Cinnamomum Osmophloeum Kanehira سے ایک نیا قدرتی اینٹی آکسیڈینٹ بائیو میٹریل میلانوجینیسیس کو دباتا ہے اور ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان سے بچاتا ہے۔

رابطہ: ali.ma@wecistanche.com

Yung-Shu Ho 1، Jane-Yii Wu 1،* اور Chi-Yue Chang 2

خلاصہ:Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) تائیوان میں ایک مقامی درخت کی انواع ہے۔ کیمیائی مرکبات،اینٹی آکسیڈینٹسرگرمی، مشرومٹائروسینیزروک تھام، میلانین کی ترکیب کا دباؤ، اور بھاپ ڈسٹلیشن کے ذریعے COK پتوں سے ہائیڈروسول کے ڈی این اے نقصان سے تحفظ کا جائزہ لیا گیا۔ ہم نے 1،1-ڈائفنائل-2-پکریل ہائیڈرزائل ریڈیکل اسکیوینگنگ، میٹل آئن چیلیٹنگ، کم کرنے والی طاقت، اور ٹرولوکس مساوی اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت (TEAC) کی جانچ کی اور کل فینولک مواد اور اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمیوں کے درمیان ارتباط کا تعین کیا۔ نتائج نے ظاہر کیا کہ COK ہائیڈروسول کی اینٹی آکسیڈیٹیو خصوصیات ان کے فینول مواد کے ساتھ قریبی تعلق رکھتی ہیں۔ مزید برآں، ہائیڈروسول کے بڑے اجزاء، یعنی cinnamaldehyde اور benzaldehyde کے، monophenolase اور diphenolase دونوں سرگرمیوں کے خلاف خوراک پر منحصر اینٹی ٹائروسینیز اثرات ہیں۔ benzaldehyde (7.{11}} فیصد)، اور cinnamyl acetate (5.3 فیصد)۔ مزید برآں، ہم نے پایا کہ بینزالڈہائیڈ کی موجودگی کے ساتھ ہائیڈروسول خالص cinnamaldehyde سے زیادہ طاقتور ہے، اور اس میں اضافہ کرتا ہے۔ٹائروسینیزہائیڈروسول کی روک تھام کی سرگرمی۔ حرکیاتی تجزیوں میں، لائن ویور – برک پلاٹس اور ریپلاٹس نے ظاہر کیا کہ سی او کے ہائیڈروسول ایک مخلوط قسم کی روک تھام کرنے والا ہے۔ مزید برآں، ہم نے پایا کہ COK ہائیڈروسول کی بہت کم خوراکیں مائیکرو فیتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن فیکٹر کی میلانوسائٹ-حوصلہ افزائی ہارمون کی حوصلہ افزائی کی ترکیب کو کم کرتی ہیں، جس کی وجہ سے B16-F10melanoma خلیات میں میلانین کی ترکیب میں کمی واقع ہوتی ہے۔ ان نتائج نے ظاہر کیا کہ بھاپ کشید کا استعمال کرتے ہوئے COK کے پتوں سے ہائیڈروسول کی پیداوار ایک محفوظ اور موثر ذریعہ فراہم کر سکتی ہے۔جلدسفید کرناکاسمیٹک اور فارماسیوٹیکل ایپلی کیشنز کے لیے ایجنٹ، کے ساتھاینٹی آکسیڈینٹ، اینٹی ٹائروسینیز، اینٹی میلانوجینیسیس، اور ڈی این اے حفاظتی سرگرمیاں۔

مطلوبہ الفاظ: اینٹی آکسیڈینٹسرگرمی؛ Cinnamomoum ​​osmophloeum; ہائیڈروسول؛ٹائروسینیزروک تھام کی سرگرمی؛سفید کرنا; ڈی این اے کو نقصان پہنچانے والے حفاظتی اثرات

پر کلک کریں۔Cistancheجلد کو سفید کرنے کے لیے تنا اور مصنوعات

1. تعارف

انسانی جلد کے امراض جیسے لینٹیگو، عمر کے دھبے، میلاسما، اور مہلک میلانوما میلانین کی تشکیل اور جمع ہونے سے جڑے ہوئے ہیں [1]۔ ٹائروسیناسس کی روک تھام اور میلانوجینیسیس ڈرمیٹولوجیکل عوارض اور ہائپر پگمنٹیشن سنڈروم کو بہتر بناتا ہے۔ مزید برآں، جلد کو سفید کرنے والے ایجنٹوں اور کاسمی سیوٹیکل مصنوعات کی عالمی منڈی میں حال ہی میں توسیع ہوئی ہے کیونکہ بہت سے سیاہ فام افراد کی طرف سے ہلکی جلد کے رنگ کو ترجیح دی جاتی ہے [2]۔ لہذا، مؤثر اور محفوظٹائروسینیزاور میلانین کی ترکیب روکنے والوں کو روغن کی بیماری اور میلانین سے متعلق انسانی صحت کے دیگر مسائل کی روک تھام کے لیے اہم سمجھا جاتا ہے [3,4]۔ مزید برآں، ماحولیاتی زہریلے مادے انسانوں کے لیے مختلف آکسیڈیٹیو تناؤ کا باعث بنتے ہیں، اور رد عمل والی نائٹروجن پرجاتیوں یا ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کو پیدا کر سکتے ہیں [5]۔ ضرورت سے زیادہ فری ریڈیکلز اور آر او ایس اشتعال انگیز سگنلنگ پاتھ ویز سے وابستہ ہیں، جو بالآخر سیلولر نقصان، بڑھاپے، اعصابی عوارض، ذیابیطس، ایتھروسکلروسیس، سوزش، قلبی بیماری، کینسر، اور میلانوجینیسیس [6,7] کا باعث بنتے ہیں۔ کئی مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہاینٹی آکسیڈینٹآکسیڈیٹیو پریشر کے نقصانات کو فری ریڈیکل اسکیوینجرز یا ROSscavengers کے طور پر کام کر کے روک سکتا ہے [7,8]۔ مزید برآں، ROS جنریشن اور ROS scavengers دونوں ہی inhibitors melaninpigments کی پیداوار کو کم کر سکتے ہیں [9]۔ خاص طور پر،ٹائروسینیزیہ ایک کلیدی انزائم ہے جو میلانین کی ترکیب کے عمل کے دوران پہلے دو مراحل میں شرح کو محدود کرنے والے قدموں کو اتپریرک کرتا ہے [10]، اور ٹائروسیناسیس کی کمی کو کنٹرول کرنا جلد کی بیماری کی روک تھام کے لیے ایک اہم ہدف ہے۔جلد کو سفید کرناایجنٹس [11]۔لہٰذا، قدرتی اینٹی آکسیڈینٹس کی نشوونما جو مؤثر طریقے سے ٹائروسینیز کو روکتی ہے یا جلد کی ناپسندیدہ ہائپر پگمنٹیشن کے علاج اور ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان سے تحفظ ضروری ہے۔

Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) ایک تائیوان کی دیسی دار چینی کی انواع ہے جس میں چینی جڑی بوٹیوں کی دوائی کے طور پر بہت سے استعمال ہوتے ہیں۔ COK ضروری تیل کے فعال مرکبات فارماسولوجیکل اینٹی بیکٹیریل کے طور پر بہترین صلاحیت ظاہر کرتے ہیں [12]۔ اگرچہ COK کے پتوں کے الکحل کے عرق کے پچھلے مطالعات میں اینٹی ٹائروسینیز سرگرمیاں ظاہر ہوئیں، تقریباً ان تمام مطالعات میں سے ایتھانولیکسٹریکٹس یا COK سے ضروری تیل پر توجہ مرکوز کی گئی۔ اس کے علاوہ، کوئی مقداری اور منظم مطالعہ کی اطلاع نہیں دی گئی ہے۔اینٹی آکسیڈینٹخواصٹائروسینیزروکنے والی سرگرمیاں اور COK پتوں کے پانی کے عرق (ہائیڈروسول) کے ذریعے میلانین کی ترکیب کا جبر۔ لہذا، یہ مطالعہ B16F10 میلانوما خلیوں میں آکسیڈیٹیو تناؤ اور میلانوجینیسیس پر COK ہائیڈروسول کے اثرات کی تحقیقات اور ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان سے بچانے کے لیے کیا گیا تھا۔ یہ مطالعہ کیمیائی ساخت کی پہلی تفصیلی رپورٹ ہے اوراینٹی آکسیڈینٹٹائروسینیز روکنا، میلانوجینیسیس ریپریسو، اور ڈی این اے کو سی او کے پتوں سے ہائیڈروسول کی حفاظتی سرگرمیوں کو نقصان پہنچاتا ہے۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 کیمیکل اور اینٹی باڈیز

مشرومٹائروسینیز, butylated hydroxytoluene (BHT), -tocopherol, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylcroman-2-carboxylic acid (Trolox), trichloroacetic acid (TCA), gallic تیزاب، پوٹاشیم فیریکیانائیڈ، فیرک کلورائیڈ، فیرس کلورائیڈ، فیروزین، 1،1-ڈفینائل-2-پکریل ہائیڈرزائل (DPPH)،2،20-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline{{14} } سلفونک ایسڈ (ABTS)، Folin–Ciocalteu reagent، L-tyrosine، اور L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) Merck Co. (Darmstadt, Germany) سے حاصل کیے گئے تھے۔ تمام کیمیکل اور مطالعہ میں استعمال ہونے والے سالوینٹس تجزیاتی گریڈ کے تھے یا اعلی کارکردگی والے مائع کرومیٹوگرافی کے تھے۔ مائکروفتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن فیکٹر (MITF) اور ایکٹین کے خلاف اینٹی باڈیز بالترتیب سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی (ڈینورس، ایم اے، یو ایس اے) اور سگما کیمیکل کمپنی (سینٹ لوئس، یو ایس اے) سے حاصل کی گئیں۔

2.2 ہائیڈروسول کی تیاری: بھاپ کشید کا استعمال کرتے ہوئے سی او کے پتوں سے نکالنا

تائیوان (نمبر 186، یونگپنگ روڈ، ژونگلیاؤ ٹاؤن شپ، نانتو کاؤنٹی، تائیوان) میں ایک 13-سال پرانے COK درخت کے پتے ہوا میں خشک تھے۔ سٹینلیس سٹیل کی چکی کا استعمال کرتے ہوئے، پتوں کو پھر ایک باریک پاؤڈر (<10 میش="" سے="" کم)="" میں="" پیس="" کر="" کمرے="" کے="" درجہ="" حرارت="" پر="" محفوظ="" کیا="" جاتا="" تھا۔="" اس="" کے="" بعد،="" 3.5="" کلو="" گرام="" خشک="" cok="" پتی="" کا="" پاؤڈر="" 4="" گھنٹے="" کے="" لیے="" بھاپ="" کشید="" کے="" ذریعے="" نکالا="" گیا۔="" یہ="" عمل="" چار="" بار="" دہرایا="" گیا۔="" ویکیوم="" کا="" استعمال="" کرتے="" ہوئے،="" نچوڑ="" کو="" فلٹر="" کیا="" گیا="" اور="" پھر،="" روٹری="" ایوپوریٹر="" کا="" استعمال="" کرتے="" ہوئے،="" خشک="" عرق="" حاصل="" کیا="" گیا="" (شکل="" 1)۔="" آخر="" کار="" حتمی="" وزن="" حاصل="" کرنے="" کے="" لیے="" نچوڑ="" کو="" بخارات="" بنا="" دیا="">

2.3۔ گیس کرومیٹوگرافی/ماس سپیکٹرو میٹری (GC/MS) ہائیڈروسول کا تجزیہ

تھرمو ویکس ایم ایس کراس لنکڈ 5 فیصد فینائل- 95 فیصد میتھائل پولیسیلوکسین کیپلیری کالم کے ساتھ ایک تھرمو-GC/MS آلہ (60 m × 0.25 ملی میٹر id، فلم کی موٹائی {{1} 0}}.25 µm) کو 1.0 mL/min کی مستقل بہاؤ کی شرح پر ایک کیریئر گیس کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ انجیکشن کے بعد کالم کو 5 منٹ تک 200 ◦C پر برقرار رکھا گیا اور پھر 5 ◦C/min سے 260 ◦C پر گرم کیا گیا۔ خالص ضروری تیل (1.0 ملی لیٹر) 1:100 کے تقسیم تناسب کے ساتھ لگایا گیا تھا۔ انجیکٹر، ٹرانسفر لائن اور آئن سورس کا درجہ حرارت بالترتیب 250 ◦C، 250 ◦C، اور 200 ◦C تھا۔ MS کا پتہ لگانے کو الیکٹران اثر انداز میں 70 eVionisation انرجی اور 60 µA ionisation کرنٹ پر انجام دیا گیا تھا۔ آلے کو 50–350 amu کی حد میں مکمل اسکین ایکوزیشن موڈ میں چلایا گیا تھا۔ مرکبات کو برقرار رکھنے کے اوقات اور کرومیٹوگرافک چوٹیوں کے اشاریوں کا مستند حوالہ جات کے معیارات کے ساتھ موازنہ کرکے شناخت کیا گیا تھا، جو انہی شرائط کے تحت لگائے گئے تھے۔ ایم ایس فریگمنٹیشن پیٹرن کا موازنہ خالص مرکبات کے ساتھ کیا گیا، اور نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف اسٹینڈرڈز اینڈ ٹیکنالوجی (NIST) MSspectral ڈیٹا بیس [13] کا استعمال کرتے ہوئے ماس اسپیکٹرم ڈیٹا بیس کو تلاش کیا گیا۔

