2.6۔ Caspase-3 اور Caspase-6 کا اظہار

سیستانچ کا گلائکوسائیڈ دل اور جگر کے بافتوں میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بھی بڑھا سکتا ہے، اور ہر ٹشو میں لیپوفسن اور ایم ڈی اے کے مواد کو نمایاں طور پر کم کر سکتا ہے، مختلف رد عمل آکسیجن ریڈیکلز (OH-، H₂O₂، وغیرہ) کو مؤثر طریقے سے ختم کر سکتا ہے اور DNA کو پہنچنے والے نقصان سے بچا سکتا ہے۔ OH ریڈیکلز کے ذریعہ۔ Cistanche phenylethanoid glycosides میں آزاد ریڈیکلز کو صاف کرنے کی مضبوط صلاحیت ہوتی ہے، وٹامن C کے مقابلے میں زیادہ کم کرنے کی صلاحیت ہوتی ہے، سپرم معطلی میں SOD کی سرگرمی کو بہتر بناتی ہے، MDA کے مواد کو کم کرتی ہے، اور سپرم کی جھلی کے کام پر ایک خاص حفاظتی اثر رکھتی ہے۔ Cistanche polysaccharides D-galactose کی وجہ سے تجرباتی طور پر حساس چوہوں کے erythrocytes اور پھیپھڑوں کے ٹشوز میں SOD اور GSH-Px کی سرگرمی کو بڑھا سکتے ہیں، نیز پھیپھڑوں اور پلازما میں MDA اور کولیجن کے مواد کو کم کر سکتے ہیں، اور elastin کے مواد کو بڑھا سکتے ہیں۔ ڈی پی پی ایچ پر اچھا اثر ڈالتا ہے، سینسنٹ چوہوں میں ہائپوکسیا کے وقت کو طول دیتا ہے، سیرم میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بہتر بناتا ہے، اور تجرباتی طور پر سنسنی والے چوہوں میں پھیپھڑوں کے جسمانی انحطاط میں تاخیر کرتا ہے، سیلولر مورفولوجیکل انحطاط کے ساتھ، تجربات سے معلوم ہوا ہے کہ Cistanche میں اینٹی آکسیڈنٹ کی اچھی صلاحیت ہے۔ اور جلد کی بڑھتی ہوئی بیماریوں کو روکنے اور علاج کرنے کے لیے ایک دوا بننے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ ایک ہی وقت میں، Cistanche میں echinacoside میں DPPH فری ریڈیکلز کو ختم کرنے کی قابل ذکر صلاحیت ہے اور اس میں رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کو نکالنے اور آزاد ریڈیکل-حوصلہ افزائی کولیجن کے انحطاط کو روکنے کی صلاحیت ہے، اور تھامین فری ریڈیکل ایون کے نقصان پر بھی اچھا اثر ڈالتا ہے۔

اینٹی آکسیڈینٹ کے لیے Cistanche Tubulosa جاننے کے لیے یہاں کلک کریں۔

【مزید معلومات کے لیے:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

TgAPP چوہوں نے کیسپیس{{0}} جین ایکسپریشن (فگر 8C1، H1) میں اضافہ دکھایا، جو WT چوہوں کے ہپپوکیمپی کے مقابلے میں اہم اور 30 ​​فیصد سے زیادہ تھا (شکل 8H1؛ p <0.05)۔ جہاں تک کیسپیس-6 اظہار کا تعلق ہے، ٹرانسجینک اور غیر ٹرانسجینک چوہوں کے درمیان کوئی فرق نہیں دیکھا گیا (شکل 8C2، H2)۔

Quercetin اور rutin کے علاج ہپپوکیمپس میں کیسپیس{{0}} mRNA کی سطح کو شماریاتی لحاظ سے اہم انداز میں کم کرنے کے قابل تھے (شکل 8H1؛ p < 0.05)، تقریباً 17 فیصد کی روک تھام کے ساتھ اور بالترتیب مادہ اور نر چوہوں کے لیے 27 فیصد۔ دماغی پرانتستا میں، اہم اختلافات صرف مردوں میں روٹین کے علاج میں دیکھے گئے (شکل 8C1؛ p <0.05)۔

کیسپیس-6 کے بارے میں، quercetin اور rutin کے علاج نے پرانتستا یا ہپپوکیمپس (Figure 8C2, H2) میں کوئی اعداد و شمار کے لحاظ سے کوئی خاص اثر نہیں ڈالا، حالانکہ بعد میں TgAPP مردوں میں Caspase-6 کا رجحان ظاہر ہوا کمی (شکل 8H2)۔

2.7۔ سوزش کے نشانات

اشتعال انگیز ثالثوں IL-1، TNF-، اور IFN- کے جین اظہار کے لیے حاصل کردہ نتائج کو شکل 9 میں دکھایا گیا ہے۔

TgAPP میں، WT چوہوں کے مقابلے دونوں جنسوں میں پرانتستا اور ہپپوکیمپس میں تقریباً 20 فیصد IL{{{0}} جین کے اظہار میں نمایاں اضافہ ہوا ہے (شکل 9C1, H1; p <0.05)۔ TNF- کے حوالے سے، اگرچہ TgAPP میں اعلی mRNA کی سطح دکھائی گئی ہے، لیکن وہ WT چوہوں (شکل 9C2، H2) میں اعدادوشمار کے لحاظ سے اہم نہیں ہیں۔ IFN- کے بارے میں، مردوں میں اس کے اظہار میں تقریباً 30 فیصد کا اضافہ ہوا، جو صرف پرانتستا میں شماریاتی لحاظ سے اہم تھا (شکل 9C3؛ p <0.05)۔

quercetin اور rutin کے ساتھ علاج، دونوں خواتین اور مردوں میں، TgAPP چوہوں کو کنٹرول کرنے کے مقابلے میں دماغی پرانتستا اور ہپپوکیمپس میں IL{{{0}} کے اظہار کو کم کرنے میں کامیاب تھے (شکل 9C1, H1; p < {{8) }}.05)، WT چوہوں سے ملتی جلتی اقدار حاصل کرنا، اور خاص طور پر نر چوہوں کے ہپپوکیمپی میں کم (شکل 9H1؛ p <0.05)۔

IL{{0}} اظہار پر دونوں flavonoid علاج کا مجموعی اثر TNF- کے ساتھ نہیں دیکھا گیا اور نہ ہی INF- کے ساتھ۔ اس طرح، TgAPP مردوں میں، quercetin علاج کے بعد، ہپپوکیمپل TNF- (شکل 9H2؛ p < 0.05) اور کارٹیکل IFN- اظہار میں نمایاں کمی واقع ہوئی (شکل 9C3؛ p <0.05)۔

2.8۔ انحطاط پذیر نیوران اور ان کے تخمینوں کا اندازہ

WT چوہوں کے مقابلے میں جس عمر میں ٹرانسجینک TgAPP چوہوں کا تجربہ کیا گیا تھا اس عمر میں نیوروڈیجنریشن کی کوئی خاص علامت نہیں دیکھی گئی، اور نہ ہی quercetin اور rutin کے علاج میں TgAPP (شکل S1، ضمنی اعداد و شمار) کے مقابلے میں 4 ہفتوں تک کوئی تبدیلی دکھائی نہیں دی۔

