طبی لحاظ سے متعلقہ بکواس اتپریورتن (حصہ 2)

مزید معلومات کے لیے plz رابطہ کریں۔david.wan@wecistanche.com

3۔{1}} بحث

ڈی ڈی آر پاتھ وے میں ثانوی ہٹ کے اضافے کے ذریعے جینٹوکسک تناؤ کو بڑھا کر، ہم نے ایک نیا ماؤس ماڈل تیار کیا جو آج تک کے کسی بھی ماڈل کے AT علامات کا سب سے جامع سیٹ دکھاتا ہے۔ اس میں سیریبلر ایٹروفی سے وابستہ شدید اور ترقی پسند ایٹیکسیا اور PN خصوصیات کی خرابی کے ساتھ کینسر کے زیادہ واقعات اور مدافعتی خلیوں کی نشوونما میں نقائص شامل ہیں۔ ایک ساتھ، یہ comorbidities قبل از وقت موت کی تین اہم وجوہات کو گھیرے ہوئے ہیں۔AT - ہر ایک حصہ ڈالنے والاتقریباً ایک تہائی اموات۔ ان میں سے، ایٹیکسیا کا ناکارہ اثر سب سے زیادہ اثر انگیز ہے اور مریضوں اور دیکھ بھال کرنے والوں کے ذریعہ ان کے معیار زندگی پر سب سے زیادہ اثر کے طور پر رپورٹ کیا جاتا ہے۔ اس وجہ سے، اس نئے ماؤس ماڈل میں ایٹیکسیا اور سیریبلر ایٹروفی کی موجودگی بہت اہمیت کی حامل ہے، کیونکہ یہ پہلی بار نہ صرف اعصابی خرابی کے طریقہ کار کو واضح کرنے کے لیے ایک وسیلہ فراہم کرتا ہے، بلکہ ویوو ماڈل میں اس کی شدید ضرورت بھی ہے۔ ٹیسٹ کی سخت ضرورت ہے AT علاج، جیسے پڑھنے کے ذریعے مرکبات جو ہم یہاں بیان کرتے ہیں۔ ہمیں Atm3535 میں ایٹیکسیا کی مجموعی ترقی کے درمیان کئی مماثلتیں ملیں۔ Aptx چوہوں اوراے ٹی کے مریض. کلینیکل اے ٹی میں، موٹر کی کمی تقریباً 2 سال کی عمر تک دیکھی جا سکتی ہے، جب والدین اور ڈاکٹروں کو چھوٹا بچہ سے ہموار، اضطراری طور پر مربوط گیٹ کی طرف منتقلی کی کم صلاحیت کا پتہ چلتا ہے — بدقسمتی سے، بیماریوں کی وجہ سے ابتدائی مراحل میں موٹر کے نقائص کے بارے میں بہت کم معلوم ہے۔ کم پھیلاؤ اور ابتدائی تشخیصی جانچ کی موجودہ کمی (Rothblum-Oviatt et al. 2016)۔ مریض عام طور پر مدد کے بغیر چلنا سیکھتے ہیں اور اعصابی علامات زندگی کے پہلے 4 سے 5 سال تک مستحکم رہتی ہیں (Rothblum-Oviatt et al. 2016)۔ ہمیں Atm735×R3x میں موٹر خسارے کی اسی طرح کی ابتدائی ترقی ملی۔ Aptx^' چوہوں، P8 پر ابتدائی ہلکے موٹر خسارے کا پتہ لگانا (رائٹنگ اضطراری خسارہ) جس کے بعد نسبتا استحکام کی مدت ہوتی ہے، p210 کے بعد ترقی پسند اور شدید ایٹیکسیا کے شروع ہونے سے پہلے جس میں چال، چونکا دینے والے اضطراری، تھرتھراہٹ، اور لوکوموٹر میں تبدیلیاں شامل تھیں۔ سرگرمی ان نتائج سے کئی اہم سوالات پیدا ہوتے ہیں، بشمول اے ٹی ایم اور/یا اے پی ٹی ایکس کا اعصابی ترقی میں کوئی کردار ہے یا نہیں۔

سیریبیلم عارضے کے ابتدائی مرحلے پر مرکوز مستقبل کے مطالعے اس بات کو سمجھنے میں اہم ہوں گے کہ کیا سیریبیلم غیر فعال ہونے سے پہلے عام طور پر نشوونما پاتا ہے یا ترقیاتی نقائص ابتدائی وجہ ہیں۔ ہم نے یہ بھی پایا، AT کے مریضوں کی طرح، کہ دیر سے ترقی پذیر ایٹیکسیا کی شدت متغیر تھی، کچھ چوہے اناڑی، اونچے قدموں والے پیچھے والے دروازے (ویڈیو 3) کے ساتھ حرکت کرتے ہیں اور دوسرے تقریباً مکمل طور پر عقبی تنے کی ٹوٹ پھوٹ کے ذریعے حرکت کرتے ہیں۔ تصویر 1E اور ویڈیو 4)(Rothblum-Oviatt et al.2016؛ Levy and Lang 2018؛ Boder and Sedgwick 1958)۔ مجموعی طور پر، ہم نے پایا کہ Atm?35×xR35×; Aptx کے چوہوں نے موٹر کوآرڈینیشن میں بصری طور پر گہرا اور قابل پیمائش ترقی پسند نقصان پیدا کیا جیسا کہ AT مریضوں میں دیکھا گیا تھا، جسے Atm یا Aptx get he کی کم از کم ایک کاپی کے اظہار سے بچایا گیا تھا۔ اے ٹی میں موٹر کوآرڈینیشن کے نقصان کو دماغ میں نسبتاً منتخب نیوروپیتھولوجی کی وجہ سے سیریبلر انحطاط سے منسوب کیا گیا ہے اور ایٹیکسیا کی کئی مختلف شکلوں میں اس کے کارگر کردار (Hoche et al.2012)۔ کے ساتھ مطابقتاے ٹی مریضنیورو امیجنگ اسٹڈیز (Wallis et al.2007; Sahama et al. 2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al. 2013), ہمیں پتہ چلتا ہے کہ cerebellar سائز Atm735 × R× میں ہے ; Aptx کے چوہے شروع میں نارمل ہوتے ہیں، لیکن اعصابی فعل میں تبدیلی کے ساتھ ساتھ آہستہ آہستہ atrophies۔ اگرچہ سیریبلر ٹشو کے نقصان کو انسانوں میں ایٹیکسیا کی ایک اہم وجہ سمجھا جاتا ہے، لیکن طبی اعداد و شمار سے یہ واضح نہیں ہے کہ آیا پوسٹ مارٹم میں پائے جانے والے سیریبلر انحطاط کی حد کا ایٹیکسیا کی شدت ایک اچھی پیش گو ہے (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al., 2006 : Dineen et al.2020)۔ اے ٹی ایم میں؟35×R35×; Aptx^ چوہوں، ہمیں Purkinje neuron dendrite تہہ کے پتلے ہونے سے وابستہ واضح ایٹروفی ملتی ہے جو دیر سے، شدید طرز عمل کے خسارے سے پہلے ہوتی ہے۔ اے ٹی ایم میں ہمارے ہسٹولوجیکل مشاہدات 35xR35×; Aptx'mice تجویز کرتے ہیں کہ سیریبلر سیلز کے گہرے نقصان کے بجائے خود سیریبلر فنکشن میں تبدیلیاں، ایٹیکسک فینوٹائپ کا سبب بننے کے لیے کافی ہیں، جو کہ متعدد SCAs میں PN کے اہم نقصان سے قبل رویے کے نقائص کے مشاہدے کے مطابق ہیں (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti et al. 2000؛ Clark et al. 1997؛ Jayabal et al. 2016)۔ اے ٹی ایم اور اے پی ٹی ایکس کی کمی کی وجہ سے چوہوں میں ایٹیکسیا پیدا کرنے کی ضرورت کیوں ہے جب کہ ان میں سے کسی ایک کا نقصان انسانوں میں ایٹیکسیا پیدا کرنے کے لیے کافی ہے۔ ایک امکان یہ ہے کہ چوہا دماغ ہر روز خلیوں کو متاثر کرنے والے 10-20k DNA گھاووں کا جواب دیتے ہوئے معاوضہ کے راستوں یا بے کار پروٹین کو زیادہ لچکدار طریقے سے استعمال کر سکتا ہے (Lindahl and Barnes 2000)۔ ممکنہ طور پر اس چیلنج کو پورا کرنے کے لیے ڈی این اے کی مرمت کی کئی شکلیں موجود ہیں، بشمول بیس ایکسائز ریپیر (BER)، نیوکلیوٹائڈ ایکسائز ریپیر (NER)،

