میلانوما سیلز میں آنکوجینک کناز PAK1 کے منٹ لیول کا سیرم/PDGF پر منحصر میلانوجینک کردار انتہائی حساس کناز پرکھ سے ثابت ہوتا ہے۔

رابطہ:joanna.jia@wecistanche.com/ واٹس ایپ: 008618081934791

خلاصہ:ہم نے پہلے یہ ظاہر کیا ہے کہ oncogenic kinase PAK4، جس کا اظہار میلانوماس اور نارمل میلانوسائٹس دونوں بہت زیادہ سطح پر کرتے ہیں، ان کے لیے ضروری ہے۔melanogenesis. موجودہ مطالعے میں، انتہائی حساس "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo) کناز پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے ایک اور oncogenic kinase PAK1 کی میلانوجینک صلاحیت کی چھان بین کی، جس کا میلانوما (B16F10) خلیات صرف ایک منٹ کی سطح پر اظہار کرتے ہیں۔ PAK1 جین کو خاموش کرنے کے لیے میلانوما خلیوں کو PAK1-shRNA سے منتقل کرنے کے بعد، میلانین مواد،ٹائروسینیزسرگرمی، اور PAK1 کی کناز سرگرمی کا جنگلی قسم اور ٹرانسفیکٹنٹس کے درمیان موازنہ کیا گیا۔ ہم نے پایا کہ (i) PAK1 میلانوجینک ہارمونز جیسے IBMX (3-isobutyl-1-methyl xanthine) اور -MSH (melanocyte-stimulating hormone)، (ii) endogenous PAK1 جین کو خاموش کر کے نمایاں طور پر متحرک ہوتا ہے۔ PAK1-مخصوص shRNA کے ذریعے میلانوما سیل میلانین مواد اور دونوں کو کم کرتا ہے۔ٹائروسینیزسیرم اور میلانوجینک ہارمونز دونوں کی موجودگی میں بیسل لیول تک سرگرمی، (iii) میلانوما سیلز میں خارجی طور پر شامل جنگلی قسم PAK1 بیسل کو متاثر کیے بغیر -MSH- inducible melanin کی سطح کو کئی گنا بڑھاتا ہے، اور (iv) - MSH/IBMX-حوصلہ افزائی میلانوجینیسس سیرم یا PAK1 کی غیر موجودگی میں مشکل سے ہوتا ہے، واضح طور پر اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ PAK1 بنیادی طور پر سیرم- اور-MSH/IBMX پر منحصر ہے۔melanogenesis، لیکن میلانوما خلیوں میں بیسل نہیں۔ اس مطالعے کا نتیجہ یہ بتانے کے لیے پہلی سائنسی بنیاد فراہم کر سکتا ہے کہ کاسمیٹکس میں ہربل PAK1-بلاکرز جیسے CAPE (کیفیک ایسڈ فینیتھائل ایسٹر)، کرکومین، اور شیکونن کی وسیع اقسام کیوں مفید ہیں۔جلد کو سفید کرنا.

مطلوبہ الفاظ:PAK1،melanogenesisمیلانوماٹائروسینیز، MITF،جلد کو سفید کرنا، سیرم

جلد کی دیکھ بھال کی مصنوعات کو سفید کرنا

تعارف

بالوں کی رنگت، آنکھوں کی چمک اور جلد کو روغن کے ایک خاندان کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے جسے میلانین کہتے ہیں۔ میلانین کا انٹرا سیلولر ذریعہ ٹائروسین ہے اور انزیمیٹک آکسیڈیشن (ہائیڈرو آکسیلیشن) کی ایک سیریز کے ذریعے میلانین میں تبدیل ہوتا ہے جس میںٹائروسینیز، TRP (ٹائروسینیز سے متعلق پروٹین) 1، اور TRP2۔ ان میلانوجینک انزائمز کے لیے جین انکوڈنگ کے اظہار کے لیے کم از کم دو آنکوجینک/میلانوجینک ٹرانسکرپشن فیکٹرز (MTFs) کی ضرورت ہوتی ہے: بیٹا کیٹنین اور MITF (مائیکروفتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن فیکٹر)۔ میں جڑی بوٹیوں کے مرکبات کی اکثریتجلد کو سفید کرناکاسمیٹکس یا تو براہ راست ان میلانوجینک انزائمز کو روکتے ہیں یا MTFs کو کم کرتے ہیں۔ ٹائروسین اینالاگ جیسے کوجک ایسڈ کا تعلق پہلی قسم سے ہے (ٹائروسینیزinhibitors)، جبکہ باقیات کی اکثریت جیسے CAPE (caffeic acid phenethyl ester)، curcumin، اور shikonin کا ​​تعلق دوسری قسم (MTF ریگولیٹرز) (1,2) سے ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ ان میں سے بہت سے MTF ریگولیٹرز بشمول CAPE، curcumin، shikonin، اور cucurbitacin oncogenic/aging kinase PAK1 (RAC/CDC42-activated kinase 1) (3-5) کو روکنے کے لیے جانے جاتے ہیں۔ اس طرح، یہ سب سے زیادہ امکان ہے کہ PAK1 بالوں کے خلیوں، آنکھوں کے جلنے، یا جلد کے میلانوسائٹس میں ان میلانوجینک/آنکوجینک ٹرانسکرپشن عوامل کو چالو کرنے میں ملوث ہے۔ درحقیقت، کم از کم بیٹا کیٹنین PAK1 (6) کے براہ راست ذیلی ذخائر میں سے ہے۔ PAK1 ایکٹیویشن کے لیے Ser 675 پر بیٹا کیٹنین کو فاسفوریلیٹ کرتا ہے، جس سے مہلک تبدیلی آتی ہے۔ مزید برآں، بیٹا کیٹنین ایم آئی ٹی ایف کو چالو کرنے کے لیے ضروری ہے، جس کی وجہ سےmelanogenesisیا/اور میلانوسائٹس کی آنکوجینیسیس (7)۔

تاہم، دلچسپ بات یہ ہے کہ حال ہی میں یہ انکشاف ہوا ہے کہ روغن والے چوہوں میں ناک آؤٹ PAK1 جین کسی بھی البینو چوہوں کو پیدا کرنے میں ناکام رہتا ہے (Hong He et al.، غیر مطبوعہ مشاہدہ)، واضح طور پر اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ کم از کم بالوں کے خلیوں اور آنکھ دونوں میں بیسل میلانوجینیسیس۔ irises PAK1 سے آزاد ہے، حالانکہ PAK1 کی جلد میں شراکت ہے۔melanogenesisواضح ہونا باقی ہے.

