آریل ہائیڈرو کاربن ریسیپٹر کی چالو کرنا 6-فارمیلنڈولو[3،2-ب] کاربازول نے سوزش اور اپوپٹوسس کو دبا کر گردے کی شدید چوٹ کو دور کیا

edmund.chen@wecistanche.com

خلاصہ:شدیدگردے کی چوٹ(AKI) مختلف ایٹولوجیز کی ایک کثیر الجہتی بیماری ہے۔ آریل ہائیڈرو کاربن ریسیپٹر (AhR) ایک ligand-activated ٹرانسکرپشن عنصر ہے جو ligands کو جین کے تاثرات کو دلانے یا دبانے کے لیے جواب دیتا ہے، اس طرح حیاتیاتی یا پیتھو فزیولوجک اثرات کے متنوع سپیکٹرم کو منظم کرتا ہے۔ تاہم، AKI پر AhR کا اثر نامعلوم ہے۔ C57BL/6J چوہوں میں rhabdomyolysis دلانے کے لیے 50 فیصد گلیسرول کا ایک واحد انٹراپریٹونیل انجکشن لگایا گیا تھا۔ دو طرفہگردوںpedicles 30 منٹ کے لئے بند کر دیا گیا تھا اور پھر حوصلہ افزائی کے لئے ہٹا دیا گیا تھاگردوںI/R چوٹ۔ 6-formylindolo[3,2-b]car-bazole (FICZ), ٹرپٹوفن کی فوٹو آکسیڈیشن پروڈکٹ جس میں AhR سے زیادہ تعلق ہے، استعمال کیا گیا تھا۔ ان وٹرو مطالعہ HK-2 خلیوں پر کیا گیا تھا۔ فیرس میوگلوبن اور ایف آئی سی زیڈ کو مختلف سیل گروپس میں میڈیم میں تحلیل کیا گیا تھا۔ AhR agonist FICZ کے ساتھ علاج نے AKI میں سیرم کریٹینائن اور یوریا کی بلندی کو نمایاں طور پر کم کیا۔ AKI ماڈلنگ کی حوصلہ افزائیگردوں کا نقصانFICZ کی طرف سے کم کیا گیا تھا. AhR بنیادی طور پر قریبی نلی نما خلیوں میں ظاہر ہوتا ہے اور اسے FICZ انتظامیہ کے ذریعہ چالو کیا جاسکتا ہے۔ دریں اثنا، AKI نے زخمیوں میں سوزش والی سائٹوکائنز کی پیداوار کو متحرک کیا۔گردے، جبکہ FICZ نے ان کے اظہار کو روک دیا۔ مزید برآں، FICZ نے مؤثر طریقے سے AKI ماڈلز میں سیل اپوپٹوس کو الٹ دیا۔ میکانکی طور پر، AKI نے NF-κB اور JNK راستوں کو چالو کرنے کی تحریک دیگردے، جبکہ FICZ نے ان متعلقہ پروٹین اظہار کو نمایاں طور پر دبا دیا۔ ان وٹرو مطالعہ کے لیے، FICZ نے میوگلوبن یا H/R-حوصلہ افزائی HK-2 خلیوں میں سوزش اور اپوپٹوس کو بھی روکا۔ خلاصہ یہ کہ FICZ کے ذریعہ AhR کی اذیت نے رابڈومائلیسس اور I/R-حوصلہ افزائی AKI کو ختم کیا۔ FICZ نے قریبی نلی نما خلیوں میں NF-κB اور JNK راستوں کو دبا کر سوزش اور اپوپٹوس کو روکا۔

مطلوبہ الفاظ:شدید گردے کی چوٹ، اپوپٹوسس، ایرل ہائیڈرو کاربن ریسیپٹر، سوزش، رینل نلی نما اپکلا سیل

CISTANCHE گردے/ گردوں کی بیماری کو بہتر کرے گا۔

تعارفشدیدگردے کی چوٹ(AKI) کی تیزی سے کمی سے مراد ہے۔گردوں کی تقریبکی وجہ سے چند گھنٹوں سے کئی دنوں میںگردوںپرفیوژن کی کمی، نیفروٹوکسک ادویات یا زہر، پیشاب کی نالی میں رکاوٹ اور دیگر وجوہات۔ 1 AKI کی طبی وجوہات میں بنیادی طور پر اسکیمیا ریپرفیوژن چوٹ، نیفروٹوکسک مادے (جیسے کہ دوائیں، کنٹریکٹ ایجنٹس اور rhabdomyolysis کے ذریعے جاری ہونے والے پٹھوں کے خلیوں کے مواد) اور sepdomyolysis شامل ہیں۔ دنیا میں ہر سال تقریباً 13.3 ملین لوگ AKI کا شکار ہوتے ہیں۔ 2 AKI، اپنی اعلیٰ اموات اور اخراجات کے ساتھ، ایک بہت بڑا بوجھ لاتا ہے۔گردوںعروقی نظام، 4,5 اینڈوپلاسمک ریٹیکولم تناؤ، 6,7 مائٹوکونڈریل نقصان، 8 اپوپٹوسس، 9 آکسیڈیٹیو تناؤ، اور سوزش۔ 10 Rhabdomyolysis (RM) ایک سنڈروم ہے جس کی خصوصیت پٹھوں کی نیکروسس اور پٹھوں کے خلیوں کے مواد کی گردش میں جاری ہوتی ہے، جس کے دوران AKI سب سے عام پیچیدگی ہے11؛ اسکیمیا-ریپرفیوژن (I/R) AKI کی ایک بڑی پیتھوفزیولوجی ہے، جو AKI کی تمام وجوہات میں سے 60 فیصد کا سبب بنتی ہے۔ علاج، اورگردوںمتبادل تھراپی.

