جلد پر Polyoxometalates کے اینٹی ایجنگ اثرات

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

خلاصہ:سوزش اور گلائیکشن کے ذریعہ ضرورت سے زیادہ رد عمل آکسیجن اسپیسز (ROS) کی نسل جسم میں بڑھتی عمر سے متعلق مختلف تبدیلیوں میں حصہ ڈالتی ہے۔ لہذا، ROS کی پیداوار کو روکنا جلد میں جھریوں، میکولے، پھیکا پن اور سست پن کو روک سکتا ہے۔ جلد پر دو پولی آکسومیٹیلیٹس (PMs: VB2 اور VB3) کے اینٹی ایجنگ اثرات کا جائزہ لینے کے لیے، اس تحقیق میں یہ تحقیق کی گئی کہ آیا انھوں نے عام انسانی ڈرمل فائبرو بلاسٹس (NHDF) کے بڑھاپے کے خلاف ردعمل کو آکسیڈیٹیو تناؤ کے لیے بہتر کیا ہے جس کی وجہ اعلی درجے کی گلیکشن اینڈ پروڈکٹس (AGEs) ہیں۔ ) یا H2C 2 کی نمائش۔ اکیلے AGEEs کے سامنے آنے والے خلیوں میں AGE ریسیپٹرز کے mRNA اظہار کی سطح کے مقابلے میں، VB2 یا VB3 کے ساتھ اضافی علاج نے FEEL-1، FEEL-2، اور RAGE کے اظہار کی سطح میں نمایاں اضافہ کیا۔ AGE-حوصلہ افزائی کشیدگی کے حالات کے تحت، پانچ ہیٹ شاک پروٹینوں کے اظہار کی سطح کو VB علاج کے ذریعہ نمایاں طور پر بڑھایا گیا تھا۔ اس کے برعکس، VBs نے سیل ڈیتھ اور انٹرا سیلولر ROS پروڈکشن کی شمولیت کو دبا دیا۔ VBs نے تناؤ کے حالات میں ان نقصان دہ واقعات پر پروفیلیکٹک اثرات بھی مرتب کیے ہیں۔ مزید برآں، AQP-1/AQP-3 اظہار کو دبانے اور H2O2 کی نمائش کے ذریعے پیدا ہونے والی ہائیلورونان اور ایلسٹن کی پیداوار کو دبانے دونوں کو روکنے کے لیے VB علاج پائے گئے۔ یہ نتائج VB2 اور VB3 کی صلاحیت کو اینٹی ایجنگ ایجنٹ کے طور پر ظاہر کرتے ہیں۔

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

مطلوبہ الفاظ:polyoxometalate؛ اوکسیڈیٹیو تناؤ؛ HyO2; ری ایکٹیو آکسیجن اسپیسز؛ اعلی درجے کی گلیکشن اختتامی مصنوعات؛ سپر آکسائیڈ خارج کرنا؛ hyaluronan؛ ایکواپورین

1. تعارف

گلائی کیشن، آکسیڈیشن، اور دائمی سوزش 3 اہم عمر بڑھنے سے متعلق رد عمل ہیں، اور ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں (ROS)، جو ان رد عمل کی جگہوں پر پیدا اور جمع ہوتی ہیں، کو بڑھاپے کے مختلف مظاہر [1-5] کو دلانے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ چونکہ یہ عمر بڑھنے سے متعلق رد عمل جلد میں پائے جاتے ہیں، اس لیے ROS کی دبی ہوئی نسل کو جھریوں، میکولے، سست پن اور سستی کو روکنے کے لیے موثر سمجھا جاتا ہے [6]۔

گلائی کیشن ایک غیر انزیمیٹک کیمیائی رد عمل ہے جس کے ذریعے شوگر کے مالیکیولز یا گلوکوز میٹابولزم انٹرمیڈیٹس (مثلاً، گلیسرالڈیہائیڈ) مختلف پروٹینوں میں امینو ایسڈ کی باقیات پر کاربند رہتے ہیں اور آخر کار اعلی درجے کی گلیکشن اینڈ پروڈکٹس (AGEs) پیدا کرتے ہیں۔puritans وٹامن سیAGEs نہ صرف پورے جسم میں بڑھتی عمر کے مظاہر میں بلکہ مختلف بیماریوں میں بھی اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ مثال کے طور پر، جلد میں کولیجن قدرتی طور پر گلائکیٹڈ ہوتا ہے اور اس طرح عمر کے ساتھ ساتھ گلائی کیشن مصنوعات کی مقدار بڑھ جاتی ہے۔ AGEs میں اضافے کو ذیابیطس میں کارآمد کردار ادا کرنے کے لیے تجویز کیا گیا ہے جس کی بنیاد پر یہ ظاہر ہوتا ہے کہ صحت مند عمر سے مماثل افراد کی نسبت ذیابیطس کے مریضوں میں جلد کی کولا جین میں ان کا مواد زیادہ تھا [8]۔ مزید یہ کہ خلیوں میں AGEs کی تشکیل اور جمع جلد کی عمر [8]، الزائمر کی بیماری [9]، ہائی بلڈ پریشر [10]، arteriosclerosis [1]، اور osteoporosis [12] میں ملوث ہے۔