2.9 Ionotropic Glutamate ریسیپٹرز کا اظہار

ریسیپٹر ایکسپریشن میں کوئی خاص فرق نہیں پایا گیا، کنٹرول TgAPP چوہوں کے لیے حاصل کردہ اقدار کا WT چوہوں کے لیے حاصل کردہ اقدار کے ساتھ موازنہ کرتے ہوئے۔ quercetin یا rutin علاج کی موجودگی میں ان ionotropic ریسیپٹرز کے اظہار پر کوئی قابل ذکر اثرات بھی نہیں تھے (ٹیبل S5، ضمنی ڈیٹا)۔

3. بحث

ہمارے موجودہ مطالعے کا مقصد AD روگجنن کے پہلے مراحل میں دو flavonoids، quercetin، اور rutin کے اثرات کا اندازہ لگانا تھا، قطع نظر اس کے کہ ان کا اثر نیوروڈیجنریشن اور/یا علمی فعل پر کیوں نہ ہو۔ پرانتستا اور ہپپوکیمپس دماغ کے وہ حصے تھے جن کا تجزیہ کیا جا رہا تھا، کیونکہ یہ AD میں سب سے زیادہ متاثر دماغی ڈھانچے ہیں۔ اس بات کو دھیان میں رکھنا چاہیے کہ quercetin اور rutin کو ایک وضع کردہ خوراک کے ذریعے دیا گیا تھا جس میں دو میں سے کسی ایک flavonoids پر مشتمل تھا، AD جانوروں کے ماڈل میں، ایک صحت مند انسانی خوراک کی مقدار، جس میں ایک فعال جزو ہوتا ہے۔

خاص طور پر، C57B6 ماؤس میں transgene APPswe نے GSH/GSSG تناسب، MDA کی سطحوں، اینٹی آکسیڈینٹ انزائم کی صلاحیت، APP اظہار، BACE1 سرگرمی، اور کیسپیس-3 اور IL-1 اظہار پر نمایاں اثر ڈالا۔ جب کہ انسانوں میں اے پی پی کی تبدیلیوں کا نتیجہ عام طور پر عام AD کی صورت میں نکلتا ہے، وہ بنیادی طور پر اے پی پی ٹرانسجینک چوہوں میں مکمل طور پر امائلائیڈ پیتھالوجی سے منسلک ہوتے ہیں اور کوئی قابل ذکر نیوروڈیجنریشن نہیں ہے [14,15]، کیونکہ ہمارے ٹرانسجینک چوہوں میں TgAPP کے برعکس کوئی خصوصیت کی علامتیں نہیں دیکھی گئیں۔ ڈبلیو ٹی چوہوں (ضمنی اعداد و شمار، شکل S1) ہپپوکیمپل نیوران کے 40 -6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) کا مقابلہ کرنے سے ہمیں جوہری شکل کا مشاہدہ کرنے کی اجازت ملی، کیونکہ یہ مرکب نیوکلک ایسڈز کے لیے فلوروسینٹ رنگ ہے۔ ہم نے بکھرے ہوئے یا لوبولر نیوکللی کا مشاہدہ نہیں کیا، عام طور پر اپوپٹوٹک؛ اور نہ ہی ہم نے WT حصوں سے متعلق کنٹرول ٹرانسجینک لائن TgAPP کے ہپپوکیمپل ہسٹولوجیکل سیکشنز کا موازنہ کرنے میں کوئی قابل ذکر فرق نہیں دیکھا۔ اور نہ ہی ہم نے TgAPP چوہوں کے کنٹرول سے متعلق quercetin اور rutin علاج کے درمیان کوئی فرق نہیں دیکھا۔

تجزیہ کیے جانے والے AD بائیو کیمیکل خصوصیات کے پینل میں، ہم نے بنیادی طور پر دو فلیوونائڈ غذا میں سے کسی ایک پر GSH/GSSG تناسب کا تعین کرنے پر توجہ مرکوز کی، کیونکہ GSH کی سطح کی کمی AD [16,17 میں ابتدائی بائیو کیمیکل مارکروں میں سے ایک کی نمائندگی کرتی ہے۔ ] اور اس کے روگجنن اور بیماری کے بڑھنے کے دوران دیکھا گیا ہے۔ دماغی GSH کی سطحوں کی پیمائش [18] اور، حال ہی میں، خون میں GSH کی سطح [19] AD کے ابتدائی مراحل کے لیے تشخیصی نشانات کے طور پر امید افزا رہی ہے۔ مزید برآں، خود یا ان کے پیشرو [20-22] کے ذریعہ endogenous GSH اسٹورز کی تکمیل کے لیے بھی کوششیں کی گئی ہیں۔ ہمارے مطالعے میں، WT جانوروں سے متعلق TgAPP چوہوں میں، نر اور مادہ، اور دماغ کے دونوں حصوں میں سیلولر کم کرنے والی طاقت (GSH/GSSG) میں کمی دیکھی گئی۔ WT اور TgAPP دونوں چوہوں کے کارٹیکس اور ہپپوکیمپس میں، GSH/GSSG تناسب عورتوں کے مقابلے مردوں میں کم تھا۔ Quercetin اور rutin غذا نے علاج نہ کیے جانے والے TgAPP چوہوں کے مقابلے میں GSH/GSSG تناسب میں نمایاں اضافہ کیا، اور یہ اضافہ ہپپوکیمپس میں زیادہ واضح تھا۔ مردوں کے quercetin یا rutin کے علاج پر GSH اور GSSG کی سطحوں اور GSH/GSSG تناسب میں تبدیلیاں، بڑھتی ہوئی ریڈوکس طاقت کے حوالے سے، خواتین کی نسبت زیادہ نمایاں تھیں۔ ہمارے عزم کے نتائج سے Tg2576 چوہوں میں جنسی سے وابستہ اختلافات کی ایک اہم بنیاد ظاہر ہو سکتی ہے جو ایک طرف میکرو مالیکیولز کے آکسیڈیٹیو نقصان کے لیے حساسیت میں ہے، کیونکہ گلوٹاتھیون نظام متعدد حیاتیاتی افعال میں ایک ورسٹائل کم کرنے والا ہے، اور روک تھام کے اثرات میں۔ دوسری طرف اس کی جسمانی حیثیت کو بحال کرنے میں flavonoid غذا۔ جیسا کہ ہم اس بحث میں دیکھیں گے، ہم نے GSH/GSSG تناسب میں اضافہ کو مرکزی محور کے طور پر مقرر کیا ہے جو TgAPP چوہوں میں مشاہدہ کیے گئے اثرات کے سیٹ کی وضاحت کر سکتا ہے۔

