پلیٹلیٹ پور اور امیر پلازما میں Xanthine Oxidoreductase ایکٹیویٹی مریضوں میں آکسیڈیٹیو تناؤ کے اشارے کے طور پر رینل ریپلیسمنٹ تھراپی کی ضرورت ہوتی ہے۔

خلاصہ پس منظر: Xanthine oxidoreductase(XOR) ایک ہائیڈروکسیلیس انزائم ہے جو پیورینز کے میٹابولزم میں شامل ہے۔ XOR کی سرگرمی مختلف ہو سکتی ہے: ہوموڈیمر پروٹین کو دو مختلف isoforms XD (اینٹی آکسیڈینٹ) اور XO (prooxidant) میں تبدیل کیا جا سکتا ہے۔ آکسیڈیٹیو تناؤ اور سوزش جو اس کے ساتھ ہے۔دائمی گردے کی بیماری(CKD)، ڈائیلاسز، اور گردے کی پیوند کاری کے نتیجے میں پلیٹلیٹ ایکٹیویشن ہوا۔ موجودہ مطالعہ کا مقصد xanthine oxidoreductase اور اس کی isoform سرگرمی پر اپلائیڈ رینل ریپلیسمنٹ تھراپی کے اثر و رسوخ کا تعین کرنا ہے۔

مواد اور طریقے: مطالعاتی گروپ 117 مریضوں پر مشتمل تھا، جنہیں 4 گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: ہیمو ڈائلیسس - 30 مریض، پیریٹونیل ڈائیلاسز - 30 مریض، گردے کی پیوند کاری کے مریض - 27، اور قدامت پسند علاج {{5} } مریض. کنٹرول گروپ 30 صحت مند رضاکاروں پر مشتمل تھا۔ نتائج: مطالعہ کیے گئے گروپوں کے اندر پلیٹلیٹ ناقص پلازما (PPP) میں XOR سرگرمی میں اہم اختلافات پائے گئے (p=0.001)۔ پی پی پی (پی<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Theدائمی گردے کی بیماری کی وجہپی پی پی میں XD اور XO سرگرمی میں فرق میں بھی جھلکتا تھا۔

نتیجہ: CKD کے مریضوں میں استعمال ہونے والی رینل ریپلیسمنٹ تھراپی کی قسم، مریضوں کی عمر، ڈائیلاسز کی مدت، CKD کی وجوہات، اور بڑھنے کا مرحلہ XOR اور اس کے آئسفارمز کی سرگرمی کو نمایاں طور پر متاثر کرتا ہے۔

مطلوبہ الفاظ: Xanthine oxidoreductase، پلیٹ لیٹس، رینل ریپلیسمنٹ تھراپی،دائمی گردے کی بیماری، اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز

CISTANCHE کو کام کرنے میں کتنا وقت لگتا ہے؟

پس منظر

Xanthine oxidoreductase (XOR) ایک ہائیڈروکسیلیس انزائم ہے جو پیورینز کے میٹابولزم میں شامل ہے۔ یہ ہائپوکسینتھائن سے زانتھائن اور زانتھائن سے یورک ایسڈ (UA) کے آکسیکرن کو متحرک کرتا ہے۔ XOR کی سرگرمی مختلف ہو سکتی ہے: ہوموڈیمر پروٹین کو دو مختلف آئسفارمز میں تبدیل کیا جا سکتا ہے۔ Xanthine dehydrogenase (XD) کا اظہار بنیادی طور پر صحت مند بافتوں میں ہوتا ہے، اور xanthine oxidase (XO) پوسٹ ٹرانسلیشنل XD ترمیم، آکسیڈیشن سیسٹین کی باقیات کے ساتھ ساتھ محدود پروٹولیسس کے ذریعے پیدا ہوتا ہے، جو زخموں کے دوران خلیوں اور بافتوں میں غالب کردار ادا کرتا ہے۔ ] مذکور isoforms کی سرگرمیاں ایک دوسرے کی مخالفت کرتی ہیں [4]۔ XOR NAD+ کی موجودگی میں ڈیہائیڈروجنیز کے طور پر اور سالماتی آکسیجن کے ساتھ آکسیڈیز کے طور پر کام کرتا ہے۔ XOR کی تیزی سے اینٹی آکسیڈینٹ سے آکسیڈینٹ میں تبدیل ہونے کی صلاحیت، مختلف قسم کے بافتوں کو پہنچنے والے نقصان میں، تیزی سے پیدائشی مدافعتی ردعمل کے لیے ایک لازمی عنصر ہے، مثال کے طور پر، بیکٹیریل یا فنگل انفیکشن [5] میں فائدہ مند ہے۔