ایرل ہائیڈرو کاربن ریسیپٹر (AhR) کو نقل کیا گیا ہے اور AHR جین سے ترجمہ کیا گیا ہے۔ انسانوں میں، AhR مختلف اعضاء میں ظاہر ہوتا ہے، بشمول پھیپھڑوں، thymus،گردہ،جگر، آنت، وغیرہ۔ 13 Unliganded AhR ایک پروٹین کمپلیکس میں سائٹوسول میں رہتا ہے جس میں ہیٹ شاک پروٹین 90 (HSP90) کا ایک ڈائمر بھی ہوتا ہے اور کو-chaperones AIP اور p23.14 ایک ligand سے منسلک ہونے پر، AhR چالو ہوتا ہے اور داخل ہوتا ہے۔ نیوکلیئس، جہاں یہ AhR نیوکلیئر ٹرانسلوکیٹر (ARNT) سے منسلک ہوتا ہے، اور بہت سے مختلف ڈاون اسٹریم جینز کی نقل کو فروغ دیتا ہے۔ مختلف ذرائع اور ساخت کے ساتھ لیگنڈس مختلف وابستگیوں کے ساتھ AhR سے منسلک ہوتے ہیں اور مختلف جسمانی یا پیتھولوجیکل اثرات کو متحرک کرسکتے ہیں۔ 16 پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ AhR اپنے بہاو والے راستوں کے ساتھ سوزش مخالف، 17 اینٹی اپوپٹوسس، 18 سیل سائیکلوں کو ریگولیٹ کرنے اور ریگولیٹ کرنے کے افعال رکھتا ہے۔ استثنیٰ، 20 جو کہ AKI کے روگجنن کے اہم اجزاء ہیں۔ AhR کے لیے Endogenous ligands بنیادی طور پر ٹرپٹوفن میٹابولزم سے ہوتے ہیں۔ 6-formylindolo[3,2-b]carbazole (FICZ)، ٹرپٹوفن کی فوٹو آکسیڈیشن پروڈکٹ، AhR کے ساتھ بہت زیادہ تعلق رکھتی ہے۔ 19} اگرچہ تفتیش کاروں نے پایا کہ یوریمک ٹاکسن کے ذریعہ AhR کو چالو کرنے کے دائمی مریضوں میں منفی اثرات مرتب ہوتے ہیں۔گردے کی بیماریوں(CKD)، 25 کسی بھی مطالعہ نے AKI میں اس کے اظہار کی تبدیلیوں کی پیمائش نہیں کی۔ یہ بھی واضح نہیں ہے کہ آیا FICZ میں ایک ہے۔گردوںrhabdomyolysis اور I/R حوصلہ افزائی AKI میں حفاظتی اثر، کیونکہ AhR مکمل طور پر مختلف بہاو اثرات کو چالو کر سکتا ہے۔

جانوروں کے تجرباتتمام تجرباتی پروٹوکولز اور جانوروں کے طریقہ کار جانوروں کے تجربات میں اخلاقی اصولوں کے مطابق کیے گئے جو سچوان یونیورسٹی آف ایکریمینٹیشن کے ذریعہ اختیار کیے گئے تھے اور سیچوان یونیورسٹی کی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کی اخلاقیات کمیٹی سے منظور شدہ تھے۔ نر C57BL/6 چوہے (10-12 ہفتے، وزن 25 سے 27 گرام کے درمیان) سچوان یونیورسٹی (چینگڈو، چین) کے اینیمل لیبارٹری سینٹر سے خریدے گئے تھے۔ چوہوں کو پانی اور خوراک تک مفت رسائی کے ساتھ مستقل درجہ حرارت (23 ± 2 ڈگری) اور روشنی/تاریک حالات (12/12 گھنٹے) میں رکھا گیا تھا۔ مزید تحقیق سے پہلے چوہوں کو 1 ہفتہ تک اس ماحول میں ڈھال لیا گیا۔ rhabdomyolysis ماڈل میں، چوہوں کو تصادفی طور پر چار گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: کنٹرول (n {{10}})، FICZ (n=3)، گلیسرول (n=6) اور گلیسرول جمع FICZ (n=6)۔ گلیسرول گروپ کے چوہوں کو 50 فیصد گلیسرول 0.9 فیصد نارمل نمکین (9 μL/g جسمانی وزن) میں گھل کر پچھلے اعضاء میں دو طرفہ طور پر rhabdomyolysis-in AKI کو اکسانے کے لیے لگایا گیا تھا۔ دریں اثنا، کنٹرول گروپ کے چوہوں کو انٹرا مسکولر انجیکشن کے ذریعہ اسی مقدار میں نمکین ملا۔ جہاں تک گلیسرول پلس ایف آئی سی زیڈ گروپ کا تعلق ہے، ایف آئی سی زیڈ کو 2.5 فیصد پی ای جی 400 میں تحلیل کیا گیا اور 0.9 فیصد نارمل نمکین میں گھلایا گیا تاکہ گلائیسٹرول انجیکشن سے پہلے مسلسل چار دن تک 100 ug/kg/d کی خوراک میں انٹراپریٹونلی طور پر دیا جائے۔ ایف آئی سی زیڈ گروپ کے چوہوں کو مسلسل چار دنوں تک ایف آئی سی زیڈ کی ایک ہی خوراک انٹراپریٹونلی طور پر دی گئی، بغیر گلیسرول انجیکشن کے۔