Cistanche بڑھاپے کو روک سکتا ہے۔

AGEs مخصوص پیتھولوجیکل حالات کے تحت تیار ہوتے ہیں، جیسے آکسیڈیٹیو تناؤ، اور پروانفلامیٹری ثالث کے طور پر کام کرتے ہیں۔ وہ جسم میں تقریباً ہر قسم کے سیل کو متاثر کرتے ہیں۔ AGEs کے بہت سے سیلولر اثرات میں دو مختلف قسم کے AGE ریسیپٹرز شامل ہیں؛ ایک قسم سوزش اور ROS کی نسل میں اس کے انٹرا سیلولر سگنل کے راستوں کو چالو کرنے کے ذریعے ملوث ہے، جب کہ دوسری قسم ریسیپٹر ثالثی کے ذریعے AGEs کے انحطاط اور خاتمے میں ملوث ہے۔ اینڈوسیٹوسس اور لیزوزوم پر منحصر پروٹولوسیس (شکل 1)۔puritans وٹامن سیسابقہ ​​AGE ریسیپٹرز کے اثرات کو دبانے کی ضرورت ہے، جبکہ بعد کے اثرات کو سیلولر سنسنی کو روکنے یا اس میں تاخیر کرنے کے لیے فروغ دینے کی ضرورت ہے۔ سابقہ ​​گروپ میں AGE ریسیپٹرز میں ایڈوانس گلائیکیشن اینڈ پروڈکٹس (RAGE) اور AGE ریسیپٹر 2 (AGE-R2) کے لیے ریسیپٹر شامل ہیں، اور بعد والے گروپ میں فاسیکلن ای جی ایف نما، لامین قسم ای جی ایف نما، لنک ڈومین پر مشتمل شامل ہیں۔ سکیوینجر ریسیپٹر-1 (FEEL-1), FEEL-2,AGE-R1,AGE-R3, and CD36۔

AGE ریسیپٹرز میں AGE-R1،FEEL-1، FEEL-2، اور CD-36 خلیات میں ایکسٹرا سیلولر AGEs کے اینڈو سی ٹوسس اور فاگوزوم-لائسوسوم فیوژن کے ذریعے ان کے انحطاط میں حصہ ڈالتے ہیں۔ دیگر AGE ریسیپٹرز، جیسے AGE-R2، AGE-R3، اور RAGE، NADPH آکسیڈیز کو چالو کرنے کے ذریعے براہ راست یا بالواسطہ طور پر انٹرا سیلولر ROS نسل میں اضافہ کرتے ہیں۔

ڈی این اے، پروٹین، اور لپڈس کو پہنچنے والا نقصان، جو آکسیڈیٹیو تناؤ کے حالات کے تحت پیدا ہونے والے ROS کی وجہ سے ہوتا ہے، ایک بڑا سیلولر واقعہ ہے جو تیزی سے بڑھتی عمر اور جراثیمی بیماریوں کی نشوونما اور بڑھنے میں مضبوطی سے ملوث ہے [7,13]۔ لہذا، یہ ضروری ہے کہ ROS کے جمع ہونے کو روکا جائے اور عمر بڑھنے کے عمل کو کنٹرول کرنے کے لیے اینٹی آکسائیڈنٹس کی سطح کو بڑھایا جائے، جیسے کہ سپر آکسائیڈ ڈسموٹیز (SOD)[14]۔ مزید برآں، ایکواپورین (AQP)-1 اور AQP-3، جو سیل کی جھلی میں پانی کے مالیکیولز کی پارگمیتا کو کنٹرول کرتے ہیں، نیز ہائیلورونان اور ایلسٹن جلد کی نمی اور عمر بڑھانے میں حصہ لیتے ہیں۔ AQP-land AQP-3 کے اظہار کی سطح کو آکسیڈیٹیو تناؤ کے حالات میں کم ہوتے دکھایا گیا ہے [15]۔sistancheلچکدار ریشوں کا ایک بنیادی پروٹین، ایلسٹن کے انحطاط کو جھریوں کی تشکیل کا ایک سبب سمجھا جاتا ہے، جبکہ اس کی پائیدار اور مناسب پیداوار جلد کی تخلیق نو میں قریبی طور پر شامل ہے [16,17]۔ لہذا، جلد میں عمر بڑھنے کے رجحان کو دبانے کے لیے تناؤ کے حالات میں ان مالیکیولز کو برقرار رکھنا ضروری ہے۔

کئی سو پولی آکسومیٹیلیٹس (PMs)، جو دھاتی آکسائیڈ ہیں جو کئی ڈھانچے بناتے ہیں، کو آج تک ترکیب کیا گیا ہے، اور کچھ اینٹی نوپلاسٹک، اینٹی وائرل، اور اینٹی بیکٹیریل سرگرمیاں ظاہر کرتے ہیں[18]۔ ہم نے پہلے مضبوط اینٹی بیکٹیریل اور اینٹی وائرل سرگرمیوں کے ساتھ 2PMs (VB2 اور VB3) کی نشاندہی کی تھی اور یہ ظاہر کیا تھا کہ وہ وائرل ذرات سے منسلک ہوکر خلیوں میں وائرس کے آسنجن اور حملے کو روکتے ہیں[19]۔ بہترین حفظان صحت کی خصوصیات کے ساتھ مصنوعات کی ترقی مستحکم اور اینٹی مائکروبیل PMs کو مواد میں شامل کر کے ممکن ہو سکتی ہے [20]۔

موجودہ مطالعے میں، ہم نے AGEs اور ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ (H2O2) پر انسانی جلد کے فائبرو بلاسٹس کے تناؤ کے ردعمل پر PMs (VB2 اور VB3) کے اثرات کا جائزہ لیا اور ان کی عمر مخالف سرگرمیوں کا جائزہ لیا۔