ہم نے پہلے دکھایا ہے کہ oncogenic kinase PAK4 (CDC42-منحصر کناز 4) میلانوما اور نارمل میلانوسائٹ سیل لائنوں دونوں میں بہت زیادہ ظاہر ہوتا ہے، اور ان کے میلانوجینیسیس کے لیے ذمہ دار ہے، CREB/beta-catenin-MIFT- کو چالو کرتا ہے۔ٹائروسینیزپاتھ وے، جبکہ PAK2 (RAC/CDC42-ایکٹیویٹڈ kinase 2)، PAK فیملی کا ایک اور انتہائی اظہار شدہ رکن، ان کے میلانوجینیسس (8) میں کوئی کردار ادا نہیں کرتا ہے۔

اس مطالعے میں، ہم جلد میں PAK1 نامی ایک اور آنکوجینک کناز کے مخصوص کردار کے لیے پہلا حیاتیاتی کیمیائی ثبوت فراہم کرتے ہیں۔melanogenesis، اس حقیقت کے باوجود کہ اس کے اظہار کی سطح منٹ ہے: میلانوسائٹس (B16F10) میں PAK1 جین کی shRNA-حوصلہ افزائی خاموشی نے ماؤس میلانوما سے ماخوذ -MSH/IBMX- inducible کو نمایاں طور پر کم کردیا۔melanogenesisبیسل سطح تک، جبکہ PAK1 جین کے زیادہ اظہار نے بیسل کو متاثر کیے بغیر -MSH- inducible melanogenesis کو فروغ دیا۔ مزید برآں، ہم نے پایا کہ -MSH/IBMXinducible melanogenesis کے لیے سیرم فیکٹر کی ضرورت ہوتی ہے جو کہ PDGF (پلیٹلیٹ سے ماخوذ گروتھ فیکٹر) ہے۔ سیرم فری میڈیم میں، صرف بیسلmelanogenesisجگہ لیتا ہے.

cistancheٹائروسینیز کی سرگرمی کو کم کریں۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 مواد

B16F10 میلانوما سیل امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن (Rockville، MD، USA) سے خریدے گئے تھے۔ PAK1-SureSilencing plasmids, Attractive transfection, endofree® plasmid maxi kit Qiagen (Valencia, CA 91355, USA) سے خریدے گئے تھے۔ بنیادی PAK1-اینٹی باڈیز، بایوٹینیلیٹڈ سیکنڈری اینٹی باڈیز، سگنل فائر ٹی ایم ای سی ایل ریجنٹ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی (ڈینورس، ایم اے، یو ایس اے) سے حاصل کیے گئے تھے۔ Kinase Glo reagent اور ATP (ATP_Glo kinase kit) Promega (Madison, Wisconsin, USA) سے خریدے گئے تھے۔ Lipofectamine اور JM109 قابل خلیات Invitrogen اور Life Technology سے خریدے گئے تھے۔ AG1295 اور AG1478 Calbiochem (San Diego, CA, USA) سے خریدے گئے تھے۔ انسانی PDGF-bb سمیت دیگر تمام کیمیکل سگما-الڈرچ (سینٹ لوئس، ایم او، یو ایس اے) سے خریدے گئے تھے۔

2.2 ماؤس میلانوسائٹس (B16F10) میں PAK1 جین کو ماؤس PAK1-مخصوص shRNA کے ساتھ مستحکم منتقلی کے ذریعے خاموش کرنا

2.2.1 سیل کلچر

B16F10 میلانوما خلیات DMEM میں 10 فیصد ہیٹ ایکٹیویٹڈ FBS اور 1 فیصد پینسلن/سٹریپٹومائسن (10,000 U/mL اور 100 µg/mL) کے ساتھ 37 ڈگری پر مرطوب ماحول میں 5 فیصد CO2 پر مشتمل تھے۔

2.2.2 ماؤس PAK1-مخصوص shRNA کے ساتھ مستحکم ٹرانسفیکشن

B16F10 سیل لائن کا ShRNA ٹرانسفیکشن بنیادی طور پر اسی طریقہ کار کے ذریعے کیا گیا تھا جو پہلے بیان کیا گیا تھا (9)، لیکن ماؤس PAK1-مخصوص shRNAs (# KM04553, Qiagen) کے ساتھ۔ shRNAs کے درج ذیل چار الگ الگ کلون ٹرانسفیکشن کے لیے استعمال کیے گئے تھے: کلون 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT)، کلون 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT)، کلون 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT)، اور کلون 4 (GTACCACCAGGTTCGAGAGAAGAT)، اور کلون 4 (GTACCACCAGTGTGTGTGA) منفی کنٹرول کے ساتھ ساتھ . تاہم، اس تحقیق میں، کلون 1 اور 2 اس میلانوسائٹ لائن میں ماؤس PAK1 جین کو خاموش کرنے کے لیے کلون 3 اور 4 سے زیادہ موثر ثابت ہوئے (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔ G418 (1 mg/mL) کی موجودگی میں مستحکم ٹرانسفیکٹینٹس کا انتخاب کیا گیا جو 99 فیصد سے زیادہ غیر منتقلی خلیوں کو ہلاک کر دیتا ہے۔

2.2.3 PAK1 پروٹین کی سطح کا مغربی بلاٹ تجزیہ اور ٹرانسفیکٹنٹس میں PAK1 کی کناز سرگرمی کے لیے وٹرو پرکھ

2.2.3.1 مغربی دھبے کا تجزیہ

کنٹرول (WT) سیل لائن اور PAK1-سائلنسڈ ٹرانسفیکٹنٹ (G418-مزاحم) دونوں میں PAK1 کی انتہائی کم سطح کی مقدار درست کرنے کے لیے، "غیر مخصوص شور" کی سطح کو کم سے کم کرکے، ہم نے مغربی بنیادی اینٹی باڈی کے طور پر PAK1 (#2062، سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی) کے خلاف خرگوش پولی کلونل اینٹی باڈی کا استعمال کرتے ہوئے دھبے کا تجزیہ۔ مختصرا،، ہر کلون کو 6 کنویں پلیٹ میں 2 × 105 خلیات / کنویں کے ارتکاز میں سیڈ کیا گیا تھا، 48 گھنٹے کے لیے پری کلچر کیا گیا تھا، اور سیل لائسیٹس کو 5 منٹ کے لیے SDS-PAGE بفر کے 25 µL میں ابالا گیا تھا۔ ہر ایک سلاٹ کے آٹھ µL (کل پروٹین کے 15 µg پر مشتمل) SDS-PAGE کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ نائٹرو سیلولوز کو اینٹی PAK1 IgG (1:1،000 ایک بنیادی اینٹی باڈی کے طور پر کم کرنے)، اور سیکنڈری اینٹی باڈیز کے طور پر، HRP سے منسلک اینٹی خرگوش IgG اور اینٹی بایوٹین IgG (#7074, # 7075، سیل سگنلنگ) کا استعمال PAK1 اور ایکٹین بینڈ دونوں کا پتہ لگانے کے لیے کیا گیا تھا جو بالآخر ایمرشام سے ECL سسٹم کے ساتھ تصور کیے گئے تھے۔ مغربی بلاٹ اسیس تین آزاد تجربوں کے نمائندے تھے۔

