ASK1 inhibitor NQDI‑1 چوہوں میں Subarachnoid Hemorrhage کے بعد ASK1/p38 اور JNK سگنلنگ پاتھ وے کے ذریعے آکسیڈیٹیو تناؤ اور نیوروپوپٹوس کو کم کرتا ہے۔

خلاصہ. سبارکنائیڈ ہیمرج (SAH) کے بعد آکسیڈیٹیو تناؤ اور نیوروپوپٹوس کلیدی پیتھولوجیکل عمل ہیں۔ موجودہ مطالعہ نے اپوپٹوسس سگنل ریگولیٹنگ کناز 1 (ASK1) کے اینٹی آکسیڈیشن اور اینٹی اپوپٹوٹک نیورو پروٹیکٹو اثرات کا جائزہ لیا ہے جو ایتھائل-2,7-ڈائی آکسو-2,7-ڈائی ہائیڈرو-3Ho1, چوہے کے ماڈل میں SAH کے بعد ابتدائی دماغی چوٹ (EBI) میں 3-de) کوئنولین1-کاربو آکسیلیٹ (NQDI-1)۔ کل 191 چوہوں کا استعمال کیا گیا تھا اور SAH ماڈل کو مونوفیلمنٹ پرفوریشن کا استعمال کرتے ہوئے حوصلہ افزائی کی گئی تھی۔ بعد میں مغربی بلوٹنگ کا استعمال پروٹین کے اینڈوجینس اظہار کی سطح کا پتہ لگانے کے لئے کیا گیا تھا۔ اس کے بعد امیونو فلوروسینس کا استعمال ASK1 کے اعصابی سیلولر لوکلائزیشن کی تصدیق کے لیے کیا گیا تھا۔ قلیل مدتی نیورولوجیکل فنکشن کا اندازہ ترمیم شدہ گارسیا اسکورز اور بیم بیلنس ٹیسٹ 24 گھنٹے SAH کے بعد کیا گیا، جبکہ طویل مدتی اعصابی فنکشن کا اندازہ روٹروڈ ٹیسٹ اور مورس واٹر میز ٹیسٹ کے ذریعے کیا گیا۔ نیوران کے اپوپٹوس کا اندازہ TUNEL سٹیننگ کے ذریعے کیا گیا تھا اور آکسیڈیٹیو تناؤ کا اندازہ SAH کے 24 گھنٹے بعد dihydroethidium سٹیننگ کے ذریعے کیا گیا تھا۔ فاسفوریلیٹڈ (p‑)ASK1 اور ASK1 کے پروٹین اظہار کی سطح SAH کے بعد بڑھ گئی۔ NQDI-1 کو SAH کے بعد 1 گھنٹہ کے اندر اندر انجکشن لگایا گیا تھا اور اس نے مختصر اور طویل مدتی اعصابی فعل دونوں میں نمایاں بہتری کا مظاہرہ کیا اور آکسیڈیٹیو تناؤ اور نیورونل اپوپٹوس کو نمایاں طور پر کم کیا۔ NQDI-1 کے انجیکشن نے p-ASK1، p-p38، p-JNK، 4 ہائیڈروکسینونینل، اور Bax کے پروٹین اظہار کی سطح میں نمایاں کمی کی اور ہیم آکسیجن 1 اور Bcl-2 کے پروٹین اظہار کی سطح میں نمایاں اضافہ کیا۔ p38 inhibitor BMS-582949 یا JNK inhibitor SP600125 کا استعمال بالترتیب p‑p38 یا p‑JNK کے پروٹین اظہار کی سطح میں نمایاں کمی اور آکسیڈیٹیو تناؤ اور نیورونل اپوپٹوس میں نمایاں کمی کا باعث بنا۔ تاہم، ان روکنے والوں نے p-ASK1 یا ASK1 پروٹین اظہار کی سطح پر اثر نہیں دکھایا۔ آخر میں، NQDI-1 کے ساتھ علاج سے اعصابی افعال میں بہتری آئی اور چوہوں میں SAH کے بعد EBI میں آکسیڈیٹیو تناؤ اور نیورونل اپوپٹوسس میں کمی آئی، ممکنہ طور پر ASK1 فاسفوریلیشن اور ASK1/p38 اور JNK سگنلنگ پاتھ وے کی روک تھام کے ذریعے۔ NQDI-1 کو SAH کے مریضوں کے علاج کے لیے ممکنہ ایجنٹ سمجھا جا سکتا ہے۔