2. مواد اور طریقہ

2.1.PMs

VB2(K1H[(VO)(SbWgO3)2]27H-O) اور VB3(Na[SbWg]-19H2O) کے بلک پاؤڈر ہمارے پیٹنٹ طریقہ (بین الاقوامی پیٹنٹ اشاعت نمبر:WO2{{11}) کا استعمال کرتے ہوئے ترکیب کیے گئے تھے۔ 19/230210۔ ہر بلک پاؤڈر کو مارٹر میں پیس کر انتہائی صاف پانی میں تحلیل کیا جاتا تھا، اور اس محلول کو 045-um فلٹر سے گزرنے کے بعد تجربات میں استعمال کیا جاتا تھا۔ 2.2۔مواد

DL-glyceraldehyde اور HzOg Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka, Japan) سے خریدے گئے تھے۔ بووائن سیرم البومین (BSA) (فریکشن V) سگما (سینٹ لوئس، ایم او، یو ایس اے) سے خریدا گیا تھا۔

2.3.BSA کا گلائکیشن

AGEs تیار کیے گئے تھے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [21]۔cistanche befíciosBSA (25 mg/mL) کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین، pH7.4 (PBS) میں 0.1 M DL-glyceraldehyde کے ساتھ 37 ڈگری پر 7 دنوں کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا، اور تجربات میں AGEs کے طور پر استعمال کیا گیا۔ 2.4 سیل کلچرز

عام انسانی ڈرمل فبرو بلاسٹس (NHDF) جو نوعمروں کی چمڑی (C-12300, PromoCell, Sickingenstr.63/65,69126 Heidelberg, Germany) سے اخذ کیے گئے تھے خاص فائبروبلاسٹ گروتھ میڈیم (C-23010, PromoCell, Sickingenstr. .63/65، 69126 ہائیڈلبرگ، جرمنی) 5 فیصد CO2 میں 37 ڈگری پر۔

2.5 AGE کے ساتھ علاج کیے جانے والے خلیوں میں AIGE ریسیپٹرز اور ہیٹ شاک پروٹینز (Hsps) کے mRNA اظہار پر VBs کے اثرات

NHDF کا علاج AGE(100 ug/mL) کے ساتھ 10 ug/mL VBs کی موجودگی یا غیر موجودگی میں 37 ڈگری پر 4 گھنٹے کے لیے کیا گیا اور کل RNA TRIzol reagent (Am-bion) کا استعمال کرتے ہوئے خلیوں سے نکالا گیا۔ AGE کے mRNA اظہار کی سطح رسیپٹرز اور Hsps کو مقداری ریورس ٹرانسکرپشن-پولیمریز چین ری ایکشن (qRT-PCR) طریقہ استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔

2.6. HzO2 کے ساتھ علاج کیے جانے والے خلیوں میں AQP-1 اور AQP-3 کے mRNA اظہار پر VBs کے اثرات

آکسیڈیٹیو تناؤ کے حالات میں VBs کے علاج کے اثرات کا اندازہ لگانے کے لیے، NHDF کا علاج {{0}}.2 mM HzO2 for2 h کے ساتھ کیا گیا، PBS کے ساتھ دھویا گیا، اور پھر 4 h کے لیے 10 ug/mL VBs کے ساتھ کلچر کیا گیا۔ ان کے حفاظتی اثرات کا اندازہ کرنے کے لیے، خلیات کو 10ug/mL VBs کے ساتھ 4h کے لیے علاج کیا گیا، دھویا گیا، اور 0.2 mM H-O2 for2h [22] کے ساتھ کلچر کیا گیا۔اینٹی ایجنگ cistancheاس کے بعد کل RNA نکالا گیا، اور mRNAs کے اظہار کی qRT-PCR کے ذریعے جانچ کی گئی۔

2.7.qRT-PCR

AGE ریسیپٹرز کی mRNA لیولز بشمول RAGE، FEEL-1 (Stabilin-1), FEEL-2 (Stabilin-2), CD-36, AGE-R1 ,AGE-R2، اور AGE-R3، Hsps میں سے، جیسے Hsp104، gp96، Hsp90، Hsp70، Hsp60، اور Hsp32، اور AQP کے، بشمول AQP-1 اور AQP-3، میں NHDF کو ایک قدمی QRT-PCR اور مخصوص پرائمر سیٹ (ٹیبل 1) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase کے mRNA کی سطح کو بھی اندرونی کنٹرول [23-28] کے طور پر ناپا گیا۔ ایک قدمی RT-PCR، جس میں الٹ ٹرانسکرپشن ری ایکشن اور qPCR کے ذریعے cDNA کی ترکیب ایک واحد ٹیسٹ ٹیوب میں کل RNA (500 ng) کا استعمال کرتے ہوئے PCR کے سانچے کے طور پر کی جا سکتی ہے، Luna Universal One-Step qRT- کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ پی سی آر کٹ۔ استعمال ہونے والا پی سی آر سسٹم ٹاکارا تھرمل سائیکلر ڈائس ریئل ٹائم سسٹم Ⅱ تھا۔cistanche کیا ہےلونا یونیورسل ون سٹیپ ری ایکشن مکس（2x）,10 μL,لونا وارم سٹارٹ RT اینزائم مکس ,0.8μL، اور ٹیمپلیٹ RNA کو ایک ہی رد عمل کے نظام میں ملایا گیا تھا، اور کل حجم کو نیوکلیز سے پاک پانی کے ساتھ 20 uL میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ رد عمل 30 سیکنڈ کے لیے 95 ڈگری پر 1 سائیکل اور 50 سیکنڈ کے لیے 95 ڈگری پر اور پھر 30 سیکنڈ کے لیے 60 ڈگری پر مشتمل تھا۔ mRNA اظہار میں ایک 4-گنا یا زیادہ تبدیلی (PCR کے 2 سائیکل) کو اہم سمجھا گیا۔