CISTANCHE گردے/ گردوں کی خرابی کو بہتر کرے گا۔

رینل اسکیمیا ریپرفیوژن ماڈل میں، چوہوں کو تصادفی طور پر چار گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: کنٹرول (n=6)، FICZ (n=3)، I/R (n=6) اور I /R جمع FICZ (n=10)۔ I/R گروپ میں چوٹ کو 30 منٹ تک نان ٹرامیٹک مائیکرو واسکولر کلیمپس کے ساتھ رینل پیڈیکلز کو کلیمپ کرنے سے نکالا گیا، جس کے بعد کلیمپ ہٹانے کے بعد 24 گھنٹے ریفرفیوژن کیا گیا۔ رنگ کی تبدیلیوں کے ذریعہ رکاوٹ اور ریفرفیوژن کی تصدیق ہوئی۔گردے. کنٹرول گروپ میں چوہوں نے ایک ہی جراحی کے طریقہ کار سے گزرے سوائے کلیمپنگ پیڈیکلز کے۔ I/R پلس FICZ گروپ کے لحاظ سے، FICZ کا انتظام I/R ماڈلنگ سے پہلے لگاتار چار دنوں تک کیا گیا جیسا کہ اوپر بتایا گیا ہے۔ اسی طرح، FICZ گروپ میں چوہوں کو FICZ کی ایک ہی خوراک مسلسل چار دنوں تک دی گئی اور کنٹرول گروپ کے طور پر تمام جراحی کے طریقہ کار کا تجربہ کیا۔ چوہوں کے دو بیچوں کو بالترتیب پینٹوباربیٹل سوڈیم انجیکشن (50 ملی گرام/کلوگرام، آئی پی) کے ذریعے خوش کیا گیا اور ماڈلنگ کے 24 گھنٹے بعد قربانی دی گئی۔ سیرم اورگردہمزید تجزیہ کے لیے نمونے اکٹھے کیے گئے اور −80 ڈگری پر محفوظ کیے گئے۔

سیرم بائیو کیمسٹری اسسیسخون کے نمونوں کو فوری طور پر 1509.3 جی پر 20 منٹ کے لیے سنٹرفیوج کیا گیا تاکہ جانچ کے لیے سیرم کو الگ کیا جا سکے۔ سیرم کریٹینائن (sCr)، یوریا اور کریٹائن کناز (CK) کی سطحوں کا ایک خودکار بائیو کیمیکل تجزیہ کار (Mindray BS-240) کے ذریعے پتہ چلا۔ ماڈلنگ گروپس کی sCr کی سطح ان کی کنٹرول اقدار کے دو گنا تک بڑھنا کامیاب AKI ماڈلنگ کی نشاندہی کرتی تھی۔

ہسٹولوجیکل تشخیصگردے کے ؤتکوں کو 10 فیصد غیر جانبدار بفرڈ فارملین میں طے کیا گیا تھا، پیرافین میں سرایت شدہ مر گیا تھا، اور 4 μm موٹائی پر سیکشن کیا گیا تھا۔ ڈیپرافینائزیشن اور ری ہائیڈریشن کے بعد حصوں کو متواتر ایسڈ-شف (PAS) سے داغ دیا گیا تھا۔ PAS سے داغدار حصوں کی چھان بین لائٹ مائکروسکوپی کے تحت ×200 یا ×400 کی میگنیفیکیشن پر کی گئی۔ دس فیلڈز کو تصادفی طور پر ہر سیکشن سے ×200 کی میگنیفیکیشن پر منتخب کیا گیا تھا اور نیم مقداری تجزیہ کے لیے ہر گروپ میں کم از کم تین کے ہر نمونے سے دو حصے تصادفی طور پر منتخب کیے گئے تھے۔ ہسٹوپیتھولوجیکل تبدیلیوں کا اندازہ زخمیوں / نقصانات کے فیصد سے کیا گیا۔گردوںنلیاں، جیسا کہ نلی نما بازی، lysis، خلل اور کاسٹ کی تشکیل سے ظاہر ہوتا ہے۔ ٹشو کی چوٹ {{0}} کے پیمانے پر بنائی گئی تھی، 0، 1، 2، 3 اور 4 کے ساتھ 0 فیصد،<25%, 26%-50%,="" 51%-75%="" and="">76 فیصد زخمی/نقصان پہنچاگردوںtubules، بالترتیب.26

امیونو فلوروسینس سٹیننگماؤس جم گیا۔گردہOCT میں سرایت شدہ ٹشوز کو کریوسٹیٹ پر 4-μm-موٹی حصوں میں کاٹا گیا اور داغ لگنے تک −80 ڈگری پر محفوظ کیا گیا۔ فاسفیٹ بفرڈ نمکین (پی بی ایس) جس میں 5 فیصد ہارس سیرم ہوتا ہے، کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے غیر مخصوص بائنڈنگ سائٹس کو بلاک کرنے کے لیے لگایا گیا تھا۔ پھر حصوں کو راتوں رات 4 ڈگری پر مرطوب چیمبر میں بنیادی اینٹی باڈیز کے ساتھ سینک دیا گیا۔ پی بی ایس کے ساتھ دھونے کے بعد، اسی ثانوی اینٹی باڈی کو روشنی سے گریز کرتے ہوئے 1 گھنٹے تک استعمال کیا گیا۔ اس کے بعد نمونے PBS کے ذریعے دھوئے گئے، DAPI (D8200، Solarbio) سے داغے گئے، اور آخر میں کور سلپس کے ساتھ لگائے گئے۔ پرائمری اینٹی باڈیز کو پی بی ایس نے منفی کنٹرول میں تبدیل کیا تھا۔ ثانوی اینٹی باڈیز (1:500 dilution؛ Jackson ImmunoResearch) پرائمری اینٹی باڈیز کے ساتھ مماثل فلوروسینٹ سگنلز کو برآمد کرنے کے لیے لاگو کیا گیا تھا۔ تصاویر کو ZEN 2012 (بلیو ایڈیشن) مائکروسکوپی سافٹ ویئر کے ذریعے حاصل کیا گیا اور ان کا تجزیہ کیا گیا۔

امیونو ہسٹو کیمسٹریگردے کے ٹشوز فارملین سے طے شدہ، پانی کی کمی سے دوچار، پیرا فن میں سرایت شدہ، 5 μm موٹائی پر سیکشن کیے گئے، اور بعد میں شیشے کی سلائیڈوں پر نصب کیے گئے۔ اس کے بعد سلائیڈز کو 2.5 فیصد نارمل گوٹ سیرم کے ذریعے بلاک کیا گیا اور 4 ڈگری پر بنیادی اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ سلائیڈوں کو پی بی ایس میں تین بار دھویا گیا، اور ہم نے داغ لگانے کے لیے ویکٹاسٹین اے بی سی کٹ (ویکٹر) کا استعمال کیا۔ تصاویر ZEN 2012 (بلیو ایڈیشن) مائکروسکوپی سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے کیپچر کی گئیں۔