Cistanche کے بارے میں مزید جاننے کے لیے یہاں کلک کریں۔

نیز ہم جنس اور غیر ہم جنس اختتامی شمولیت (HEJ اور NHEJبالترتیب)، جن میں سے تمام ATM اور APTX کو ملوث کیا گیا ہے (Chou et al.2015; Caglayan et al. 2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee and Walker 2017) متبادل طور پر، یہ ہو سکتا ہے ایسی صورت میں کہ صرف ATM یا APTX میں کمی ماؤس کی نسبتاً مختصر عمر کے دوران سیل کی صحت کو مناسب طور پر متاثر نہیں کرتی ہے، اور اس طرح دونوں پروٹینوں کو ختم کرنا ضروری ہے تاکہ اس وقت کے دوران ظاہر ہونے والے DNA کے نقصان کو کافی حد تک جمع کیا جا سکے۔ اس امکان کو اس حقیقت سے تقویت ملتی ہے کہ اے ٹی ایم اور اے پی ٹی ایکس ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کے ردعمل میں الگ الگ حیاتیاتی کیمیائی خصوصیات اور فعال کردار رکھتے ہیں، اور اس وجہ سے دونوں میں کمی کی پیش گوئی کی جائے گی کہ وہ جینوم کے استحکام (یعنی جینٹوکسک تناؤ میں اضافہ) کو وسیع پیمانے پر متاثر کرے گا۔ ہماری یہ دریافت کہ چوہوں میں اعصابی نقائص پیدا کرنے کے لیے دو جینوم اسٹیبلٹی پاتھ وے پروٹین کی ضرورت ہوتی ہے سختی سے پتہ چلتا ہے کہ یہ ڈی این اے کی مرمت میں اے ٹی ایم کے اوریول کا نقصان ہے، بجائے اس کے کہ آکسیڈیٹیو اسٹریس سگنلنگ، مائٹوفجی، یا مائٹوکونڈریل فنکشن میں ممکنہ افعال جو سیریبلر نقائص کا سبب بنتے ہیں۔ شیلوہ 2020)۔ تاہم، متبادلات کو مکمل طور پر مسترد نہیں کیا جا سکتا، کیونکہ APTX، جیسے ATM، دماغی خلیات کے مائٹوکونڈریا کے اندر دیکھا گیا ہے، جہاں یہ خیال کیا جاتا ہے کہ وہ مائٹوکونڈریل ڈی این اے کی پروسیسنگ میں معاونت کرتا ہے (Meagher and Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011)۔ یہ نیا ماؤس ماڈل ان امکانات کو تلاش کرنے اور میکانکی طور پر اس بات کی وضاحت کرنے کے لیے ایک نیا ٹول فراہم کرتا ہے کہ کس طرح ATM اور APTX کا نقصان بالآخر سیریبلر ڈیسفکشن کا سبب بنتا ہے۔ AtmR35XR35X سے ریکارڈ شدہ PNs میں مشاہدہ کی گئی بائیو فزیکل ہنگامہ آرائی؛ Aptx چوہے اسی طرح ایٹیکسیا کے کئی دوسرے ماؤس ماڈلز میں پائے جاتے ہیں۔ اس میں وہ تبدیلیاں شامل ہیں جو ہم نے PN ان پٹ مزاحمت، جھلی کی گنجائش، اور AP کی حد اور چوڑائی میں دیکھی ہیں، جنہیں SCA کے ماؤس ماڈل جیسے 1، 3، اور 7 میں بھی بیان کیا گیا ہے (Stoyas et al.2020؛ Shakkottai et al.2011؛ ​​Dell 'Orco et al.2015)۔ مزید برآں، PN ایکشن ممکنہ فائرنگ کی فریکوئنسی میں ترقی پسند کمی جو ہم نے مثبت طور پر رپورٹ کی ہے وہ AtrnR35XR35X میں ایٹیکسیا کی نشوونما سے منسلک ہے۔ Aptx'mice کی اطلاع بڑی تعداد میں ایٹیکسک ماؤس ماڈلز میں دی گئی ہے، بشمول SCAs 1, 2, 3,5, 6, اور 13 کے ساتھ ساتھ چند ایپیسوڈک شکلیں (جائزہ دیکھیں (Cook, Fields, and Watt 2021))۔ واضح سیلولر نقائص کی وجہ سے ہونے والے بہت سے مختلف ایٹیکسیا میں مشاہدہ کردہ PN perturbations میں نمایاں اوورلیپ کو دیکھتے ہوئے، PN AP فائرنگ کی تعدد کو بحال کرنا ایک وسیع البنیاد علاج کے طریقہ کار کے طور پر سمجھا جاتا ہے۔ تاہم، یہ ابھی تک واضح نہیں ہے کہ آیا PN فائرنگ کا کم ہونا ایٹیکسیا کا ایک سبب ہے۔ مزید برآں، تجرباتی شواہد سے پتہ چلتا ہے کہ PN سرگرمی میں تبدیلیاں درحقیقت PN فزیالوجی (Dell'Orco et al.2015) کی جاری بیماری سے متعلق خرابی کے دوران ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے کے لیے ایک عمومی ردعمل ہو سکتی ہے۔ اس طرح، تمام سیریبلر ایٹیکسیا میں مسلسل کوششوں کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ بیماری کی وجہ سے پیدا ہونے والی جینیاتی، سالماتی اور سیلولر رکاوٹوں کو سیریبلر نیورل سگنلنگ میں مخصوص تبدیلیوں سے جوڑنے کے لیے جو بالآخر ایٹیکسیا کو جنم دیتے ہیں۔ اس کوشش میں اہم اہمیت کا تعین کرنا ہوگا کہ آیا بیماری پیدا کرنے والے سیریبلر نقائص عام طور پر یا فرق سے سیریبلر فنکشن (مثلاً نقل و حرکت کے دوران کوآرڈینیٹنگ سگنلز کا نقصان) کے نقصان کے ذریعے ایٹیکسیا کا سبب بنتے ہیں یا غالب-منفی اثر (مثلاً، نیچے کی دھارے میں خلل ڈالنا) غیر معمولی عصبی آؤٹ پٹ پیٹرن کے ساتھ سرکٹس)۔ بالآخر، جب کہ سیریبلر ایٹیکسیاس کو دور کرنے کے لیے ایک عام علاج کی حکمت عملی کا سب سے زیادہ اثر پڑے گا، ایک ہدایت شدہ نقطہ نظر جو کہ سیلولر dysfunction کی الگ الگ جینیاتی اور سالماتی وجوہات کو حل کرتا ہے، بالآخر ایک مؤثر علاج کو کامیابی کے ساتھ تیار کرنے کے لیے ضروری ہو سکتا ہے۔ ATM اور APTX اور PN dysfunction جیسے استحکام پروٹین واضح نہیں ہے۔ ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ PNs پر ATM اور APTX کے نقصان کا اثر اندرونی ہے، کیونکہ ہمیں گرینول سیلز کی presynaptic خصوصیات میں تبدیلی یا ان کے سیلولر نقصان (GCL موٹائی میں کوئی تبدیلی) کا ثبوت نہیں ملتا ہے۔ مزید برآں، جب کہ ہم نے ATM- اور APTX کی کمی والے PNs اور وائلڈ ٹائپ میں کمتر زیتون کے ان پٹ کی قلیل مدتی پلاسٹکٹی میں فرق دیکھا، یہ نتائج ممکنہ طور پر Inositol 1,4،5- میں کمی کے ذریعے Ca2* ہومیوسٹاسس میں رکاوٹ کی طرف اشارہ کرتے ہیں۔ ٹرائی فاسفیٹ ریسیپٹر 1(ltpr1) اظہار، جیسا کہ SCAs 1,2 اور 3 ماؤس ماڈلز کے ساتھ ساتھ ATM کی کمی والے چوہوں (Kim et al.2020; Chen et al.2008; Demirci et al.2009; Shakkottai et al. al.2011)۔ اگرچہ یہ مستقبل کے امتحان اور موازنہ کے لیے ایک امید افزا راستہ فراہم کرتا ہے، لیکن یہ ابھی تک واضح نہیں ہے، یہاں تک کہ SCAs کے لیے، چاہے Ca²* ہومیوسٹاسس میں تبدیلیاں، سبب کا عنصر ہے یا صرف ایک اور علامت ہے یا بیمار یا پریشان PNs ​​(Dell) کا معاوضہ ردعمل ہے۔ 'Orco et al.2015)۔ مدافعتی نظام میں، اے ٹی ایم ڈی این اے بریکس کی مرمت میں ملوث ہے جو قدرتی طور پر B-اور T-سیل کے پیشگیوں میں اینٹیجن ریسیپٹر جینز کے جین کی دوبارہ ترتیب کے دوران ہوتا ہے، ان خلیوں کے اینٹیجن ریسیپٹر (LG اور TCR) کے تنوع کے لیے ایک اہم واقعہ۔ اسے تلاش کرناٹی سیلخون میں تناسب نمایاں طور پر کم ہو جانا انسانوں اور AT ناک آؤٹ چوہوں میں پہلے کے مطالعے کے مطابق ہے (Schubert, Reichenbach, and Zielen 2002; Hathcock et al.2013; Chao, Yang, and Xu 2000; Barlow et al.1996)۔ دائرہ میں ٹی سیلز کی یہ کمی ممکنہ طور پر سیلولر اور مزاحیہ استثنیٰ دونوں میں خرابی سے منسلک ہے۔ اہم بات یہ ہے کہ ہم نے پایا کہ ATM جین کی ایک کاپی کا اظہار خون میں CD4 پلس خسارے کو بحال کرنے کے لیے کافی ہے جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ ATM کے جزوی اظہار کو بحال کرنے کے قابل علاج معالجے کی افادیت رکھتے ہیں۔ اگرچہ ہم نے اس مقالے میں بی سیل کی ترقی کا اندازہ نہیں لگایا ہے، لیکن امکان ہے کہ میکانکی مماثلت کے پیش نظر اسی طرح کے نتائج اس عمل پر لاگو ہوں گے (Marshall et al. 2018)۔ جیسا کہ توقع کی گئی ہے، پردیی خون میں ٹی سیلز کی کمی کا تعلق تھاموسائٹ کی خرابی سے ہے۔ تھیمس میں، ہم نے دو اہم نقائص پائے۔ ایک، بنیادی طور پر APTX کی کمی کی وجہ سے، DN3 سے DN4 منتقلی میں ایک نقص کے طور پر ظاہر ہوتا ہے جو TCR لوکس کی جلد از سر نو ترتیب کے ساتھ ملتا ہے۔ دوسری خرابی، بنیادی طور پر اے ٹی ایم کی کمی کی وجہ سے، ڈبل پازیٹو CD4*CD8 کی سنگل پازیٹو سیلز، بنیادی طور پر CD4' thymocytes سے بڑھنے میں کمی سے تعلق رکھتی ہے۔ اگرچہ APTX کی تلاش حیران کن تھی، کیونکہ اس کی کمی (AOA 1) کا تعلق مدافعتی خسارے سے نہیں ہے، APTX TCR جین ری آرنجمنٹ پروٹینز کے ساتھ تعامل کے لیے جانا جاتا ہے، بشمول XRCC4(Clements et al. 2004)۔ TCR جین کی دوبارہ ترتیب کے دوران اختتامی شمولیت کے طریقہ کار میں APTX کے کردار کی وضاحت کرنے کے لیے مستقبل کے مطالعے