2.8. آکسیڈیٹیو تناؤ کے حالات کے تحت سیل کی قابل عملیت پر VBs کے اثرات

آکسیڈیٹیو تناؤ کے حالات کے تحت سیل کی قابل عملیت پر VBs کے اثرات کو جانچنے کے لیے، خلیوں کا علاج کیا گیا جیسا کہ مواد اور طریقوں کے سیکشن 2.6 میں بیان کیا گیا ہے اور خصوصی فبروبلاسٹ گروتھ میڈیم میں مزید 18 گھنٹے کے لیے کلچر کیا گیا۔ سیلز جمع کیے گئے تھے اور سیل گنتی کٹ-8 (DOJINDO, Tokyo, Japan) کا استعمال کرتے ہوئے قابل عملیت کی پیمائش کی گئی تھی۔

2.9.انٹرا سیلولر ROS پیداوار کی پیمائش

انٹرا سیلولر آر او ایس کو فلورومیٹری کے ذریعے ڈائی کلوروفلوورسین ڈائیسیٹیٹ (DCF-DA؛ Invitrogen، Carlsbad, CA,USA) کے ذریعے ماپا گیا۔ سیلز کا علاج کیا گیا جیسا کہ مواد اور طریقوں کے سیکشن 2.6 میں بیان کیا گیا ہے، PBS سے دھویا گیا، اور 10 uM DCFDA پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ 20 منٹ کے لیے 37 ڈگری۔ مائکروپلیٹ ریڈر (SYNERGY/HT، BioTek، Tokyo, Japan) کا استعمال کرتے ہوئے 525 nm کی اتیجیت طول موج پر فلورس سنس کی شدت کی پیمائش کرکے انٹرا سیلولر ROS کی سطحوں کا اندازہ لگایا گیا۔

2.10.ایس او ڈی کی پیداوار کی پیمائش

SOD کی پیمائش SOD Assay Kit (کیمین کیمیکل، این آربر، MI، USA) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ VBs اور H2O2 کے ساتھ علاج کیے جانے کے بعد، جیسا کہ مواد اور طریقوں کے سیکشن 2.6 میں بیان کیا گیا ہے، خلیات کو 24 گھنٹے کے لیے خصوصی فائبروبلاسٹ گروتھ میڈیم میں کلچر کیا گیا اور لیسز بفر کے اضافے کے بعد ہم آہنگ کیا گیا۔ سینٹرفیوگریشن کے بعد، نمونے کے 10 μL کو کمرے کے درجہ حرارت پر 200 uL xanthine oxidase کے ساتھ ملایا گیا، اور 450 nm پر جذب 30 منٹ کے بعد ماپا گیا۔

2.11۔ Hyaluronan اور Elastin کی پیداوار کی تشخیص

مواد اور طریقوں کے سیکشن 2.6 میں بیان کردہ VBs اور HzO2 کے ساتھ خلیوں کا علاج کرنے کے بعد، کلچر سپرنٹنٹ میں ہائیلورونان کی مقدار کو Hyaluronan Enzyme-linked Immunosorbent Assay کٹ (R&D sys-tems. Inc.، Minneapolis) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ ، MN، USA)۔ elastin کی پیداوار کی پیمائش کرنے کے لئے، خلیات کو لیس کیا گیا تھا، اور ایک واضح lysate تیار کیا گیا تھا. لیسیٹ میں ایلسٹن کی مقدار کو انسانی حل پذیر ایلسٹن ELISA Kit (Aviscera Bioscience Inc., SK00806-01, Santa Clara, CA,USA) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار میں طے کیا گیا تھا۔

2.12 شماریاتی تجزیہ

تمام تجربات سہ رخی میں کیے گئے تھے۔ نتائج کو اوسط ± SD کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ طلباء کے ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے اختلافات کی اہمیت کی جانچ کی گئی تھی، اور اختلافات کو اہم سمجھا جاتا تھا جب p<0.05.>

3.1 عمر کی حوصلہ افزائی والے تناؤ کے ماحول میں VBs کے بڑھاپے کے مخالف اثرات

3.1.1.AGE رسیپٹر mRNAs کا اظہار

ہم نے یہ ظاہر کیا کہ VB2 اور VB3 دونوں نے مختلف انسانی پیتھوجینز کے خلاف اہم اینٹی مائکروبیل سرگرمیوں کی نمائش کی جس سے مائکروجنزموں کو اعلی تعلق کے ساتھ پابند کیا گیا اور میزبان خلیوں کے ساتھ تعامل میں مداخلت کی۔ فنکشنل ملٹی پوٹینسی کے لیے VBs کی صلاحیتوں کو مزید واضح کرنے کے لیے، ہم نے یہاں جلد پر VBs کے بڑھاپے کے مخالف اثرات کا جائزہ لینے کی کوشش کی۔ NHDF کو تناؤ کے حالات میں VBs کے ساتھ مہذب کیا گیا تھا اور اینٹی ایجنگ مظاہر سے متعلق مختلف پیرامیٹرز کی سطح کی پیمائش کی گئی تھی۔ NHDF اہم خلیات ہیں جو ڈرمس میں موجود ہیں اور ایپیڈرمل کیراٹینوسائٹس کے ساتھ ساتھ ایپیڈرمس کی حالت کو متاثر کرتے ہیں۔ جب NHDF کو تن تنہا VB2 یا VB3 کے ساتھ مہذب کیا گیا تھا، تو AGE ریسیپٹرز کے mRNA اظہار کی سطح میں کوئی خاص تبدیلیاں نہیں دیکھی گئیں۔ تاہم، AGE کے ساتھ علاج نے جلد کے فائبرو بلاسٹس میں زیادہ تر AGE ریسیپٹرز کے اظہار کو متاثر کیا۔ اکیلے AGEs کے جواب میں AGE ریسیپٹرز کے mRNA اظہار کی سطح کے مقابلے میں، VB2 یا VB3 کے ساتھ ایک اضافی علاج نے واضح طور پر ان کی سطح میں اضافہ کیا۔ FEEL-1، FEEL-2، اور RAGE کے mRNA اظہار کی سطحوں میں واضح اضافہ ہوا ہے (شکل2)۔