2.2.3.2 میلانوما خلیوں میں PAK1 کے لیے "میکارونی-ویسٹرن" (IP- ATP_Glo) کناز پرکھ

WT melanocytes اور shRNA transfectants (SHs) میں PAK1 کی kinase سرگرمی کو ایک دہائی پرانے طریقہ (جسے ہم نے "Macaroni-Western" بنایا تھا) میں ایک اطالوی گروپ (1{{39) کی طرف سے تیار کردہ کافی ترمیم (5) سے ماپا گیا۔ }})۔ مختصراً، B16F10 میلانوما سیل لائنز (WT یا SHs، 2 × 105 سیل/mL) کو 24 گھنٹے کے لیے 6- ویل پلیٹ پر پہلے سے کلچر کیا گیا تھا۔ پھر خلیوں کا علاج 100 nM -MSH یا 100 µM IBMX کے ساتھ 48 گھنٹے تک کیا گیا۔ 50 mM Tris HCl pH 7.5 اور 150 mM NaCl اور 1 فیصد Triton-X پر مشتمل lysis بفر سے خلیات میں خلل پڑا۔ PAK1 کے امیونوپریسیپیٹیشن (IP) کے لیے، کلیئر شدہ سیل لائسیٹس کو اینٹی PAK1 IgG (1:50 dilution) اور پروٹین A-agarose موتیوں کے ساتھ ٹھنڈے کمرے میں 1-2 گھنٹے کے لیے روٹری مکسر کے ذریعے مسلسل ہلاتے ہوئے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ (Nissin, Suginami-ku, Tokyo, Japan) ہر لیسیٹ کے نتیجے میں آئی پی (PAK1) کو ATP Glo kinase assay kit (Promega) کے ساتھ ATP اور MBP (مائیلین بنیادی پروٹین) کی موجودگی میں 37 ڈگری پر 1 گھنٹہ کے لیے لگایا گیا تھا، اور بقیہ اے ٹی پی کی سطح کو اے ٹی پی کے ذریعے ناپا گیا تھا۔ انحصار لوسیفرین-لوسیفریز ردعمل جو آخر کار ایک چمک پیدا کرتا ہے (10)۔ حتمی معطلی کو سینٹری فیوج کیا گیا تھا، اور سپرنٹنٹ کو پڑھنے کے لیے ایک 96-کنویں پلیٹ میں منتقل کیا گیا تھا۔ Luminescence کو MTP-880لیب مائکروپلیٹ ریڈر (کورونا، ہٹاچیناکا-کو، ایباراکی، جاپان) نے 0.5 سیکنڈ فی کنواں کے انضمام وقت کے ساتھ ریکارڈ کیا تھا۔

2.3۔ ٹرانسفیکٹینٹس میں میلانین مواد اور ٹائروسینیز کی سرگرمی کی پیمائش

2.3.1 میلانین مواد کی پیمائش

میلانین مواد کا تعین کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (11)۔ مختصراً، B16F10 خلیات (جنگلی قسم یا PAK1-مخصوص shRNA ٹرانسفیکٹنٹس) کو 2 × 104 خلیات کی کثافت پر ایک 24-کنویں پلیٹ میں چڑھایا گیا تھا۔ کلچر کے 24 گھنٹے کے بعد، 100 µM isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) یا 100 nM -MSH شامل کیا گیا اور 37 ڈگری پر اضافی 72 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ خلیوں کو دو بار فاسفیٹ بفر سے دھویا گیا، پھر 1 M NaOH اور 10 فیصد DMSO پر مشتمل محلول کے 500 µL کے ساتھ لیس کیا گیا اور میلانین کو گھلنشیل کرنے کے لیے 80 ڈگری پر 1 گھنٹہ تک انکیوبیٹ کیا گیا، اور میلانین کے مواد کی پیمائش 490 nm پر کی گئی۔ جنگلی قسم اور منتقلی خلیوں میں میلانین کے مواد کا موازنہ کرنے کے لیے، جنگلی قسم کے میلانوسائٹس کے ذریعہ تیار کردہ میلانین کی کل مقدار کو کنٹرول (100 فیصد) کے طور پر سمجھا جاتا تھا، اور ٹرانسفیکٹینٹس کے ذریعہ ان کا حساب اسی کے مطابق کیا جاتا تھا۔

2.3.2 انٹرا سیلولر ٹائروسینیز سرگرمی کے لئے پرکھ

ٹائروسینیزسرگرمی کا تعین کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (12)، معمولی ترمیم کے ساتھ۔ B16F10 خلیات (جنگلی قسم یا ٹرانسفیکٹنٹس) کو 2 × 104 خلیات/ کنویں کی کثافت پر چڑھایا گیا تھا، اور کلچر کے 24 گھنٹے کے بعد، 100 µM IBMX یا 100 nM -MSH شامل کیا گیا تھا اور 37 ڈگری پر اضافی 72 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ . اس کے بعد خلیوں کو آئس کولڈ فاسفیٹ بفر سے دھویا گیا اور فاسفیٹ بفر (pH 6.8) کے ساتھ لیس کیا گیا جس میں 1 فیصد Triton-X (500 µL/well) تھا۔ پلیٹوں کو −80 ڈگری پر 30 منٹ کے لیے منجمد کر دیا گیا تھا۔ پگھلنے کے بعد، ہر کنویں میں 100 µL 1 فیصد L-DOPA شامل کیا گیا۔ 2 گھنٹے کے لیے 37 ڈگری پر انکیوبیشن کے بعد، جذب 490 nm پر ناپا گیا۔

2.4 جنگلی قسم میں میلانین کے مواد کی پیمائش اور PAK1--ایم ایس ایچ کے علاج کے بعد میلانوسائٹس کا زیادہ اظہار

Myc ویکٹر (2 µg) کا استعمال کرتے ہوئے، میلانوسائٹس (B16F10) کو جنگلی قسم (WT) PAK1 یا نام نہاد "آئینی طور پر فعال" (CA) PAK1 T423E اتپریورتن کے ساتھ عارضی طور پر منتقل کیا گیا تھا۔ 3 دن کی ثقافت کے بعد، ہر منتقل شدہ کلون کو مزید تجربے کے لیے کاٹا گیا۔ میلانین مواد پر PAK1-اوور ایکسپریشن کا اثر انہی طریقہ کار کے ذریعے ماپا گیا جو پہلے بیان کیا گیا تھا (8)۔ مختصراً، میلانوسائٹس، یا تو وائلڈ ٹائپ یا PAK{12}}اوور ایکسپریشن جو کہ جنگلی قسم کے PAK1 یا اس کے CA اتپریورتی کا اظہار کرتے ہیں، کو 100 nM -MSH کے ساتھ 3 دن تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ میلانین کو تحلیل کرنے کے لیے سیلز کو 1 M NaOH اور 20 فیصد DMSO پر مشتمل محلول کے ساتھ لیس کیا گیا تھا، اور اس کے مواد کا تعین 405 nm پر کیا گیا تھا۔

2.5 سیرم فری میڈیم میں میلانوجینیسیس

B16F10 سیلز (وائلڈ ٹائپ یا PAK1-مخصوص shRNA ٹرانسفیکٹنٹس) کو 10 فیصد FBS کی موجودگی میں ایک 24-کنویں پلیٹ میں 2 × 104 سیلز/کنویں کی کثافت پر چڑھایا گیا تھا۔ انکیوبیشن کے 24 گھنٹے کے بعد، کلچر میڈیم کو سیرم فری میڈیم سے بدل دیا جاتا ہے، اور میلانین مواد کی پیمائش کے لیے 100 µM IBMX یا 100 nM -MSH کے ساتھ یا اس کے بغیر اضافی 72 گھنٹے کے لیے کلچر کیا جاتا ہے۔

2.6۔ سیرم پر منحصر میلانوجینیسیس پر PDGF/EGF ریسیپٹر روکنے والوں کا اثر

2 × 104 B16F10 خلیات کو ہر کنویں میں 24 گھنٹے کے لیے 10 فیصد FBS پر مشتمل میڈیم میں سیڈ کیا گیا، اور پھر 100 nM -MSH اور مندرجہ ذیل پر مشتمل تازہ میڈیم میں اضافی 72 گھنٹے کے لیے کلچر کیا گیا: (1) کوئی سیرم نہیں، (2) میلانین مواد کی پیمائش کرنے کے لیے اکیلے 10 فیصد FBS، (3) 10 فیصد FBS پلس 2 µM AG1295 (PDGF ریسیپٹر انہیبیٹر)، اور (4) 10 فیصد FBS پلس 400 nM AG1478 (EGF ریسیپٹر انہیبیٹر)۔