2.4.کل فینولک مواد

نچوڑ کے کل فینولک مواد (TPC) کا تعین پہلے بیان کردہ Folin – Ciocalteu assayas کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا [14]۔ مختصراً، ہائیڈروسول کے نمونے (100 µL) کو 100 µL aliquotsof Folin–Ciocalteu reagent (10-fold dilution) اور 10 µL aliquots کے سوڈیم کاربونیٹ (10 فیصد، w/v) کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ 30 منٹ تک ذخیرہ کرنے کے بعد جذب 735 nm پر ماپا گیا۔ TPCs کو gallic acid equivalents (GAE) کے طور پر mg فی 100 گرام تازہ مواد میں ظاہر کیا جاتا ہے۔

2.5 ڈی پی پی ایچ فری ریڈیکل اسکیوینگنگ اسسیس

جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، ڈی پی پی ایچ پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے، ہائیڈروسول کی ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمیوں کا تعین کیا گیا [15]، ترمیم کے ساتھ۔ مختصراً، ہائیڈروسول کے نمونوں کے مختلف ڈائلیشنز (ٹرپلیکیٹ میں 75 µL) ڈی پی پی ایچ کے 150 µL ایلی کوٹس (0.02 g/100 mL) میں شامل کیے گئے اور جاذبیت 30 منٹ کے بعد 517 nm پر ماپا گیا۔ بی ایچ ٹی کو مثبت کنٹرول (0.5 ملی گرام / ایم ایل ایتھنول) کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمیوں کو مندرجہ ذیل مساوات کا استعمال کرتے ہوئے روکنا تناسب (فیصد) کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا:

روکنا تناسب (فیصد )=[1 - (A/B)] × 100 فیصد

جہاں A ہائیڈروسول کے نمونے کا جاذب ہے اور B خالی جگہ کا جاذب ہے۔

2.6۔ فریکشنل انحیبیٹری ارتکاز

فریکشنل انحیبیٹری ارتکاز (ایف آئی سی) کے اسسز کیے گئے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [16]، ترمیم کے ساتھ۔ مختصراً، FeSO4 (20 µL؛ 2 mM) کو ہائیڈرو سولسمپل (200 µL) کے مختلف ڈائیوشنز کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ فیروزین (40 µL؛ 5 mM) شامل کرنے کے بعد، رد عمل کو 10 منٹ تک آگے بڑھنے کی اجازت دی گئی پھر جذب کو 562 nm پر ماپا گیا۔ مزید برآں، 0.5 mg/mL ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔ فیروزین-Fe2 پلس پیچیدہ شکل کی روک تھام کا حساب درج ذیل فارمولے کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔

دھاتی چیلیٹنگ اثر ( فیصد )=[1 - (A/B)] × 100 فیصد

جہاں A ہائیڈروسول کے نمونے کا جاذب ہے اور B خالی جگہ کا جاذب ہے۔

2.7۔ پاور اسیس کو کم کرنا

COK ہائیڈروسول کی کم کرنے والی طاقت کا تعین Fe3 پلس toFe2 پلس کی کمی کی نگرانی کے ذریعے کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [17]، ترمیم کے ساتھ۔ مختصراً، ہائیڈروسول کے 50 µL ڈائیوشن، 50- µLaliquots of فاسفیٹ بفر (pH 6.6, 200 mM) اور 50-µL پوٹاشیم فیریکانائیڈ (1 فیصد، w/v) تھے۔ شامل کیا 20 منٹ تک 50 ◦C پر انکیوبیشن کے بعد، 50 µL TCA (10 فیصد، w/v) شامل کیا گیا تھا۔ اور مرکب کو 9،000 rpm پر 3 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ آخر میں، 50 µL سپرناٹینٹ کو 50 µL ڈسٹل واٹر اور 50 µL فیرک کلورائڈ پانی میں ملایا گیا (0.1 فیصد، w/v)، اور جاذبیت 10 منٹ کے رد عمل کے وقت کے بعد خالی کے خلاف 700 nm پر ماپا گیا۔ استعمال کیے گئے مثبت کنٹرولز بٹلیٹڈ ہائیڈروکسی ٹولین (BHT) اور ٹوکوفیرول تھے۔

2.8۔ Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) Assay

اینٹی آکسیڈینٹCOK ہائیڈروسول کی سرگرمیوں کا اندازہ پہلے بیان کردہ طریقہ [15,18] کے مطابق ترمیم کے ساتھ کیا گیا۔ مختصراً، مرتکز ABTS ریڈیکل کیٹیشن (ABTS• plus ) محلول کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین (pH 7.4) میں 734 nm پر 0.80 ± 0.05 کے حتمی جذب کرنے کے لیے حل کیا گیا۔ 1 mL ABTS پلس محلول کے ساتھ (0.02 mL) نمونے کو ملانے کے بعد، 5 منٹ کے بعد 734 nm پر جذب میں کمی واقع ہوئی۔ ٹرولوکس کو ایک معیاری کے طور پر استعمال کیا گیا، اور ہائیڈروسول کی سرگرمیوں کو Troloxcalibration منحنی خطوط بنا کر TEAC کے طور پر ظاہر کیا گیا۔ ہائیڈروسول کے نمونوں کی مولر مساوی TEAC قدروں کا حساب Trolox محلول کے جذب میں کمی کے مطابق کیا گیا۔ BHT اور -tocopherol کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔

2.9 مشروم ٹائروسینیز کی روک تھام پر ہائیڈروسول کے اثرات

مشرومٹائروسینیزاسپیکٹرو فوٹومیٹرک تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے سرگرمی کی پیمائش کی گئی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، ترمیم کے ساتھ [19]۔ مختصراً، PBS میں 20 µL L-tyrosine یا 20 µL L-DOPA (pH 6.8؛ 80 µL) اور 80 µL PBS کو بغیر ٹیسٹ ہائیڈروسول کے ساتھ 96-کنویں کے مائکرو پلیٹس میں شامل کیا گیا، اور پھر 20 µL مشروم ٹائروسینیز (100) mL) شامل کیا گیا۔ 20 منٹ تک 37 ◦C پر اختلاط اور انکیوبیشن کے بعد، رد عمل کے مرکب میں ڈوپاکروم پروڈکشن (یا کھپت) کا تعین 475 nm جذب پر کیا گیا۔ کوجک ایسڈ، جو ٹائروسینیز کو روکتا ہے، ایک مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال ہوتا تھا۔ ٹائروسینیز کی روک تھام کا فیصد اس طرح شمار کیا گیا تھا:

روکنا ( فیصد ) ≡ {[(A − B) − (C − D)]/(A − B)} × 100 فیصد

جہاں A ہائیڈروسول کے نمونے کی عدم موجودگی میں انزائم کے ساتھ جذب کی نشاندہی کرتا ہے، B انزائم یا ہائیڈروسول کے نمونے کے بغیر جذب کی نشاندہی کرتا ہے، C انزائم کے ساتھ جذب، اور ہائیڈروسول اور ڈینڈیکیٹ جذب کو بغیر انزائم کے لیکن ہائیڈروسول کے ساتھ ظاہر کرتا ہے۔ ہم نے بھی 50 فیصد کا حساب لگایاٹائروسینیزنمونوں کی روک تھام کی تعداد (IC50) جو کہ ٹائروسینیز کی سرگرمی کو 50 فیصد تک روکتی ہے۔