سیستانچ کا گلائکوسائیڈ دل اور جگر کے بافتوں میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بھی بڑھا سکتا ہے، اور ہر ٹشو میں لیپوفسن اور ایم ڈی اے کے مواد کو نمایاں طور پر کم کر سکتا ہے، مختلف رد عمل آکسیجن ریڈیکلز (OH-، H₂O₂، وغیرہ) کو مؤثر طریقے سے ختم کر سکتا ہے اور DNA کو پہنچنے والے نقصان سے بچا سکتا ہے۔ OH ریڈیکلز کے ذریعے۔ Cistanche phenylethanoid glycosides میں آزاد ریڈیکلز کو صاف کرنے کی مضبوط صلاحیت ہوتی ہے، وٹامن C سے زیادہ کم کرنے کی صلاحیت، سپرم معطلی میں SOD کی سرگرمی کو بہتر بناتی ہے، MDA کے مواد کو کم کرتی ہے، اور سپرم کی جھلی کے کام پر ایک خاص حفاظتی اثر رکھتی ہے۔ Cistanche polysaccharides D-galactose کی وجہ سے تجرباتی طور پر حساس چوہوں کے erythrocytes اور پھیپھڑوں کے ٹشوز میں SOD اور GSH-Px کی سرگرمی کو بڑھا سکتے ہیں، نیز پھیپھڑوں اور پلازما میں MDA اور کولیجن کے مواد کو کم کر سکتے ہیں، اور elastin کے مواد کو بڑھا سکتے ہیں۔ ڈی پی پی ایچ پر اچھا اثر ڈالتا ہے، سینسنٹ چوہوں میں ہائپوکسیا کے وقت کو طول دیتا ہے، سیرم میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بہتر بناتا ہے، اور تجرباتی طور پر سنسنی والے چوہوں میں پھیپھڑوں کے جسمانی انحطاط میں تاخیر کرتا ہے، سیلولر مورفولوجیکل انحطاط کے ساتھ، تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ Cistanche میں اینٹی آکسیڈنٹ کی اچھی صلاحیت ہے۔ اور جلد کی بڑھتی ہوئی بیماریوں کو روکنے اور علاج کرنے کے لیے ایک دوا بننے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ ایک ہی وقت میں، Cistanche میں echinacoside میں DPPH فری ریڈیکلز کو ختم کرنے کی قابل ذکر صلاحیت ہے اور یہ رد عمل آکسیجن کی انواع کو ختم کر سکتا ہے، آزاد ریڈیکل-حوصلہ افزائی کولیجن کے انحطاط کو روک سکتا ہے، اور تھامین فری ریڈیکل ایون کے نقصان پر بھی اچھا مرمتی اثر رکھتا ہے۔

اینٹی ایجنگ Cistanche Para Que Serve پر کلک کریں۔

【مزید معلومات کے لیے: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

مطلوبہ الفاظ: subarachnoid hemorrhage, NQDI-1, apoptosis سگنل ریگولیٹنگ کناز 1, oxidative stress, apoptosis, ابتدائی دماغی چوٹ

تعارف

Subarachnoid hemorrhage (SAH) ایک شدید شدید دماغی بیماری ہے جو دماغ کی سبارکنائیڈ جگہ میں خون کے بہاؤ کی وجہ سے ہوتی ہے (1)۔ تاہم، فی الحال، SAH کے بعد دماغی بافتوں کو پہنچنے والے نقصان کو بہتر بنانے کے لیے کوئی موثر دوائیں دستیاب نہیں ہیں جو کہ خون بہنے کی روک تھام کے بعد ہیں (2)۔ لہذا، SAH کے بعد دماغی چوٹ کے طریقہ کار کے بارے میں مزید مطالعات اور SAH کی تشخیص کی بہتری کے لیے مناسب علاج کے اختیارات کی تلاش کی فوری ضرورت ہے۔