حال ہی میں یہ تجویز کیا گیا ہے کہ GSH/GSSG تناسب، صرف ریڈوکس بفر کے طور پر کام کرنے کے بجائے، ایک اہم ریگولیٹری میکانزم کے طور پر کام کرے گا، جس سے پروٹین کو سیلولر کے تھیول-ڈسلفائیڈ توازن کو مضبوطی سے کنٹرول کرکے اپنی مقامی ساخت اور فعالیت حاصل کرنے کی اجازت ملے گی۔ پروٹوم مختصراً، گلوٹاتھیون نظام صحت مند پروٹوم کو محفوظ رکھنے کے لیے ضروری طور پر پیدا ہوتا ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ گلوٹاتھیون ریڈوکس ہومیوسٹاسس میں خلل (یعنی جینیاتی یا فارماسولوجیکل طور پر) آٹوفجی کی افادیت میں خلل کی وجہ سے پروٹین کی جمع کو بڑھاتا ہے [23]۔ لہذا، glutathione redox homeostasis کو برقرار رکھنے کی حکمت عملیوں میں پروٹین کی جمع سے منسلک بیماریوں میں علاج کی صلاحیت ہو سکتی ہے، جیسے AD۔ پروٹوم کے تحفظ سے قریبی تعلق ubiquitin–proteasome degradation مشینری ہے، جو AD کے روگجنن میں شامل ہے۔ پروٹیزوم منتخب طور پر متعدد ذیلی ذخائر کو کم کرتا ہے جو نیورونل ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے میں اہم ہیں، بشمول آکسائڈائزڈ اور مجموعی پروٹین کی کیٹابولزم۔ BACE1 ہر جگہ سے گزرتا ہے، اور یہ ظاہر کیا گیا ہے کہ ubiquitin–proteasome پاتھ وے کو مسدود کرنا BACE1 کے انحطاط کو روکے گا اور اس کے نتیجے میں BACE1 انزیمیٹک سرگرمی کی پیداوار میں اضافہ ہو گا، زیادہ کلیویج پروڈکٹ C99، اور A 1-40 اور A { دونوں میں اضافہ ہوگا۔ {8}} نیورونل اور غیر نیورونل خلیوں میں [10]۔ ہمارے پچھلے مطالعات سے پتہ چلا ہے کہ flavonoids، quercetin، اور rutin، نیوروبلاسٹوما خلیوں میں پروٹیزوم فنکشن کی ماڈیولیشن سے وابستہ مختلف سگنلنگ پاتھ ویز اور مالیکیولر نیٹ ورکس کو متاثر کرتے ہیں [9]۔ اس کے علاوہ، یہ بھی ظاہر کیا گیا ہے کہ کم گلوٹاتھیون (GSH) کے ساتھ اضافی نیورونز نے پروٹیزوم سرگرمی کو بحال کیا اور مجموعی تشکیل کو کم کیا [11] کیونکہ پروٹیزوم فنکشن ریڈوکس اسٹیٹس ریگولیٹڈ ہے [24]۔ لہذا، quercetin یا rutin غذا کھانے پر جانوروں کے ذریعے محسوس ہونے والے GSH/GSSG تناسب میں اضافہ quercetin اور rutin کے ذریعے پروٹیزوم کی ماڈیولیشن کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے، جس کا مظاہرہ سابق ویوو نے کیا تھا۔

جیسا کہ پہلے ذکر کیا گیا ہے، ریڈوکس عدم توازن انتہائی آکسیڈیٹیو ترمیم شدہ پروٹین کی طرف لے جاتا ہے جو پروٹیزوم کی خرابی [25] کے نتیجے میں مجموعے کو جمع اور تخلیق کرنے کا رجحان رکھتے ہیں۔ اس طرح، AD کے روگجنن میں آکسیڈیٹیو تناؤ کے اہم کردار کو دیکھتے ہوئے، TgAPP اور WT چوہوں میں پرانتستا اور ہپپوکیمپس میں لپڈ پیرو آکسیڈیشن (MDA لیول) اور اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز سمیت آکسیڈیٹیو تناؤ کے بائیو مارکرز کا اندازہ کیا گیا۔ ایس او ڈی، سی اے ٹی، جی آر، اور جی پی ایکس سب سے اہم اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز ہیں جو آکسیجن فری ریڈیکلز کے خلاف کام کرتے ہیں اور جسم میں فری ریڈیکلز کے میٹابولزم کو منظم کرتے ہیں اور فری ریڈیکل سکیوینگ سسٹم میں اپنا کردار ادا کرتے ہیں، جسم کے خلیوں کو لپڈ پیرو آکسیڈیشن سے بچاتے ہیں۔ . ہمارے مطالعے میں، اے پی پی اوور ایکسپریشن کے نتیجے میں، ڈبلیو ٹی چوہوں کے مقابلے ٹی جی اے پی پی چوہوں میں اینٹی آکسیڈینٹ انزائم کی سرگرمیوں میں عمومی کمی دیکھی گئی، جو کہ CAT کے لیے شماریاتی لحاظ سے اہم ہے۔ کم جی ایس ایچ کی سطح کے ساتھ ہم آہنگ، ٹی جی اے پی پی چوہوں میں لپڈ پیرو آکسائڈریشن میں نمایاں اضافہ ہوا تھا۔ اگرچہ انسانی AD میں آکسیڈیٹیو تناؤ کا ذریعہ انتہائی پیچیدہ اور کثیر الجہتی ہے، لیکن ایسا لگتا ہے کہ چوہوں میں تیار کردہ امائلائیڈ پیتھالوجی پیتھولوجیکل عمل کو شروع کرنے کے لیے کافی ہے جس کی وجہ سے دماغ میں آکسیڈیٹیو تناؤ میں اضافہ ہوتا ہے [26]۔ روٹین کے ساتھ علاج کیے جانے والے جانوروں نے نر اور مادہ دونوں میں پرانتستا میں CAT کی سرگرمی اور ہپپوکیمپس میں GR سرگرمی میں اضافہ کا تجربہ کیا۔ صرف روٹین کے ساتھ علاج کیے جانے والے جانوروں نے ہی پرانتستا میں CAT اور GR کے جین کے اظہار میں اور نر اور مادہ دونوں میں ہپپوکیمپس اور مادہ چوہوں کے ہپپوکیمپی میں GPx میں تبدیلی کا تجربہ کیا۔ اس تناظر میں، کئی قدرتی مرکبات پروٹیزوم اور ریڈوکس ریگولیشن کے درمیان کراسسٹالک کو متاثر کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے۔ مزید واضح طور پر، quercetin ایک معروف Nrf2 ایکٹیویٹر ہے [27] جو پروٹیزوم فنکشن کے محرک کے ذریعے اینٹی آکسیڈینٹ خصوصیات کو ظاہر کرتا ہے، آکسیڈیٹیو تناؤ کے خلاف مزاحمت کو بڑھاتا ہے اور سیل کی لمبی عمر دیتا ہے [28]۔