2.10 مشروم ٹائروسینیز انبیشن کا متحرک تجزیہ

رد عمل کے مرکب میں 20 µL L-tyrosine یا L-DOPA (0.25 mg/mL) سبسٹریٹس کے طور پر، 0.2 M سوڈیم فاسفیٹ بفر میں 100 µLof مشروم ٹائروسینیز (20 یونٹس/mL) pH 6.8) اور 200 µL کے کل حجم میں ہر ہائیڈروسول نمونے کا 80 µL۔ پرکھ 25 ◦C پر کی گئی تھی، اور ہر ایک ہائیڈروسول نمونے کی روک تھام کرنے والی حرکیاتٹائروسینیزلائن ویور – برک پلاٹوں کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا۔ باہمی مساوات کو مخلوط قسم کی غیر مسابقتی روک تھام سے تیزی سے توازن کے لیے استعمال کیا گیا، جیسا کہ مساوات (1) [20] میں ظاہر کیا گیا ہے۔ ہائیڈروسول کے نمونوں کے لیے Ki قدروں کا تخمینہ ڈھلوان ریپلاٹ (مساوات (2)) سے لگایا گیا تھا۔ ہائیڈروسول کے لیے Ki قدروں کا حساب 1/v ایکسس انٹرسیپٹ ریپلاٹ (مساوات (3)) سے کیا گیا تھا،

جہاں Vmax کی زیادہ سے زیادہ رفتار ہے۔ٹائروسینیزسرگرمی، Ksis انزائم-سبسٹریٹ کمپلیکس (ES) سے سبسٹریٹ (S) کے انحطاط مستقل کو، Kiis انزائم-انحیبیٹر کمپلیکس سے inhibitor[I] کا انحطاط مستقل اور Kiis انزائم-سبسٹریٹ سے روکنے والے کی انحطاط مستقل ہے۔ - روکنے والا کمپلیکس (ESI)۔

2.11۔ سیل کلچر اور سیل وائبلٹی اسسیس

B16-F10 میلانوما سیل (BCRC60031) بائیو ریسورس کلیکشن اینڈ ریسرچ سینٹر (BCRC)، تائیوان سے حاصل کیے گئے تھے۔ B16-F10 سیلز Dulbecco کے ترمیم شدہ Eagles میڈیم (Gibco, California, USA) میں کلچر کیے گئے تھے جن میں 5 فیصد CO2 میں 37 ◦C پر 10 فیصد FBS تھا۔ ٹرپسنائزیشن کے ذریعہ، خلیوں کی کٹائی کی گئی۔ سیل کی قابل عملیت کی پیمائش 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی جیسا کہ لی [15] نے بیان کیا ہے۔ ]

2.12۔ سیلولر میلانین مواد

میلانین کے مواد کو لی کے بیان کردہ طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ [15]۔ مختصراً، B16-F10 خلیات کو 6-کنویں کی پلیٹوں میں 0.8 × 105 سیل فی کنویں کی کثافت پر کلچر کیا گیا تھا اور پھر 24 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ 100-nM -melanocyte-stimulating hormone (-MSH)، کوجک ایسڈ (مثبت کنٹرول) اور ہائیڈروسول کے ساتھ 24 گھنٹے تک مختلف ارتکاز پر علاج کیا جاتا ہے۔ PBS کے ساتھ دو بار دھونے کے بعد، خلیات کو 100 mM سوڈیم فاسفیٹ (pH 6.8)، 1 فیصد Triton X-100 اور 0.1 mM phenylmethanesulphonyl fluoride پر مشتمل ایک بفر میں لیسڈن کیا گیا اور 30 ​​منٹ کے لیے −80 ◦C پر محفوظ کیا گیا۔ خلیوں کو جمع کرنے کے بعد، سیل گولی 1N NaOH میں تحلیل ہو گئی تھی جس میں 10 فیصد DMSO 65 ◦C پر 1 گھنٹے کے لیے تھا۔ اس کے بعد، جذب 405 nm پر ماپا گیا۔

2.13۔ مغربی دھبہ

سیلز لیس کیے گئے جیسا کہ سیکشن 2.11 میں بیان کیا گیا ہے اور اینٹی MITF اینٹی باڈی کا استعمال کرتے ہوئے MITF پروٹین کے لیے ویسٹرن بلوٹنگ کا نشانہ بنایا گیا۔

2.14 ڈی این اے پروٹیکشن اسسز

آکسیڈیٹیو ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کا تعین سرکلر سپر کوائلڈ پی سی آئی نیو پلاسمڈ ڈی این اے کو معمولی ترمیم کے ساتھ پہلے بیان کردہ طریقہ [21,22] کا استعمال کرتے ہوئے نکیڈ سرکلر یا مزید انحطاط شدہ شکلوں میں تبدیل کرنے کے مطابق کیا گیا تھا۔ 20 µL کے رد عمل کے مرکب میں 2.5 µL supercoiledpCI neo (150 ng/µL)، 10 µL فینٹن ری ایکشن محلول ہے جس میں 30 mM ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ، 100-µMferric chloride، 100-µMferric chloride 20 mM Tris-HCl بفر (pH 7.6) میں µM ascorbic acid، اور 5µL ہائیڈروسول (0.3325–5.32 mg/mL) یا quercetin (مثبت کنٹرول؛ 250 µg/mL)۔ رد عمل کے آمیزے کو 37 ◦C پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا اور پلازمڈ ڈی این اے فارمز کو 0.7 فیصد ایگروز جیلوں پر الگ کیا گیا تھا اور سیف ویو ™ (اپلائیڈ بائیولوجیکل میٹریلز (ABM) انکارپوریشن، رچمنڈ، کینیڈا) کا استعمال کرتے ہوئے داغے ہوئے تھے۔

نیم مقدار کے لیےاینٹی آکسیڈینٹنچوڑوں کی سرگرمیوں، پی سی آئی نیو کے سپر کوائلڈ اور نِکڈ فارمز کی مقدار کو الفا آئی میجر منی (پروٹین سادہ) آلے کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کیا گیا، اور گیلپرو سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے ایگرز جیلوں پر بینڈ کی شدت کی مقدار درست کی گئی۔ منفی اور مثبت کنٹرول کے طور پر، پی سی آئی نیوپلاسمڈ کو بالترتیب تنہا اور فینٹن ریجنٹ مکسچر کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ ڈیٹا کو منفی کنٹرول میں (100 فیصد) کے مقابلے میں سپر کوائلڈ ڈی این اے کی مقدار کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ نچوڑ کی حفاظتی سرگرمیوں کا حساب درج ذیل مساوات کا استعمال کرتے ہوئے سپر کوائلڈ اور نکیڈ پلاسمڈ ڈی این اے کی مقدار سے کیا گیا تھا [23]:

سپر کوائلڈ پلاسمڈ کا تحفظ (فیصد ) =سپر کوائلڈ فارم کی شدت

نِکڈ پلاسمڈ کا تحفظ ( فیصد ) =نیکڈ فارم کی شدت

2.15۔ شماریاتی تجزیہ

تمام اعداد و شمار کو ذرائع کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے ± معیاری انحراف (SD)۔ اسٹوڈنٹ کے ٹی ٹیسٹ یا ANOVA کے بعد شیفے کے ٹیسٹ کے ذریعے علاج کے درمیان فرق کی شناخت کی گئی۔ اختلافات کو اہم سمجھا جاتا تھا جب p <>

3. نتائج اور مباحثہ

3.1 ہائیڈروسول میں غیر مستحکم مرکبات کی شناخت

GC/MS کا استعمال کرتے ہوئے ہائیڈروسول کے مشمولات کا تجزیہ کیا گیا۔ اجزاء کی شناخت معیار کے برقرار رکھنے کے اوقات کے مطابق کی گئی تھی اور مقدار کا تعین ایلیوینٹس کے چوٹی والے علاقوں سے کیا گیا تھا (شکل 2)۔جیسا کہ شکل 2A–D میں بتایا گیا ہے، ٹرانس سنمالڈہائڈ، بینزالڈہائڈ، اور سنامیل ایسٹیٹ COK ہائیڈروسول میں اہم مرکبات تھے اور ان میں موجود تھے۔ بالترتیب 87.7 فیصد، 7{6}} فیصد، اور 5.3 فیصد۔ Eugenol پہلے C. verum سے ضروری تیلوں میں 7.29 فیصد پایا جاتا تھا [24] لیکن موجودہ COK ہائیڈروسول (شکل 2) میں اس کا پتہ نہیں چلا۔ نکالنے کے عمل اور پرکھ کے طریقوں میں فرق C. cassia ضروری تیلوں کے cinnamaldehyde کے مواد میں فرق کا سبب بن سکتا ہے [25]۔

3.2 سی او کے پتوں سے ہائیڈروسول کی اینٹی آکسیڈینٹ خصوصیات

3.2.1 ڈی پی پی ایچ ریڈیکل اسکیوینگنگ ایکٹیویٹی

شکل 3A میں، 1 سے ہائیڈروسولز کی ڈی پی پی ایچ ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمیاں۔ فیصد ± 0.96 فیصد اور 41.76 فیصد ± 2.50 فیصد بالترتیب۔ یہ اعداد و شمار COK ہائیڈروسول کے ذریعہ خوراک پر منحصر ریڈیکل اسکیوینگنگ کی نشاندہی کرتے ہیں۔ اس کے مقابلے میں، مثبت کنٹرول BHT اور -tocopherolscavenged 94.32 فیصد ± 0.08 فیصد اور 93.82 فیصد ± 0.13 فیصد DPPH کے رد عمل والے ریڈیکلز، بالترتیب، 0.5 mg/mL۔ COK hydrosol کی ریڈیکل اسکیوینگنگ سرگرمی کا امکان زیادہ تر وجہ سے ہے .بہت سے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ فینولک اور فلیوونائڈز ہائیڈروجن ایٹموں کو عطیہ کرکے ڈی پی پی ایچ ریڈیکلز کی تشکیل کو روکتے ہیں۔ لہذا، Cinnamomum پرجاتیوں کی DPPH ریڈیکل سکیوینگنگ سرگرمیاں بھی ہائیڈروجن ڈونر کے طور پر اعمال کی عکاسی کر سکتی ہیں [26,27]۔

3.2.2 میٹل آئن چیلیشن

ہم نے 1.06 × 10−3 اور 5.32 × 10−1 mg/mL پر ہائیڈروسولز کی Fe2 پلس بائنڈنگ صلاحیت کا اندازہ کیا، جیسا کہ شکل 3A میں دکھایا گیا ہے۔ ہائیڈروسول اجزاء کے ذریعے دھاتی چیلیشن میں ارتکاز کے ساتھ معمولی اضافہ ہوا، لیکن 6 ملی گرام/ملی لیٹر پر، EDTA (شکل 3A) کی چیلیٹنگ سرگرمی کا صرف 37.3 فیصد تھا۔

3.2.3 طاقت کو کم کرنا

جیسا کہ شکل 3A میں دکھایا گیا ہے، ہائیڈروسول اجزاء کی کم کرنے والی طاقت ارتکاز پر منحصر تھی اور BHT اور ٹوکوفیرول (0.22 ± 0 سے زیادہ تھی۔{7}}1 اور {{9 }}.33 ± 0.15، بالترتیب) 0.5 mg/mL۔ پچھلے مطالعات میں، BuOH فریکشنز میں C. osmophloeum twigs سے خام نچوڑ کی کم کرنے والی طاقت تمام حصوں میں سب سے زیادہ تھی اور ارتکاز کے ساتھ لکیری طور پر بڑھی تھی [28]۔اینٹی آکسیڈینٹنچوڑ میں مرکبات کے درمیان پوٹینشل مختلف ہوتے ہیں، نچوڑ کی مجموعی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمیاں نکالنے والے سالوینٹس پر مضبوطی سے انحصار کرتی ہیں۔ تاہم، C. osmophloeum twigs سے پانی کے نچوڑ کی کم کرنے والی طاقت (OD قدر {{0}}.7) موجودہC کی طرح (OD قدر=0.66 ± 0.01) تھی۔ osmophloeum hydrosols (شکل 3A)، جو بھاپ کشید کے ذریعے تیار کیے گئے تھے۔ طاقت کو کم کرنا عام طور پر کم کرنے والے ایجنٹوں اور اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کی موجودگی سے منسلک ہوتا ہے، جو ہائیڈروجن ایٹموں کو کم کرنے کے ذریعہ آزاد ریڈیکل چین کے رد عمل کے خاتمے کی عکاسی کرتا ہے۔ C. osmophloeum کی کم کرنے والی طاقت شاید فینولک مرکبات (شکل 2) میں ہائیڈروکسیل گروپس کی موجودگی کی وجہ سے ہے، جو الیکٹران عطیہ دہندگان کے طور پر کام کر سکتے ہیں۔

3.2.4 TEAC Assays

موجودہ ہائیڈروسول کی TEAC قدریں 5.32 × 10−3 mg/mLand سے زیادہ ارتکاز پر بڑھی تھیں جو کہ حوالہ جاتی مرکبات ٹوکوفیرول اور BHT سے زیادہ تھیں، جیسا کہ شکل 3A میں دکھایا گیا ہے۔ ABTS پلس کی ریڈیکل سائٹ تک سٹیرک رسائی ہے۔ TEAC assays میں سرگرمی کے لیے بنیادی معیار۔