xanthine dehydrogenase (XDO) اور آکسیجن کا ایک ردعمل انٹرمیڈیٹس NAD+ اور O2 دونوں کے ساتھ رد عمل ظاہر کر سکتا ہے لیکن NAD+ [6] کے لیے ایک اعلی تعلق پیش کرتا ہے۔ اس انٹرمیڈیٹ آئسفارم کو الگ تھلگ نہیں کیا گیا ہے، لیکن اس کی سرگرمی کا تعین XD سے XO میں تبدیلی کی ٹریکنگ میں سہولت فراہم کرتا ہے [7]۔

مختلف بیماریوں میں سیرم XOR کی سرگرمی کی وسیع پیمانے پر تحقیقات کی گئی ہیں۔ اس انزائم میں دلچسپی کی وجہ اس کے عمل کی دوغلی پن ہے: اینٹی آکسیڈینٹس پیدا کرنے کی صلاحیت، اور دوسری طرف، رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کی تخلیق۔ XOR کی سرگرمی میں اضافہ پیتھولوجیکل حالات میں ہوتا ہے جیسے وائرل ہیپاٹائٹس، متعدی مونو نیوکلیوسس، آٹومیمون امراض، نمونیا، شیزوفرینیا، اور قسم II ذیابیطس۔ گردوں یا جگر کی پیوند کاری کے بعد مریضوں کے سیرم میں بھی XOR کی سرگرمی میں اضافہ دیکھا جاتا ہے [8]۔ یہ دکھایا گیا ہے کہ XOR کے لیے جین کوڈنگ گردوں کی پختگی، اور گردے میں ایڈیپوجینیسیس کے لیے ذمہ دار ہو سکتی ہے، اور اپکلا خلیوں کی mesenchymal ٹشو میں تبدیلی کو روک سکتی ہے [9]۔ تاہم، ہمارے بہترین علم کی وجہ سے، رینل ریپلیسمنٹ تھراپی سے گزرنے والے مریضوں میں پلیٹلیٹ-غریب پلازما (PPP) اور پلیٹلیٹ سے بھرپور پلازما (PRP) میں XOR سرگرمی کی تحقیقات کرنے والی کوئی رپورٹ شائع نہیں ہوئی ہے۔ مریضوں کے اس گروپ میں XOR سرگرمی کی اہمیت کا تعلق پلیٹلیٹ ایکٹیویشن میں اضافے سے ہے، جو آکسیڈیٹیو تناؤ اور سوزش کی وجہ سے ہوتا ہے جو گردے کی دائمی بیماری (CKD)، ڈائیلاسز، اور گردے کی پیوند کاری کے ساتھ ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، ڈائیلاسز اور اعضاء کی پیوند کاری کے دوران، ٹشوز اور خون کی نالیوں کو نقصان پہنچایا جاتا ہے، اور پلیٹلیٹس ٹشو کو پہنچنے والے نقصان کی جگہ تک پہنچنے والے پہلے خلیے ہیں، جو سوزش کے عمل کے ابتدائی مراحل میں فعال طور پر حصہ لیتے ہیں اور شفا یابی [10]۔