اہم، اور اس امکان کے کہ متبادل اختتامی طریقہ کار، جیسا کہ مائیکروہومولوجیز کا استعمال، اس کی عدم موجودگی میں مدافعتی خسارے کی کمی کا سبب بنتا ہے، مزید تحقیقات کی ضرورت ہے (Bogue et al. 1997)۔ اے ٹی ایم کی بقا؟35×/R35×; Aptx'mice پہلے کے AT ماؤس ماڈلز سے کافی لمبا ہے۔ اس کے مقابلے میں پہلااے ٹی کوبارلو ایٹ ال کے ذریعہ رپورٹ کردہ ماؤس ماڈل۔ عام طور پر پیدائش کے بعد 2-4 مہینوں کے اندر تھائموما سے مر گیا (بارلو ایٹ ال۔ 1996)۔ اس اور بہت سے دوسرے ناک آؤٹ اے ٹی ماؤس ماڈلز میں کینسر کی بقا میں کمی ممکنہ طور پر جینیاتی ہے، کیونکہ تبدیلی کو پناہ دینے والے پس منظر کے تناؤ کے کینسر کے پھیلاؤ اور بقا پر نمایاں اثرات دکھائے گئے ہیں، A/J اور C57BL/6 کے ساتھ۔

بی اے ایل بی سی اور 129 ایس سٹرین (جینک ایٹ ال۔ 2014) پر بقا کی صلاحیت میں نمایاں اضافہ کرنے والے پس منظر۔ حقیقت یہ ہے کہ ہمارے ATM کی کمی والے چوہوں کو C57BL/6 پس منظر پر بنایا گیا تھا، اس کی بنیادی وجہ ہے۔ کہ Aptx*t چوہوں میں ایٹیکسیا پیدا نہیں ہوتا، یہ ان کی نسبتاً لمبی عمر ہے۔ یہ دیکھتے ہوئے کہ Atm35xR35×; اس بات کا امکان نہیں ہے کہ AT KO چوہوں میں ابتدائی موت ایک ایٹیکسک فینوٹائپ کے مشاہدے کو روکتی ہے جو دوسری صورت میں ان چوہوں میں ترقی کرے گا۔ تاہم، یہ معلوم نہیں ہے کہ آیا C57BL/6 پس منظر ترقی پذیر ایٹیکسیا کے لیے لچک فراہم کرتا ہے، جیسا کہ یہ کینسر کے لیے کرتا ہے۔ جینیاتی یا ممکنہ طور پر ایپی جینیٹک عوامل کی وضاحت کرنا جو بیماری کی شدت کو متاثر کرتے ہیں مستقبل میں علاج کی ترقی کے لیے راستے فراہم کر سکتے ہیں۔ ہمارے ماؤس ماڈل میں ATM اور APTX null اتپریورتن کی عالمی نوعیت کو دیکھتے ہوئے، ہم اس بات کو مکمل طور پر مسترد نہیں کر سکتے کہ اضافی سیریبلر نقائص بھی شدید ایٹاکسک فینوٹائپ میں حصہ ڈال سکتے ہیں، اور اس طرح مستقبل میں دماغ، دماغ، ریڑھ کی ہڈی میں سیریبیلم سے باہر کا معائنہ کیا جا سکتا ہے۔ ، اور یہاں تک کہ پٹھوں کو منعقد کرنے کی ضرورت ہوگی۔ سیربیلم کے اندر، جب کہ ہمیں سیریبیلم کے مختلف خطوں کے اندر PN فائرنگ کی خصوصیات میں کچھ جسمانی اختلافات پائے گئے، ہم نے ML کی چوڑائی یا PN کثافت میں علاقائی فرق نہیں پایا۔ تاہم، ریجنل اناٹومی کو سیریبیلم میں گروپنگ فیکٹر کے طور پر استعمال کرنے میں چیلنجز ہیں، کیونکہ ٹشو کے جسمانی تہہ ضروری طور پر فنکشنل، مالیکیولر ایکسپریشن، یا فزیولوجیکل پراپرٹی ڈومینز کی حدود سے تعلق نہیں رکھتے جن کی وضاحت کی گئی ہے (ایپس اور ہاکس 2009) ؛ Tsutsumi et al.2015؛ Gao, van Beugen, and De Zeeuw 2012; Zhou et al.2014)۔ ان ڈومینز کے اندر سیریبلر نقائص کی حد کو جانچنے پر مرکوز تجربات مستقبل کے مطالعے میں اہم ہوں گے اور اے ٹی مریضوں میں جسمانی اختلافات کی کہانیوں کی رپورٹوں کے مقابلے (Verhagen et al.2012؛ De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, اور Teplitz 1979؛ Monaco et al. 1988؛ Terplan اور Krauss 1969؛ Strich 1966؛ Solitare 1968؛ Solitare and Lopez 1967؛ Aguilar et al. 1968a؛ Paula-Barbosa et al. 1983)۔ جب کہ ہم Atm735wR35x میں ایٹیکسیا کے بڑھنے کے دو ممکنہ مراحل کا پتہ لگاتے ہیں۔ Aptx چوہوں، انسانوں میں بچپن کے آغاز کے مقابلے میں، چوہوں میں جوانی میں شدید ایٹیکسیا کا بعد کا مرحلہ تیار ہوتا ہے۔ یہ کچھ نیورو ڈیولپمنٹل اسٹڈیز میں اس کے استعمال کو محدود کر سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، مستقبل کے تجربات کی تشریح میں اس حقیقت کو احتیاط سے پیش کیا جانا چاہیے کہ یہ نیا ماڈل ایک ہی وقت میں دو جینوم استحکام والے جینوں میں کالعدم تغیرات کا اظہار کرتا ہے، ایسی صورت حال جس کا پتہ AT یا AOA1 والے انسانی مریضوں میں نہیں پایا گیا ہے۔ آخر میں، یہ بتانا کہ کہاں، کب، اور کیسے ATM کی کمی سیریبلر پیتھالوجی اور ایٹیکسیا کا سبب بنتی ہے ایک چیلنج رہا ہے، کیونکہ پہلے ATM کی کمی والے چوہوں میں عام طور پر سیلولر اور مالیکیولر خسارے کو ataxic phenotype سے جوڑنے کے لیے درکار خصوصیات کی کمی ہوتی ہے۔ تفتیش کے متعدد امید افزا راستوں کی وضاحت کی گئی ہے، جن میں نیورونل سطح پر توجہ مرکوز کی گئی ہے، جہاں اے ٹی ایم آکسیڈیٹیو اسٹریس سگنلنگ (چن ایٹ ال۔ 2003) اور سیناپٹک فنکشن (لی ایٹ ال۔ 2009؛ وائل ایٹ ال۔ 2016) میں ملوث ہے۔ اس کے ساتھ ساتھ گلیل فنکشن، جہاں حالیہ شواہد سے پتہ چلتا ہے کہ گلیل پیتھالوجی سیریبلر پیتھالوجی میں ایک اہم عنصر ہو سکتی ہے (کامینسکی ایٹ ال۔ 2016؛ کیمپبل ایٹ ال۔ 2016؛ پیٹرسن، رِمکس، اور واسرمان 2012؛ وییمی ایٹ ال۔2015)۔ یہ ناول جانوروں کا ماڈل میکانکی مفروضوں کو جانچنے کے لیے ایک نیا ٹول فراہم کرتا ہے کہ کس طرح اے ٹی ایم کی کمی سیریبلر پیتھالوجی اور ایٹیکسیا کا سبب بنتی ہے۔ مزید برآں، یہ ماڈل پہلے سے تجویز کردہ علاج کے امیدواروں (Browne et al.2004; Chen et al.2003) اور ہمارے اپنے SMRT مرکبات (Du et al. 2013) کی جانچ کے لیے سب سے اہم طور پر ایک اہم preclinical ٹول کے طور پر کام کر سکتا ہے۔ علاج کی جانچ کے لیے موزوں طبی ماڈل نہ ہونے کی سنگین حدود، خاص طور پر AT اور AOA1 جیسے نایاب عوارض کے لیے، کو بڑھا چڑھا کر پیش نہیں کیا جا سکتا۔