3.2.5 TPCs اور اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمیوں کے مابین ارتباط

جیسا کہ شکل 3B میں دکھایا گیا ہے، GAE میں 1.75 ± 0.438 سے 100.41 ± 1.581 mg/g تک TPCs اور DPPH فری ریڈیکل سکیوینگنگ سرگرمی کے درمیان ایک انتہائی اہم ارتباط تھا۔ . DPPH فری ریڈیکل سکیوینگنگ ایکٹیویٹی، ایف آئی سی سرگرمی، کم کرنے والی طاقت اور TEAC کے ساتھ TPC کے ارتباطی گتانک بالترتیب 0.980، 0.925، 0.967 اور 0.902 تھے (شکل 3B)۔ مجموعی طور پر، یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہاینٹی آکسیڈینٹCOK hydrosols کی سرگرمیاں فینول کے مواد کے ساتھ قریبی تعلق رکھتی ہیں۔

3.3 Tyrosinase سرگرمی پر COK ہائیڈروسول حراستی کا اثر

ہم نے مشروم کے ذریعہ L-tyrosine اور L-DOPA کے آکسیکرن پر COK ہائیڈروسول حراستی کے اثرات کا تعین کیا۔ٹائروسینیزاور کوجک ایسڈ کی سرگرمی سے موازنہ کیا، جو کہ معروف ٹائروسینیز انحیبیٹر (شکل 3C،D) ہے۔ موجودہ ہائیڈروسول قوی طور پر اور خوراک پر منحصر مشروم ٹائروسینیز (شکل 3C) کی L-tyrosine اور L-DOPA آکسیڈیز سرگرمیوں کو روکتا ہے لیکن L-DOPA (diphenolase سرگرمی) کے مقابلے L-tyrosine substrate (monophenolase activity) کی موجودگی میں hightyrosinase inhibitory activity تھی۔ IC5{{10} monophenolase اور diphenolaseactivities کے خلاف کوجک ایسڈ کی قدریں 4 تھیں۔{26}} × 10−5 اور 7.8 × 10−3 mg/mL (شکل 3C)، بالترتیب، موجودہ ہائیڈروسول سے نمایاں طور پر زیادہ (بالترتیب 7.96 × 10−4 mg/mL اور 0.35 mg/mL؛ شکل 3D)۔ اس لیے، 90 فیصد ٹائروسینیز انحیبیٹری سرگرمی (مونوفینولیز سرگرمی) حاصل کرنے کے لیے، بالترتیب 0.52 mg/mL اور 4.0 × 10−3 mg/mL پر ہائیڈروسول اور کوجک ایسڈ کی ضرورت تھی، جب L-tyrosine کو بطور ذیلی استعمال کیا جاتا تھا (شکل 3C، D )۔ اگرچہ ٹائروسینیز روکنے والے اثرات کے لیے COK ہائیڈروسولتھن کوجک ایسڈ کی زیادہ تعداد کی ضرورت ہوتی ہے، لیکن ان تجربات میں قوی ٹائروسینیز روکنے والی سرگرمی واضح تھی۔

مختلفٹائروسینیزتیاریوں، سرگرمی پرکھ کے طریقے، اور روکنے والے کی پاکیزگی اور اجزاء نے انزائم روکنے والے حرکیات میں فرق میں حصہ ڈالا ہے [29]۔ تاہم، پودوں کے نچوڑوں کی حیاتیاتی سرگرمیاں ان کے حیاتیاتی اجزاء کے ذریعے ادا کی جاتی ہیں، جو پودوں کی انواع، کٹائی کے وقت، موسم، جغرافیائی ماخذ، زرعی طریقوں اور نکالنے کے طریقوں سے متاثر ہو سکتے ہیں۔ بہت سے حالیہ مطالعات میں قدرتی ذرائع سے روکنے والوں کی شناخت کی گئی ہے اور ان کی خصوصیات کی گئی ہے، اور روک تھام کرنے والی سرگرمیوں اور قدرتی اجزاء کے درمیان تعلقات اچھی طرح سے قائم ہیں (ٹیبل 1)۔ خاص طور پر، بہت سے الڈیہائڈز اور دیگر مرکبات کو الگ تھلگ کر دیا گیا ہے اور انہیں ٹائروسیناسین انحیبیٹرز کے طور پر نمایاں کیا گیا ہے۔ ان میں cinnamaldehyde، 2-hydroxy-4-methoxy benzaldehyde، anisaldehyde،cuminaldehyde، cumic acid، flavonols، flavones، اور isoflavans [4,19,30–37] شامل ہیں۔ موجودہ ہائیڈروسول میں 87.7 فیصد cinnamaldehyde اور 7.0 فیصد benzaldehyde شامل ہیں، جس سے پتہ چلتا ہے کہ cinnamaldehyde، اس کے بعد benzaldehyde، ہائیڈروسول کی ٹائروسینیز انحبیٹری سرگرمی کے لیے ذمہ دار اہم مادہ ہے۔ thanpure cinnamaldehyde، اور بڑھاتا ہےٹائروسینیزہائیڈروسول کی روک تھام کی سرگرمی۔ Benzaldehydes نے بھی diphenolase سرگرمی اور mushroomtyrosinase کی monophenolase سرگرمی دونوں کو روکنے کی تصدیق کی ہے [38]۔ benzaldehyde-type inhibitors کا tyrosinase inhibitory mechanism غالباً انزائم [33,39] میں ایک پرائمری امینو گروپ کے ساتھ Schiff بیس بنانے کی ان کی صلاحیت سے آتا ہے۔ بینزالڈہائیڈ کی پیرا پوزیشن پر الیکٹران عطیہ کرنے والے گروپ کا اضافہ ٹائروسیناز کی روک تھام کی سرگرمی کو بڑھاتا ہے۔ شاید شیف بیس کو مستحکم کرنا۔

3.4 COK ہائیڈروسول کے ذریعہ مشروم ٹائروسینیز کی روک تھام کے متحرک طریقوں

بالترتیب سبسٹریٹ کے طور پر L-tyrosine اور L-DOPA کا استعمال کرتے ہوئے ٹائروسیناز کی monophenolase اور diphenolase سرگرمی پر hydrosol کے حرکیاتی طرز عمل کا مطالعہ کیا گیا۔ دیٹائروسینیزہائیڈروسول کی روک تھام کی حرکیات کا تجزیہ لائن ویور – برک ڈبل ریپروکیل پلاٹوں کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا، جیسا کہ شکل 4 میں دکھایا گیا ہے۔ شکل 4A، B میں، چار لائنیں غیر روکے ہوئے انزائم (لائن 1) اور تین ارتکاز (لائن 2 – لائن 4، اور 4 کی روک تھام) کی نمائندگی کرتی ہیں۔ یہ لکیریں 1/v محور کے بائیں طرف 1/S محور کے اوپر کاٹتی ہیں۔ غیر روکے ہوئے تجرباتی حالات کے تحت، ٹائروسینیز کے ذریعے اتپریرک L-tyrosine اور L-DOPA آکسیڈیشن رد عمل کی زیادہ سے زیادہ رفتار (Vmax) {{10}}.055 ∆OD475/minand 0.096 ∆OD475/min تھی ہائیڈروسول (شکل 4A، B میں لائن 1) بالترتیب۔ مشروم کے لیے حرکیاتی پیرامیٹر کلومیٹر (مائیکلس مستقل)ٹائروسینیزL-tyrosine اور L-DOPA کو بالترتیب سبسٹریٹس کے طور پر L-Tyrosine اور L-DOPA سے حاصل کردہ Lineweaver–Burk سے حاصل کیا گیا، یہ ظاہر کرتا ہے کہ Km تھا 0.534 mg/mL اور0.511 mg/mL بغیر ہائیڈروسول (لائن) شکل 4A، B میں 1)۔