2.7۔ شماریاتی تجزیہ

ڈیٹا کو ان کی معیاری غلطیوں کے ساتھ اوسط اقدار کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ شماریاتی موازنہ یکطرفہ ANOVA کے ذریعے انجام دیا گیا جس کے بعد ڈنکن کا متعدد رینج ٹیسٹ ہوا۔ شماریاتی تجزیہ SAS (ریلیز 9.2؛ SAS انسٹی ٹیوٹ، کیری، NC، USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا، اور p 0.05 سے کم یا اس کے برابر اہم سمجھا گیا۔

maca ginseng cistanche

3. نتائج

3.1 میلانوما سیل لائن (B16F10) میں میلانوجینک ہارمونز کے ذریعے PAK1 کا فعال ہونا

دو میلانوجینک ہارمونز، -ایم ایس ایچ (میلانوسائٹ کو محرک کرنے والا ہارمون) اور آئی بی ایم ایکس (3-اسوبوٹائل-1-میتھائل زانتھائن) اکثر حوصلہ افزائی کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔melanogenesisمیلانوسائٹس میں جیسے میلانوما سیل لائن B16F10۔ اس طرح، ہم نے پہلے جانچ کی کہ آیا یہ ہارمونز اس سیل لائن میں PAK1 کو چالو کر سکتے ہیں، حالانکہ PAK1 کی پروٹین کی سطح PAK2 اور PAK4 (8) کے مقابلے میں انتہائی کم ہے۔ خلیوں میں PAK1 کی کناز سرگرمی میں ہونے والی تبدیلیوں کی نگرانی کے لیے، ہم نے حال ہی میں سیل سے PAK1 کے امیونو-پریسیپیٹیشن (IP) کو ملا کر "Macaroni-Western" (IP ATP-Glo) کناز پرکھ کا ایک انتہائی حساس/مخصوص کناز پرکھ تیار کیا ہے۔ lysates اور Promega's ATP_Glo kinase kit (5)۔ اس کناز پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے پایا کہ -MSH (100 nM) اور IBMX (100 µM) دونوں PAK1 کو میلانوما خلیوں میں چالو کرتے ہیں، جس میں -MSH IBMX سے زیادہ طاقتور ہے (شکل 1 میں دیکھیں)۔ تاہم، ہمیں قارئین کو یاد دلانا چاہیے کہ یہاں دکھایا گیا PAK1 کی فولڈ ایکٹیویشن صرف ظاہر ہے، کیونکہ اس وقت استعمال کرنے والے ٹیسٹ ٹیوب آئی پی اور کناز پرکھ (مجموعی طور پر 3 گھنٹے سے زیادہ) ان میلانوجینک ہارمونز کے بغیر ہونے کے دوران، PAK1 کو آہستہ آہستہ معمول پر لایا جائے گا۔ وقت دوسرے لفظوں میں، ہم ان محرکات کے ساتھ علاج کیے جانے والے سیل کلچر کے اختتام پر PAK1 کی صحیح کناز کی حیثیت کو منجمد نہیں کر سکتے، اور فولڈ ایکٹیویشن ان سمولیٹرز کے ذریعے سیل کلچر کے دوران PAK1 ایکٹیویشن کی صرف ایک کم تخمینہ عکاسی ہے۔

3.2 ماؤس میلانوما سیل لائن میں shRNAs کے ذریعہ PAK1 جین کو خاموش کرنا

مزید بائیو کیمیکل تحقیق کرنے کے لیے اگر PAK1 اس میں تعاون کرتا ہے۔melanogenesisجلد کے خلیات (میلانوسائٹس) میں، ہم نے PAK1 جین کو منتخب طور پر خاموش کرنے کے لیے میلانوما سیل لائن B16F10 کو ماؤس PAK1-مخصوص shRNA سے مستحکم طور پر منتقل کیا۔

3.2.1 میلانوسائٹس میں PAK1 جین کو خاموش کرنا

ہمارے ابتدائی مغربی دھبے کے تجزیے نے تجویز کیا کہ دو الگ الگ PAK1-خاموش کلون (SH1 اور 2) میں PAK1 پروٹین کی سطح نمایاں طور پر (تقریباً 75 فیصد تک) کم ہو گئی ہے، لیکن اس میلانوما سیل لائن کی شرح نمو فی سی نہیں تھی۔ PAK1 خاموشی سے نمایاں طور پر متاثر ہوا (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔ تاہم، اس مغربی دھبے کو اسکین کرکے PAK1 پروٹین کی سطحوں کی درست مقدار کا تعین کرنا کافی مشکل تھا، بنیادی طور پر PAK1 بینڈ کے گرد پس منظر کے زیادہ شور کی وجہ سے اس کے انتہائی کم اظہار کی سطح کو دیکھنے کی کوشش میں۔ اس کے بجائے، "Macaroni-Western" kinase assay (5,10) کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے تصدیق کی کہ SH1 اور 2 دونوں کلون میں PAK1 کی کناز سرگرمی کنٹرول (WT) خلیات میں اس کا صرف 25-30 فیصد ہے۔ تصویر 2A دیکھیں)۔

3.2.2 PAK1 جین کو خاموش کرکے میلانوجینیسیس میں کمی

ہمارا اگلا اہم سوال یہ تھا کہ کیا PAK1 کی کناز سرگرمی میں اس طرح کی کمی متاثر ہوتی ہے۔melanogenesis. اس طرح، ان کلون (SH1 اور 2) میں میلانین کے مواد کا موازنہ جنگلی قسم (WT) میلانوما خلیوں کے ساتھ کیا گیا، ان تمام خلیوں کا 72 گھنٹے تک -MSH، ایک میلانوجینک انڈیسر کے ساتھ علاج کرنے کے بعد۔ جیسا کہ شکل 2B میں دکھایا گیا ہے، ان PAK1-کی کمی میلانوسائٹس (SH1 اور 2) میں میلانین کا مواد تقریباً 50 فیصد (51-55 فیصد) تک کم ہو جاتا ہے، جو میلانجینک ہارمون کے بغیر WT میں بنیادی سطح تک پہنچ جاتا ہے۔ یہ دیکھنے کے لیے کہ آیا میلانین کے مواد میں یہ کمی ٹائروسینیز کی سرگرمی کو دبانے سے وابستہ ہے، ہم نے پیمائش کی۔ٹائروسینیزWT کے مقابلے PAK1-کی کمی والے خلیات (کلون SH1 اور 2) میں سرگرمی۔ جیسا کہ شکل 2C میں دکھایا گیا ہے، PAK1-کی کمی والے خلیوں میں ٹائروسینیز کی سرگرمی WT میں اس کا صرف 45 فیصد (33-58 فیصد) ہے، جو دوبارہ بنیادی (غیر محرک) سطح تک پہنچتی ہے، جو واضح طور پر ظاہر کرتی ہے۔ کہ PAK1 -MSH-حوصلہ افزائی میلانین کی پیداوار کے لیے ضروری ہے۔ٹائروسینیزmelanocytes میں. مزید برآں، اس میلانوما سیل لائن (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا) میں PAK1 جین کو خاموش کر کے IBMX-حوصلہ افزائی میلانوجینیسیس کو بھی اسی طرح کم کیا گیا تھا۔ تاہم، مندرجہ ذیل دو عوامل کو مدنظر رکھتے ہوئے، یہ سب سے زیادہ امکان ہے کہ صرف نصفmelanogenesisمیلانوسائٹس میں PAK1- منحصر ہے، اور باقی (بڑی حد تک "بنیادی") PAK4- پر منحصر ہے: (i) PAK4 میلانوسائٹس (8) میں ایم ایس ایچ کی حوصلہ افزائی میلانوجینیسیس کے لیے بھی ضروری ہے، اور (ii) PAK1 جین کا تقریباً 25 فیصد اب بھی ان ٹرانسفیکٹینٹس (SH1 اور 2) میں ظاہر ہوتا ہے۔ تاہم، یہ واضح ہونا باقی ہے کہ آیا PAK1 ہارمون کے لیے ذمہ دار ہے یا بیسلmelanogenesis.