ابتدائی دماغی چوٹ (EBI) سے مراد دماغی بافتوں کے ثانوی نقصان سے ہے جو متعدد جسمانی خلل اور پیتھولوجیکل تبدیلیوں کی ایک رینج کی وجہ سے ہوتا ہے جو SAH (3) کے آغاز کے 72 گھنٹے کے اندر ہوتی ہے۔ SAH کے بعد شدید ردعمل کے مرحلے میں، چوٹ سبارچنوئڈ اسپیس میں بڑی مقدار میں خون کے داخل ہونے سے شروع ہوتی ہے اور اس کے بعد پیتھولوجیکل زخموں کا ایک سلسلہ شروع ہوتا ہے (4)۔ چونکہ مائٹوکونڈریا خاص طور پر ہائپوکسیا اور اسکیمک چوٹ کے لیے حساس ہوتا ہے، مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن SAH (5) کے بعد ہونے والی بنیادی پیتھولوجیکل چوٹوں میں سے ایک ہے۔ بڑی تعداد میں رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کو جاری کیا جاتا ہے، جو آکسیڈیٹیو تناؤ کو بڑھانے اور مائٹوکونڈریل اپوپٹوٹک راستے کو چالو کرنے کا باعث بنتا ہے، جس سے مائٹوکونڈریل چوٹ اور dysfunction (6) ہوتا ہے۔ لہذا، علاج کے طریقے جو آکسیڈیٹیو تناؤ اور اپوپٹوسس کو کم کرتے ہیں SAH کی تشخیص کی بہتری کے لیے کلیدی حیثیت رکھتے ہیں۔

اپوپٹوس سگنل ریگولیٹنگ کناز 1 (ASK1)، مائٹوجن ایکٹیویٹڈ پروٹین 3 کناز (MAP3K) فیملی کا ایک رکن، متعدد مختلف قسم کے سیلولر تناؤ سے چالو ہوتا ہے اور اس کا آکسیڈیٹیو تناؤ اور اپوپٹوسس (7) میں اہم کردار ہوتا ہے۔ ماؤس ہپپوکیمپل نیوران کی بنیادی ثقافتوں میں، Rho kinase inhibitor fasudil ‑amyloid-حوصلہ افزائی فاسفوریلیٹڈ (p‑)ASK1 کی بلندی کو ریورس کرتا ہے، جو الزائمر کی بیماری میں نیورونل اپوپٹوس کو کم کرتا ہے (8)۔ تاہم، ہماری بہترین معلومات کے مطابق، SAH کے بعد ASK1 کو نشانہ بنانے والے علاج کے اختیارات کا جائزہ نہیں لیا گیا ہے۔

Ethyl‑2,7‑dioxo‑2,7‑dihydro-3H-naphtho(1,2,3-de)quinoline1-carboxylate (NQDI‑1) بتایا گیا ہے۔ ASK1 کا ایک مخصوص روکنے والا اور وٹرو کناز اسسیس (9,10) کا استعمال کرتے ہوئے توثیق کیا گیا ہے۔ پچھلے مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ NQDI-1 ASK1 سرگرمی (11,12) کی روک تھام کے ذریعے متعدد بیماریوں کے علاج میں مؤثر ثابت ہو سکتا ہے۔ NQDI‑1 ASK1 (13) کے ایکٹیویشن کی روک تھام کے ذریعے ڈمبگرنتی گرینولوسا سیلز میں مائکرو سسٹین-LR-حوصلہ افزائی مائٹوکونڈریل نقصان اور اپوپٹوسس کو کم کرتا ہے۔ مزید برآں، انڈومیتھاسن اینڈوپلاسمک ریٹیکولم اسٹریس (14) کی ASK1 ایکٹیویشن کے ذریعے گلیل سیلز میں اپوپٹوٹک جھرنوں کے ردعمل کو آمادہ کر سکتا ہے۔ لہٰذا، ASK1-مخصوص روک تھام کرنے والا NQDI-1 ASK1 کی سرگرمی کو روکنے کے ذریعے SAH کے بعد نیورو پروٹیکٹو اثرات مرتب کر سکتا ہے۔ p38 اور JNK کو ASK1 کے ڈاون اسٹریم سگنلنگ پاتھ ویز بنانے کے لیے سمجھا جاتا ہے۔ متحرک p38 اور JNK مختلف قسم کے ذیلی ذخیروں کو مزید فعال کر سکتے ہیں، بشمول نیوکلیئر ٹرانسکرپشن فیکٹرز کے ساتھ ساتھ پروٹین کنیز اور دیگر فنکشنل پروٹین، جو آکسیڈیٹیو تناؤ اور اپوپٹوس (15) کے آغاز کا باعث بنتے ہیں۔