PRP اور PPP خون کے پلازما کے حصے ہیں جن میں پلیٹلیٹ کی مختلف تعداد ہوتی ہے۔ PRP اور PPP کا پلیٹلیٹ مواد بالترتیب پلیٹلیٹ/ml اور پلیٹلیٹ/ml ہے۔ پی پی پی اور پی آر پی مختلف سینٹری فیوگل رفتاروں پر انسانوں کے پورے خون کو بار بار سنٹرفیوجنگ اور دھو کر حاصل کیے جاتے ہیں [11، 12]۔

پی پی پی، اینٹی کوگولیٹڈ خون کے سینٹرفیوگریشن ضمنی پروڈکٹ کے طور پر، عام خون کے مقابلے میں پلیٹلیٹ کا کم ارتکاز ہے۔ پی پی پی کے اہم اجزاء فائبرنوجن، فائبرونیکٹین اور تھرومبن ہیں۔ پی پی پی کے حیاتیاتی اثرات ہیموسٹاسس اور کوایگولیشن میں حصہ لے رہے ہیں، سیل اٹیچمنٹ ویکٹر کے طور پر کام کر رہے ہیں، اور فبرو بلوسٹس اور اپکلا خلیوں کے مائٹوسس کو فروغ دے رہے ہیں [13]۔ اگرچہ PPP پلیٹلیٹس میں PRP کی طرح مرتکز نہیں ہے، لیکن یہ ثابت ہوا ہے کہ PPP سیل کی نشوونما اور بقا کو بھی برقرار رکھ سکتی ہے۔ پی پی پی زخم کی شفا یابی سے وابستہ سیل کے افعال کو فروغ دیتا ہے اور سیل کی منتقلی اور فبرو بلوسٹس کے پھیلاؤ کو تیز کرتا ہے [14، 15]۔ پلیٹلیٹ سے بھرپور پلازما میں عام پلازما (تقریباً 150–400×103 خلیات/ ڈی ایل) سے زیادہ مرتکز پلیٹلیٹ ہوتے ہیں۔ یہ ادب میں PRP کی سب سے عام تعریفوں میں سے ایک ہے [16]۔ آج تک، محدود مطالعات میں XOR اور اس کی isoform سرگرمی کو پلیٹلیٹ سے بھرپور یا ناقص پلازما میں گردوں کی دائمی بیماری میں مبتلا مریضوں میں نمایاں کیا گیا ہے۔ Tan et al. ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کے ذریعے تباہ شدہ خلیوں کو دکھایا گیا (دائمی رینل ریپلیسمنٹ تھراپی کی صورت میں) XOR isoforms "لیک" ہوتا ہے، جس سے پلازما میں انزائم کی سطح میں اضافہ ہوتا ہے [17]۔ یہ طریقہ کار پی پی پی کے مقابلے میں پلیٹلیٹس میں XOR کی کم سرگرمی اور اس کے آئسفارمز کی وضاحت کرتا ہے۔ لہذا، PPP اور PRP میں oxidoreductases کی سرگرمی بہت دلچسپی کا حامل ہے، کیونکہ وہ روزانہ ہونے والے سیلولر عمل کو ننگا کرنے میں مدد کر سکتے ہیں۔ اس طرح کی تحقیقات بالواسطہ طور پر مریضوں کے اس گروپ میں آکسیڈیٹیو تناؤ کی شدت کو بھی اجاگر کر سکتی ہیں۔