مزید برآں، ہم نے تصدیق کی ہے کہ endogenous PAK1 اس میلانوما سیل لائن میں IBMX اور -MSH جیسے melanogenic inducers کے ذریعے نمایاں طور پر چالو ہوتا ہے (تصویر 1 دیکھیں)، لیکن Thr 423 میں اس کے آٹو فاسفوریلیشن میں کسی خاص تبدیلی کے بغیر جیسا کہ اینٹی pPAK1 کے ذریعے فیصلہ کیا گیا ہے۔ اینٹی باڈی (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔

3.3 زیادہ اظہار شدہ PAK1 کے ذریعے -MSH- inducible melanogenesis میں اضافہ

میلانوسائٹس (B16F10 سیل لائن) میں جنگلی قسم (WT) PAK1 جین کی منتقلی کے ذریعے، ہم نے انکشاف کیا کہ خارجی طور پر شامل PAK1 جین -MSH- inducible melanin کی سطح کو کئی گنا بڑھاتا ہے (شکل 3 کے بائیں طرف دیکھیں، موازنہ کریں۔ لین 2 اور 4)، جبکہ یہ آزاد "بیسل" میلانین کی سطح کو مشکل سے متاثر کرتا ہے (شکل 3 کے بائیں پینل میں لین 1 اور 3 کا موازنہ کریں)، یہ تجویز کرتا ہے کہ PAK1 بنیادی طور پر -MSH/IBMX پر منحصر ہے۔melanogenesis, اور exogenous stimulator(s) کے بغیر بیسل melanogenesis نہیں۔

3.4 -MSH/IBMX- inducible melanogenesis پر سیرم کا اثر

مزید دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے پایا کہ -MSH/IBMX کے ذریعے میلانوجینیسیس کو شامل کرنے کے لیے PAK1 کے علاوہ 10 فیصد FBS (فیٹل بوائن سیرم) کی ضرورت ہوتی ہے۔ جیسا کہ شکل 4A میں دکھایا گیا ہے، سیرم سے پاک میڈیم میں، یا تو -MSH یا IBMX مشکل سے حوصلہ افزائی کرتا ہے۔melanogenesisڈبلیو ٹی سیلز میں، اگرچہ صرف 10 فیصد FBS (بغیر-MSH/IBMX) نےmelanogenesisنمایاں طور پر (تقریباً 60 فیصد)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ سیرم کی موجودگی یا غیر موجودگی میں ایس ایچ ٹرانسفیکٹنٹس (PAK1-کمی والے خلیات) میں میلانوجینیسیس وہی سطح تھی جو سیرم کی غیر موجودگی میں ڈبلیو ٹی سیلز میں تھی (شکل 4B دیکھیں)، یہ تجویز کرتا ہے کہ سیرم پر منحصر میلانوجینیسیس PAK1 کی بھی ضرورت ہے۔ اس تصور کی تائید میں، صرف سیرم ہی WT خلیوں میں PAK1 کی کناز سرگرمی کو نمایاں طور پر متحرک کرتا ہے، لیکن WT خلیوں میں PAK1 کی MSH پر منحصر ایکٹیویشن کے لیے سیرم کی ضرورت ہوتی ہے (شکل 4C دیکھیں)۔

میلانوجینک سیرم فیکٹر کی کیمیائی نوعیت کے بارے میں جو اکیلے PAK1 کو چالو کرتا ہے، ہم قیاس کرتے ہیں کہ یہ PDGF (پلیٹلیٹ سے ماخوذ نمو کا عنصر) مندرجہ ذیل وجوہات کی بناء پر ہے: (i) ایک دہائی سے زیادہ پہلے ہم نے دکھایا ہے کہ PDGF واحد ترقی کا عنصر ہے۔ سیرم جو PDGF ریسیپٹر (13,14) کے ذریعے EGF (ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر) ریسیپٹر کے ٹرانس ایکٹیویشن کے ذریعے PAK1 کو چالو کرتا ہے، اور حال ہی میں دوسروں نے ثابت کیا ہے کہ PDGF یا EGF اکیلے ہی واقعی میں تحریک پیدا کرتا ہے۔melanogenesisمیلانوسائٹس (15,16) کی

3.5 سیرم/PDGF پر منحصر میلانوجینیسس کو EGF ریسیپٹر کی ضرورت ہوتی ہے۔

اس میلانوجینک سیرم فیکٹر کی مخصوص کیمیائی نوعیت کی نشاندہی کرنے کی کوشش میں، ہم نے سیرم پر منحصر AG1295 (PDGF ریسیپٹر کے لیے مخصوص inhibitor) یا AG1478 (EGF ریسیپٹر کے لیے مخصوص inhibitor) کے اثر کا تجربہ کیا ہے۔melanogenesismelanocytes میں. جیسا کہ شکل 5 میں دکھایا گیا ہے، یا تو 2 µM AG1295 یا 400 nM AG1478 نے سیرم پر انحصار کو سختی سے کم کیا۔melanogenesisبنیادی (سیرم فری) میلانوجینیسیس کے برابر کی سطح تک۔ چونکہ سیرم میں PDGF وافر مقدار میں موجود ہے، لیکن EGF نہیں ہے اور AG1295 EGF ریسیپٹر کو نہیں روکتا، جبکہ AG1478 PDGF ریسیپٹر (13) کو نہیں روکتا، اس بات کا زیادہ امکان ہے کہ سیرم میں PDGF اپنے ریسیپٹر کو چالو کرتا ہے جو بدلے میں EGF ریسیپٹر کو متحرک کرتا ہے۔ آخر کار PAK1 کو چالو کرتا ہے جو سیرم پر منحصر میلانوجینیسیس کے لیے ضروری ہے (تفصیل کے لیے، شکل 6 دیکھیں)۔ اس مفروضے کی بنیاد پر، ہم بعد میں PAK1 کو چالو کرنے کے لیے -MSH اور سیرم/PDGF کے درمیان ظاہری ہم آہنگی کے زیرِ اثر سب سے زیادہ امکانی طریقہ کار پر تبادلہ خیال کریں گے، جو مضبوط میلانوجینیسیس کا باعث بنتا ہے۔