TUNEL داغگردے کے ٹشوز فارملین سے فکسڈ تھے، پیرافین میں سرایت کیے گئے تھے، اور 4 μm موٹائی پر سیکشن کیے گئے تھے۔ DeadEnd™ Fluorometric TUNEL سسٹم (G3250, Promega) کا استعمال کرتے ہوئے ٹرمینل deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP نک اینڈ لیبلنگ (TUNEL) سٹیننگ کی گئی تھی۔ جوہری داغ لگانے کے لیے، حصوں کو DAPI (D8200، Solarbio) کے ساتھ 1:500 کی کمی پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ تصاویر فلوروسینس مائکروسکوپی کے ذریعہ × 400 کی میگنیفیکیشن پر پیش کی گئیں۔ ہم نے مثبت خلیات کو شمار کیا اور ہر نمونے میں کم از کم 10 فیلڈ فی سیکشن کا معائنہ کیا۔

CISTANCHE کڈنی/رینل فنکشن کو بہتر کرے گا۔

مغربی دھبے کا تجزیہدیگردے کے ٹشوs یا HK{{0}} خلیات کو ریڈیو امیون پریپیٹیشن (RIPA) lysis بفر (P0013B، Beyotime Biotechnology) کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا تھا جس میں 1‰ proteinase inhibitors (Keygen Biotech) شامل تھے۔ 15 منٹ تک سینٹرفیوگریشن (18 894.2 جی، 4 ڈگری پر) کے بعد، سپرناٹینٹ کو جمع کیا گیا، اور مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق بائیو ٹائیم انسٹی ٹیوٹ آف بائیوٹیکنالوجی (بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیوٹیکنالوجی) کے ذریعے پروٹین کی تعداد کا تعین بائی سینچونینک ایسڈ پروٹین آسے کٹ کے ذریعے کیا گیا۔ پروٹین لائسیٹ کو مساوی مقدار کے ساتھ 10 فیصد - 12 فیصد SDS-PAGE سے الگ کیا گیا جس کے بعد پولی وینیلائیڈین ڈائی فلورائیڈ جھلی (بائیو ریڈ) میں منتقلی ہوئی۔ جھلیوں کو 5 فیصد غیر چکنائی والے خشک دودھ (w/v) کے ساتھ Tris-buffered saline میں 0.1 فیصد Tween-20 (TBS-T) کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ کے لیے بلاک کیا گیا تھا اور پھر اسی بنیادی اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ رات بھر 4 ڈگری پر 5- منٹ کے وقفوں پر TBS-T سے تین بار دھونے کے بعد، جھلیوں کو HRP-conjugated سیکنڈری اینٹی باڈیز کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے تک سینک دیا گیا۔ جھلیوں پر پروٹین کے دھبے اموبیلون ویسٹرن کیمیلومینیسینٹ ایچ آر پی سبسٹریٹ (ملی پور کارپوریشن) نے بائیو ریڈ کیمی ڈاکٹر ایم پی کے ساتھ دیکھے تھے۔ کثافت کا تجزیہ امیج جے 6.0 سافٹ ویئر (نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور ایکٹین کو لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔

مقداری ریئل ٹائم پی سی آر تجزیہمنجمد سے کل RNAگردہنمونوں کو اینیمل کل آر این اے آئسولیشن کٹ (فورجین) کے ساتھ الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ الگ تھلگ mRNA کے ارتکاز کا تعین ScanDrop 100 (Analytik Jena) ڈیٹریکٹر کے ذریعے کیا گیا تھا اور cDNAs کو PrimeScript™ RT ریجنٹ کٹ (Takara Bio) کا استعمال کرتے ہوئے ترکیب کیا گیا تھا۔ کوانٹیٹیو ریئل ٹائم پی سی آر ریورس ٹرانسکرپشن کے بعد پی سی آر سسٹم (سی ایف ایکس کنیکٹ؛ بائیو ریڈ) میں iTaq™ یونیورسل SYBR گرین سپرمکس (Bio-Rad) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ پرائمر کے سلسلے ٹیبل S1 میں درج ہیں۔ متعلقہ جین کی مقدار -ایکٹین کے اظہار کی سطح کے مقابلے میں 2−∆∆Ct طریقہ سے شمار کی گئی تھی۔

سیل کلچر اور علاجہیومن رینل پروکسیمل ٹیوبلر سیل لائن (HK-2 سیل) پروفیسر Xueqing Yu (Guangdong Provincial People's Hospital) کی طرف سے ایک مہربان تحفہ تھا اور (DMEM)/F12 میڈیم (SH30023. 01B، Hyclone) میں 10 فیصد کے ساتھ مکمل کیا گیا تھا۔ فیٹل بوائین سیرم (SH30084. 03، Hyclone)، 5 فیصد CO2 اور 95 فیصد ہوا کے مرطوب ماحول کے تحت 37 ڈگری پر مایوگلوبن ماڈل میں، تیزی سے بڑھنے والی حالت میں خلیوں کو چار گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: FICZ گروپ، 100 کے ساتھ انکیوبیٹڈ 24 گھنٹے کے لیے nmol/L FICZ؛ میوگلوبن گروپ، 24 گھنٹے تک 200 μmol/L فیرس میوگلوبن کے ساتھ انکیوبیٹڈ؛ Mb پلس FICZ گروپ، FICZ کے ساتھ 100 nmol/L پر میوگلوبن علاج کے انتظام کے ساتھ؛ اور کنٹرول گروپ، سیلز کو کنٹرول گروپ میں اکیلے مکمل میڈیم کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ فیرس میوگلوبن تیار کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا۔ H/R گروپ کے خلیات ہائپوکسیا کو دلانے کے لیے 12 گھنٹے تک بغیر سیرم کے درمیانے درجے میں ہائپوکسک حالات (1 فیصد O2، 94 فیصد N2 اور 5 فیصد CO2) کے تحت کلچر کیے گئے تھے۔ اس کے بعد خلیوں کو دوبارہ آکسیجن کے لیے 6 گھنٹے کے لیے آکسیجن کے ساتھ باقاعدہ کلچر میڈیم میں منتقل کر دیا گیا۔ کنٹرول سیلز کو باقاعدہ انکیوبیٹر میں مکمل کلچر میڈیم میں لگایا گیا تھا۔ H/R پلس FICZ گروپ میں FICZ ایڈمنسٹریشن (100 nmol/L) H/R آپریشن سے ٹھیک پہلے دی گئی تھی۔