چار لائنیں، جو غیر روکے ہوئے انزائم سے حاصل کی گئی ہیں اور ہائیڈروسول کے تین مختلف ارتکاز سے، 1/S محور کے اوپر 1/v محور کے بائیں طرف کاٹتی ہیں۔ ہائیڈروسول کی بڑھتی ہوئی ارتکاز کے نتیجے میں Vmax میں کمی اور کلومیٹر میں اضافہ ہوا۔ خاص طور پر، جب L-tyrosine کو سبسٹریٹ کے طور پر استعمال کیا جاتا تھا، ہائیڈروسول کے بڑھتے ہوئے ارتکاز کے نتیجے میں مختلف ڈھلوانوں اور وقفوں کے ساتھ متعدد لائنیں نکلتی ہیں، لیکن یہ دوسرے کواڈرینٹ میں ایک دوسرے کو کاٹتی ہیں (شکل 4A میں لائن 1–4)۔ اسی طرح کے نتائج اس وقت حاصل ہوئے جب L-DOPA کو ذیلی ذخیرے کے طور پر استعمال کیا گیا تھا (شکل 4B میں لائن 1–4)، اس دعوے کی تائید کرتے ہوئے کہ ہائیڈروسول ٹائروسینیز کے مخلوط قسم کے روکنے والے رکھتا ہے۔ مخلوط قسم کی روک تھام کے مطابق، ہائیڈروسول اجزاء ممکنہ طور پر فری انزائم اور انزائم-سبسٹریٹ کمپلیکس کو باندھتے ہیں۔ مخلوط قسم کی روک تھام کئی طریقوں سے پیدا ہو سکتی ہے: ہائیڈروسول کی روک تھام اس لیے پیدا ہو سکتی ہے کیونکہ وہ رد عمل کے پیٹرن میں بعد میں انٹرمیڈیٹ کے ساتھ تعامل کرتے ہیں لیکن ابتدائی انزائم سبسٹریٹ کمپلیکس کے ساتھ نہیں بالترتیب) فری انزائم (E) اور انزائم-سبسٹریٹ کمپلیکس کے پابند ہونے کے لیے L-tyrosine (Figure 4C, D) یا L-Tyrosine کی موجودگی میں ہائیڈروسول کے ارتکاز کے مقابلے میں ڈبل ریسیپروکل پلاٹ اور ڈھلوان اور عمودی مداخلت کے پلاٹ کا استعمال کرتے ہوئے DOPA بطور سبسٹریٹس (شکل 4E، F)۔ جیسا کہ شکل 4A، B میں دکھایا گیا ہے، جب L-tyrosine کا استعمال کیا گیا تو Ki قدر L-DOPA کی موجودگی میں اس سے تقریباً 1.28 گنا کم تھی، L-DOPA کے مقابلے L-tyrosine کے ساتھ زیادہ موثر روکے ہوئے انزائم بائنڈنگ کی نشاندہی کرتا ہے۔ مزید برآں، Ki کی قدر L-DOPA کے آکسیڈیشن کے لیے Ki قدر سے 1.71 گنا زیادہ تھی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ مفت انزائم کے لیے ہائیڈروسول اجزاء کی وابستگی انزائم-سبسٹریٹ کمپلیکس کے مقابلے میں زیادہ مضبوط ہے۔ L-DOPA کے لئے انزائم لیکن فعال سائٹ کو پابند نہیں کرتا ہے۔ مزید برآں، Ki کی قدر L-tyrosine کے کیفور کے آکسیڈیشن کے برابر تھی، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ مخلوط روکنے والے غیر مسابقتی روکنے والے ہیں، جو L- کا استعمال کرتے ہوئے ایک ہی توازن کے ساتھ ایک آزاد انزائم اور اینزائم-سبسٹریٹ کمپلیکس سے منسلک ہوتے ہیں۔ ٹائروسین بطور سبسٹریٹ (شکل 4A)۔ تاہم، مفت انزائم اور انزائم-سبسٹریٹ کمپلیکس کے لیے توازن بائنڈنگ کنسٹنٹ، بالترتیب، L-DOPA کو بطور سبسٹریٹ (شکل 4B) استعمال کرتے ہوئے مختلف ہیں، جو اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ مخلوط قسم (مسابقتی اور غیر مسابقتی مخلوط) روکنے والا نہ صرف اس کے ساتھ پابند ہو سکتا ہے۔ ایک مفت انزائم لیکن انزائم سبسٹریٹ کمپلیکس کے ساتھ بھی L-DOPA کو بطور سبسٹریٹ استعمال کرتا ہے۔ پچھلے مطالعات نے یہ بھی انکشاف کیا ہے کہ C. cassia ضروری تیل اور cinnamaldehyde مخلوط قسم کے روکنے والے ہیں [19]۔ اس کے برعکس، C. کیسیا کی چھال سے الگ تھلگ ٹرانس cinnamaldehyde مشروم کے ذریعے L-DOPA کے تھیو آکسیڈیشن کے لیے مسابقتی روک تھام کا اشارہ کرتا ہے۔ٹائروسینیز[32]، جبکہ cinnamaldehyde P کی جڑ سے الگ تھلگ۔ cernua ایک غیر مسابقتی روکنا تھا [35]۔

3.5 میلانوجینیسیس پر ہائیڈروسول ارتکاز کے ارتکاز پر منحصر اثرات

مختلف ارتکاز ({{{0}}.0035–10.64 mg/mL) میں سیل کی قابل عملیت اور میلانوجینیسیس پر ہائیڈروسول کے اثرات کا جائزہ لینے کے لیے، ہم نے B16-F10 میلانوما سیلز میں -MSH اور موازنہ کا استعمال کرتے ہوئے میلانوجینیسیس کی حوصلہ افزائی کی۔ کوجک ایسڈ کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کرنے کے اثرات (شکل 5)۔ اس خلیے کی وابستگی کے نتائج نے اشارہ کیا کہ ہائیڈروسول میں B16F10melanoma خلیات (شکل 5a) میں 0.0035–1.064 mg/mL کے ارتکاز میں کوئی سائٹوٹوکسیٹی نہیں ہے۔ چونکہ میلانوجینیسیس روکنے والے تیار کیے جا رہے ہیں، بہت سی ایپلی کیشنز کے لیے حفاظت اور تاثیر کو سب سے اہم خیال ہونا چاہیے۔ تاہم، ہائیڈروسول کے ساتھ B16F10melanoma خلیات کے علاج کے نتیجے میں 5.32–10.64 mg/mL کے ارتکاز میں سیل کی قابل عملیت میں واضح کمی واقع ہوئی۔ کی حفاظت اور افادیت کی اسکریننگ کے مطالعے کے نتائج کے مطابقجلد کو سفید کرناB16F10 سیل ثقافتوں میں مصنوعات، 1.064 mg/mL سیل پر مبنی پرائمری اسکریننگ کے لیے ایک حد کا ارتکاز ہے۔ لہذا، ہائیڈروسول کے ذریعہ B16F10 میلانوما خلیوں میں اینٹی ٹائروسینیز کے طریقہ کار کی جانچ کرنے کے لیے 0.1064–1.064 mg/mL کی ارتکاز کا استعمال کیا گیا۔