3.1.2.Hsp mRNAs کا اظہار

ہم نے VB2 اور VB3 کی صلاحیتوں کی چھان بین کی تاکہ AGE- علاج شدہ NHDF میں Hsp mRNAs کے اظہار کو آمادہ کیا جا سکے۔ جب VB2 یا VB3 کو اکیلے شامل کیا گیا تو مختلف Hsp کے RNA کی سطحوں میں کوئی تبدیلی نہیں دیکھی گئی۔ تاہم، Hsp90 کے علاوہ تمام Hsps کے mRNA کی سطح میں AGE کے اضافے سے نمایاں اضافہ ہوا، اور VB2 اور VB3 (شکل 3) کے ساتھ اضافی علاج سے اس ردعمل کو نمایاں طور پر بڑھایا گیا۔

3.2. آکسیڈیٹیو تناؤ کے حالات کے تحت سیل کی قابل عملیت پر VBs کے اثرات

اس کے بعد کے تجربات میں، ہم نے جانچ کی کہ آیا VBs نے NHDF کے ردعمل کو آکسیڈیٹیو تناؤ کے لیے بہتر بنایا۔ جب NHDF کو 0.2 mM H2O2 کے ساتھ آکسیڈیٹیو تناؤ کا سامنا کرنا پڑا تو سیل کی بقا کی شرح 59 فیصد تک کم ہو گئی۔ جب VB2 یا VB3 کو اسی تناؤ کے حالات کے تحت ان خلیوں میں شامل کیا گیا تو، VB کے ارتکاز پر منحصر انداز میں سیل کی بقا کی شرح نمایاں طور پر بحال ہوئی۔ VBs کے ساتھ علاج کے بارے میں، بقا کی شرح VB2 کے ساتھ 300 ug/mL پر 76 فیصد اور VB3 کے ساتھ 300 ug/mL پر 78 فیصد ہو گئی۔ اس کے علاوہ، جب VB2 یا VB3 کے ساتھ علاج کے بعد NHDF کو آکسیڈیٹیو تناؤ کا سامنا کرنا پڑا تو خلیات کے آکسیڈیٹیو تناؤ کے خلاف مزاحم ہونے کا زیادہ امکان تھا۔ یہ حوصلہ افزائی مزاحمت مکمل طور پر ارتکاز olf VBs پر منحصر تھی اور VB2 اور VB3 کے ساتھ علاج کیے جانے والے خلیوں میں 10 ug/mL (Figure4) سے کم ارتکاز میں سیل کی عملداری میں نمایاں اضافہ دیکھا گیا۔

3.3. انٹرا سیلولر ROS اور SOD کی پیداوار پر VBs کے اثرات

اینٹی ایجنگ ایجنٹ کے طور پر VBs کے اثرات کی چھان بین کرنے کے لیے، آکسیڈیٹیو تناؤ سے متاثرہ انٹرا سیلولر ROS پروڈکشن پر VBs کے اثرات کا اندازہ فلوروسینٹ DCF-DA کو بطور اشارے (شکل 5a) استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ H2O2 کے سامنے آنے والے خلیوں میں فلوروسینس کی شدت میں اضافہ ہوا۔ 3۔{7}}عام خلیات سے گنا۔ جب H-O2 کے سامنے آنے کے بعد خلیوں کا VBs کے ساتھ علاج کیا گیا تو، ارتکاز پر منحصر انداز میں VBs کے علاج سے انٹرا سیلولر ROS کی پیداوار کو نمایاں طور پر دبا دیا گیا۔ مزید برآں، H2O2-حوصلہ افزائی ROSlevels کو VBs والے خلیات کے پچھلے علاج سے واضح طور پر دبا دیا گیا تھا۔

ROS کی پیداوار کے برعکس، H2O2 کے سامنے آنے کے بعد SOD کی سطح کنٹرول کے 56 فیصد تک کم ہو گئی اور VB علاج کے ساتھ ارتکاز پر منحصر انداز میں صحت یاب ہو گئی۔ مزید برآں، VBs کے ساتھ ایک سابقہ ​​علاج SOD کی پیداوار میں H2O2-کی حوصلہ افزائی کمی (شکل 5b) کے خلاف مزاحمت فراہم کرتا ہے۔

3.4.VBson کے اثرات AQP-1 اور AQP-3 کے mRNA اظہار اور آکسیڈیٹیو تناؤ کے حالات کے تحت Hyaluronan اور Elastin کی پیداوار پر