Annexin V-FITC/پروپیڈیم آئوڈائڈ پرکھہم نے Annexin V-FITC اپوپٹوس تجزیہ کٹ (AO2001- 02PH، SUNGENE) کا اطلاق کیا۔ HK-2 خلیات کو چھ کنویں پلیٹوں میں سیڈ کیا گیا تھا۔ 24 گھنٹوں تک مختلف میڈیا کے سامنے آنے کے بعد، ٹرپسن کے ذریعے منسلک خلیات کو الگ کر دیا گیا۔ اس کے بعد، خلیوں کو بائنڈنگ بفر میں دوبارہ معطل کیا گیا اور 5 μL Annexin V-FITC اور 5 μL پروپیڈیم آئوڈائڈ (کمرے کا درجہ حرارت، 15 منٹ، اندھیرے سے بچنا) کے ساتھ داغ دیا گیا۔ اپوپٹوٹک خلیوں کی شناخت فلو سائٹو میٹر کے ذریعہ کی گئی تھی۔

شماریاتی تجزیہڈیٹا اوسط ± SD کے طور پر دیا گیا تھا۔ متعدد گروپ موازنہ کے لیے شماریاتی اقدار کا تجزیہ یک طرفہ ANOVA کے ذریعے کیا گیا، اور SNK ٹیسٹ کے ذریعے جوڑا موازنہ کیا گیا۔ تمام شماریاتی تجزیے SPSS 21 میں کیے گئے تھے۔{2}}۔ P < 0.05="" کو="" شماریاتی="" لحاظ="" سے="" اہم="" سمجھا="" جاتا="">

نتائج

AhR agonist FICZ نے AKI کو کم کیا۔اس بات کی توثیق کرنے کے لیے کہ آیا FICZ رینو پروٹیکٹو اثر فراہم کرتا ہے، ہم نے رابڈومائلیسس اور اسکیمیا/ریپرفیوژن (I/R) سے متاثر AKI ماڈلز قائم کیے ہیں۔ پھر ہم نے گردوں کے فنکشن اور گردے کے ٹشوز میں پیتھولوجیکل تبدیلیوں کا جائزہ لیا۔ کریٹینائن، یوریا، سی کے، جگر کے خامروں کی میٹابولک سرگرمیوں کے سیرم کی سطح میں کوئی خاص گڑبڑ نہیں

FICZ گروپ میں مشاہدہ کیا گیا تھا (شکل 1A-C؛ ٹیبل S3)۔ جیسا کہ شکل 1A-B میں دکھایا گیا ہے، FICZ انتظامیہ نے گلیسرول انجیکشن یا I/R سرجری کے 24 گھنٹے بعد سیرم کریٹینائن اور یوریا کی سطح میں نمایاں اضافہ کو نمایاں طور پر کم کیا، بغیر rhabdomyolysis چوہوں (Figure 1C) میں سیرم CK کی سطح کو متاثر کیے بغیر۔ دریں اثنا، PAS سٹیننگ نے FICZ کو مؤثر طریقے سے پیتھولوجیکل نقصان کو کم کیا جس کی خصوصیات نلی نما پھیلاؤ، سوجن، کاسٹ کی تشکیل اور دونوں ماڈلز میں AKI ماڈلز کے مقابلے برش بارڈر کا نقصان (شکل 1D-E)۔ امیونو فلوروسینس سٹیننگ اور ریئل ٹائم پی سی آر کے نتائج نے ظاہر کیا کہ ایف آئی سی زیڈ کے استعمال نے زخمیوں میں نیوٹروفیل جیلیٹنیز سے وابستہ لیپوکلین (این جی اے ایل) کے اظہار اور نقل کو نمایاں طور پر کم کیا، جو گردوں کی چوٹ کا بائیو مارکر ہے۔گردے(شکل 2A-D)۔ اسی طرح، ایف آئی سی زیڈ نے گلیسرول سے متاثرہ ایم آر این اے کی سطح کو بھی روک دیا۔گردے کی چوٹگلیسرول کے انجیکشن کے بعد مالیکیول 1 (KIM1) (شکل 2A)۔