4۔{1}} مواد اور طریقے

4.1 اخلاقیات کا بیان

یہ مطالعہ نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ کے لیبارٹری جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کے لیے گائیڈ میں دی گئی سفارشات کے مطابق سختی سے کیا گیا تھا۔ تمام جانوروں کو دی Lundquist Institute (31374-03,31773-02) اور UCLA(ARC-2007-082, ARC{{3}) میں منظور شدہ ادارہ جاتی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی (IACUC) پروٹوکول کے مطابق سنبھالا گیا تھا۔ })۔ پروٹوکول کی منظوری لنڈکویسٹ انسٹی ٹیوٹ کی جانوروں کے تجربات کی اخلاقیات پر کمیٹی نے دی تھی (یقین نمبر: D16-00213)۔ ضرورت پڑنے پر مدد فراہم کرکے اور اخلاقی نقطہ نظر کا انتخاب کرکے درد اور تکلیف کو کم کرنے کی ہر ممکن کوشش کی گئی۔

4.2 چوہے

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>T اتپریورتن شمالی افریقی کی ایک بڑی آبادی میں پایا جاتا ہے۔پرمریض using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA)، انسانی AT PTC کی نقل تیار کرنا)۔ اس کے بعد جینومک ایللیس کو 3-طریقہ گیٹ وے ری ایکشن (Bradley et al. 2012) کا استعمال کرتے ہوئے NorCOMM ممالیہ ہدف بنانے والے ویکٹر کے ایک ترمیم شدہ ورژن میں کلون کیا گیا۔ نتیجے میں ہدف بنانے والے ویکٹرز کو C2 ES خلیات (C57BI/6N، A. Nagy لیب، ٹورنٹو، کینیڈا میں ماخوذ) میں الیکٹروپوریٹ کیا گیا اور G418 (Gertsenstein et al.2010) کے ساتھ انتخاب کے ذریعے کامیابی سے نشانہ بنائے گئے کلون کی شناخت کی گئی۔ ATM جین لوکس میں تبدیل شدہ ٹارگٹنگ کیسٹ کے انضمام کی تصدیق سدرن بلاٹ سے ہوئی، اور PCR پروڈکٹس کی ترتیب سے ATM PTC میوٹیشن کی موجودگی کی تصدیق، ATM لوکس میں غلطی سے پاک ٹارگٹنگ، اور غلطی سے پاک فنکشنل اجزاء

ویکٹر (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔ ٹرانسجینک لائنوں کو حاصل کرنے کے لئے blastocyst انجیکشن کے لئے مثبت ES کلون استعمال کیے گئے تھے۔ ٹرانسجینک ایلیل میں فلوکسڈ انسانی بیٹا ایکٹین پروموٹر ڈیلٹا ہوتا ہے۔TK1-نو cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc؛ (تصویر 1A)۔ دو Atm لائنوں کی جین ٹائپنگ Tm 62 ڈگری ڈگری پر درج ذیل پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی: Atm جین فارورڈ (F) پرائمر:5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; اور Atm جین ریورس(R)پرائمر: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3'، 151bp کی جنگلی قسم کی ایلیل پروڈکٹ یا 241bp کی ٹارگٹڈ ایلیل پروڈکٹ (تصویر 1A, 1B)۔Atmn35×v اور Atm035 × تھے۔ C57Bl/6J چوہوں کے ساتھ 9 نسلوں (99.2 فیصد isogenic) کے ساتھ کرائیو پریزرویشن اور بعد میں C57BI/6J سروگیٹ ماؤں کا استعمال کرتے ہوئے دوبارہ حاصل کرنے سے پہلے۔ Atm735× اور Atm?35xand Atm 35×/Q35× F1 بہن بھائی Atm35 اور Atm835X پلس چوہوں سے حاصل کیے گئے بریڈر تھے۔ AtmR35×k35×: دونوں زرخیز پائے گئے۔ Aptx ناک آؤٹ (Aptx) چوہوں کو ڈاکٹر میک کینن (Ahel et al.2006) سے ایمبریو کے طور پر ڈاکٹر میتھیوز کو فراہم کیا گیا اور بعد میں C57Bl/6J سروگیٹ ماؤں کے ذریعے دوبارہ حاصل کیا گیا۔ Aptx کے چوہے C57Bl/6 اور 129 مخلوط پس منظر پر ہیں۔ Atm35k35; مختلف جنگلی قسم کے Aptx چوہوں، heterozygous، اور homozygous combinations Atm35X سے بنائے گئے تھے۔ Aptxt بریڈرز Atm?35×R35 اور Aptx^ چوہوں کو عبور کرکے پیدا کیے گئے تھے۔ ڈبل اتپریورتی اور متعلقہ کنٹرول چوہوں کا ایک گروہ طولانی طرز عمل کے مطالعہ میں چال کے تجزیوں اور SHERPA ٹیسٹنگ (تصویر 2,3) میں استعمال کیا گیا تھا۔ الیکٹرو فزیولوجیکل، امیونو ہسٹولوجیکل، اور ورٹیکل پول ٹیسٹ تجربات (تصویر 4، 7) کے لیے عمر سے مماثل ڈبل اتپریورتی اور کنٹرول چوہوں کے متعدد اضافی مجموعے استعمال کیے گئے تھے۔ امیونولوجیکل اور پروٹین ایکسپریشن کے تجربات اصل AtmR35× اور Atm35× دوبارہ حاصل کیے گئے چوہوں (Figs.5، 6، اور 8) سے پالے گئے چوہوں کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے۔ جین ٹائپنگ P8-11 چوہوں کے کان کے ٹشو کے نمونوں سے کی گئی۔ Transnetyx Inc. کی طرف سے کئے گئے ریئل ٹائم پی سی آر طریقے ہر جانور کے جین ٹائپ کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ جانوروں کو کان کی بایپسی کے ساتھ ہی انگلیوں کے ٹیٹو کے ذریعے قابل شناخت بنایا گیا تھا۔ اے ٹی ایم 35 × اور اے ٹی ایم 35 × کے لئے منفرد پرائمر کی مقدار طے کی گئی تھی اور جنگلی قسم کے، ہیٹرروزائگس اور ہوموزائگس چوہوں (اوپر درج) کی شناخت کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ Aptx'and Aptx*" پرائمر ان کی جین ٹائپس کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔

4.3 جانوروں کی صحت

P8، 45، 120،210،400 پر ڈیجیٹل پیمانے کے ذریعے جانوروں کا وزن کیا گیا۔ جانوروں کی موت کو مردہ پائے جانے والے دن کے طور پر ریکارڈ کیا گیا تھا، یا یوتھنائزیشن کے دن جب جانور ایک انسانی نقطہ پر پہنچ گئے تھے (جانور 60 کی دہائی کے اندر اپنے آپ کو ٹھیک کرنے سے قاصر تھے، اہم بالوں کی چٹائی خود کو سنوارنے کی کمی یا ضرورت سے زیادہ تکلیف کی نشاندہی کرتی ہے جیسا کہ ویٹرنری نے نوٹ کیا ہے۔ عملہ)۔ مرنے پر جانوروں کی لاشوں کو فوری طور پر منجمد کر دیا گیا، اور پوسٹ مارٹم کی لاشیں بیچوں میں کی گئیں۔ اندرونی اعضاء کے بصری معائنے کے ذریعے عملے کے جانوروں کے ڈاکٹر (ڈاکٹر کیٹالینا گویرا) کے تعاون سے موت کی ممکنہ وجہ کا تعین ہماری بہترین صلاحیت کے مطابق کیا گیا۔ ویوریم کے عملے کے ذریعہ کچھ چوہوں کو نشہ آور یا اتفاقی طور پر ٹھکانے لگایا گیا تھا۔

اس لیے "لاپتہ" کے طور پر لیبل کیا گیا۔ موت کی کوئی قابل فہم بصری وجہ کے بغیر چوہوں کو "ناقابل تعیین" کا لیبل لگا دیا گیا۔ وہ چوہے جو چھاتی کے بڑے پیمانے کے ساتھ پائے گئے جہاں تھامس عام طور پر نوجوان چوہوں میں ہوتا ہے "تھائیمک کینسر" کے طور پر درج کیا گیا تھا۔ موت کی ممکنہ وجوہات (مثلاً جگر کا بڑھنا، پیشاب کی رکاوٹ) کو "دوسرے" کا لیبل لگایا گیا تھا۔