عام APP پروسیسنگ کے لیے BACE1 کا ٹشو سے متعلق اظہار اہم ہے، اور اس کا بے ضابطگی اظہار AD روگجنن میں کردار ادا کر سکتا ہے۔ BACE1 کا اظہار بنیادی طور پر ہپپوکیمپل نیوران، پرانتستا، اور سیریبلر گرینولر پرت [10] میں ہوتا ہے۔ واضح رہے کہ اس سے پہلے کے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ سویڈش اتپریورتی اے پی پی ٹرانسجینک چوہوں نے ایک مستحکم حالت میں A کی دماغی سطح کو نمایاں طور پر بڑھایا تھا [29]، یہ تجویز کرتا ہے کہ BACE1 AD روگجنن میں amyloidogenic راستے میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے اور یہ ایک اچھا علاج کا ہدف ہے۔ AD کے علاج کے لیے۔ ہمارے مطالعے میں، ہم نے quercetin اور rutin کے علاج پر BACE1 کی سرگرمی میں نمایاں کمی دیکھی، جو چوہوں میں A کے جمع ہونے میں کمی کا باعث بن سکتی ہے۔ ہم دلیل دیتے ہیں کہ صرف BACE1 انزائم، quercetin، اور rutin کے inhibitors کے طور پر کام کرنے سے زیادہ GSH/GSSG کے تناسب میں اضافے سے متعلق BACE1 کی سرگرمی میں کمی لا سکتا ہے، جو کہ پروٹیزوم سرگرمی کی بحالی کو بڑھانے کے مفروضے پر مبنی ہے۔ اس لحاظ سے، یہ معلوم ہے کہ BACE1 inhibitors کو APPswe (سویڈش میوٹیشن) کی کلیویج سائٹ پر نشانہ بنانا اس کے پلازما میمبرین تک پہنچنے سے پہلے ہوتا ہے، جبکہ APPwt (وائلڈ ٹائپ) کو سیل کی سطح سے شروع ہونے والے ابتدائی اینڈوسوم میں پروسیس کیا جاتا ہے۔ لہٰذا، BACE1 جو APPwt کو توڑتا ہے وہ کبھی کبھی APP پروسیسنگ سے پہلے سیل کی سطح پر BACE1 روکنے والے کا پابند ہوتا ہے، تاہم، APPswe پر کارروائی کرنے والا انزائم نہیں ہے [30]۔ یہی وجہ ہے کہ APPswe پروسیسنگ کی غیر معمولی لوکلائزیشن BACE1 inhibitors کے طور پر quercetin اور rutin کی طاقت کو نمایاں طور پر کم کر سکتی ہے۔ اس طرح، ہم اس بات کی حمایت کرنے کے لیے زیادہ مائل ہیں کہ Vivo ماڈل میں BACE کی سرگرمی میں کمی انزائم کی روک تھام کی وجہ سے نہیں بلکہ GSH/GSSG تناسب میں اضافے کی وجہ سے ہے۔ کسی بھی صورت میں، کم ہونے والی BACE1 سرگرمی کو TgAPP چوہوں میں -amyloid کی پیداوار کو کم کرنے کی کوشش کے طور پر تعبیر کیا جا سکتا ہے۔ جہاں تک BACE1 سرگرمی کی کشندگی پر ہپپوکیمپس میں quercetin اور rutin کے سب سے زیادہ قابل ذکر اثر کے بارے میں، یہ بات قابل توجہ ہے کہ پرانتستا میں ہپپوکیمپس [31] کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ نیوران کثافت ہوتی ہے، اور AD پیتھولوجیکل فینوٹائپ میں پروٹیزوم کی منتخب خرابی پرانتستا ہپپوکیمپس سے زیادہ کمزور اور متاثر ہوتا ہے [32]۔

BACE1 انزائم کی سرگرمی پر علاج کے اثر کا تعین کرنے کے بعد، ہم اس کے اظہار کا جائزہ لینے میں دلچسپی رکھتے تھے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ، WT چوہوں کے مقابلے TgAPP چوہوں کے درمیان BACE1 اظہار میں کوئی خاص فرق نہیں پایا گیا، اور quercetin یا rutin علاج کے ساتھ کوئی قابل ذکر تبدیلیاں نہیں دیکھی گئیں۔ لہذا، ایسا لگتا ہے کہ BACE1 انزائم کی سرگرمی میں اضافہ اظہار میں اضافے سے وابستہ نہیں ہے۔ اس تناظر میں، یہ قابل ذکر ہے کہ Apelt et al. [14] Tg2576 چوہوں میں 9 سے 13 ماہ کی عمر کے درمیان کارٹیکل BACE1 سرگرمی میں اضافہ پایا گیا جبکہ BACE1 پروٹین اور mRNA کے اظہار کی سطح عمر کے ساتھ تبدیل نہیں ہوئی۔ مزید برآں، اس بات کی حمایت کرنے والے شواہد پائے گئے ہیں کہ گھلنشیل امائلائیڈ اے 1–42 کے بجائے فائبرلر امائلائیڈ اے 1–42، BACE1 پروٹین ایکسپریشن کو اپ گریڈ کر سکتے ہیں، اور اس طرح امائلائیڈ آئسوفارمز کے تناسب میں چھوٹی تبدیلیاں امائلائڈ کی مجموعی کنفارمیشنز اور سیل کو نقصان پہنچا سکتی ہیں۔ 33]۔ اس طرح، BACE1 اظہار میں تبدیلی کی عدم موجودگی اس کی سرگرمی میں اضافے پر جو ہم نے پائی ہے ہمارے ماؤس ماڈل TgAPP میں fibrillar amyloid A 1–42 isoform کے مقابلے میں گھلنشیل amyloid A 1–42 کے پھیلاؤ کا سبب بن سکتی ہے۔