آخر میں، یہ بتانے کے قابل ہونا چاہئے کہ -MSH کے بغیر "بیسل" میلانین مواد کو PAK1 کے زیادہ اظہار شدہ CA (آئینی طور پر فعال) اتپریورتی T423E اتپریورتن کے ذریعہ نمایاں طور پر تبدیل نہیں کیا گیا تھا (شکل 3، لین 5 کا بائیں پینل دیکھیں) اگر یہ یا تو DN (غالب منفی) یا غیر فعال اتپریورتی تھا۔ درحقیقت، -MSH نے Thr 423 پر WT PAK1 کے فاسفوریلیشن کو بالکل نہیں دلایا (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔ اس طرح، یہ نتیجہ اخذ کیا جا سکتا ہے کہ Thr 423 پر PAK1 کے آٹو فاسفوریلیشن کا PAK1 کے MSH-حوصلہ افزائی سے کوئی تعلق نہیں ہے، جو مضبوطی کی طرف جاتا ہے۔melanogenesisمیلانوما کے خلیات میں. چونکہ PAK1 کا T423E اتپریورتی انتہائی آنکوجینک (6) کے طور پر جانا جاتا ہے، شاید Thr 423 میں آٹو فاسفوریلیشن "میلانوجینک" سے "آنکوجینک" سگنلنگ میں تبدیل ہو سکتا ہے۔

4. بحث

melanocyte/melanoma خلیات میں PAK1- منحصر اور PAK4- دونوں پر منحصر میلانوجینیسس پر ہمارے مشاہدے سے، دو ممکنہ طور پر دلچسپ مسائل پیدا ہوتے ہیں جن کی نشاندہی کی جائے: (i) PAK1 کی "مخصوص" میلانوجینک سرگرمی ( صرف منٹی اظہار) میلانوما خلیوں میں PAK4 (انتہائی اظہار شدہ) سے کہیں زیادہ ہونا چاہئے۔ (ii) ایسا معلوم ہوتا ہے کہ PAK1 بنیادی طور پر سیرم کی حوصلہ افزائی میلانوجینیسیس کے لیے ذمہ دار ہے، جبکہ PAK4 بنیادی طور پر اندرونی (بیسل) کے لیے ذمہ دار ہے۔melanogenesis. دوسرے لفظوں میں، اگرچہ PAK4-کی کمی چوہوں میں برانن طور پر مہلک ہے، جبکہ PAK1-کی کمی صرف "البینو" چوہوں کو پیدا کرنے میں ناکام رہتی ہے، اصل جلد کے رنگ میں واضح فرق (بنیادیmelanogenesisمثال کے طور پر سیاہ فام اور سفید فام لوگوں کے درمیان کم از کم جزوی طور پر PAK4 کے اظہار کی سطح میں فرق کے ساتھ ساتھ میلانوجینک کی سطح میں فرق کی عکاسی ہو سکتی ہے۔ٹائروسینیزs.

Vivo میں، HRM-2 (پگمنٹڈ لیکن بغیر بالوں والے) چوہوں کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے حال ہی میں دکھایا ہے کہ ایک کریم جس میں 10 μM PF3758309 (PAK1/PAK4- inhibitor) ہوتا ہے ان کی جلد میں UV سے متاثرہ میلانوجینیسیس کو کم کرتا ہے۔ بنیادی سطح، اگرچہ یہ ابھی بھی واضح ہونا باقی ہے کہ آیا PAK4 یا PAK1 میلانوجینیسیس (8) کے یووی انڈکشن کے لیے ذمہ دار ہے۔ چونکہ PAK1 inducible کے لیے ذمہ دار ہے، لیکن بنیادی، melanogenesis کے لیے نہیں، اس لیے یہ جانچ کے قابل ہو گا کہ PAK1 نمایاں طور پر UV-inducible میں حصہ ڈالتا ہے۔melanogenesis(سن ٹیننگ) کے ساتھ ساتھ، سیاہ بالوں اور آنکھوں والے چوہوں کے C57B16 تناؤ سے ماخوذ نایاب PAK1 KO (ناک آؤٹ) اتپریورتی کا استعمال کرتے ہوئے (Hong He et al.، غیر مطبوعہ مشاہدہ)، یہ سمجھنے کی کوشش میں کہ آیا مختلف قسم کی جڑی بوٹیوں کی PAK1 کاسمیٹکس میں بلاکرز سن اسکریننگ ایجنٹوں کے لیے مفید ہیں یا نہیں۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ PAK1 کو UV شعاع ریزی اور دیگر ڈی این اے کو نقصان پہنچانے والے ایجنٹوں (17) کے ذریعہ چالو ہونے کی اطلاع ملی ہے۔

یہ دکھایا گیا ہے کہ -MSH Tyr kinase JAK2 (18) کو چالو کرتا ہے، جس کے نتیجے میں PAK1 کو Tyr 285 پر فاسفوریلیشن (Thr 423 کی بجائے) چالو کرتا ہے، جس سے PIX-PAK1 تعامل (19) ہوتا ہے۔ یہ اس بات کی وضاحت کر سکتا ہے کہ PAK1 کی -MSH- منحصر ایکٹیویشن کیوں نہیں ہے اور نہ ہی میلانوجینیسیس Thr 423 پر PAK1 کی آٹو فاسفوریلیشن شامل ہے۔ اس طرح، ہم نے حال ہی میں تحقیق کی ہے کہ آیا PAK1-منحصر میلانوجینیسیس کو ایک طاقتور جڑی بوٹیوں والے JAK کے ذریعے بلاک کیا گیا ہے2- کڑوے خربوزے (گویا) سے cucurbitacin I (CBI) کو روکنے والا جو براہ راست JAK2 (20) کو روکتا ہے، اور پتہ چلا کہ CBI روکتا ہے۔melanogenesisمیلانوجینک ہارمونز کی موجودگی میں 70 فیصد سے زیادہ، یہ امکان ظاہر کرتا ہے کہ سی بی آئی نہ صرف PAK1 بلکہ PAK4 (5) کو بھی روکتی ہے۔ اس تناظر میں، یہ نوٹ کرنا بہت دلچسپی کا باعث ہوگا کہ ہربل PAK1-بلاکرز جیسے کہ CAPE، curcumin، shikonin، اور FTY 720 صرف ماؤس یا انسانی جلد کے خلیوں میں -MSH کی حوصلہ افزائی میلانوجینیسیس کو روک سکتے ہیں۔ 50 فیصد یہاں تک کہ ان کے ارتکاز میں جہاں PAK1 تقریباً مکمل طور پر مسدود ہے (1,2)، جبکہ مصنوعی پین-PAK-بلاک PF3758309، PAK1 اور PAK4 دونوں کو روکتا ہے، کو ختم کر دیتا ہے۔melanogenesisجلد کے خلیوں میں 300 nM (8) پر تقریباً 90 فیصد۔ دوسرے لفظوں میں، میلانوسائٹس میں -MSH-حوصلہ افزائی میلانوجینک نظام PAK1-مخصوص بلاکرز کو پین PAK-بلاکرز سے ممتاز کر سکتا ہے۔ ابھی تک ہربل PAK4-مخصوص بلاکرز (PAK4-مخصوص siRNAs کے علاوہ) کی شناخت نہیں کی گئی ہے۔ تاہم، ایمیزون کے جنگلوں میں اگائے جانے والے ایک کڑوے درخت سے ماخوذ گلوکاروبینون نامی ایک بہت ہی طاقتور کواسینائڈ حال ہی میں PAK1 اور PAK4 دونوں کو روکتا ہوا دکھایا گیا ہے، جو وٹرو اور ویوو (21) دونوں میں لبلبے کے کینسر کے خلیوں کی نشوونما کو روکتا ہے۔ اس طرح، یہ جانچنا بہت دلچسپی کا باعث ہوگا کہ آیا یہ ہربل PAK-blocker PF3758309 کی طرح جلد کے خلیات کے میلانوجینیسس کو تقریباً مکمل طور پر دبا دیتا ہے۔