4.4 سلوک

کسی بھی طرز عمل کی جانچ کرنے سے پہلے، چوہوں کو ~ 20 منٹ کے لیے رویے کے سوٹ کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا تھا۔ چوہوں کو ان کے روزمرہ کے چکر کے مطابق دن کے مختلف اوقات میں جانچا گیا۔ رویے کے ٹیسٹوں کی بیٹری رویے پر منحصر ہے لیکن چوہوں کے ایک ہی گروہ میں مختلف ٹائم پوائنٹس پر اشارے شدہ جین ٹائپس کے بولی ڈبل اتپریورتی چوہوں پر کی گئی تھی۔ ٹیسٹوں کی بیٹری میں کیٹ واک گیٹ اسسمنٹ (P45, 120,210, 400) اور SmithKline-Beecham Harwell Imperial-college and Royal-London-Hospital Phenotype Assessment (SHERPA) ٹیسٹ (P30 اور 40) کا سب سیٹ شامل تھا۔ یہ ٹیسٹ UCLA Behavioral Core کے ذریعے کئے گئے تھے۔ عمودی قطب ٹیسٹ پر ڈبل اتپریورتی اور کنٹرول چوہوں کا بھی معائنہ کیا گیا۔ تمام طرز عمل کے آلات کو ہر ٹیسٹنگ مضمون کے درمیان ایتھنول (70 فیصد) سے مٹا دیا گیا تھا۔

چال کا تجزیہ

ہم نے ایک Noldus Catwalk Gait analysis system کا استعمال کیا جو نیم خودکار طور پر عام ایمبولیشن کے دوران چوہوں کی چال کی پیمائش اور تجزیہ کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا تھا۔ مختصراً، شیشے کے نیچے والے کوریڈور میں چوہوں کی نقل و حرکت کو مرکزی پوزیشن سے ویڈیو ریکارڈ کیا جاتا ہے۔ شیشے کے چلنے کے پلیٹ فارم پر روشنی کی روشنی کی وجہ سے ویڈیو میں پاو پرنٹس کو نمایاں کیا گیا ہے۔ ویڈیو کے اندر ماؤس کے ہر قدم کا پتہ بعد میں کیٹ واک ایکس ٹی (نولڈس) کا استعمال کرتے ہوئے نیم خودکار انداز میں کیا جاتا ہے۔ ہر ماؤس کے لیے ایک رن مانیٹر شدہ پلیٹ فارم پر مستقل ایمبولیشن کے 3 ٹرائلز پر مشتمل ہوتا ہے۔ صرف مسلسل ٹرائلز قبول کیے جاتے ہیں، اور چوہوں کو راہداری میں کسی بھی سمت میں 3 مطابق آزمائشیں مکمل کرنے میں 10 کوششیں لگ سکتی ہیں۔ کمپلائنٹ ٹرائلز کی تعریف ان لوگوں کے طور پر کی گئی ہے جو پلیٹ فارم پر 5 s-لمبے سے کم حرکت کرتے ہیں اور رفتار میں 60 فیصد سے زیادہ تغیر نہیں رکھتے۔ ایک بار پلیٹ فارم پر رکھے جانے کے بعد، چوہے عام طور پر تجربہ کار کے اشارے کی ضرورت کے بغیر آگے پیچھے بھاگتے ہیں۔

عمودی قطب

چوہوں کو 80 سینٹی میٹر لمبے بولٹ کے اوپر رکھا جاتا ہے جس کی ناک نیچے کی طرف ہوتی ہے اور پچھلے پنجے اوپر کے قریب ہوتے ہیں۔ چوہوں کو فوری طور پر چھوڑ دیا جاتا ہے، اور جگہ پر فوری طور پر وقت شروع ہوتا ہے.

وقت رک جاتا ہے جب پہلا فورپاو قطب کے نیچے کی سطح کو چھوتا ہے۔ ایک چوہے کا قدرتی رجحان یہ ہے کہ وہ فوری طور پر کھمبے سے نیچے چڑھ جائے، اور انہیں قطب سے گزرنے کے لیے 60 کی دہائی تک دی جاتی ہے، بصورت دیگر، انہیں قطب سے اترنے میں مدد ملتی ہے۔ ایک غیر مکمل آزمائش کو خود بخود 30 کا وقت دیا جاتا ہے، کیونکہ 95 فیصد چوہے جو 30 سیکنڈ کے اندر نہیں اترتے تھے وہ 60 کی دہائی کے نشان پر اب بھی قطب پر موجود تھے۔ SHIRPA کے طرز عمل کے ٹیسٹ P30 پر کیلیفورنیا یونیورسٹی، لاس اینجلس کے طرز عمل کور کے ذریعے کیے گئے تھے۔

اور P400۔ تمام پیرامیٹرز ایک مقداری تشخیص فراہم کرنے کے لیے بنائے گئے ہیں۔ جو وقت کے ساتھ اور مختلف لیبارٹریوں کے درمیان نتائج کے موازنہ کو قابل بناتا ہے۔ اگلے ماؤس پر جانے سے پہلے ہر ماؤس کو ~20- منٹ کے وقفے کے اندر تمام طرز عمل میں ترتیب وار جانچا گیا تھا۔ تجربہ کار جانوروں کے جین ٹائپ سے اندھا تھا۔ جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے اسکرین کو انجام دیا گیا تھا (Rogers et al. 1997)۔

طرز عمل کا مشاہدہ

پرائمری اسکرین رویے کے مشاہدے کا پروفائل فراہم کرتی ہے اور ہر جانور کا اندازہ 5 منٹ تک دیکھنے والے جار (10 سینٹی میٹر قطر) میں غیر متزلزل رویے کو دیکھ کر شروع ہوتا ہے۔ جسمانی پوزیشن، بے ساختہ سرگرمی، سانس لینے کی شرح، اور تھرتھراہٹ کے اسکور کیے گئے طرز عمل کے علاوہ، مبصر عجیب و غریب یا دقیانوسی طرز عمل اور آکشیپ، زبردستی چاٹ، خود کو تباہ کن کاٹنے، اور ریٹروپلشن (پیچھے چلنا) اور مقامی کے اشارے کی کسی بھی مثال کو ریکارڈ کرتا ہے۔ disorientation

میدان کا برتاؤ

اس کے بعد، ماؤس کو میدان میں منتقل کیا جاتا ہے (30 سینٹی میٹر x 50 سینٹی میٹر) منتقلی کی حوصلہ افزائی کی جانچ اور معمول کے رویے کے مشاہدے کے لئے. ایرینا کو 10 x 10 cm² مربعوں کے گرڈ میں نشان زد کیا گیا ہے تاکہ 30 s کے دورانیے میں لوکوموٹر کی سرگرمی کی پیمائش کی جا سکے۔ جب ماؤس میدان میں سرگرم ہوتا ہے، چونکا دینے والے ردعمل، چال، شرونیی بلندی، اور دم کی بلندی کے اقدامات ریکارڈ کیے جاتے ہیں۔

سوپائن ریسٹرینٹ

خود مختار طرز عمل کو ریکارڈ کرنے کے لیے جانور کو ایک دبیز حالت میں روکا جاتا ہے۔ اس تشخیص کے دوران، گرفت کی طاقت، جسم کا سر، پننا اضطراری، قرنیہ اضطراری، پیر کی چوٹکی، تار کی چال، اور دل کی دھڑکن کا جائزہ لیا گیا۔

توازن اور واقفیت

آخر میں، ویسٹیبلر سسٹم فنکشن کے کئی اقدامات کیے گئے۔ رائٹنگ ریفلیکس، کانٹیکٹ رائٹنگ ریفلیکس، اور منفی جیوٹیکسس ٹیسٹ کیے گئے۔ اس پورے طریقہ کار کے دوران آواز، پیشاب، اور عام خوف، چڑچڑاپن، یا جارحیت ریکارڈ کی گئی۔