یہ قیاس کیا گیا تھا کہ ASK1 inhibitor NQDI-1 نیورو پروٹیکٹو اثرات مرتب کرتا ہے اور چوہوں میں SAH کے بعد EBI میں ASK1/p38 اور JNK سگنلنگ پاتھ وے کے ذریعے آکسیڈیٹیو تناؤ اور نیوروپپٹوس کو کم کرتا ہے۔

مواد اور طریقے

تجرباتی جانور۔جانوروں کے تجربات کو سینٹرل ساؤتھ یونیورسٹی کے تجرباتی جانوروں کی اخلاقیات کمیٹی (منظوری نمبر 2019sydw0104) نے منظور کیا تھا۔ 280‑320 گرام وزنی کل 191 نر Sprague-Dawley (SD) چوہوں کو ایک مستقل درجہ حرارت (21‑23˚C) اور نمی (45‑50 فیصد) ماحول میں 12/12‑h روشنی/تاریک چکر کے ساتھ رکھا گیا تھا۔ اور پانی اور خوراک تک مفت رسائی تھی۔ جانوروں کے تمام تجربات اینیمل ریسرچ: رپورٹنگ ان ویوو تجرباتی رہنما خطوط (16) کے مطابق کیے گئے تھے اور یہ نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ (NIH) گائیڈ فار دی کیئر اینڈ یوز آف اینیمل گائیڈ لائنز (17) کے ذریعے کیے گئے تھے۔ جب چوہے تجربے کے مقررہ وقت پر پہنچ گئے یا یوتھناسیا کے مخصوص معیار پر پورا اترے [24 گھنٹے کے لیے مکمل بھوک نہ لگنا یا 3 دن تک بھوک نہ لگنا (معمول سے 50 فیصد کم)، کھانے پینے سے قاصر ہونا، یا ان کا اندازہ لگایا گیا موت کے قریب (خود کو نقصان پہنچانے والا رویہ، غیر معمولی کرنسی، سانس کی تکلیف، وغیرہ)]، چوہوں کو کاربن ڈائی آکسائیڈ ایتھاناسیا ڈیوائس میں رکھا گیا تھا جس میں CO2 حجم کی نقل مکانی کی شرح 30 فیصد / منٹ (18) پر رکھی گئی تھی۔ موت کی تصدیق سانس لینے اور دل کی دھڑکن بند ہونے اور شاگردوں کے پھیلاؤ سے ہوئی۔ تمام چوہوں کی لاشوں کو تھیلے میں بند کر کے ماحول کے لحاظ سے ٹھوس ٹھکانے لگانے کے لیے منجمد کر دیا گیا تھا۔

SAH ماڈل۔ The rat SAH model was induced using monofil‑  ment perforation (19). After anesthetizing the rats (induction,  3% isoflurane; maintenance, 2% isoflurane), the left common,   internal and external carotid arteries of the rats were exposed.  The distal external carotid artery was clipped using cauterize‑ to form the stump of the external carotid artery. A 3‑cm   sharpened model 4‑0 proline wire was inserted ~2 cm through the external carotid artery until a slight resistance was felt. The puncture line was slowly advanced by ~3 mm to puncture the arterial wall. Brain tissue was removed at the corresponding time points predetermined for the experiment. If a blood clot was found on the ventral side of the brain tissue, it indicated that the rat had SAH. Rats with a score >SAH گریڈنگ سکور کی تشخیص کے ذریعے 8 کو تجرباتی تقاضوں کو پورا کرنے اور ایک کامیاب ماڈل سمجھا جاتا تھا۔ شیم گروپ کا طریقہ کار SAH گروپ کی طرح تھا، اس استثنا کے ساتھ کہ 4‑0 پرولین تار شریان کی دیوار میں سوراخ نہیں کرتا تھا۔ سانس، دل کی دھڑکن، جلد کا رنگ، اور پیڈل اضطراری کی نگرانی ہر 5 منٹ بعد جراحی اور بے ہوشی کے علاج کے تمام مراحل میں کی گئی۔ ان میں سے 23 چوہے مر گئے اور 8 چوہوں کو خارج کر دیا گیا، اور ان اموات اور اخراج کو نئے SAH ماڈل والے چوہوں نے پورا کیا۔