اس مطالعے کا بڑا مقصد PAK1 کے مخصوص میلانوجینک کردار پر توجہ مرکوز کرنا تھا، اور اس کی تفصیل سے تفتیش نہیں کرنا تھا کہ PAK1 میلانوجینک انزائمز اور MTFs سمیت میلانوجینک سگنلنگ پاتھ وے کو کیسے چالو کرتا ہے۔ تاہم، یہ سب سے زیادہ امکان ہے کہ PAK1 Ser 675 پر فاسفوریلیٹنگ کے ذریعے براہ راست بیٹا کیٹنین کو چالو کرتا ہے، جس سے MITF کو چالو کیا جاتا ہے جو کہ میلانوجینک انزائمز کے لیے جین انکوڈنگ کے اظہار کے لیے ضروری ہے۔ٹائروسینیز(ٹائر)۔

حال ہی میں ہم نے پایا کہ PAK4 (CDC42- منحصر کناز 4) بھی اس میں ملوث ہےmelanogenesisایک ہی میلانوما سیل لائن کے دو ٹرانسکرپشن عوامل، CREB اور بیٹا کیٹنین کو چالو کر کے، یہ دونوں MIFT ایکٹیویشن کے لیے ضروری ہیں (8)۔ چونکہ CREB کو LIM kinase (22,23) کے ذریعے فعال کرنے کے لیے جانا جاتا ہے جو کہ بیٹا-کیٹنین کی طرح PAK1 اور PAK4 (6,18) دونوں کے مشترکہ براہ راست ذیلی ذخائر میں سے ہے، اس لیے زیادہ امکان ہے کہ PAK1 اور PAK4 ایک ہی CREB کا اشتراک کرتے ہیں۔ /beta-catenin-MITF سگنلنگ راستے میلانوجینک انزائم جینز کو چالو کرنے کے لیے۔

تاہم، PAK1 کے -MSH/IBMX پر منحصر ایکٹیویشن کی طرف جانے والے تفصیلی سگنل کے راستے PAK4 کو چالو کرنے والوں سے نمایاں طور پر مختلف ہو سکتے ہیں، بنیادی طور پر اس وجہ سے کہ سابق میں سیرم فیکٹر (PDGF) شامل ہوتا ہے۔ اکیلا سیرم ہی PAK1 (13) کو چالو کرنے کی صلاحیت رکھتا ہے اور PAK1 کی -MSH/IBMX پر منحصر ایکٹیویشن کو بھی بڑھاتا ہے۔ دوسرے لفظوں میں، PAK1 ایکٹیویشن اور دونوں میں سیرم اور ان میلانوجینک ہارمونز کے درمیان واضح ہم آہنگی ہے۔melanogenesis.

ذیل میں ہمارا کام کرنے والا مفروضہ ہے کہ یہ ہم آہنگی کیسے ہو سکتی ہے۔ PAK1 ایکٹیویشن کی طرف لے جانے والا اہم سگنلنگ راستہ oncogenic EGFR (ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر ریسیپٹر) -RAS-PI 3 kinase-RAC/CDC42-PAK1 جھرن ہے۔ تاہم، مکمل ایکٹیویشن کے لیے اکیلے یہ جھرنا کافی نہیں ہے۔ اسے PIX نامی ایک اور عنصر کی ضرورت ہے، ایک SH3 اڈاپٹر پروٹین جو PAK18 کہلانے والے 18 امینو ایسڈز کے اپنے پرو امیر شکل کے ذریعے براہ راست PAK1 کو جوڑتا ہے۔ PIX-PAK1 کے تعامل کو ایک تیسرے پروٹین کی ضرورت ہوتی ہے جسے JAK2 کہا جاتا ہے، ایک Tyr-kinase، جو PAK1 کو Tyr 285 پر فاسفوریلیٹ کرتا ہے۔ RAS پرولیکٹن کے ذریعے JAK2 کو ریگولیٹ کرتا ہے۔ ہمارے اور دوسروں (13-16) کی چند پچھلی دریافتوں کے مطابق، PDGF (پلیٹلیٹ سے ماخوذ نمو کا عنصر) -MSH/IBMX-حوصلہ افزائی کے لیے ضروری میلانوجینک سیرم فیکٹر (فیکٹرز)melanogenesis، کیونکہ یہ اپنے ریسیپٹر (PDGFR) Tyr-kinase کو چالو کرتا ہے جو بدلے میں EGFR (ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر ریسیپٹر=ErbB1) Tyr-kinase کو متحرک کرتا ہے، جس کے نتیجے میں oncogenic RAS-PI3 kinase-RAC کے ذریعے PAK1 کو چالو کیا جاتا ہے۔ /CDC42 پاتھ وے (13)۔ اس طرح، اکیلے سیرم میں PDGF PAK1 کو چالو کر سکتا ہے اور آدھے راستے تک میلانوجینیسیس کو آمادہ کر سکتا ہے۔ تاہم، PAK1-منحصر میلانوجینیسس کی مکمل ایکٹیویشن کے لیے، -MSH/IBMX کو JAK2 کو ایک کیمپ پر منحصر راستے (جس میں PKA شامل ہو سکتا ہے) کے ذریعے فعال کرنے کی ضرورت ہے جو بالآخر PIX-PAK1 تعامل کو محفوظ بناتا ہے (تفصیل کے لیے، تصویر 6 دیکھیں)۔

آخر میں، ہم یہاں پہلا بائیو کیمیکل ثبوت پیش کرتے ہیں جو اس بات کی وضاحت کر سکتے ہیں کہ کس طرح کاسمیٹک کریموں میں مختلف قسم کے ہربل PAK{0}}بلاکرز جیسے CAPE، curcumin، اور shikonin "جلد کو سفید کرنا"اثرات۔ مزید ثبوت یا تصدیق کے لیے انسانی میلانوسائٹس کے ساتھ مشابہ مطالعات کا ایک سلسلہ منتظر ہے۔

maca ginseng cistanche

حوالہ جات

1. لی جے ایچ، جنگ جے وائی، پارک سی، کم بی ڈبلیو، چوئی وائی ایچ، چوئی بی ٹی۔ Curcumin B16F10 خلیوں میں الفا-میلانوسائٹ-حوصلہ افزائی ہارمون-حوصلہ افزائی میلانوجینیسیس کو دباتا ہے۔ انٹ جے مول میڈ۔ 2010; 26:101-106۔

2. لی جے وائی، چوئی ایچ جے، چنگ ٹی ڈبلیو، کم سی ایچ، جیونگ ایچ ایس، ہا کے ٹی۔ کیفیک ایسڈ فینیتھائل ایسٹر مائیکرو فیتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن عنصر کی ٹرانس ایکٹیویشن سرگرمی کو دبانے کے ذریعے الفا میلانوسائٹ محرک ہارمون کی حوصلہ افزائی میلانین ترکیب کو روکتا ہے۔ جے نیٹ پروڈکٹ۔ 2013; 76:1399-1405۔