استعمال شدہ سامان

1. Plexiglas ایرینا صاف کریں (تخمینہ اندرونی طول و عرض 55x33 x18 سینٹی میٹر)۔ میدان کے فرش پر ایک Plexiglas شیٹ ہے جس پر 15 مربع (11 سینٹی میٹر) کا نشان لگایا گیا ہے۔ ایک سخت افقی تار (3 ملی میٹر قطر) کو عقبی دائیں کونے میں اس طرح محفوظ کیا جاتا ہے کہ جانور تار کی چال کے دوران اطراف کو چھو نہیں سکتے۔ 12 ملی میٹر میش (تقریبا) کے ساتھ ایک گرڈ (40x 20 سینٹی میٹر) کو باکس کی چوڑائی میں ٹیل سسپنشن اور گرفت کی طاقت کے رویے کی پیمائش کے لیے محفوظ کیا جاتا ہے۔ 2. ایک واضح Plexiglas سلنڈر (15 x ll cm) کو دیکھنے کے جار کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ 3. ایک گرڈ فلور (40x 20 سینٹی میٹر) 12 ملی میٹر میش کے ساتھ جس پر دیکھنے کے جار کھڑے ہیں۔4۔ چار بیلناکار سٹینلیس سٹیل سپورٹ (3 سینٹی میٹر لمبائی x 2.5 سینٹی میٹر قطر) بنچ سے گرڈ کو بلند کرنے کے لیے۔ 5. میدان میں جانوروں کی منتقلی کے لیے ایک مربع (13 سینٹی میٹر) سٹینلیس سٹیل کی پلیٹ۔ 6. قرنیہ اور پینا اضطراری ٹیسٹوں کے لیے فورپس میں 3/0 کی لمبائی کاٹنا مرسلک 7. تھوک اور کاٹنے کی جانچ کرنے کے لیے ایک پلاسٹک ڈوول کی چھڑی کو پنسل پوائنٹ پر تیز کیا گیا تھا۔8۔ انگلیوں کی چوٹکی کے لیے باریک پوائنٹس (125 ملی میٹر فورپس، فلپ ہیرس سائنٹیفک، کیٹ نمبر D46-174) کے ساتھ مڑے ہوئے سامان کو جدا کرنے والے آلات کا ایک جوڑا۔ 9۔ایک سٹاپ واچ۔10۔ چونکا دینے والے جوابات کی جانچ کے لیے ایک IHR کلک باکس استعمال کیا جاتا ہے۔ کلک باکس 90dB SPL پر ایک مختصر 20 kHz ٹون تیار کرتا ہے جب ماؤس سے 30cm اوپر رکھا جاتا ہے۔ پروفیسر KP اسٹیل، MRC انسٹی ٹیوٹ آف ہیئرنگ ریسرچ، یونیورسٹی پارک، نوٹنگھم NG7 2RD سے رابطہ کریں۔ 11.A حکمران.12.A 30 سینٹی میٹر صاف Plexiglas ٹیوب جس کا اندرونی قطر 2.5 سینٹی میٹر کے ساتھ رابطہ رائٹنگ ریفلیکس کے لئے۔ 4.5 الیکٹرو فزیالوجی ایکیوٹ سیریبلر سلائس کی تیاری 300 μm موٹائی کے پیارے پیراساگیٹل سلائسز لیٹرمیٹ سیریبل کے تجرباتی کنٹرول سے تیار کیے گئے تھے۔ شائع شدہ طریقوں پر عمل کرتے ہوئے (Hansen et al.، 2013)۔ مختصراً، سیریبیلا کو جلدی سے ہٹا دیا گیا اور (ایم ایم): 119 NaCl، 26 NaHCOg، 11 گلوکوز، 2.5 KCl، 2.5 CaCla، 1.3 MgCla، اور 1 NaHzPOa، pH7.4 کی ترکیب کے ساتھ برف کے ٹھنڈے ایکسٹرا سیلولر محلول میں ڈبو دیا گیا۔ 5 فیصد CO-/95 فیصد O2 کے ساتھ گیس۔ سیریبیلا کو ایک وائبراٹوم (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Germany) کا استعمال کرتے ہوئے پیراجیٹ طور پر سیکشن کیا گیا تھا اور ابتدائی طور پر 35 ڈگری پر -30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا، اور پھر استعمال ہونے تک کمرے کے درجہ حرارت پر متوازن اور محفوظ کیا گیا تھا۔ ایکسٹرا سیلولر الیکٹرو فزیالوجی ایکسٹرا سیلولر اور انٹرا سیلولر ریکارڈنگز پورکنجے نیوران (PNs) سے سلائسس میں حاصل کی گئیں جو مسلسل کاربوجن ببلڈ ایکسٹرا سیلولر محلول کے ساتھ پرفیوز ہوتی ہیں اور اسے 37 ڈگری C (ایکسٹرا سیلولر) یا 32 ڈگری (انٹرا سیلولر) ± 1 ڈگری (اوپر) پر برقرار رکھا جاتا ہے۔ زیس ایگزامینر مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے ڈی آئی سی آپٹکس اور واٹر وسرجن 40× مقصد (این اے 0.75) کے ساتھ سیلوں کا تصور کیا گیا۔ ~3 MQ ریزسٹنس (ماڈل P-1000، Sutter Instruments, Novato, CA) کے شیشے کے پائپیٹ ایکسٹرا سیلولر محلول سے بھرے ہوئے تھے اور وولٹیج-کلیمپ موڈ میں ایکشن پوٹینشل سے وابستہ کیپسیٹیو کرنٹ ٹرانزینٹس کی پیمائش کرنے کے لیے PN ایکسن پہاڑیوں کے قریب رکھے گئے تھے۔ 0 mV پر رکھی ہوئی پائپیٹ صلاحیت کے ساتھ۔ پورے سیل پیچ-کلیمپ کی ریکارڈنگ کے لیے، پائپیٹس کو انٹرا سیلولر حل (ایم ایم) سے بھرا گیا تھا: 140 ماہ (CH3KO3S)، 10 NaCl، 2 MgCl2,0.2 CaClz، 10 HEPES، 14 فاسفوکریٹائن （tris نمک）، 1 EGTA، 4 Mg -ATP,0.4 Na-GTP.100 μM Picrotoxin (Sigma) کو روکنے والے GABAegeric synaptic inputs کو روکنے کے لیے شامل کیا گیا تھا۔ کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا حاصل کیا گیا۔

ایک ملٹی کلیمپ 700B یمپلیفائر 20 یا 100 kHz پر وولٹیج یا کرنٹ-کلیمپ موڈ میں، Digidata 1440 with pClamp10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) اور 2 سے 4 kHz پر فلٹر کیا گیا ہے۔ سیریز کی مزاحمت عام طور پر 10 اور 15 MQ کے درمیان تھی۔ سیریز کی مزاحمت کو صرف قلیل مدتی پلاسٹکٹی تجربات کے لیے 80 فیصد پر معاوضہ دیا گیا۔ ایکسٹرا سیلولر ریکارڈنگ کے لیے، تمام جین ٹائپس، جنسوں اور عمر کے گروپوں میں ہر جانور کے لیے کل 20 سے 45 PN ریکارڈ کیے گئے۔ ریکارڈنگ کو سیریبیلم کے درمیانی لیٹرل اور روسٹروکاڈل محور دونوں پر تقسیم کیا گیا تھا۔ صرف "صحت مند" نظر والے خلیات (سیلولر بارڈرز کے کم برعکس) اور باقاعدہ، بلاتعطل فائرنگ کی شرح کی جانچ کی گئی۔ تجزیہ کے دوران، چند خلیوں میں 2 سیکنڈ سے زیادہ کی فائرنگ میں خلاء پایا گیا، اور ان خلیوں کو تجزیہ سے ختم کر دیا گیا، کیونکہ اس قسم کی فائرنگ کا تعلق "غیر صحت مند" ہونے سے ہے۔ ریکارڈنگ سے پہلے DIC مائیکروسکوپی کے تحت ظاہر ہونا، اور نہ ہی "غیر صحت مند" خلیات کی تعداد دیگر جین ٹائپس سے زیادہ تھی (7 فیصد بمقابلہ 4 سے 11 فیصد تمام خلیات P400 پر کنٹرول جین ٹائپس میں)۔ عصبی سرگرمی کا مقامی موازنہ فلوکولس، لیٹرل (2"d یا 3')، انٹرمیڈیٹ (6" یا 7ویں) اور میڈل (11" یا 12t) سلائسس میں سیریل سیکشنز سے ریکارڈنگ کے ذریعے حاصل کیا گیا۔ کم عمر کے گروپس (P45 اور 110) تمام عمر کے گروپوں میں ریکارڈنگ کی متعلقہ پوزیشننگ سے تقریباً مماثل ہیں۔ 0-3 ریکارڈنگ ہر ایک ٹکڑے کے اندر ہر ایک لابیول سے کی گئی تھی جو ٹشو کے معیار اور صحت پر منحصر ہے۔ ہر ریکارڈنگ {{29} تک جاری رہی ہر عمر کے گروپ کے لیے 3 سے 5 چوہوں کا استعمال کیا گیا، اور تجربہ کار کو جین ٹائپ، عمر اور جنس سے اندھا کر دیا گیا۔

انٹرا سیلولر ریکارڈنگ PNs سے میڈل سیریبیلم (یعنی ورمس) کے lobule IIl یا VIl میں حاصل کی گئی تھی۔ lobules کے درمیان خصوصیات میں کوئی شماریاتی فرق نہیں دیکھا گیا۔