SAH کی شدتSAH (20) کے بعد SAH گریڈنگ سکور 24 گھنٹے کا استعمال کرتے ہوئے SAH کی شدت کا اندازہ لگایا گیا۔ دماغ کے بافتوں کے وینٹرل سائیڈ کو 6 علاقوں میں تقسیم کیا گیا تھا، ہر ایک کو خون کے جمنے کی مقدار اور خون کی نالیوں کو کتنی اچھی طرح سے دھندلا دیا گیا تھا اس پر منحصر ہے کہ ہر ایک کو 0‑3 درجہ دیا گیا ہے: 0 کا اسکور ظاہر کرتا ہے کہ کوئی جمنا نہیں ہے، 1 تھوڑے سے جمنے کی نشاندہی کرتا ہے، 2 جمنے کی معتدل مقدار کی نشاندہی کرتا ہے لیکن کھوپڑی کی بنیاد پر بڑے برتن اب بھی قابل شناخت ہیں، اور 3 کھوپڑی کے اڈے پر بہت زیادہ جمنے اور ناقابل شناخت برتنوں کی نشاندہی کرتا ہے۔ کل سکور (0-18) کا حساب لگانے کے لیے چھ علاقائی سکور کا خلاصہ کیا گیا، جہاں زیادہ اسکور زیادہ شدید نکسیر کی نشاندہی کرتے ہیں۔ 8 سے کم یا اس کے برابر کے کل SAH گریڈ کے اسکور والے چوہوں کو ہلکا SAH سمجھا جاتا تھا، بعد کے تجربات سے خارج کر دیا جاتا تھا، اور نئے ماڈل والے چوہوں سے تبدیل کیا جاتا تھا۔

منشیات کی انتظامیہ۔دماغی بافتوں میں منشیات کے ارتکاز کو جگر اور دیگر عوامل سے آزادانہ طور پر زیادہ درست طریقے سے منظم کرنے کے قابل بنانے کے لیے، siRNAs اور NQDI-1 کا انتظام intracerebroventricularly انجیکشن (21) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ اینستھیٹائزیشن کے بعد (انڈکشن، 3 فیصد آئسو فلورین؛ مینٹیننس، 2 فیصد آئسو فلورین)، چوہوں کو دماغی سٹیریوٹیکسک اپریٹس پر لگایا گیا تھا۔ مائیکرو انجیکٹر کو بریگما پر 10 پیچھے، 1.5 دائیں، اور 3.3 ملی میٹر گہرائی پر طے کیا گیا تھا۔ ASK1 siRNA (cat. no. 4390771; Thermo Fisher Scientific, Inc.) یا Scr siRNA کنٹرول (cat. no. 4390843; Thermo Fisher Scientific, Inc.) کو 5 µl نیوکلیز سے پاک جراثیم سے پاک پانی میں تحلیل کیا گیا تھا۔ 500 pmol اور SAH سے پہلے 48 گھنٹے زیر انتظام۔ ASK1 siRNA کی ترتیب حسب ذیل تھی: Sense 5'‑CGG CAGACAUUGUUCAAtt‑3' اور antisense 5'‑UUGAUA ACAAUGUCUGCCGtc‑3'۔ اسی طرح کے مطالعہ (22) میں رپورٹ کردہ منشیات کی تعداد اور خوراکیں اور NQDI-1 کی حل پذیری کا استعمال موجودہ مطالعہ میں استعمال ہونے والے ارتکاز کا تعین کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ NQDI‑1 کی تین خوراکیں (1, 3, اور 10 µg/kg; Selleck کیمیکلز) یا گاڑی کا محلول 5 µl/چوہا کے کل حجم میں SAH کے 1 گھنٹے بعد لگایا گیا۔ BMS‑582949 (100 mg/kg؛ Selleck کیمیکلز)، SP600125 (30 mg/kg؛ Selleck کیمیکلز)، اور گاڑیوں کے محلول خون کے دماغی رکاوٹ کو عبور کر سکتے ہیں اور SAH (23,24) کے بعد 1 گھنٹہ انٹراپریٹونلی طور پر چلائے گئے۔