شکل 6a,b AQP-1 اور AQP-3 کی mRNA لیولز دکھاتا ہے، جو کہ سیل کی سطح کے مالیکیولز ہیں جو جلد کی نمی میں حصہ ڈالتے ہیں۔ AQP-1 اور AQP-3 کے mRNA اظہار میں واضح طور پر کمی واقع ہوئی جب NHDF کو H202 کے سامنے لایا گیا، لیکن VB علاج کے ذریعے آکسیڈیٹیو تناؤ کے بعد ارتکاز پر منحصر انداز میں بازیافت ہوا۔ VBs والے خلیات کے پچھلے علاج نے H2O2-کے خلاف مزاحمت فراہم کی جس میں mRNA اظہار کی سطحوں میں کمی واقع ہوئی۔ خلیوں میں VBs کے اثرات 1 ug/mL اور اس سے زیادہ کے ارتکاز میں دیکھے گئے، اور VB2 اور VB3 کے درمیان کوئی خاص فرق نہیں دیکھا گیا۔

شکل 7a،b کلچر سپرنٹنٹ میں ہائیلورونن کی مقدار اور انٹرا سیلولر ایلسٹن کی مقدار کو ظاہر کرتا ہے۔ H-O2 کے علاج کے بعد ہائیلورونان کی سطح تقریباً 50 فیصد تک کم ہو گئی ہے اور یہ کمی VB علاج کے ذریعے بحال نہیں ہوئی تھی۔ دوسری طرف، ہائیلورونن پرو ڈکشن میں ایچ او2-کی حوصلہ افزائی کی گئی کمی کو VBs والے خلیات کے زیادہ ارتکاز (شکل 7a) کے پچھلے علاج سے کم کیا گیا تھا۔

Hyaluronan کی طرح، elastin کی پیداوار H2O2 کے علاج کے بعد کنٹرول کے مقابلے میں 56 فیصد تک کم ہو گئی۔ یہ کمی VB علاج کے ذریعے حاصل نہیں کی گئی۔ دوسری طرف، ایلسٹن کی پیداوار میں HzOz کی حوصلہ افزائی کی کمی زیادہ تر VBs والے خلیات کے پچھلے علاج کی وجہ سے منسوخ ہوتی دکھائی دیتی ہے۔ ایلسٹین کی پیداوار کنٹرول سے اوپر کی سطح تک بڑھ گئی جب خلیات کو VB2 کے ساتھ 100 ug/mL یا اس سے زیادہ اور VB3 کے ساتھ 300 ug/mL (شکل 7b) پر علاج کیا گیا۔

4. بحث

ہم نے پہلے اطلاع دی تھی کہ VBs بہت مستحکم مالیکیول ہیں جو مضبوط اینٹی وائرل اور اینٹی بیکٹیریل سرگرمیوں کی نمائش کرتے ہیں [19]۔ ان نتائج کے علاوہ، VBs ان کی انتہائی کم سائٹوٹوکسیٹی کی خصوصیت رکھتے ہیں۔ درحقیقت، یہ پایا گیا ہے کہ وہ کسی بھی سائٹوٹوکسائٹی کا استعمال نہیں کرتے ہیں یہاں تک کہ جب خلیات کا علاج اس تحقیق میں استعمال ہونے والے خلیات سے 300 گنا زیادہ ارتکاز کے ساتھ کیا جاتا ہے۔ 2 PMs (VB2 اور VB3) کی استعداد کی چھان بین کرنے کے لیے، ہم نے یہاں جلد پر ان کے بڑھاپے کے مخالف اثرات کے ساتھ ساتھ AGE اور H-Oz کے سامنے آنے والے NHDF میں سائٹو پروٹیکٹو ردعمل پیدا کرنے کی صلاحیت پر توجہ مرکوز کی۔ حاصل کردہ نتائج نے واضح طور پر ظاہر کیا کہ VBs کو صرف عام جلد کے فائبرو بلاسٹس میں شامل کرنے سے خلیات میں نمایاں تبدیلیاں نہیں آئیں، بلکہ cytoprotective molecules کے اظہار کو منظم کیا اور تناؤ کے خطرے سے دوچار خلیوں میں منفی ردعمل کو بہتر بنایا۔ NHDF میں AGE ریسیپٹرز یا Hsps کا mRNA اظہار جب اکیلے استعمال کیا جاتا ہے (اعداد و شمار 2 اور 3) NHDF میں AGE، VB2 اور VB3 کے سامنے آنے سے AGE ریسیپٹرز کی نقل میں نمایاں اضافہ ہوا، خاص طور پر FEEL-1، FEEL-2، اور غصہ پچھلے مطالعے میں بتایا گیا ہے کہ FEEL-1 اور FEEL-2 نے خلیوں میں مفت AGEs کے اینڈوسیٹوسس میں حصہ لے کر اور lysosomes [29] کے ذریعے ان کے انحطاط میں حصہ لے کر cytoprotection میں کردار ادا کیا۔ دوسری طرف، RAGE NADPH آکسیڈیس کو چالو کرکے ROS کی نسل میں حصہ ڈالنے کے لیے جانا جاتا ہے۔ RAGE کی بہتر نقل کو ROS کی بڑھتی ہوئی پیداوار سے منسلک کیا جا سکتا ہے۔ RAGE کی صورت میں، نقل کے دوران الگ الگ تبدیلیاں ہوتی ہیں، جس کے نتیجے میں دو قسمیں ہوتی ہیں۔ ایک RAGE ہے جس میں انٹرا سیلولر ڈومینز کا فقدان ہے (C-terminally truncated RAGE: C-RAGE)، جو کہ خلیات سے خارج ہونے والا ایک حل پذیر RAGE پروٹین ہے، اور دوسرا RAGE ہے جس میں ایکسٹرا سیلولر V ڈومین کی کمی ہے (N-terminally truncated RAGE: N-RAGE) ) [30,31]۔ چونکہ یہ دو کٹے ہوئے RAGE نے AGE ریسیپٹرز کے طور پر کوئی کام نہیں کیا، RAGE کی بڑھتی ہوئی نقل ضروری طور پر ROS کی پیداوار کو فروغ نہیں دے سکتی۔ یہ مسئلہ مزید مطالعہ کی ضمانت دیتا ہے۔