ہم نے میں AhR کی نقل اور اظہار کا مزید جائزہ لیا۔گردہٹشوز شکل 3 میں، RT-PCR، ویسٹرن بلوٹنگ، امیونو ہسٹو کیمسٹری اور امیونو فلوروسینس سٹیننگ کے نتائج نے روکا کہ AKI ماڈلنگ دونوں گروپوں میں MRNA اور AhR کے پروٹین کی سطح میں نمایاں کمی واقع ہوئی ہے۔ ایف آئی سی زیڈ کے انٹراپریٹونیل انجیکشن نے گلیسرول پلس ایف آئی سی زیڈ اور آئی/ آر پلس ایف آئی سی زیڈ گروپس میں اس کی نقل اور اظہار کو نمایاں طور پر متحرک کیا۔ چونکہ گردوں کے نلی نما اپکلا خلیات AKI میں اہم کردار ادا کرتے ہیں، 28 ہم نے جانچ کی کہ آیا نلی نما اپکلا خلیوں میں AhR کا اظہار کیا جا سکتا ہے۔ امیونو کیمسٹری کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ AhR بنیادی طور پر گردوں کی نلیاں (شکل 3C-D) میں ظاہر ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، گردے کے ٹشو سیکشن لیکٹین کے ساتھ داغے ہوئے تھے، جو قربت والے نلی نما اپکلا خلیوں کے لیے ایک مارکر، نیوکلی کے لیے AhR اور DAPI تھے۔ جیسا کہ شکل 3E-F میں دکھایا گیا ہے، AhR لیکٹین کے ساتھ ضم ہوگیا، اس طرح یہ ظاہر ہوتا ہے کہ AhR بنیادی طور پر قریبی نلی نما اپکلا خلیوں میں ظاہر ہوتا ہے۔ ایک ساتھ مل کر، FICZ زخمیوں میں AhR کے فعال ہونے کے ذریعے rhabdomyolysis اور I/R-حوصلہ افزائی AKI کے خلاف محفوظ رکھتا ہے۔گردے

FICZ نے AKI چوہوں کے گردوں میں سوزش والی سائٹوکائن کی پیداوار کو کم کر دیااس بات کا جائزہ لینے کے لیے کہ آیا FICZ AKI کی طرف سے پیدا ہونے والی سوزش کو گھومنے کے قابل تھا، q-PCR کا استعمال گردوں میں سوزش کے حامی عوامل کی نقل کی سطح کا پتہ لگانے کے لیے کیا گیا تھا۔ گردوں کے ٹشوز میں IL-1، IL-6 اور TNF- کی mRNA کی سطح گلیسرول انجیکشن یا I/R کی چوٹ سے نمایاں طور پر بڑھی، جبکہ FICZ انتظامیہ نے ان جین ٹرانسکرپشنز کو نمایاں طور پر کم کیا (شکل 4A)۔ مستقل طور پر، AKI ماڈلنگ کی حوصلہ افزائی IL-1، IL-6 اور TNF- کی بلندی کو FICZ علاج (شکل 4B-C) کے ذریعے مؤثر طریقے سے کم کیا گیا۔ ان نتائج نے تجویز کیا کہ FICZ AKI ماڈلنگ میں گردوں کی سوزش کو کم کر سکتا ہے۔

FICZ نے AKI چوہوں کے گردوں میں سیل اپوپٹوس کو کم کیا۔سوزش کے علاوہ، سیل اپوپٹوسس اے کے آئی کے روگجنن میں ایک اور اہم خصوصیت ہے۔ ہم نے I/R-حوصلہ افزائی چوہوں میں گردے کے apoptosis پر FICZ کے اثر کی تحقیقات کے لیے TUNEL سٹیننگ کا اطلاق کیا۔ جیسا کہ شکل 5B میں دکھایا گیا ہے، FICZ نے TUNEL-مثبت خلیوں کی تعداد میں نمایاں کمی کی ہے۔گردےI/R چوہوں کا۔ اس کے علاوہ،

امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ کے نتائج نے ظاہر کیا کہ کلیویڈ کیسپیس-3 کے اظہار کو، جو کہ اپوپٹوس سے متعلق پروٹین میں ترمیم کرنے والا ایک اہم عمل ہے، کو FICZ انتظامیہ نے رابڈومائلیسس ماڈل (شکل 5A) میں نمایاں طور پر کم کیا تھا۔ دریں اثنا، FICZ rhabdomyolysis اور I/R induced AKI دونوں ماڈلز میں کیسپیس-3 کے mRNA کی سطح کو کم کر سکتا ہے۔ مزید برآں، ویسٹرن بلٹ کے نتائج نے ظاہر کیا کہ FICZ کلیویڈ کیسپیس-3 اور بیکس کے اظہار کو کم کر سکتا ہے، اور Bcl-2 کی سطح کو اپ ریگولیٹ کر سکتا ہے۔گردےAKI چوہوں کا (شکل 5C)۔ خلاصہ طور پر، ان نتائج نے اشارہ کیا کہ ایف آئی سی زیڈ نے اینٹی اپوپٹوٹک اثرات دکھائے۔گردےAKI چوہوں کی

FICZ نے AKI چوہوں کے گردوں میں NF-κB اور JNK سگنلنگ کو دبا دیا۔

سگنلنگ پاتھ ویز کی ایکٹیویشن کا مغربی بلوٹنگ تجزیہ کے ذریعے مزید جائزہ لیا گیا تاکہ FICZ کے اینٹی سوزش اور اینٹی اپوپٹوٹک میکانزم کا پتہ لگایا جا سکے۔گردےAKI چوہوں کی جیسا کہ شکل 6 میں دکھایا گیا ہے، AKI چوہوں کے گردوں میں IκB اور P65 کی فاسفوریلیشن کی سطح واضح طور پر FICZ کے زیر علاج گروپوں سے زیادہ تھی۔ مزید برآں، پچھلے مطالعات نے واضح کیا کہ JNK سگنلنگ اپوپٹوس کو تبدیل کر سکتا ہے اور NF-κB سگنلنگ کے ساتھ تعامل کر سکتا ہے۔ اوپر لیا گیا، ان نتائج سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ NF-κB اور JNK راستوں نے AKI چوہوں کے گردوں میں FICZ کی سوزش اور اینٹی اپوپٹوٹک سرگرمی میں حصہ لیا۔