تجزیہ کرتا ہے۔

ClampFit (مالیکیولر ڈیوائس)، GoPro (Wavemetrics)، اور Excel (Microsoft) میں معیاری اور حسب ضرورت معمولات کا استعمال کرتے ہوئے خود بخود ایکشن ممکنہ انٹرسٹیمولس وقفوں کا پتہ چلا اور ان کا تجزیہ کیا گیا۔ خاص طور پر، ایکشن پوٹینشل کا پتہ لگایا گیا تھا، اور بڑھتے ہوئے اعدادوشمار (یعنی تعدد اور وقفہ کی لمبائی) کا تعین کیا گیا تھا درمیانی انٹر اسپائک وقفہ (CV) اور درمیانی انٹر اسپائک وقفہ (CV2=2 ISIN پلس 1-ISINl/(ISIN پلس 1 پلس ISIN)) کے تغیر کے گتانک کو ایکسل میں استعمال کرتے ہوئے شمار کیا گیا تھا۔ اپنی مرضی کے میکرو. lgorPro کا استعمال کرتے ہوئے معیاری جھلی کی خصوصیات کا تجزیہ کیا گیا۔ RM کا تعین ایک -80 mV سے ایک -5 mV سٹیپ پلس پر 3 وولٹیج ٹریس ردعمل کے اوسط سے کیا گیا تھا اور شروع ہونے کے بعد 900 اور 1000 ms کے درمیان نتیجے میں موجودہ انحراف کی پیمائش کی گئی تھی۔ جھلی کے وقت کی مستقل کو چوٹی کے 90 فیصد سے 10 فیصد تک ابتدائی زوال کے مرحلے میں ایک ایکسپونینشل کو فٹ کر کے ناپا گیا۔ CM کا حساب RM کے ذریعے جھلی کے مستقل وقت کو تقسیم کر کے لگایا گیا تھا۔ متوازی اور چڑھنے والے فائبر محوروں کو تھیٹا گلاس الیکٹروڈز (WPI) اور TTL کنٹرول شدہ محرک الگ تھلگ (ISO-Flex، AMPI) کا استعمال کرتے ہوئے حوصلہ افزائی کی گئی۔ lgorPro میں حسب ضرورت معمولات کا استعمال کرتے ہوئے ایووکڈ EPSC طول و عرض اور زوال کے وقت کے مستقل (متوازی کے لیے 1 exp. اور 2 exp. چڑھنے والے ریشوں کے لیے) کا تجزیہ کیا گیا۔ ایکشن پوٹینشل کی جانچ 1 s کرنٹ انجیکشنز کے ایک سیٹ کے حصے کے طور پر کی گئی تھی -500 اور 2250 PA (250 pA اسٹیپس) کے درمیان ہولڈنگ کرنٹ کے ساتھ ~70 mV پوٹینشل کو برقرار رکھنے کے لیے ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ ایکشن ممکنہ لہروں کی پیمائش حسب ضرورت استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔

lgorPro میں معمولات۔ ایکشن پوٹینشل تھریشولڈ کی تعریف پہلی جھلی وولٹیج کے طور پر کی گئی تھی جس میں پہلا مشتق 30 mV/ms سے تجاوز کر گیا تھا (Zhu et al.2006)۔

4.6 سیریبلر ایٹروفی کا امتحان

سیریبلر سائز کھوپڑی سے دماغ کو ہٹانے کے فورا بعد، ایک ڈورسل، پوری ماؤنٹ امیج حاصل کی گئی۔ پھر فجی (NIH) کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر پر کارروائی کی گئی۔ پیشانی دماغ اور سیریبلر سائز کا اندازہ ان کی 2-جہتی جگہ کا خاکہ بنا کر اور پھر علاقے کا حساب لگا کر کیا گیا۔ ہم نے دماغ کے مجموعی سائز میں ممکنہ فرق کو معمول پر لایا تاکہ سیریبیلم کے نتائج کو پیشانی کے سائز سے تقسیم کر کے ایک رشتہ دار سیریبیلم سے پیشانی کا تناسب پیدا کیا جا سکے۔ تجربہ کار جانور کے جین ٹائپ سے اندھے تھے۔ امیونو ہسٹو کیمسٹری متعلقہ اسٹڈی اینڈ پوائنٹس پر (P45, 120,210,4{{7{{1{108}}4}}}}0), تمام جین ٹائپ کے نر اور مادہ چوہے اس مطالعے میں جس کی نمائندگی کی گئی تھی اسے آئسوفلورین کے ساتھ اینستھیٹائز کیا گیا تھا اور فاسفیٹ بفرڈ نمکین کے ساتھ ٹرانسکارڈیل پرفیوژن سے گزرا تھا جس کے بعد 4 فیصد (w/v) بفرڈ پیرافارمیلڈہائڈ (PFA) تھا اور پھر دماغ کو نکالنے کے لیے الگ کیا گیا تھا۔ دماغ کو کھوپڑی سے نکالنے کے فوراً بعد پورے دماغ کی تصاویر لی گئیں اور دماغ کو 24 گھنٹے کے لیے 4 فیصد پی ایف اے میں ڈبو دیا گیا، اور پھر 0.05 فیصد ایزائیڈ اور 30 ​​فیصد سوکروز کے ساتھ ٹریس بفرڈ سیلائن (ٹی بی ایس) میں کریو پروٹیکٹ کیا گیا۔ گھنٹے اور مزید استعمال تک 4 ڈگری پر محفوظ کیا جاتا ہے۔ سیریبیلم کو پیشانی دماغ سے الگ کیا گیا تھا اور ایک سلائیڈنگ مائکروٹوم (مائیکروم ایچ ایم 430، تھرمو سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے سیکشن کیا گیا تھا اور اسے 40 μm موٹائی پر سیٹ کیا گیا تھا۔ سیریبیلم کے حصوں کو چھ کی ایک سیریز میں جمع کیا گیا اور TBS-AF (TBS کے ساتھ 30 فیصد سوکروز، 0.05 فیصد سوڈیم ایزائڈ، اور 30 ​​فیصد ایتھیلین گلائکول) میں 4 ڈگری یا -20 ڈگری پر مزید استعمال تک محفوظ کیا گیا۔ Purkinje نیورونز کے امیونو فلوروسینٹ ویژولائزیشن کے لیے، دونوں Atm* کے سیریبیلم سیکشن؛ Aptx*t اور Atm؟35×R35×; Aptx^(n=5 فی جینوٹائپ) کو ٹی بی ایس میں 5 منٹ کے لیے تین بار دھویا گیا اور پھر کمرے کے درجہ حرارت پر 15 فیصد نارمل گوٹ سیرم میں 30 منٹ تک بلاک کر دیا گیا جس کے بعد خرگوش یا ماؤس اینٹی کیلبینڈین ڈی میں فری فلوٹنگ انکیوبیشن -28k (1:1000) ایک گھنٹہ کے لیے کمرے کے درجہ حرارت پر ایک مداری شیکر پر۔ اس کے بعد حصوں کو ٹی بی ایس کے ساتھ تین بار 5 منٹ کے لیے دھویا گیا، اس کے بعد بکرے کے مخالف خرگوش یا ماؤس الیکسا فلور 488 (1:1000) میں کمرے کے درجہ حرارت پر اندھیرے میں 1 گھنٹے کے لیے مداری شیکر پر فری فلوٹنگ انکیوبیشن کی گئی۔ ثانوی اینٹی باڈی انکیوبیشن کے بعد، حصوں کو ٹی بی ایس میں 5 منٹ کے لیے تین بار دھویا گیا، پھر DAPI کے ساتھ Fluoromount-G کے ساتھ نصب اور کور سلپ کر دیا گیا۔ کچھ حصوں کے لیے، اینٹی کلیویڈ کیسپیس-3(1:200) اور اینٹی CD68(1:400) اینٹی باڈیز کو الیکسا فلور 647 (1:500) سیکنڈری اینٹی باڈی کا استعمال کرتے ہوئے Calbindin کے متوازی طور پر اضافی طور پر جانچا گیا تھا۔ ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) سے لیس Zeiss مائکروسکوپ پر Stereo Investigator (MBF Bioscience, ver.2020) کا استعمال کرتے ہوئے سلائیڈز کو 2.5، 10,20,40، یا 63x مقصد، اور تصویر کا استعمال کرتے ہوئے اسکین کیا گیا تھا۔ Hamamatsu CMOS کیمرہ (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus) کے ساتھ کیپچر۔ نتیجے میں آنے والی تصاویر میں ہر ایک لابیول میں کیلبینڈین-ری ایکٹیو سیلز کی تعداد کو درست کرنے کے لیے، ہم نے 300 μm سے 500 انچ کے درمیان تصادفی طور پر 2 لائنیں کھینچنے کے لیے Stereo Investigator کا استعمال کیا۔ ہر ایک لابیول نے اور دستی طور پر 40x میگنیفیکیشن کے تحت ٹشو سلائس کی 40 um موٹائی کے اندر لمبائی کے ساتھ PNs کی کل تعداد گنی۔ 2D کثافت (# PNs/(لکیری لمبائی*40 um موٹائی)) فی لوبول کے دو نمونے اس وقت تھے۔ lobules اور جانوروں کے درمیان مزید موازنہ کے لیے اوسط۔ Calbindin مثبت PN dendrite کی چوڑائی 20x میگنیفیکیشن کے تحت 25 یا 40 um موٹی ٹشو سیکشن میں ہر جانور سے lobule VI میں پہلے سے طے شدہ مقام پر ناپی گئی۔ بنیادی اور ثانوی شاخوں کی ڈینڈریٹک چوڑائیوں کو پی این سیل باڈیز اور سالماتی پرت کے کنارے کے درمیان مڈ لائن پر ماپا گیا۔ 7 اور 13 ڈینڈرائٹس کے درمیان فی سیکشن، فی جانور ایک سیکشن ماپا گیا۔ PN somatic پیمائشوں کے لیے، سٹیریو انوسٹی گیٹر کا استعمال PNs کو 20x میگنیفیکیشن کے تحت پورے میڈل سیکشن میں تصادفی طور پر منتخب کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ فی جانور کی اوسط PN چوڑائی کا تعین 3 سیریل سیکشنز (16 سے 37 PNs فی سیکشن) کے اوسط نتائج سے کیا گیا تھا۔ PN کی چوڑائی PN پرت یا باہر نکلنے والے ڈینڈرائٹ کے لیے کھڑے ہو کر ناپی گئی تھی اگر کچھ ڈگری سے زیادہ کی طرف سے جھکاؤ۔ مالیکیولر پرت اور گرینول سیل پرت (بالترتیب Calbindin اور DAPI کے داغوں کے ساتھ تصور کردہ) چوڑائی کا اندازہ سٹیریو انوسٹی گیٹر میں ہر ایک لابیول کے لیے پہلے سے طے شدہ مقامات پر دو چوڑائی کی پیمائش کے ذریعے، تقریباً آدھے راستے کے ساتھ ساتھ 2.5x CD68 میگنیفیکیشن کے تحت ہر لوبول کی لمبی حد کے ساتھ لگایا گیا۔ سیریبلر سیکشن میں مثبتیت کو CD68 کے کل فیصد رقبہ کے علاوہ پورے میڈل سیریبلر سیکشن میں مثبت داغ کی پیمائش کرکے مقدار درست کی گئی۔ 10x سلی ہوئی تصاویر کو منفی کنٹرول کی حد تک پہنچا دیا گیا تھا اور امیج جے کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئی تھی، فی جانور ایک سیکشن۔ Calbindin-Positive PNs کے فیصد کی مقدار درست کرنے کے لیے جو کلیویڈ Caspase-3 کے لیے مثبت تھے، ہم نے سٹیریو انویسٹی گیٹر کا استعمال کرتے ہوئے پورے سیریبیلم میں PNs کو شمار کیا۔ فی جانور تین، 20x میگنیفیکیشن سلائی امیجز کی جانچ کی گئی اور نتائج کا اوسط لیا گیا۔ Caspase-3 مثبتیت کی حد صرف ثانوی اینٹی باڈیز سے داغے ہوئے کنٹرول حصوں سے قائم کی گئی تھی۔ غیر فلوروسینٹ ہسٹولوجیکل تجزیہ کے لیے، 25-م-موٹی، آزاد فلوٹنگ ٹشو سیکشنز کو مثبت چارج شدہ سلائیڈوں پر اور راتوں رات ہوا سے خشک کیا جاتا ہے۔ ٹشو کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) میں 5 منٹ کے لیے دو بار دھویا گیا، پھر 95 فیصد ایتھنول میں 0.1 فیصد ہیماتوکسیلین کے ساتھ ~ 25s کے لیے اور 3s کے لیے 95 فیصد ایتھنول میں 0.5 فیصد Eosin کے ساتھ داغ دیا گیا اور ڈبل ڈِسٹ کے بعد پانی میں دھویا گیا۔ ہر داغ. ٹشو کو بعد میں 95 فیصد ایتھنول، 100 فیصد ایتھنول، اور 100 فیصد زائلین واش میں 1 منٹ کے لیے پانی کی کمی ہوئی، پھر پرماؤنٹ کے ساتھ ڈھانپ دیا گیا۔ اسی زائس مائکروسکوپ اور MBF حصول سافٹ ویئر پر رنگین کیمرہ (Q امیجنگ، MBF بایو سائنسز) کا استعمال کرتے ہوئے سلائیڈوں کی تصویر کشی کی گئی۔ تجربہ کاروں کو ماؤس جینی ٹائپ سے اندھا کر دیا گیا تھا جس میں حصوں کی جانچ کی گئی تھی، اور تمام ہسٹولوجیکل پیمائشوں کے لیے امتحان کی ترتیب کو ایک دوسرے سے الگ کر دیا گیا تھا۔