بیری وغیرہ۔ یہ بھی بیان کریں کہ xanthine oxidoreductase جگر، چھوٹی آنت، mammary gland اور endothelial خلیات میں تقسیم کیا جاتا ہے۔ سب سیلولر لوکلائزیشن کے طریقوں نے سائٹوپلازم اور سیل کی جھلیوں دونوں پر xanthine oxidoreductase کی موجودگی کو ظاہر کیا ہے۔ وہ یہ بھی بتاتے ہیں کہ پلازما xanthine oxidasereductase سیل کی جھلیوں سے xanthine oxidoreductase شیڈنگ یا cytoplasm سے نکلنے کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ یہ ان وجوہات میں سے ایک ہے جو ہم PPP اور PRP میں XOR کی سرگرمی کی جانچ کرتے ہیں تاکہ پلیٹلیٹس اور پلازما میں موجود خون کے دوسرے خلیوں میں انزائم کی سرگرمی کو الگ کیا جا سکے [18]۔ اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کی سرگرمی کی بنیاد پر، ہم یہ بھی تعین کر سکتے ہیں کہ کس قسم کی رینل ریپلیسمنٹ تھراپی سے مریض کو آکسیڈیٹیو تناؤ کا سامنا کرنے کا امکان کم ہے۔ XOR کی دوہری نوعیت کی وجہ سے، گردوں کی تبدیلی کے علاج کی قسم اور XOR isoforms کی سرگرمی کے درمیان تعلق کی سمجھ بہت دلچسپ اور گردوں کی تبدیلی کی تھراپی کی قسم کے انتخاب میں مددگار ثابت ہو سکتی ہے۔

مواد اور طریقے

اخلاقی منظوری اور رضامندی۔

Szczecin میں Pomeranian Medical University میں Bioethical Commission نے کی گئی تحقیق کی منظوری دی (کوئی KB−0012/36/11)۔ کنٹرول گروپ میں صحت مند رضاکاروں سمیت تمام شرکاء کو مطالعہ کے مقصد اور دائرہ کار کے بارے میں مطلع کیا گیا اور انہوں نے نمونے عطیہ کرنے اور نتیجے میں ڈیٹا کی اشاعت کے لیے اپنی رضامندی دی۔

مطالعاتی گروپ

147 شرکاء تھے: 30 صحت مند رضاکاروں (NK) کا ایک کنٹرول گروپ، اور دائمی گردے کی بیماری (CKD) کے 117 مریض جو Szczecin میں Pomeranian Medical University کے Nephrology، Transplanetology، اور اندرونی امراض کے کلینک میں شریک تھے۔ Te مریضوں کو ان کے حاصل کردہ علاج کی بنیاد پر 4 گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: ہیمو ڈائلیسس سے پہلے اور بعد میں 30 مریض (HD A اور HD B): 30 مریضوں کو پیریٹونیل ڈائلیسس (PD)؛ گردے کی پیوند کاری سے پہلے اور بعد میں 27 مریض (سرجری کے 5–7 دن بعد) (TE, TE A)؛ 30 مریضوں نے قدامت پسند علاج (CT) (CKD مرحلہ 2–5) حاصل کیا۔ جنس، عمر، ڈائیلاسز کی مدت، گردے کی دائمی بیماری کی وجہ اور مرحلہ، اور ٹیسٹ اور کنٹرول گروپس میں کریٹینائن کا ارتکاز جدول 1 اور 2 میں دیا گیا ہے۔