FICZ نے HK-2 خلیوں کو سوزش اور apoptosis کو روک کر میوگلوبن محرک اور H/R کی چوٹ سے محفوظ رکھاہم نے گواہی دی کہ آیا FICZ کے ذریعہ AhR کو چالو کرنا میوگلوبن سے محرک انسانی قربت والے ٹیوبول اپیتھیلیل (HK-2) خلیوں میں سوزش اور اپوپٹوس کو دبا سکتا ہے۔ سب سے پہلے، ہم نے تصدیق کی کہ میوگلوبن محرک یا H/R زخمی خلیوں میں AhR کے ان وٹرو ایکسپریشنز کو نمایاں طور پر نیچے ریگولیٹ کیا گیا تھا، جب کہ FICZ (شکل 7B-D) کے ذریعے ان کو الٹ دیا گیا تھا۔ میوگلوبن ماڈل میں ہر گروپ کے سیل اپوپٹوس کی شرح کا پتہ بہاؤ سائٹوومیٹری (شکل 7A) کے ذریعہ لگایا گیا تھا۔ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں، FICZ گروپ میں HK-2 خلیوں کے apoptosis اور necrosis میں کوئی اضافہ نہیں ہوا۔ اس کے برعکس، میوگلوبن کے محرک کے بعد، HK-2 خلیات نے بڑی تعداد میں apoptotic خلیات کی نمائش کی جو کہ 12.3 فیصد ہے۔ جبکہ Mb پلس FICZ گروپ نے نمایاں طور پر کم apoptotic خلیات دکھائے۔ اس کے علاوہ، FICZ نے مائیوگلوبن محرک یا H/R زخمی HK-2 خلیات (شکل 7BD) میں کلیویڈ کیسپیس-3 اور بیکس کے تاثرات کو نیچے سے منظم کیا۔ مزید برآں، مایوگلوبن یا سوزش کے حامی عوامل کی H/R-حوصلہ افزائی کی بلندی FICZ (شکل 7B-D) کے ذریعے نمایاں طور پر الٹ گئی۔ مستقل طور پر، P65 اور JNK کی فاسفوریلیشن کی سطح میوگلوبن محرک یا H/R کی چوٹ کے بعد نمایاں طور پر زیادہ تھی، جبکہ FICZ کے علاج نے انہیں مؤثر طریقے سے کم کیا (شکل 7B-D)۔ لہذا، ان نتائج نے اشارہ کیا کہ AhR agonist FICZ نے HK-2 خلیات کو مایوگلوبن اور H/R کے خلاف سوزش اور اپوپٹوسس کو روک کر محفوظ کیا۔

بحث

موجودہ مطالعہ میں، ہم نے پایا کہ FICZ کی طرف سے AhR اذیت کو کم کر سکتا ہے۔گردے کا نقصانrhabdomyolysis اور ischemia/reperfusion induced AKI میں۔ AhR بنیادی طور پر proximal tubular epithelial خلیات میں موجود تھا، جبکہ AhR agonist FICZ NF-κB اور JNK سگنلنگ پاتھ ویز کے ذریعے سوزش اور سیل اپوپٹوسس کو ریگولیٹ کرکے AKI کے خلاف قربت والے نلی نما اپکلا خلیوں کی حفاظت کرسکتا ہے۔ پچھلے مطالعات سے پتا چلا ہے کہ یوریمک ٹاکسنز، جیسے انڈوکسیل سلفیٹ، AhR کے agonists تھے۔ CKD والے مریضوں کو ان یوریمک ٹاکسن کا سامنا کرنا پڑتا ہے، اس طرح AhR نے CKD والے مریضوں اور چوہوں دونوں کو متحرک کر دیا ہے۔ یا یوریمک میٹابولزم CKD چوہوں اور چوہوں کے گردوں میں AhR33,34 کو چالو کر سکتا ہے، جس نے AKI چوہوں میں ہمارے نتائج سے مختلف رجحانات کی نمائش کی۔ تاہم، AhR کے لیے الگ الگ ligands مختلف بہاو سگنلنگ راستوں کو متاثر کر سکتے ہیں۔ 35 اس کے علاوہ، AKI پر پچھلی تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ لیفلونومائڈ I/R-حوصلہ افزائی AKI میں AhR کو چالو کر سکتا ہے اور مدافعتی نظام کو منظم کرنے اور سوزش کو روکنے کے ذریعے گردوں کے پیتھولوجک نقصان کو بہتر بنا سکتا ہے۔36 MiR{{ 11}}b نے AhR ریپریسر کو روکنے کے ذریعے AhR کو چالو کیا اور گردے کو سسپلٹین سے متاثرہ چوٹ سے بچایا۔گردے کی چوٹAhR پر منحصر CYP1A1/2 جگر میں شامل کرنے کے ذریعے۔ 38 ہمارے نتائج AKI پر ان سابقہ ​​نتائج سے مطابقت رکھتے تھے۔ مزید برآں، AhR agonist FICZ نے مختلف بیماریوں جیسے میٹابولک سنڈروم، 39 آٹو امیون یوویائٹس، 22 کولائٹس، 23 psoriases، 24 وغیرہ میں حفاظتی اثرات مرتب کیے ہیں۔