اے پی پی پروسیسنگ میں شامل انزائمز کے جین ایکسپریشن کے تعین کے بعد، ہم نے اے پی پی کی نان امیلائیڈوجینک پروسیسنگ میں شامل انزائم سیکریٹیز پر کوئرسیٹن اور روٹین کے اثر کا جائزہ لیا۔ ہم نے ADAM10 پر توجہ مرکوز کی کیونکہ یہ -secretase کا جسمانی لحاظ سے سب سے اہم تشکیلاتی آئسفارم ہے۔ ADAM10 ایس اے پی پی اور سی ٹرمینل فریگمنٹس (-CTF) [34,35] پیدا کرنے کے لیے A ڈومین کے اندر کلیونگ اے پی پی کے ذریعے نیوروٹوکسک اولیگومرک A تختیوں کی نسل کا مقابلہ کرتا ہے۔ اگرچہ ہمارے مطالعے میں پائی جانے والی ADAM10 اظہار میں تبدیلیاں اعدادوشمار کے لحاظ سے اہم نہیں تھیں، لیکن WT چوہوں کے مقابلے TgAPP چوہوں میں ADAM10 کے اظہار میں معمولی کمی دیکھی گئی۔ بنیادی طور پر، روٹین کے علاج نے مطالعہ کے تحت دماغ کے دونوں علاقوں میں ADAM10 جین کے اظہار کو بڑھانے کا رجحان ظاہر کیا۔ پوسٹینا وغیرہ۔ [36] نے ظاہر کیا کہ AD ماؤس ماڈل کے ہپپوکیمپس میں جنگلی قسم کے ADAM10 کے اپ ریگولیشن نے sAPP کی رطوبت میں ثالثی کی، جس کے نتیجے میں A plaques کی نسل روکی گئی۔ quercetin کے اثر کا مطالعہ ایک ایلومینیم کلورائڈ سے متاثرہ AD چوہا ماڈل میں کیا گیا ہے جس میں ہپپوکیمپس میں -سیکریٹیز (ADAM10 اور ADAM17) کا علاج نہ کیے جانے والوں کے مقابلے میں نمایاں اضافہ دکھایا گیا ہے۔ اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ quercetin میں -secretase genes [37] کی ایکٹیویشن کے ذریعے غیر amyloidogenic راستے کو بڑھانے کی صلاحیت موجود ہے۔ پری کلینیکل ڈیٹا اس مفروضے کو تقویت دیتا ہے کہ دماغی ایس اے پی پی کی سطح کو بڑھانا AD سے متعلقہ علامات کو بہتر بنانے اور Synaptic خسارے کو کم کرنے کی ایک ممکنہ حکمت عملی ہے۔ ADAM10 اور BACE1 اے پی پی کلیویج کے لیے مقابلہ کرتے ہیں، اس لیے ADAM10 کی سرگرمی کو ممکن بنانا نیوروٹوکسک امائلائڈ جنریشن کو روک سکتا ہے۔ مزید یہ کہ، ایس اے پی پی تناؤ JNK-سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کرنے سے روک سکتا ہے، جس سے NF-κB-حوصلہ افزائی فاسفوریلیشن سرگرمی ہوتی ہے، جو پروٹیزوم انحطاط کا باعث بنتی ہے [38]۔ لہذا، بیماری سے متعلق پروٹین کے مجموعوں کی تشکیل اور جمع کو نمایاں طور پر کم کیا جاتا ہے، اور سیلولر پروٹیزوم کی سرگرمی کو بڑھایا جاتا ہے، اس طرح پروٹوسٹاسس کے ضابطے میں ایس اے پی پی کے کام کے ثبوت فراہم کرتے ہیں [39]۔ مزید برآں، یہ ظاہر کیا گیا ہے کہ ایس اے پی پی خاص طور پر گلوٹامیٹ AMPA ریسیپٹر ترکیب اور اس کی اسمگلنگ کو اپ گریڈ کرتا ہے [40]۔ ہمارے مطالعے میں، ہم نے دریافت کیا کہ کیا روٹین کے علاج پر ADAM10 اظہار میں معمولی اضافہ گلوٹومیٹرجک synaptic ٹرانسمیشن پر کچھ اثر ڈالتا ہے۔ جیسا کہ سپلیمنٹری ڈیٹا سیکشن میں دکھایا گیا ہے، اس ionotropic ریسیپٹر کے اظہار پر کوئی خاص اثرات quercetin اور rutin diets پر نہیں دیکھے گئے، شاید ADAM10 اظہار میں کمزور اضافہ کی وجہ سے، جو کہ AMPA ریسیپٹر کی اپ گریجشن کے لیے کافی نہیں ہے (ضمنی اعداد و شمار ، شکل S2 اور ٹیبل S5)۔

اس بات کو دھیان میں رکھنا چاہیے کہ ان وٹرو اسٹڈیز نے ADAM10 ذیلی ذخائر کی وسیع اقسام کو ظاہر کیا ہے [41]، اور اس وجہ سے، غیر مخصوص ADAM10-ٹارگٹنگ کے ذریعے حاصل ہونے والے ناپسندیدہ اثرات کینسر کے پھیلاؤ، خلیے کی آسنجن، فروغ میں پائے جا سکتے ہیں۔ ٹی سیل/این کے سیل کا پیش خیمہ اور سوزش وغیرہ۔ اس رکاوٹ کو دور کرنے کے لیے، ہمارا مطالعہ ایک حکمت عملی تجویز کرتا ہے جس کا مقصد جسمانی طور پر ایس اے پی پی کی رہائی کو فروغ دینا ہے۔ یہ نقطہ نظر ایک فعال جزو (quercetin یا rutin) کے طویل مدتی استعمال پر مبنی ہو سکتا ہے، جو کہ صحت مند انسانی خوراک کے ذریعے کھایا جاتا ہے۔ تاہم، یہ جاننے کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے کہ آیا ADAM10 میں اضافہ flavonoid کی خوراک پر منحصر ہے اور کیا ممکنہ فائدہ مند اثرات ممکنہ ضمنی اثرات سے زیادہ ہیں۔

جہاں تک APPswe کے اظہار کا تعلق ہے، اگرچہ ماؤس جینوم میں انسانی APP ٹرانسجن کا اندراج اس بات کی ضمانت دیتا ہے کہ APPswe پیدائش سے ہی زیادہ متاثر ہوتے ہیں، لیکن یہ بتایا گیا ہے کہ APP mRNA اور پروٹین ہپپوکیمپل کی سطح جانوروں کی نشوونما کے دوران نمایاں اتار چڑھاؤ دکھاتی ہے، زیادہ سے زیادہ اس وقت جب چوہوں کی نشوونما ہوتی ہے۔ غیر علامتی (1-ماہ پرانا) اور جب مکمل علامات ظاہر ہوتا ہے تو کم ہوتا ہے [43]۔ اس مسئلے کے باوجود، ہمارے مطالعے میں ڈبلیو ٹی چوہوں کے مقابلے پرانتستا اور ہپپوکیمپس دونوں میں اے پی پی کا اظہار نمایاں طور پر زیادہ تھا۔ quercetin یا rutin کے ساتھ مزید علاج دماغ کے دونوں حصوں میں نر اور مادہ چوہوں کے لیے اس طرح کے اظہار کو نمایاں طور پر کم کرنے میں کامیاب رہا۔ یہ نتائج آگسٹین ایٹ ال کے ذریعہ رپورٹ کیے گئے نتائج کے مطابق ہیں۔ [44] جس نے Ginkgo biloba (Egb761) کے معیاری عرق کا مطالعہ کیا، جو کہ quercetin جیسے flavonols سے بھرپور، 4-ماہ کی TgAPP چوہوں میں، APP mRNA اور پروٹین کی سطح میں کمی کا پتہ چلا۔ اس بات کو مدنظر رکھتے ہوئے کہ Tg2576 چوہوں میں اے پی پی کے ترجمے کی اپ گریجولیشن پروڈرومل اور ابتدائی علامتی مراحل میں ہوتی ہے [45]، اس بات کا امکان ہے کہ ہمارے TgAPP چوہوں میں اور ممکنہ طور پر ابتدائی طور پر quercetin یا rutin کے ذریعے APP ترجمہ کی بحالی ہوئی ہو گی۔ علامتی مرحلہ، جس کے نتیجے میں اے پی پی کے کارٹیکل اور ہپپوکیمپل سطحوں میں کمی، BACE1 سرگرمی، اور کیسپیس{10}} ایکٹیویشن۔