نمونے

مطالعہ کے تمام شرکاء سے خون کے نمونے (K2EDTA (8 ml)، 3.8% trisodium citrate (9:1; v/v)، اور سیرم (8 ml)) لیے گئے۔ ہیموڈیلائزڈ مریض کا خون ان کے آرٹیریووینس فسٹولا سے لیا گیا تھا۔ پیریفرل وینی پنکچر دیگر تمام شرکاء کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ نمونے ہیموڈالیسس کے مریضوں سے (HD A) سے پہلے اور پمپ بند ہونے کے تقریباً 10 منٹ بعد (HD B) لیے گئے تھے۔ ٹرانسپلانٹ مریض کا خون ٹرانسپلانٹیشن (TE) سے پہلے اور سرجری (TE A) کے 5-7 دن بعد جمع کیا گیا تھا۔ اس مطالعہ میں TE گروپ کے لیے بھرتی کیے گئے مریضوں کا تعلق ہیموڈالیسس یا پیریٹونیل ڈائلیسس کے مریضوں کے گروپ سے نہیں تھا۔ وہ پورے پولینڈ سے ٹرانسپلانٹیشن کے لیے اہل مریض تھے۔ گردے کی پیوند کاری والے مریضوں کی اکثریت کا پہلے سے موڈ تجزیہ کیا گیا تھا۔ K2EDTA اور جمنے والے خون کے نمونوں کو 2600 rpm پر 10 منٹ کے لیے 20 ڈگری پر بالترتیب پلازما اور سیرم حاصل کرنے کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ پلیٹلیٹ سے بھرپور پلازما (PRP) اور پلیٹلیٹ ناقص پلازما (PPP) حاصل کرنے کے لیے، سائٹریٹ کے ساتھ جمع کیے گئے خون کو 1100 rpm پر 10 منٹ کے لیے 20 ڈگری پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ نتیجے میں پی آر پی کو ایک نئی ٹیوب میں منتقل کیا گیا اور 20 ڈگری پر 10 منٹ کے لیے 6000 rpm پر سینٹرفیوج کیا گیا: پلیٹلیٹ-غریب پلازما (PPP) کو ایک علیحدہ ٹیوب میں منتقل کیا گیا؛ پلیٹلیٹ گولی کو دو بار دھویا گیا اور ٹائروڈا بفر (pH7.4) میں معطل کر دیا گیا۔ پلازما، سیرم، پی پی پی، اور پی آر پی کو −80 ڈگری پر اس وقت تک منجمد کردیا گیا تھا جب تک کہ اسسیس انجام نہیں دیا جاتا تھا۔ ہیموڈالیسس کے مریضوں میں، ہیپرین کی انتظامیہ سے پہلے اور ڈائیلاسز کے بعد اوسطاً 4-5 گھنٹے تک خون جمع کیا جاتا تھا (ہیپرین آدھی زندگی - 4 h) تاکہ XOR سرگرمی پر ہیپرین کے کسی بھی ممکنہ اثر کو ختم کیا جا سکے۔

پلیٹلیٹ - ناقص پلازما اور پلیٹلیٹس میں Xanthine oxidoreductase سرگرمی

تعین ایک پرکن ایلمر UV/VIS Lambda 40P سپیکٹرو فوٹومیٹر کے ساتھ کیا گیا۔ ختم ہونے والی تبدیلیاں 30 ڈگری پر 5 منٹ کے لیے 340nm (XD) اور 302nm (XDO, XO) پر ریکارڈ کی گئیں۔ انزیمیٹک سرگرمی کو یورک ایسڈ اور NADH (A340 اور A302 میں اضافہ) کی تشکیل کے طور پر ماپا گیا اور mU× mL−1 (ملی یونٹ فی ملی لیٹر) میں ظاہر کیا گیا۔ رد عمل کی ابتدائی شرحوں کو مدنظر رکھتے ہوئے انزیمیٹک سرگرمی کا حساب لگایا گیا۔ یورک ایسڈ کی تشکیل کو 302nm (isoforms XDO اور XO) پر ماپا گیا کیونکہ اس کا جذب اب بھی وہاں زیادہ ہے، جب کہ NAD+ کے ارتکاز میں تبدیلیاں کوئی کردار ادا نہیں کرتی ہیں۔ NADH+ H+ ε340=6.22 × 103 [L∙mol−1 cm−1] کے لیے ختم ہونے والے گتانک کو xanthine oxidoreductase NADH+ H+: ε302=2.30×103 کے آئسفارمز کی سرگرمی کا حساب لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22]۔

جدول 1 ہیموڈالیسس کے مریضوں کی عمومی خصوصیات (HD)، پیریٹونیل ڈائیلاسز (PD) کا قدامت پسندانہ علاج کیا گیا (CKD)، گردے کی پیوند کاری (TE)، اور مطالعہ میں حصہ لینے والے کنٹرول گروپ (C) کا مطلب ہے (مطلب ±SD)