ہوانگ ایٹ ال کے حالیہ نتائج کے مطابق، 22 تجرباتی آٹو امیون یوویائٹس ماڈلنگ نے NF-κB اور STAT1/3 راستوں کو چالو کیا اور نیچے دھارے کے حامی اشتعال انگیز عوامل IL-1، IL-6 اور TNF کے تاثرات کو اپ ریگولیٹ کیا --. دریں اثنا، سیل apoptosis میں اضافہ ہوا. AhR agonist علاج کے ساتھ، پرو سوزش والی سائٹوکائنز کے اظہار میں کمی اور NF-κB راستے کی روک تھام پائی گئی۔ AhR ایکٹیویشن سیل اپوپٹوسس کی روک تھام کا باعث بھی بنی۔ یہ نتائج ہمارے تجربے کے مطابق تھے۔ انہوں نے یہ بھی پایا کہ AhR ایکٹیویشن نے میکروفیج پولرائزیشن کو M1 سے M2 کی طرف منتقل کر دیا۔ اس نے تجویز کیا کہ AhR مدافعتی ضابطے میں حصہ لے سکتا ہے ، جو بہاو پرو سوزش سائٹوکائنز کے ضابطے کے لئے ایک اور ممکنہ وضاحت تھی۔ مختلف خلیوں میں NF-κB اظہار کے AhR اور RelA (P65) ذیلی یونٹ کے مابین منفی ارتباط کی متعدد اطلاعات تھیں۔ Co-immunoprecipitation Hepa1c1c7 خلیوں کے کل سیل نچوڑ کے ساتھ انجام دیا گیا تھا۔ چونکہ AhR اور NF-κB دونوں سگنل پر منحصر نیوکلیئر ٹرانسلوکیشن سے گزر سکتے ہیں، اور ARNT کا P65 سے کوئی تعلق نہیں پایا گیا، اس لیے یہ فرض کیا گیا کہ AhR اور P65 کا تعلق بنیادی طور پر cytoplasmic compartment میں تھا۔ 40 کی نقل کی سرگرمیاں AhR اور NF-κB کو ٹرانسکریشنل کوایکٹیوٹرز کے ذریعہ ماڈیول کیا جاتا ہے۔ جیسا کہ پہلے بتایا گیا ہے، ان کے شریک کاروں کے درمیان جزوی اوورلیپ تھا۔ نتیجتاً، یہ قابل فہم ہے کہ کو ایکٹیویٹر بائنڈنگ کے لیے مقابلہ ہو سکتا ہے، اس طرح کہ جب ایک راستہ فعال ہو جائے گا، تو دوسرے راستے کو ایکٹیویٹر کی دستیابی کے مقابلے کے ذریعے دبا دیا جائے گا۔ -κB JNK کو متاثر کرتا ہے، ممکنہ طور پر ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کے ذریعے۔29 Mitochondrial ROS NF-κB ایکٹیویشن کو فروغ دے سکتا ہے، اور JNK ROS جنریشن میں حصہ ڈالتا ہے، جس کے نتیجے میں JNK ایکٹیویشن کو متحرک کرتا ہے۔ اگرچہ تفصیلی طریقہ کار کو مزید تفتیش کی ضرورت ہے، لیکن یہ فرض کیا جا سکتا ہے کہ NF-κB اور JNK راستوں کے درمیان ایک مثبت ارتباط موجود ہے۔

CISTANCHE گردے/ گردوں کے درد کو بہتر کرے گا۔

پچھلی تحقیق 43,44 نے پایا کہ رابڈومائلیسس اور I/R کی حوصلہ افزائی AKI میں، ماڈلنگ گروپس میں سوزش اور سیل اپوپٹوسس میں نمایاں اضافہ ہوا، اسی دوران NF-κB اور JNK کے راستے چالو ہو گئے۔ یہ نتائج ہمارے نتائج کے مطابق تھے۔ AKI کے اہم میکانزم میں ہائپوکسیا، آکسیڈیٹیو تناؤ کا ردعمل، اور سوزش شامل ہیں۔ وہ سیل کی موت (اپوپٹوسس، آٹوفیجی، نیکروسس) یا ٹشووں کی دوبارہ تشکیل کو فروغ دے سکتے ہیں۔ خلیے کی چوٹ یا موت نے نقصان سے وابستہ مالیکیولر پیٹرن (DAMPs) اور پیتھوجین سے وابستہ مالیکیولر پیٹرن (PAMPs) کے ساتھ مادے کو جاری کیا، جس نے سوزش کو مزید بڑھا دیا۔ اس دوران، apoptosis سمیت سیل کی موت بھی AKI کے روگجنن میں شامل تھی۔ کیسپیسز فیملی ایکسپریشنز کو ریگولیٹ کیا جاتا ہے، اور AKI کے دوران متعدد مائٹوکونڈریا سے متعلقہ اینٹی اپوپٹوٹک اور پروپوپٹوٹک ریگولیٹرز تبدیل ہوتے ہیں۔ ہم نے پایا کہ FICZ کے ذریعہ AhR ایکٹیویشن نے NF-κB اور JNK راستوں کو روکنے کے ذریعے سوزش اور اپوپٹوسس کو کم کیا۔

تاہم، تحقیقات کے لیے کئی مسائل باقی ہیں۔ ہمارے مطالعے نے بنیادی طور پر FICZ کے ذریعہ AhR ایکٹیویشن کے renoprotective اثرات اور rhabdomyolysis اور I/R-حوصلہ افزائی AKI میں اس کے ممکنہ طریقہ کار کی کھوج کی۔ مزید برآں، ہم نے AKI ماڈلنگ سے پہلے چوہوں کے لیے FICZ کی احتیاطی انتظامیہ کا استعمال کیا۔ اگرچہ ایڈمنسٹریشن موڈ کا استعمال پچھلے مطالعات میں بڑے پیمانے پر کیا گیا تھا، لیکن جانوروں کے تجربات اور طبی مشق کے درمیان تضادات موجود تھے۔ مستقبل میں، اے کے آئی کی ترقی اور خاص طور پر اے ایچ آر کے انٹرا سیلولر لوکلائزیشن پر AhR کا اظہار کس طرح تبدیل ہوتا ہے اس کے لیے مزید تحقیقات کی ضرورت ہے۔ اگرچہ FICZ کارروائی کے تحت NF-κB اور JNK فاسفوریلیشن میں کمی واضح ہے، متعلقہ بلاکنگ ایجنٹوں کے مزید تجربات کی ضرورت ہے۔ مزید برآں، میکانزم کی بہتر وضاحت کے لیے، Vivo اسٹڈی کے لیے AhR ناک آؤٹ اور اوور ایکسپریشن چوہوں کی ضرورت ہے، جبکہ وٹرو اسٹڈی کے لیے AhR کی اوور ایکسپریشن اور خاموشی کی ضرورت ہے۔ اس کے علاوہ، مختلف لیگنڈز مختلف AhR سگنلنگ پاتھ ویز کو کس طرح متاثر کرتے ہیں اس کے لیے مزید ریسرچ کی ضرورت ہے۔