (Eppendorf، Germany) کے ذریعے انجام دیا گیا۔ اس کے بعد ، ایم آر این اے اظہار کے نمونوں کا تعین ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعہ کیا گیا تھا۔

HaCaT خلیات کو 3 × 105 خلیات / کنویں کی کثافت پر 6-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا تھا اور 16 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد ان کا علاج سیرم فری میڈیا میں پیپٹائڈ مرکب کی مختلف ارتکاز کے ساتھ 1 گھنٹے تک کیا گیا اور اس کے علاوہ 16 گھنٹے کے لیے 4U ٹرپسن کے ساتھ علاج کیا گیا۔ خلیوں کو جمع کیا گیا تھا اور RT-PCR اسی انداز میں انجام دیا گیا تھا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔

پروٹین اظہار تجزیہ (مغربی بلوٹنگ)

B16F10 خلیوں کو 5 × 104 خلیات کی کثافت پر ایک 6-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا اور 1 دن تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد ان کا علاج 3 دن تک 2 فیصد ایف بی ایس پر مشتمل میڈیا میں پیپٹائڈ مرکب کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ میلانین کی پیداوار کو آمادہ کرنے کے لیے، 100 ng/ml -MSH کو شریک علاج کیا گیا اور 200 M arbutin کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ خلیوں کو لیسیز بفر کے ساتھ لیس کیا گیا تھا اور BCA کٹ کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کی مقدار درست کی گئی تھی۔ بیس مائیکرو گرام پروٹین کو 8 فیصد پولی کریلامائڈ جیل پر الگ کیا گیا اور الیکٹروفورٹیکلی طور پر پولی وینیلائیڈین فلورائیڈ جھلیوں میں منتقل کیا گیا۔ پی بی ایس میں 0.5 فیصد ٹوین 20 (PBS-T) کے ساتھ 5 فیصد w/v سکم دودھ میں جھلیوں کو بلاک کیا گیا تھا۔ پرائمری اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیشن کو بلاک کرنے والے محلول میں گھل مل کر راتوں رات 4 ڈگری پر انجام دیا گیا اور اس کے بعد PBS-T سے دھویا گیا۔ مناسب ثانوی اینٹی باڈیز کو مسدود کرنے والے محلولوں میں پتلا کیا گیا تھا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ تک جھلیوں کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا جس کے بعد PBS-T سے دھویا گیا تھا۔ جھلیوں کو مغربی پتہ لگانے والے ریجنٹ (ایلپس بائیوٹیک، ڈیجیون، کوریا) کے ذریعے جیل ڈاکٹر (بائیو ریڈ، ہرکیولس، سی اے، یو ایس اے) کے ذریعے دیکھا گیا تھا۔

p-CREB اور p-ERK کے تجزیہ کے لیے، B16F10 خلیات کو 3 × 105 خلیات کی کثافت پر 6-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا اور 1 دن تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد ان کا علاج 2 فیصد FBS پر مشتمل میڈیا میں پیپٹائڈ مرکب کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ انکیوبیشن کے اوقات p-CREB کے تجزیہ کے لئے 30 منٹ اور p-ERK کے تجزیہ کے لئے 10 منٹ تھے۔ میلانین کی پیداوار کو دلانے کے لیے، 100 ng/ml -MSH کو شریک علاج کیا گیا، اور 200 M arbutin کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ ویسٹرن بلاٹنگ الگ تھلگ پروٹین کا استعمال کرتے ہوئے اسی طرح کی گئی تھی جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔

HaCaT خلیات کو 3 × 105 خلیات / کنویں کی کثافت پر 6-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا تھا اور 16 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد ان کا 3 دن تک سیرم فری میڈیا میں پیپٹائڈ مکسچر کے مختلف ارتکاز کے ساتھ علاج کیا گیا۔ ریپامائسن کے دو سو نینو گرام کو مثبت کنٹرول کے طور پر 3 گھنٹے تک علاج کیا گیا۔ ویسٹرن بلاٹنگ الگ تھلگ پروٹین کا استعمال کرتے ہوئے اسی طرح کی گئی تھی جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔

جلد کے مساوی تجزیہ

جلد کے مساوی استعمال کرتے ہوئے پیپٹائڈ مکسچر کے سفید ہونے کے اثر کو جانچنے کے لیے، لیپوزوم کا نمونہ درج ذیل تیار کیا گیا تھا۔ پیپٹائڈ مرکب کو آست پانی میں 2،000 g/ml کے ارتکاز میں تحلیل کیا گیا اور pH 7 میں ایڈجسٹ کیا گیا۔ فلٹریشن کے بعد 0۔{4}}m pore سائز فلٹر، 1 فیصد ہائیڈروجنیٹڈ فاسفیٹائڈیلچولین بفر کو 10 فیصد کے تناسب سے ملایا گیا تھا۔ نینو سائز کا لیپوزوم نمونہ مائیکرو فلائیڈائزر کا استعمال کرتے ہوئے 1،{10}} بار پر پانچ بار 75-m خلیات سے گزر کر تیار کیا گیا تھا۔