اس کے بعد ہم نے Hsps کے mRNA اظہار پر VBs کے اثرات کی جانچ کی۔ Hsps کے اظہار کو عام طور پر ماحولیاتی تناؤ جیسے گرمی، الٹرا وایلیٹ لائٹ، اور ROS کے ذریعے منظم کیا جاتا ہے۔ ایچ ایس پی ایس نئے ترکیب شدہ پروٹین کو مستحکم کرکے یا تناؤ سے خراب ہونے والے پروٹینوں کو دوبارہ فولڈ کرنے میں مدد کرکے چیپیرون کے افعال انجام دیتا ہے۔ ایچ ایس پی 104 کو پروٹینوں کی تفریق میں ثالثی کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے [32] اور جی پی 96 انٹرا سیلولر اینٹیجن پریزنٹیشن میں شامل ہے [33]۔ Hsp90 پروٹین کو مناسب طریقے سے فولڈ کرنے اور تناؤ کے سامنے آنے پر مستحکم رہنے میں مدد کرتا ہے اور سختی سے منتخب پروٹینوں کی پختگی میں سہولت فراہم کرتا ہے [34]۔ Hsp70 کو پروٹین کے فولڈنگ، نقل و حمل اور انحطاط کو کنٹرول کرکے ان کے معیار کو منظم کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے [35,36]۔ Hsp60 مائٹوکونڈریا میں پروٹین کی تہہ کو برقرار رکھتا ہے اور مائٹوکونڈریا میں پروٹین کی جھلی کے دخول میں شامل ہے [37]۔ Hsp32 ہیم انحطاط میں ملوث ہے، جس کی مصنوعات اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمیاں ظاہر کرتی ہیں [38]۔ چونکہ VB2 اور VB3 دونوں اسی طرح AGE تناؤ کے شکار خلیوں میں Hsps کے اظہار کو دلانے کے قابل ہیں، VBs تناؤ کے حالات میں طاقتور سائٹو پروٹیکٹنگ ایجنٹ کے طور پر کام کرتے دکھائی دیتے ہیں۔

H202 کے سامنے آنے والے خلیوں کے ردعمل کی چھان بین کے لیے ایک تجربے میں، ہم نے سیل کی عملداری میں تقریباً 40 فیصد کمی دیکھی۔ اس کے برعکس، VB علاج نے ارتکاز پر منحصر انداز میں سیل کی عملداری میں نمایاں اضافہ کیا۔ مزید برآں، VBs کے ساتھ علاج کیے جانے والے اور پھر H2O2 (VBs کے پروفیلیکٹک اثرات) کے ساتھ لگائے گئے خلیوں کا ردعمل VB علاج سے پہلے H2O2 کے ساتھ لگائے گئے خلیوں کے مقابلے میں زیادہ مضبوط تھا (VBs کے علاج کے اثرات؛ شکل 4)۔ بنیادی میکانزم کو واضح کرنے کے لیے، ہم نے انٹرا سیلولر ROS اور SOD پروڈکشن لیول کا اندازہ لگایا۔ انٹرا سیلولر آر او ایس کی سطح کو HzO2 علاج کے ذریعہ نمایاں طور پر بڑھایا گیا تھا لیکن VB2 اور VB3 کے ذریعہ حراستی پر منحصر انداز میں دبایا گیا تھا۔ ROS کی پیداوار پر VBs کا یہ پروفیلیکٹک اثر اس کے علاج کے اثر سے بھی زیادہ مضبوط تھا (شکل 5a)۔ دوسری طرف، SOD کی پیداوار، ROS کا ایک طاقتور سکیوینجر، H2O2 علاج سے نمایاں طور پر کم ہو گیا تھا۔ VB علاج (شکل 5b) کے ذریعہ SOD کی مقدار کو قدرے بہتر کیا گیا تھا۔ لہذا، H2O2-کی حوصلہ افزائی سیل کی موت کا تعلق انٹرا سیلولر ROS کی سطح میں اضافے سے ہوتا ہے۔ چونکہ SOD پروڈکشن لیول واضح طور پر VBs سے متاثر نہیں ہوئے تھے، اس لیے VB علاج کے بعد ROS پروڈکشن میں جو کمی دیکھی گئی ہے وہ ROS جنریشن کے سیلولر ردعمل پر روکنے والے اثر کی وجہ سے ہو سکتی ہے۔ ابھی تک، اس مطالعے میں استعمال ہونے والا DCF-DA ROS کا پتہ لگانے کے لیے ایک ورسٹائل پروب ہے اور اس کی کوئی خاصیت نہیں ہے، اس لیے یہ واضح نہیں کیا گیا ہے کہ VBs کے علاج سے ROS کی کون سی انواع کو دبایا جاتا ہے، یا آیا ہر ROS پرجاتیوں کی پیداوار ہوتی ہے۔ VBs کے ذریعہ دبایا گیا۔ یہ مسئلہ مزید وضاحت کی ضمانت دیتا ہے۔