P * - HD، PD اور CKD گروپوں کے درمیان فرق کے لیے شماریاتی اہمیت، کوالٹیٹیو متغیرات کے لیے TE اور C عین فشر ٹیسٹ؛ مقداری متغیرات کے لیے - یک طرفہ ANOVA اور؛ پی ** - ایچ ڈی، پی ڈی اور سی کے ڈی گروپس کے درمیان فرق کے لیے شماریاتی اہمیت اور مقداری متغیرات کے لیے کوالٹیٹیو متغیرات کے لیے TE عین فشر ٹیسٹ یک طرفہ ANOVA یا؛ ڈی ایم - ذیابیطس نیفروپتی؛ HA - ہائی بلڈ پریشر؛ GIK - glomerular سوزش گردے؛ ADPKD - پولی سسٹک گردے کی بیماری وراثت میں آٹوسومل ڈومیننٹ؛ NS - اعداد و شمار کے لحاظ سے کوئی اہم فرق نہیں ہے۔

جدول 2 ہیموڈالیسس کے مریضوں کی عمومی خصوصیات (B - HD سے پہلے، A - بعد)، پیریٹونیل ڈائلیسس (PD) قدامت پسندانہ طریقے سے علاج کیا جاتا ہے (CKD) گردے کی پیوند کاری سے پہلے اور بعد میں (TE B اور TE A) اور کنٹرول گروپ (NK) میں حصہ لینے والے مطالعہ (مطلب ± SD)

P * - HD A، HD B، PD اور CKD گروپوں کے درمیان فرق کے لیے شماریاتی اہمیت، مقداری متغیرات کے لیے TE اور C - Kruskal Wallis ANOVA، یک طرفہ ANOVA یا طالب علم کا t-ٹیسٹ P** - HD A کے درمیان فرق کے لیے شماریاتی اہمیت , HD B, PD اور CKD اور TE گروپس برائے Kruskal Wallis's ANOVA quantitative variables یا ANOVA یک طرفہ تجزیہ Kt/V - ڈائیلاسز انڈیکس (حجم کا حصہ V وقت پر کلیئرنس K کے ذریعے صاف کیا گیا) NS کوئی شماریاتی لحاظ سے اہم تعلق نہیں پایا گیا۔

شماریاتی تجزیہ تقسیم کا اندازہ لگانے کے لیے، KS ٹیسٹ (Kolmogorov-Smirnov) استعمال کیا گیا، جو کچھ متغیرات (PRP میں XD اور XDO isoforms کی سرگرمی) کی صورت میں پیرامیٹرز کی غیر معمولی تقسیم کو ظاہر کرتا ہے۔ مقداری ڈیٹا کا تجزیہ کرنے کے لیے عین فشر اور چی مربع ٹیسٹ استعمال کیے گئے۔ غیر متغیر نظاموں کے لیے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ اور انووا تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے، عام تقسیم کے ساتھ متغیرات کے معاملے میں متعلقہ (جوڑا) اور غیر متعلقہ (غیر جوڑا) متغیر کے درمیان فرق کا جائزہ لیا گیا۔ غیر معمولی تقسیم کے ساتھ متغیرات کی صورت میں، پیرامیٹرز کے درمیان فرق کو جانچنے کے لیے کرسکل-والس انووا تجزیہ کیا گیا، نیز جوڑا بنائے گئے ڈیٹا کے لیے Mann-Whitney U نان پیرامیٹرک ٹیسٹ یا جوڑا ڈیٹا کے لیے Wilcoxon۔ مطالعہ کیے گئے پیرامیٹرز کے مابین تعلقات کی کثیر عنصری تشخیص کا تعین کرنے کے لیے ایک لکیری متعدد ریگریشن ماڈل استعمال کیا گیا تھا۔ نتائج کا شماریاتی تجزیہ Statistica 12 (StatSoft) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