3. Maruta H. جڑی بوٹیوں کے علاج جو oncogenic kinase PAK1 کو روکتے ہیں: PAK1-پر منحصر بیماریوں اور لمبی عمر کے لیے ایک عملی نقطہ نظر۔ Phytother Res. 2014; 28:656-672۔

4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Okinawa کے پودوں میں کئی جڑی بوٹیوں کے مرکبات oncogenic/aging kinase PAK1 کو براہ راست روکتے ہیں۔ ڈرگ ڈسکوو تھیر۔ 2014; 8:238-244۔

5. Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Combination of Immunoprecipitation (IP)-ATP_سییل کلچر میں طاقتور اور محفوظ PAK1-بلاکرز کی تشخیص کے لیے گلو کناز پرکھ اور میلانوجینیسیس . ڈرگ ڈسکوو تھیر۔ 2015; 9:289-295۔

6. He H، Maruta H. PAKs اور ان کے ذیلی ذخائر کی آنکوجنکٹی۔ میں: PAKs, RAC/CDC42 (p21)-ایکٹیویٹڈ کنیز: کینسر اور دیگر PAK پر منحصر بیماریوں کے علاج کی طرف (ماروتا ایچ، ایڈ۔) ایلسیویئر، آکسفورڈ، 2013؛ صفحہ 23-51۔

7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lessnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. -کیٹنین کی حوصلہ افزائی میلانوما کی نشوونما کے لیے نیچے کی دھارے کے ہدف مائیکرو فیتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن عنصر کی ضرورت ہوتی ہے۔ جے سیل بائیول۔ 2002; 158:1079-1087۔

8. یون سی وائی، یو ایس ٹی، کم جے ایچ، چنگ جے ایچ، ہان ایس بی، شن ای وائی، کم ای جی۔ p21-فعال کناز 4 CREB/MITF اور -catenin/MITF راستوں کو چالو کرنے کے ذریعے میلانوجینیسیس کو تنقیدی طور پر منظم کرتا ہے۔ جے انویسٹ ڈرمیٹول۔ 2015; 135:1385-1394۔

9. Huynh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P21-فعال کناز 1 بڑی آنت کے کینسر کے خلیوں کی نشوونما اور ERK- اور AKT پر منحصر راستوں کے ذریعے ہجرت/حملے کو متحرک کرتا ہے۔ بائیوکیم بایوفیس ایکٹا۔ 2010; 1803:1106-1113۔

10. Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti EC. کناز پرکھ تیار کرنے کے لئے چمکیلی ٹیکنالوجی کا استعمال: سی ڈی کے 4 بطور ماڈل سسٹم۔ جے فارم بائیو میڈ اینل۔ 2005; 39:811-814.11۔ Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. مشروم ٹائروسینیز کی سرگرمی اور ماؤس B16F10 میلانوما خلیوں میں میلانین کی تشکیل پر ایکلونیا کاوا سے الگ تھلگ فلوروٹاننز کا روک تھام کا اثر۔ جے ایگرک فوڈ کیم۔ 2009; 57:{10}}۔

12. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein ERK سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کرنے کے ذریعے میلانوجینیسس کو روکتا ہے۔ انٹ جے مول میڈ۔ 2010; 25:923-927۔

13. He H, Levitzki A, Zhu HJ, Walker F, Burgess A, Maruta H. پلیٹلیٹ سے ماخوذ گروتھ فیکٹر کے لیے ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر ریسیپٹر کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ p21-ایکٹیویٹڈ کناز فیملی کنیز کو چالو کیا جا سکے۔ جے بائیول کیم۔ 2001; 276:26741-26744۔

14. Saito Y، Haendeler J، Hojo Y، Yamamoto K، Berk BC. ریسیپٹر ہیٹرو-ڈائمرائزیشن: پلیٹلیٹ سے ماخوذ گروتھ فیکٹر سے متاثر ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر ریسیپٹر ٹرانس ایکٹیویشن کے لیے ضروری طریقہ کار۔ مول سیل بائیول۔ 2001; 21:6387-6394۔

15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. پلیٹلیٹ سے ماخوذ نمو کا عنصر انسانی میلانوسائٹس کے پھیلاؤ اور تفریق کو مختلف مرحلے کے مخصوص انداز میں منظم کرتا ہے۔ جے ڈرمیٹول سائنس۔ 2016; 83:200-209۔

16. Garcez RC، Teixeira BL، Schmitt Sdos S، Alvarez-Silva M، Trentin AG. ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر (ای جی ایف) نیورل کرسٹ سیلز کے نیوران اور میلانوسائٹس میں وٹرو تفریق کو فروغ دیتا ہے۔ سیل مول نیوروبیول۔ 2009; 29:1087-1091۔

17. Roig J، Traugh JA. p21-چالو پروٹین کناز گاما PAK آئنائزنگ ریڈی ایشن اور دیگر ڈی این اے کو نقصان پہنچانے والے ایجنٹوں کے ذریعے چالو کیا جاتا ہے۔ الفا PAK سے مماثلت اور اختلافات۔ جے بائیول کیم۔ 1999; 274:31119-31122۔

18. بگی جے جے۔ B-lymphocytes پر الفا-میلانوسائٹ-حوصلہ افزائی ہارمون کو اس کے G-پروٹین-کپلڈ ریسیپٹر سے منسلک کرنا Jak/STAT راستے کو متحرک کرتا ہے۔ بائیو کیم جے 1998; 331:211-216۔

19. Hammer A، Oladimeji P، De Las Casas LE، Diakonova M. PAK1 کے ٹائروسین 285 کا فاسفوریلیشن PIX/GIT1 بائنڈنگ اور آسنجن ٹرن اوور کی سہولت فراہم کرتا ہے۔ FASEB J. 2015; 29:943-959۔

20. Blaskovich MA، Sun J، Cantor A، Turkson J، Jove R، Sebti SM. JSI-124 (cucurbitacin I) کی دریافت، ایک منتخب جینس کناز/سگنل ٹرانسڈیوسر اور ٹرانسکرپشن 3 سگنلنگ پاتھ وے انحیبیٹر کا ایکٹیویٹر جس میں چوہوں میں انسانی اور مورین کینسر کے خلیات کے خلاف طاقتور اینٹی ٹیومر سرگرمی ہوتی ہے۔ کینسر ریس 2003; 63:1270-1279۔

21. Yeo D, Huynh N, Beutler JA, Christophi C, Shulkes A, Baldwin GS, Nikfarjam M, He H. Glaucarubinone اور gemcitabine synergistically p21-activated kinases کے ڈاؤن ریگولیشن کے ذریعے لبلبے کے کینسر کی نشوونما کو کم کرتے ہیں۔ کینسر لیٹ. 2014; 346:264-272۔

22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. PAK4 serine/threonine kinase کے ذریعے منظم کردہ Cytoskeletal تبدیلیاں LIM kinase 1 اور cofilin کے ذریعے ثالثی کی جاتی ہیں۔ جے بائیول کیم۔ 2001; 276:32115-32121۔

23. یانگ ای جے، یون جے ایچ، من ڈی ایس، چنگ کے سی۔ LIM kinase 1 لافانی ہپپوکیمپل پروجینیٹر خلیوں کے نیورونل تفریق کے دوران CAMP- جوابی عنصر بائنڈنگ پروٹین کو چالو کرتا ہے۔ جے بائیول کیم۔ 2004; 279:8903-8910۔