فائبرو بلاسٹس کو ایپیڈرمل موئسچرائزیشن میں کردار ادا کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے، اور AQP کے فعال کردار، خاص طور پر AQP-1 اور AQP-3، جو کہ فائبرو بلاسٹس میں ظاہر ہوتے ہیں اور خلیوں میں پانی کے مالیکیولز کی آمد میں شامل ہوتے ہیں، بڑھتی ہوئی توجہ کو اپنی طرف متوجہ کر رہا ہے. مزید یہ کہ خلیوں سے چھپا ہوا ہائیلورون جلد کی نمی میں ملوث ہے [39]۔ موجودہ مطالعہ میں، AQP-1 اور AQP-3 کے mRNA اظہار اور hyaluro-nan کے سراو دونوں کو آکسیڈیٹیو تناؤ (Iigures 6a,b اور 7a) سے کم کیا گیا تھا، لیکن علاج کیے جانے والے خلیوں میں بازیافت کیا گیا تھا۔ VB2 یا VB3۔ پچھلے نتائج کی طرح، آکسیڈیٹیو تناؤ پر VB کے حوصلہ افزائی کے اثرات زیادہ موثر تھے جب انہوں نے پروفیلیکٹیکل کام کیا (شکل 7a، b)۔ انسانوں میں، ہائیلورونن کا 50 فیصد جلد میں موجود ہوتا ہے [40]۔ Hyaluronan عمر بڑھنے کے ساتھ epidermis میں کم ہو جاتا ہے، جبکہ یہ dermis میں برقرار رہتا ہے۔ یہ تبدیلی نمی کے نقصان، لچک میں کمی، اور جلد کے سکڑنے میں معاون ہے [40]۔ مزید برآں، آکسیڈیٹیو تناؤ کو کولیجن اور ایلسٹن کو کم کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے، جس کے بعد جھریاں بنتی ہیں اور جلد کی تخلیق نو میں کمی آتی ہے۔41]۔ موجودہ مطالعہ میں، VBs کے پروفیلیکٹک استعمال نے ہائیلورونان اور ایلسٹن میں کمی کو آکسیڈیٹیو تناؤ کے حالات میں دبا دیا، جو کہ VB2 اور VB3 کی صلاحیت کو بڑھاپے سے بچانے والے ایجنٹوں کے طور پر تجویز کرتا ہے اور عمر بڑھنے کے خلاف سرگرمی کرنے کے لیے ان کے پروفیلیکٹک استعمال کو ظاہر کرتا ہے۔ اب تک، ہم نے تناؤ کے حالات میں انسانی فبرو بلوسٹس پر VB کے اثرات کا مظاہرہ کیا ہے، لیکن جلد پر VB کے بڑھاپے کے صحیح اثرات کو واضح کرنے کے لیے، keratinocytes پر VB کے اثر کا تعین کرنا اور vivo تجربات کرنا ضروری ہوگا۔ ہم ان مسائل پر ابتدائی مرحلے میں کام کرنے اور VB کے اثرات کو واضح کرنے کی کوشش کرتے ہیں۔ مزید برآں، اگر VBs کے فائدہ مند طریقہ کار واضح ہو جاتے ہیں، تو ہم VBs کو حفظان صحت کی مصنوعات اور کاسمیٹکس پر لاگو کرنے کی کوشش کرتے ہیں تاکہ وہ اعلیٰ قیمت والی مصنوعات تیار کی جا سکیں جو معاشرے میں زیادہ حصہ ڈالیں۔

5. نتائج

موجودہ نتائج پر مبنی VBs کے اثرات کا خلاصہ شکل 8 میں کیا گیا ہے۔ جب خلیات کو صرف VB2 یا VB3 کے ساتھ علاج کیا گیا تو مختلف پیرامیٹرز میں کوئی تبدیلی نہیں دیکھی گئی۔ تاہم، AGE اور HzOz کی وجہ سے تناؤ کے حالات میں، انٹرا سیلولر ROS کی پیداوار میں اضافہ کیا گیا تھا۔ VB2 اور VB3 نے ترجیحی طور پر سائٹو پروٹیکٹنگ مالیکیولز کے اظہار کی حوصلہ افزائی کی اور ROS کی پیداوار کو دبایا، جو بالآخر سنگین بیماریوں کا سبب بن سکتا ہے، جیسے arteriosclerosis اور کینسر کے ساتھ ساتھ عمر بڑھنے سے متعلق مظاہر۔ VB2 اور VB3 مرکبات ہیں جو دونوں مضبوط اینٹی وائرل اور اینٹی بیکٹیریل سرگرمیوں کی نمائش کرتے ہیں۔ موجودہ نتائج VB2 اور VB3 کی جلد کے لیے اینٹی ایجنگ ایجنٹس کے طور پر امکان ظاہر کرتے ہیں۔

تناؤ کے بغیر ایک عام ماحول میں، اینٹی آکسیڈنٹس نے ہومیوسٹیٹک طور پر ROS کو دوبارہ منتقل کیا۔ دوسری طرف، AGE اور H2O2 کی وجہ سے تناؤ کے حالات میں ROS کی پیداوار بڑھ جاتی ہے، جو عمر بڑھنے، سوزش اور ایتھروسکلروسیس کا باعث بن سکتی ہے۔ VBs ap-pear تناؤ کے حالات میں اینٹی آکسیڈینٹس کی پیداوار کو فروغ دینے اور خلیوں کے تناؤ کے ردعمل کو بڑھانے کی صلاحیت رکھتے ہیں۔

یہ مضمون ایپل سے لیا گیا ہے۔ سائنس 2021، 11، 11948۔ https://doi.org/10.3390/app112411948 https://www.mdpi.com/journal/applsci