مزید برآں، یہ بھی کہیں اور بتایا گیا ہے کہ Tg2576 چوہوں میں (اعصابی نقصان کی غیر موجودگی میں) ہپپوکیمپس میں کیسپیس-3 ایکٹیویشن میں اضافہ ہوتا ہے ، ایکسٹرا سیلولر امائلائڈ کے جمع ہونے سے پہلے ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈی میں کمی کے ساتھ [46]۔ اعصابی نظام میں کیسپیس کے لیے غیر اپوپٹوٹک کرداروں کی حمایت میں شواہد موجود ہیں بغیر اعصابی موت [47]، اور کیسپیس-3 سرگرمی کو ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈیوں میں مقامی کیا گیا ہے جہاں یہ کیلسینورین کی سطح کو بڑھا سکتا ہے۔ اس کے نتیجے میں، AMPA جیسے ریسیپٹرز کے GluR1 سبونائٹ کی ڈیفاسفوریلیشن، جو کیلسینورین کے ذریعے شروع ہوتی ہے، پوسٹ سینیپٹک dysfunction کا نتیجہ سمجھا جاتا ہے۔ ٹرانسجنیسیس کے نتیجے میں کیسپیس-3 اظہار کی ہماری اقدار، دوسرے محققین کے ذریعہ حاصل کردہ ان اقدار سے متفق ہیں جنہوں نے TgAPP چوہوں کے ہپپو کیمپس میں ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈی کی سطح پر کیسپیس{10}} اظہار میں اضافے کی اطلاع دی۔ [48]۔ چونکہ اے پی پی اپنے امینو ایسڈ ترتیب میں کیسپیس کے لیے تین الگ الگ کلیویج سائٹس پر مشتمل ہے کیسپیس کے ذریعے اے پی پی کا-3 امائلائیڈوجینک پاتھ وے [50] کے حق میں اے پی پی کی پروٹولوٹک پروسیسنگ کو تبدیل کر سکتا ہے، جس کے نتیجے میں 31 امینو ایسڈ کی لمبائی (C31) کی سائٹوٹوکسک C-ٹرمینل سے ماخوذ پیپٹائڈ کی رہائی ہوتی ہے۔ مثال [51]۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ، چونکہ کیسپیس-3 اے پی پی سے زہریلے ٹکڑے کے اخراج میں ثالثی کر سکتا ہے، اس لیے quercetin یا rutin کے ذریعے کیسپیس-3 اظہار کو کم کرنے سے مجموعی پروٹین کو صاف کرنے کی اجازت مل سکتی ہے۔ اس کے علاوہ، جیسا کہ پہلے ذکر کیا گیا ہے، ہم نے گلوٹامیٹرجک سینیپٹک ٹرانسمیشن میں کیسپیس کے اظہار کے اضافہ اور کمی دونوں کے اثر و رسوخ کو تلاش کیا ہے، جس کی بنیاد پر GluR1 سبونائٹ کو ڈیفاسفوریلیٹ کرنے کے لیے کیلسینورین ایکٹیویٹڈ کیسپیس-3 کی صلاحیت ہے۔ پوسٹ سینیپٹک سطح پر AMPA ریسیپٹرز کا۔ یہ سالماتی تبدیلیاں ہپپوکیمپس [48] میں ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈی کی سطح پر گلوٹامیٹرجک سائناپٹک ٹرانسمیشن اور نیورونل پلاسٹکٹی کو تبدیل کرتی ہیں۔ نظریاتی طور پر، TgAPP چوہوں میں کیسپیس-3 کی سرگرمی کی فارماسولوجیکل روکنا AD جیسے فینوٹائپس کو ایک میکانزم سے بچا سکتا ہے جو Synaptic ناکامی کو چلاتا ہے۔ تاہم، ہمارے TgAPP ماؤس میں کیسپیس ایکسپریشن میں اضافے کے باوجود، ہمیں WT چوہوں کے مقابلے میں AMPA ریسیپٹر ایکسپریشن میں کوئی خاص فرق نہیں ملا، جیسا کہ پہلے ذکر کیا گیا ہے۔ یہ ہو سکتا ہے کہ کیسپیس ایکسپریشن میں تبدیلیاں اتنی نمایاں نہ ہوں کہ AMPA ریسیپٹر ایکسپریشن (ضمنی اعداد و شمار، فگر S2 اور ٹیبل S5) میں اہم تبدیلیاں پیدا کر سکیں۔

جہاں تک کیسپیس-6 اظہار کی اقدار کا تعلق ہے، TgAPP اور WT چوہوں کے درمیان کوئی خاص فرق نہیں پایا گیا۔ کیسپیس کی ایکٹیویشن-6 کو نیورونل تناؤ کے ایک اہم ثالث کے طور پر شناخت کیا گیا ہے جو اہم سائٹوسکیلیٹل پروٹینز (تاؤ اور ٹیوبلین) کو توڑتا ہے، اس طرح غلط فولڈ پروٹینز کے ubiquitin – پروٹیزوم انحطاط کو روکتا ہے، اور کئی ایکٹین کو ریگولیٹ کرنے والے پوسٹ سینیپٹک کثافت پروٹین [52]۔ ہمارے مطالعے میں کیسپیس کا غیر تبدیل شدہ اظہار-6 ڈبلیو ٹی چوہوں کے مقابلے میں، جس عمر میں ان ٹرانسجینک چوہوں کا جائزہ لیا گیا تھا، نیوروڈیجنریشن کی خصوصیت کی علامات کی عدم موجودگی سے اتفاق کرتا ہے (ضمنی اعداد و شمار، شکل S1)۔