4.7 فلو سائٹومیٹری پیمائش

خون اور تھائمس خلیوں کا فلو سائٹومیٹری تجزیہ مخصوص اینٹی ماؤس اینٹی باڈیز∶CD4، CD8، CD3، CD44، اور CD25 کے ساتھ داغ لگا کر کیا گیا تھا۔ مختصراً، پورے خون کے نمونے (50 μ) فلوروسینٹ لیبل والے اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے داغے ہوئے تھے، پھر خون کے سرخ خلیوں کو BD lysing محلول کا استعمال کرتے ہوئے لیس کیا گیا تھا جبکہ زندہ سفید خون کے خلیوں کو قابل عمل داغ کا استعمال کرتے ہوئے داغ دیا گیا تھا۔ تھیمی کو میکانکی طور پر الگ کر دیا گیا تھا۔ CD4، CD8، CD44، اور CD25 کے لیے مخصوص اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے 1 سے 2 ملین thymus خلیات اسی طرح داغدار تھے۔ مدافعتی داغ والے سفید خون کے خلیوں یا تھائمس کے نمونوں کا تجزیہ FACS ARIA l کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا اور FlowJo سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا جیسا کہ پہلے بتایا گیا تھا (Sanghez et al. 2017)۔

4.8 مغربی بائیوٹس

ریڈیو امیونوپریسیپیٹیشن پرکھ (RIPA) lysis بفر (150 mM NaCl، 1 فیصد Nonidet P-40 [NP-40]،0 میں پروٹین کے عرق (خلیوں/ٹشوز) کو ہم آہنگ کیا گیا تھا۔ .5 فیصد ڈی آکسیکولیٹ،0.1 فیصد ایس ڈی ایس، 50 ایم ایم ٹریس، پی ایچ 8.0) پروٹیز انحیبیٹرز کے ساتھ (10 ug/ml AEBSF، 10 ug/ml leupeptin، 5 ug/ml pepstatin، 5 ug/ml chymotrypsin، 10 ug/ml aprotinin)۔ پروٹین کے نچوڑوں کو سونیکیٹ کیا گیا تھا اور پھر سنٹرفیوگریشن کے ذریعے 13،000 rpm کے لیے 15 منٹ 4C پر گولی ماری گئی تھی۔ BCA پروٹین پرکھ کا استعمال پروٹین کی تعداد کو درست کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ 50 سے 100 ug فی لین پروٹین کی مساوی مقدار پر مشتمل نمونوں کو 4 سے 12 فیصد گریڈینٹ TGX precast جیل BioRad کا استعمال کرتے ہوئے الگ کیا گیا اور پھر ٹرانسبلوٹ سیمی ڈرائی بائیو راڈ سسٹم کے ذریعے نائٹروسیلوز ٹرانسفر پیک کے ذریعے منتقل کیا گیا۔ منتقل شدہ دھبوں کو برابر پروٹین لوڈ کرنے کے لیے Ponceau S سٹین سے داغ دیا گیا تھا پھر کمرے کے درجہ حرارت پر 60 منٹ کے لیے TBST میں 5 فیصد نان فیٹ خشک دودھ سے دھو کر بلاک کر دیا گیا تھا۔ پرائمری اینٹی باڈیز کو 4 ڈگری پر رات بھر ہلنے کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ مندرجہ ذیل اینٹی باڈیز کے لیے دھبوں کی جانچ کی گئی: ATM (D2E2) Rabbit mAb سیل سگنلنگ، 1:1000 dilution پر، -Actin (D6A8) Rabbit mAb سیل سگنلنگ، GAPDH (D16H11) Rabbit mAb سیل سگنلنگ اور اس کے بعد مناسب ہارس سیرا (Perbicoxida) HRP) ثانوی اینٹی خرگوش، اینٹی ماؤس کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے۔ TBST کے ساتھ متعدد دھونے کے بعد، Azure c400 اور BioRad ChemiDoc امیجنگ سسٹمز کا استعمال کرتے ہوئے Radiance Plus chemiluminescence substrate کے ذریعے پروٹین ایکسپریشن کا پتہ چلا۔ امیج جے کا استعمال کرتے ہوئے اے ٹی ایم کا کثافت میٹرک تجزیہ کیا گیا۔ تجربات 2 تکنیکی اور 2-3 حیاتیاتی نقل کے ساتھ کیے گئے جیسا کہ اشارہ کیا گیا ہے۔

4.9 شماریاتی تشخیص

ہر گروپ کے لیے منتخب کردہ جانوروں کی تعداد 0.5 کے سائز، 0.8 کی طاقت، اور ابتدائی اعداد و شمار سے تخمینہ لگائے گئے اثرات کے سائز کی بنیاد پر GPPower v3.1 کا استعمال کرتے ہوئے ترجیحی طاقت کے تجزیوں پر مبنی تھی۔ یا پہلے کی تعلیم۔ ہم نے وقفہ ڈیٹا کے لیے عام طور پر تقسیم شدہ اور غیر پیرامیٹرک (کرسکل والیس) دونوں پیرامیٹرک (1-اور 2-طریقے سے ANOVA) شماریاتی طریقوں کا استعمال کیا تاکہ گروپوں کے درمیان فرق کی جانچ کی جا سکے جس کے بعد جوڑے کے لحاظ سے متعدد موازنہ ٹیسٹ ہوتے ہیں جیسا کہ اس میں اشارہ کیا گیا ہے۔ متن انجیر میں مدافعتی اعداد و شمار کے لئے آؤٹ لیرز۔ 6 اور 7 کو ROUT طریقہ (Q=2 فیصد) کے ذریعے خارج کر دیا گیا تھا۔ ہر ڈیٹا سیٹ کے لیے استعمال کیے گئے مخصوص تجزیے ہر فگر لیجنڈ میں نوٹ کیے گئے ہیں۔ تمام اعداد و شمار کے لیے: ns اہم نہیں،*p 0.05،**p سے کم یا اس کے برابر<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">