مختلف ارتکاز میں ہائیڈروسول علاج کے ذریعہ میلانوجینیسیس کے جبر کا تعین خلیوں میں میلانین کے مشمولات (شکل 5b) میں کیا گیا تھا۔ ہم نے ویسٹرن بلاٹنگ (شکل 5c) کا استعمال کرتے ہوئے MITF اظہار کی سطح کا بھی تجزیہ کیا۔ ان تجربات میں، میلانین کے مشمولات اور MITF اظہار کی سطح کو خوراک پر منحصر COK ہائیڈروسول کے ذریعے دبایا گیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ COK ہائیڈروسول MITF ترکیب کو دبا کر خلیوں میں میلانین مواد کو کم کرتا ہے۔

3.6۔ ڈی این اے پروٹیکشن اسسز

رد عمل آکسیجن پرجاتیوں ڈی این اے کو نقصان پہنچانے اور سیل کی عمر بڑھنے اور کینسر کا سبب بننے کے لیے اچھی طرح سے جانا جاتا ہے۔ ڈی این اے نکنگ اسیسز ڈی این اے کو نقصان پہنچانے والے ریڈیکلز کی پیداوار کا حساس طور پر تعین کرنے کے لیے ایک آسان سیل فری ماڈل سسٹم پیش کرتے ہیں [41]۔ ان تجربات میں، فینٹن کے رد عمل نے ہائیڈروکسیل ریڈیکلز پیدا کیے جو سپر کوائلڈ پلاسمڈ ڈی این اے کو صاف کرتے ہیں اور اسے ڈی این اے کی نکیڈ شکل میں تبدیل کرتے ہیں، جس سے الیکٹروفورٹک موبلٹی میں کمی واقع ہوئی ہے۔ [42,43]۔ اس طرح، ہائیڈروسول کی ڈی این اے حفاظتی سرگرمیوں کا جائزہ لینے کے لیے، ہم نے پی سی آئی نو ڈی این اے کو فینٹن ری ایکٹنٹس [44] کے ساتھ لگایا۔ جیسا کہ شکل 6 میں دکھایا گیا ہے، سپر کوائلڈ اور نِکڈ پلاسمڈ فارمز ایگرز جیل پر ان کے رشتہ دار الیکٹروفورٹک موبلٹی ریٹ سے واضح طور پر ممتاز ہیں۔ سپر کوائلڈ ڈی این اے نے بالترتیب سب سے تیز حرکت کی، اور نِکڈ ڈی این اے نے بالترتیب سب سے سست حرکت کی۔ ہائیڈروسول کے ساتھ علاج کے بعد، بالترتیب (لینز 6-8) کے بالترتیب 28-58 فیصد تحفظ کے ساتھ، 1.33–5.32 mg/mL کے ہائیڈروسول ارتکاز پر ڈی این اے کا نقصان قدرے کم ہوا۔ 0.3325–0.665 mg/mL کی ہائیڈروسول ارتکاز پر، منفی کنٹرول (لین 4 اور 5) کی نسبت کوئی تحفظ نہیں دیکھا گیا۔ ثالثی شدہ ٹکڑے، جیسا کہ پہلے دکھایا گیا ہے [45]۔ یہ پہلا ڈیٹا ہے جو C سے ہائیڈروسول کے نچوڑ کے حفاظتی اثرات کو ظاہر کرتا ہے۔ Osmophloeum Kanehira فینٹن کے رد عمل سے ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان پر چھوڑتا ہے۔ یہ اثرات ممکنہ طور پر پولیفینول مرکبات کی موجودگی کی وجہ سے ہوتے ہیں۔

4. نتائج

COK طویل عرصے سے تائیوان میں دواؤں کے پودے کے طور پر استعمال ہوتا رہا ہے۔ تاہم، ہمارے علم کے مطابق، یہ پہلی رپورٹ ہے جو یہ ظاہر کرتی ہے کہ ہائیڈروسول جو کہ COK کے پتوں سے بھاپ کشید کرکے تیار کیے جاتے ہیں ان میں اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمیاں ہوتی ہیں، جیسا کہ تحقیق میں مشاہدہ کیا گیا ہے۔اینٹی آکسیڈینٹسرگرمی اور ڈی این اے کا نقصان۔ ہم نے یہ بھی دکھایا کہ یہ ہائیڈروسول melanogenesis کو دباتا ہے۔ GC/MS کے تجزیوں میں، COK ہائیڈروسول میں بڑے مرکبات cinnamaldehyde اور benzaldehyde پائے گئے، اور یہ ایجنٹ ٹائروسینیز کی monophenolase اور diphenolase کی سرگرمیوں کے خلاف ممکنہ طور پر روکنے والے تھے۔ ٹائروسینیز انحبیشن کینیٹکس کے ہمارے جائزوں میں، COK ہائیڈروسول نے L-tyrosine اور L-DOPA آکسیڈیز سرگرمیوں کی مخلوط قسم کی خوراک پر منحصر روک تھام کی نمائش کی۔ٹائروسینیز. موجودہ ہائیڈروسول مرکبات نے MITF پروٹین کے اظہار کو بھی دبایا، جس کے نتیجے میں -MSH کی حوصلہ افزائی میلانین کی ترکیب کم ہو گئی۔

آخر میں، ٹائروسینیز روکنے والوں کے لیے حفاظت ایک اہم خیال ہے، خاص طور پر ان کاسمیٹک اور کھانے کی مصنوعات کے لیے، جو ریگولیٹڈ مقدار میں استعمال کی جا سکتی ہیں۔ COK پہلے سے ہی کھانے اور کاسمیٹکس کے لیے ایک خوردنی اور بڑے پیمانے پر استعمال ہونے والا قدرتی اضافی ہے۔ مزید برآں، cinnamaldehyde کو عام طور پر انسانی استعمال کے لیے محفوظ تسلیم کیا جاتا ہے۔ COK ہائیڈروسول ایک بہترین قدرتی بایو میٹریل ہے جس میں موثر اور محفوظ ہے۔ٹائروسینیزاور میلانین کی ترکیب کی روک تھام کی سرگرمی اور ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان سے بچانے کی صلاحیت۔ لہذا، ہم سمجھتے ہیں کہ COK ہائیڈروسول کو بہت سی ایپلی کیشنز کے لیے ایک محفوظ اور موثر ڈپگمنٹنگ ایجنٹ کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