AD کے مریضوں میں نیورو انفلامیٹری ثالثوں میں نمایاں اضافہ دیکھا گیا ہے، خاص طور پر سنائیل تختیوں کے ارد گرد [53–55]۔ ایسٹروسائٹس مائکروگلیہ اور نیوران کو جی ایس ایچ کا بنیادی فراہم کنندہ ہیں۔ دائمی سوزش اور آکسیڈیٹیو تناؤ کے دوران، ایسٹروسائٹس زہریلے سوزشی ثالثوں اور آزاد ریڈیکلز کو جاری کرتے ہیں، جو مائیکروگلیہ اور نیوروڈیجنریشن کو تیز کرتے ہیں [56]۔ یہ بات قابل غور ہے کہ انٹرا سیلولر گلوٹاتھیون میں کمی کا تعلق انسانی مائیکروگلیہ اور ایسٹروائٹس [57] میں سوزش کے راستوں، p38 MAP-kinase، Jun-N-terminal kinase (JNK)، NF-κB کو چالو کرنے سے ہے۔ اس سلسلے میں، ہم نے اپنے جانوروں کے ماڈل میں IL-1، IFN- اور TNF- کی سطحوں کی مقدار درست کرنے اور ان پر quercetin اور rutin کے اثر کا تعین کرنے کا فیصلہ کیا۔ جیسا کہ جانا جاتا ہے، سوزش A پیپٹائڈ اور اے پی پی کی خراب پروسیسنگ کو فروغ دیتا ہے، A پیپٹائڈ جمع کو فروغ دیتا ہے اور اس کے نتیجے میں A رد عمل میں ترمیم کرتا ہے [58]۔ اس طرح، ہمارے مطالعے میں، ہم نے مشاہدہ کیا کہ TgAPP چوہوں نے WT چوہوں کے مقابلے میں سوزش کے حامی ثالثوں IL-1، TNF- اور IFN- کے mRNA کی سطح میں اضافہ کیا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ APPs کی حد سے زیادہ اظہار ہم نیورو-انفلامیٹری جھرنوں کو آمادہ کر سکتے ہیں۔ گلیا اور نیوران میں سالماتی راستوں کی ایک سیریز کو متحرک کرنا، جو اشتعال انگیز ردعمل کو چالو کرے گا۔ Quercetin اور rutin مردوں اور عورتوں دونوں میں IL-1 جین کے اظہار کو کم کرنے کے قابل تھے اور دماغی علاقوں کا مطالعہ کیا گیا۔ شواہد کے کئی ٹکڑے CNS کی سطح پر quercetin کے ذریعے لگائے جانے والے سوزش مخالف اثر کی حمایت کرتے ہیں، کیونکہ یہ نقلی عوامل جیسے کہ نیوکلیئر فیکٹر-kappa B (NF-κB) [59] کی سرگرمی کو روک سکتا ہے، جو iNOS کی شمولیت میں ملوث ہے، اور لہذا، ثالثوں کی رہائی کو کم کریں جیسے IL-1، TNF- اور IFN- [60]۔ اشتعال انگیز ردعمل پر جی ایس ایچ کے اثرات کے بارے میں، یہ واضح رہے کہ جی ایس ایچ زیادہ سے زیادہ سائٹوکائن کی سطح کو برقرار رکھنے میں اس طرح شامل ہے کہ پرو سوزش والی سائٹوکائنز (TNF-، IL-1، اور IL) کا اظہار۔ GSH کی کمی کی وجہ سے -6) میں اضافہ ہوا ہے، جبکہ سوزش مخالف سائٹوکائنز (یعنی، IL-10) کے اظہار میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی۔ یہ GSH ہومیوسٹاسس تبدیلی NF-κB اور JNK سگنلنگ پاتھ ویز میں اپ گریجولیشن کی وجہ سے ہوتی ہے جو نیورونل سیل ڈیتھ [61] کی طرف ممکنہ اپوپٹوٹک راستہ ہو سکتا ہے۔ ہمارے مطالعے میں، quercetin اور rutin کے ذریعے NF-κB کا ڈاون ریگولیشن GSH/GSSG ہومیوسٹاسس کو بحال کرنے کا ایک قابل عمل طریقہ کار ہو سکتا ہے اور اس وجہ سے سوزش اور سوزش والی سائٹوکائنز کے درمیان توازن کا سبب بن سکتا ہے۔ آخر میں، چونکہ BACE1 پروموٹر کے پاس NF-κB بائنڈنگ سائٹ ہے، NF-κB کی سوزش سے متاثرہ ایکٹیویشن BACE1 اظہار کی اپ گریجشن میں سہولت فراہم کرتا ہے، اور اس کے نتیجے میں A کی پیداوار میں اضافہ ہوتا ہے [62]۔ اس طرح، اگر NF-κB کا ڈاون ریگولیشن quercetin اور rutin غذا پر ہوتا ہے، BACE1 کی سرگرمی سوزش کے حامی اور سوزش والی سائٹوکائنز کی نہیں بلکہ ریلیز ریگولیشن کے نتیجے میں کم ہو جائے گی۔

4. مواد اور طریقے

4.1 تجرباتی جانور

ایک ٹرانسجینک ماؤس (Tg2576, B6؛ SJL-Tg (APPswe) 2576 Kha) جو انسانی امائلائڈ پیشگی پروٹین (hAPP) کے سویڈش ڈبل اتپریورتن کا اظہار کرتا ہے تجرباتی AD [14] کے جانوروں کے ماڈل کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ ماؤس ایک دستک ان ہیٹروزائگوٹ لائن ہے جو انسانی A PP695 isoform کو ڈبل سویڈش میوٹیشن (K670N/M671L؛ Lys670→Asn اور Met671→Leu) کے ساتھ ہیمسٹر prion پروٹین پروموٹر [63] کے کنٹرول میں ظاہر کرتی ہے۔ نتیجے کے طور پر، یہ ماؤس انسانی امائلائیڈ-پریکسرسر پروٹین (A PP) کی سطح کو ظاہر کرتا ہے، جو کہ ایک چوہے کے A PP کی سطح سے چھ گنا زیادہ ہے۔ اس کے علاوہ، یہ ماؤس A 40 اور A 42 کے اعلی درجے دکھاتا ہے۔ A کے ذخائر 9 ماہ کی عمر سے شروع ہوتے ہیں [63]۔ Tg2576 ہپپوکیمپس اور کورٹیکس کے اندر، APPswe ٹرانسجن اظہار بنیادی طور پر نیورونل ہے [64]۔

منفی کنٹرول کے طور پر، اسی کالونی [65,66] سے جنگلی قسم کے چوہے استعمال کیے گئے تھے۔ Tg2576 (B6؛ SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) ماؤس کالونی ہماری لیبارٹری میں Tg2576 heterozygous مردوں اور جنگلی قسم کی خواتین سے تیار کی گئی تھی۔ ٹرانسجینک والدین کو نیورو سائنس ڈویژن سے تعلق رکھنے والی ڈاکٹر ڈیانا فریچیلا نے یونیورسٹی آف ناوارا (پامپلونا، اسپین) کے سینٹر فار اپلائیڈ میڈیکل ریسرچ میں عطیہ کیا تھا [67]۔

جانوروں کو انفرادی طور پر ہوادار پنجروں میں رکھا جاتا تھا اور 50-60 فیصد نمی میں 12-گھنٹہ روشنی/تاریک چکر پر 22–24 ◦C پر رکھا جاتا تھا۔ جانوروں کے پروٹوکول کو کمپلیٹنس یونیورسٹی آف میڈرڈ میں ادارہ جاتی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی (IACUC) نے منظور کیا تھا اور سائنسی مقاصد کے لیے استعمال ہونے والے جانوروں کے تحفظ اور جانوروں کی فلاح و بہبود سے متعلق ہسپانوی قانون سازی سے متعلق یورپی ہدایت 2010/63/ کے مکمل مطابق تھے۔ شاہی فرمان 53/2013، 1 فروری 2013)۔

4.2 چوہوں کے جین ٹائپنگ تجزیہ

ٹیل بایپسی کے ذریعے پیدائش کے 30 دنوں کے اندر ٹرانسجنیسیٹی کا تعین کیا گیا تھا۔ پی سی آر کے ذریعہ جانوروں کے جینی ٹائپنگ کے تجزیے کیے گئے۔ اس بات پر غور کرتے ہوئے کہ Tg2576 (TgAPP) ایک متفاوت لائن ہے، اندراج جین (PrP، prion پروٹین سے) کو مثبت رد عمل کے کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ جینومک DNA NID بفر (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 میں پروٹینیز K (0.1 µg/µL) کے ساتھ ہضم شدہ ماؤس کی دم سے نکالا گیا تھا۔ mM MgCl2، 0.05 فیصد جیلیٹن، 0.45 فیصد NP-40 اور 0.4 فیصد Tween 20) 56 ◦C پر 3 گھنٹے کے لیے اور ہلایا گیا۔ ڈی این اے کے ٹکڑوں کو isopropanol کے ساتھ تیار کیا گیا تھا اور 70 فیصد ایتھنول سے دھویا گیا تھا۔ DNA precipitates کو TE بفر کے 30 µL میں تحلیل کیا گیا تھا (10 mM Tris-1 mM EDTA)۔ DNA کی پاکیزگی اور ارتکاز کا تعین 260 اور 280 nm پر کیا گیا تھا۔