MelanoDerm MEL-300-B (MatTek Corporation, Ashland, MA, USA) کا علاج 25 l یا 50 l liposome کے ساتھ کیا گیا جس میں 2,000 g/ml پیپٹائڈ مکسچر ہفتے میں تین بار 2 ہفتوں تک تھا۔ گاڑی کا ایک ہی حجم ٹشو کو کنٹرول کرنے پر لگایا گیا تھا۔ علاج شدہ جلد کے مساوی DPBS کے ساتھ دھوئے گئے اور میلانوسائٹس کی شکل کو جانچنے کے لیے ہلکی مائکروسکوپی کی گئی۔ اس کے بعد، میلانین کی پیداوار کا تجزیہ کرنے کے لیے، جلد کے مساوی اجزاء کو -80 ڈگری پر 30 منٹ کے لیے منجمد کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر پگھلا دیا گیا۔ ٹشو کے نمونے 30 منٹ کے لیے 1 فیصد سوڈیم بائک کاربونیٹ کے ساتھ لگائے گئے اور خشک کیے گئے۔ 300 l Solvable کے ساتھ علاج کے بعد، نمونوں کو رات بھر 95 ڈگری پر چھوڑ دیا گیا اور پھر کمرے کے درجہ حرارت پر ٹھنڈا کر دیا گیا۔ 490 nm پر ٹشو کے عرق کے جذب کو سپیکٹرو فوٹومیٹر سے ماپا گیا۔

ہسٹولوجی کے ذریعے ٹشوز کے اندر میلانین کی تقسیم کا مشاہدہ کرنے کے لیے، تمام نمونوں کو 24 گھنٹے کے لیے 4 فیصد فاسفیٹ بفرڈ فارملین میں طے کیا گیا تھا۔ فکسڈ نمونے پیرافین ایمبیڈڈ تھے اور ایک مائکروٹوم (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany) کا استعمال کرتے ہوئے ایک 5-m حصے میں کاٹے گئے تھے۔ مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق فونٹانا-میسن اسٹین کٹ کا استعمال کرتے ہوئے پیرافین کے حصوں کو داغ دیا گیا تھا اور ہلکی مائکروسکوپی کی گئی تھی۔

شماریات

اس مطالعے میں کیے گئے تجربات کو تین بار یا اس سے زیادہ دہرایا گیا۔ اعداد و شمار کی شماریاتی اہمیت کو طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کے ذریعے جانچا گیا۔ نتیجے میں آنے والی اقدار کو اوسط ± معیاری انحراف کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا اور جب p-value 0.05 سے کم تھی تو شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھی جاتی تھی۔

نتائج

پیپٹائڈ مرکب B16F10 خلیوں میں MSH-حوصلہ افزائی میلانین ترکیب اور ٹائروسینیز کی سرگرمی کو روکتا ہے۔

سیل کی عملداری پر پیپٹائڈ مکسچر کے اثر کا تعین کرنے کے لیے، B16F10 میلانوما سیلز، اور HaCaT keratinocytes کو پیپٹائڈ مکسچر کے ساتھ 10، 50، 100، اور 200 M کی تعداد میں علاج کیا گیا، اور MTT پرکھ کی گئی۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ پیپٹائڈ مرکب علاج کے مجموعی ارتکاز میں سائٹوٹوکسک نہیں تھا، اور اس کے بعد کے تجربات مندرجہ بالا ارتکاز کی حد (تصویر 1A) میں کیے گئے۔

میلانین کی ترکیب پر پیپٹائڈ مرکب کے روکنے والے اثر کی نشاندہی کرنے کے لیے، میلانین کی پیداوار کی شرحوں کا موازنہ کرنے کے لیے B16F10 خلیوں کو 10، 50، 100، اور 200 M کی تعداد میں علاج کیا گیا۔ نتائج نے پیپٹائڈ مرکب کے ذریعہ میلانین کی پیداوار کی خوراک پر منحصر رکاوٹ کو ظاہر کیا۔ روک تھام کی شرح 10 M کی سب سے کم ارتکاز پر 3 فیصد اور 200 M (تصویر 1B) کے سب سے زیادہ ارتکاز پر 26 فیصد تھی۔

ٹائروسینیز میلانین کی ترکیب میں کلیدی خامروں میں سے ایک ہے۔ ٹائروسینیز ایکٹیویٹی پرکھ اس بات کی تصدیق کے لیے کی گئی تھی کہ پیپٹائڈ مرکب کا میلانوجینیسیس روکنے والا اثر ٹائروسینیز کے ضابطے کی وجہ سے ہوا تھا۔ نتائج نے B16F10 خلیوں میں پیپٹائڈ مرکب کے ذریعہ ٹائروسینیز کی سرگرمی کو نمایاں طور پر روک دیا۔ روک تھام کی شرح 10 M کی سب سے کم ارتکاز پر 8 فیصد اور 200 M (تصویر 1C) کے سب سے زیادہ ارتکاز پر 33 فیصد تھی۔

مزید کے لیے پوچھیں: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501