پی آر پی اور اے پی پی جینوں کو پی سی آر کے ذریعہ بڑھا دیا گیا تھا۔ ٹرانسجینک چوہوں کی اسکریننگ کے لیے استعمال ہونے والے پرائمر کے سلسلے درج ذیل تھے: PrP فارورڈ: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG؛ PrP ریورس: GTGGATACCCCCTCCCCCAGCCTAGACC؛ اے پی پی ریورس: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG۔ پی سی آر کے رد عمل کے مراحل حسب ذیل تھے: 90 سیکنڈ کے لیے 94 ◦C پر ڈینیچریشن، 60 s کے لیے 60 ◦C پر 39 سائیکل اور 90 s کے لیے 72 ◦C، پھر 7 منٹ کے لیے 72 ◦C پر حتمی توسیع۔

تمام معاملات میں، منفی کنٹرول (ڈی این اے مولڈ کے بغیر) اور اے پی پی جین کے مثبت کنٹرول پر غور کیا گیا۔ حاصل کردہ PCR مصنوعات کو 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) بفر میں 1.5 فیصد ایگرز جیلوں میں الیکٹروفورسس کے ذریعے 70 V (مستقل وولٹیج) پر الگ کیا گیا اور پھر داغ لگا کر تصویر کشی کی گئی۔ جیل ریڈ (ملی پور)۔

4.3 جانوروں کا علاج

TgAPP چوہوں اور جنگلی قسم کے لیٹر میٹس، دونوں کی عمریں 6-7 ہفتوں کے ہیں جن کا ابتدائی جسمانی وزن 16.2 ± 0.8 جی ہے، کو مندرجہ ذیل چار گروپوں (n=8/گروپ) میں بے ترتیب بنایا گیا تھا: ( a) غیر علاج شدہ TgAPP؛ (b) Quercetin سے علاج شدہ TgAPP؛ (c) Rutin سے علاج شدہ TgAPP؛ اور (d) غیر علاج شدہ جنگلی قسم۔ چونکہ نر اور مادہ دونوں چوہوں کا مطالعہ کیا گیا تھا، اس لیے گروپوں کے دو سیٹ قائم کیے گئے تھے۔ 45 ہفتوں کی عمر میں، چوہوں کا علاج 4 ہفتوں تک quercetin یا rutin سے کیا جانا شروع ہوا۔

Quercetin (3,30,40,5,7-pentahydroxyflavone) اور rutin hydrate (quercetin-3-O-rutinoside hydrate) 95 فیصد خالص سے زیادہ یا اس کے برابر تھے اور Sigma-Aldrich سے خریدے گئے تھے۔ flavonoids میں سے ہر ایک کو معیاری خوراک (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Spain) میں 200 ppm کے ارتکاز میں شامل کیا گیا تھا، جو کہ 30 mg flavonoid/kg جسمانی وزن/دن کی مقدار کے مطابق تھا۔ علاج نہ کیے گئے چوہوں کو خصوصی طور پر غیر اضافی معیاری خوراک ملی۔ اشتھاراتی انٹیک کے لئے خوراک اور پانی فراہم کیا گیا تھا.

4.4 بائیو کیمیکل اور ہسٹولوجیکل اسیسز کے لیے دماغی بافتوں کی تیاری

علاج کے اختتام پر، چوہوں کو راتوں رات روزہ رکھا گیا، انہیں سروائیکل ڈس لوکیشن کا استعمال کرتے ہوئے ایتھانائز کیا گیا، اور پورے دماغ کو جلدی سے ہٹا دیا گیا۔ دماغ کو 4 ◦C پر نمکین میں دھویا گیا اور arachnoid جھلی کو احتیاط سے ہٹا دیا گیا۔ پھر، ہپپوکیمپس اور پرانتستا الگ تھلگ تھے۔ مزید استعمال تک نمونے فوری طور پر −80 ◦C پر محفوظ کیے گئے تھے۔

کچھ جانوروں کے پورے دماغ کو ہسٹولوجیکل سیکشن حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، جس کے لیے، ایک بار سروائیکل ڈس لوکیشن کا استعمال کرتے ہوئے ایتھانائز کیے جانے کے بعد، دماغ کو −80 ◦C پر آئسوپینٹین میں ڈوب کر منجمد کر دیا گیا تھا۔ اس کے فوراً بعد، دماغ کے کورونل حصے (30 µm موٹائی) olfactory bulb سے cerebellum تک، ایک cryostat (Leica CM1850, Nussloch, Germany) میں 120 µm کے فاصلے پر بنائے گئے۔ پورا طریقہ کار −20 ◦C پر انجام دیا گیا۔ ہسٹولوجیکل حصوں کو سلائیڈوں پر جمع کیا گیا تھا اور تجزیہ تک −80 ◦C پر رکھا گیا تھا (اضافی طریقے دیکھیں)۔

4.5 گلوٹاتھیون

گلوٹاتھیون ٹیسٹوں کے لیے، دماغی پرانتستا اور ہپپوکیمپس کے نمونوں کو ایک ارتکاز میں ریڈوکس بجھانے والے بفر-5 فیصد ٹرائکلورائیڈ ایسٹک ایسڈ (RQB-5 فیصد TCA) میں ہم آہنگ کیا گیا تھا (پہلے برف پر 15 منٹ کے لیے N2 کے ساتھ بلبلا ہوا تھا) 25 mg/mL (w/v)۔ سونیکیشن کے ذریعے 10 سیکنڈ کے لیے نمونے دوبارہ معطل کیے گئے، پھر 12، 000× g 10 منٹ کے لیے 4 ◦C پر سینٹرفیوج کیے گئے، اور سپرنٹنٹس جمع کیے گئے۔

پھر، حاصل کردہ سپرنٹنٹ میں، O-phthalaldehyde طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے GSH اور GSSG کی سطحوں کا تعین کرنے کے لیے سپیکٹرو فلورومیٹرک طریقے اپنائے گئے، جسے Senft et al نے بیان کیا ہے۔ [68]۔ جی ایس ایچ اور جی ایس ایس جی اقدار کو حیاتیاتی نمونے کی عدم موجودگی میں اچانک رد عمل کے لیے درست کیا گیا تھا۔ دونوں صورتوں میں، سپرنٹنٹس کو کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا اور اس کے بعد، فلوروسینس کو FLUOSTAR مائکروپلیٹ ریڈر (BMG LABTECH، Ortenberg، Baden-Württemberg، Germany) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا، جس میں ایکسائٹیشن فلٹر 360 nm (بینڈوتھ 5nm) پر سیٹ کیا گیا۔ اور اخراج کا فلٹر 460 nm (بینڈوتھ 5 nm) پر سیٹ کیا گیا ہے۔ ہر نمونے میں GSH اور GSSG کا ارتکاز معلوم GSH معیارات سے کیا گیا تھا۔ GSH اور GSSG دونوں کے ارتکاز کو nmol GSH/mg پروٹین کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا، جس نے glutathione redox تناسب GSH/GSSG کے حساب کتاب کی اجازت دی۔

بقیہ چھرروں کو اس وقت تک گھمایا گیا جب تک کہ 0.1 M NaOH کے 240 µL میں مکمل طور پر تحلیل نہ ہو جائے تاکہ بائنچونینک ایسڈ (BCA) طریقہ کار کے ذریعے پروٹین کی ارتکاز کی پیمائش کی جا سکے۔

【مزید معلومات کے لیے:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】