قلیل مدتی اعصابی فعل۔ترمیم شدہ گارسیا سکور اور بیم بیلنس سکور SAH کے 24 گھنٹے بعد قلیل مدتی اعصابی فعل کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال کیے گئے۔ ترمیم شدہ گارسیا سکور کو مندرجہ ذیل چھ زمروں میں تقسیم کیا گیا تھا: رضاکارانہ حرکت، رضاکارانہ اعضاء کی نقل و حرکت، فورپاو توسیع، چڑھنے کی صلاحیت، سومیٹوسینسری ردعمل، اور ٹینٹیکل رسپانس، جن میں سے ہر ایک کو انفرادی طور پر اسکور کیا گیا تھا اور اس کا خلاصہ 3‑18 سے لے کر کل سکور دیا گیا تھا۔ (25)۔ بہتر اعصابی فعل کی نشاندہی کرنے کے لیے اعلیٰ سکور پر غور کیا گیا۔ بیم بیلنس سکور کے لیے، چوہوں کو 1 منٹ کے لیے بیم پر رکھا گیا تھا اور پیدل فاصلے (26) کی بنیاد پر 0‑4 کے اسکور کا اندازہ لگایا گیا تھا۔ بہتر اعصابی فعل کی نشاندہی کرنے کے لیے اعلیٰ سکور پر غور کیا گیا۔

طویل مدتی اعصابی فعل۔SAH ماڈلنگ سے پہلے اسی ابتدائی رفتار اور ایکسلریشن کا استعمال کرتے ہوئے چوہوں پر روٹروڈ پری موافقت کے تجربات کیے گئے تھے۔ چوہوں کو SAH (27) کے بعد 7، 14 اور 21 دنوں کو روٹروڈ ٹیسٹ کے لیے Rotamex گھومنے والے بار ٹیسٹر (کولمبس انسٹرومینٹس) پر رکھا گیا تھا۔ سب سے پہلے، روٹروڈ کی ابتدائی رفتار 5 ریوولز فی منٹ اور ایکسلریشن 2 ریوولیشن فی 5 سیکنڈ پر سیٹ کی گئی تھی۔ چوہوں پر ڈالنے کے بعد، چوہوں کے گرنے میں تاخیر ریکارڈ کی گئی۔ پھر چوہوں کو 1 گھنٹہ آرام کرنے دیا گیا۔ آخر میں، چوہوں کے گرنے میں تاخیر کا دوبارہ تجربہ 5 انقلابات فی منٹ کی ابتدائی رفتار اور 2 انقلابات فی 5 سیکنڈ کے سرعت سے کیا گیا۔ چوہے میں بہتر موٹر کوآرڈینیشن کی نشاندہی کرنے کے لیے طویل زوال میں تاخیر پر غور کیا گیا۔ SAH ماڈلنگ کے بعد ہفتہ 4 میں، مورس واٹر میز ٹیسٹ کا استعمال چوہوں کی سیکھنے کی یادداشت اور مقامی واقفیت کا اندازہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا (27)۔ تیراکی کی سیکھنے کی مشق اور پانی کی سطح کے نیچے واقع پلیٹ فارم کو تلاش کرنے کی مشقیں 1 دن سے 5 دن تک ہفتہ 4 (دن 28-33 بعد از SAH) کی گئیں اور تیراکی کی رفتار، فرار میں تاخیر، اور تیراکی کا فاصلہ ریکارڈ کیا گیا۔ آخری دن، پلیٹ فارم کو جانچ کے لیے ہٹا دیا گیا، اور تیراکی کی رفتار، تیراکی کا فاصلہ، اور پروب کواڈرینٹ کا دورانیہ 60 سیکنڈ کے لیے ریکارڈ کیا گیا۔

اگر داغ لگانا۔4˚C نمکین اور 4˚C کے ترتیب وار پرفیوژن کے بعد، دماغ کے بافتوں سے خون نکالنے کے لیے دل سے 4 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ، برقرار دماغی ٹشو حاصل کیا گیا۔ سوکروز گریڈینٹ ڈی ہائیڈریشن کے بعد، دماغی بافتوں کو پھر کورونل پوزیشن میں 10‑µm حصوں میں کاٹا گیا اور ‑20˚C پر محفوظ کیا گیا۔ IF سٹیننگ کا استعمال عصبی خلیوں کے ساتھ ASK1 کے ہم آہنگی کا اندازہ لگانے کے لیے کیا گیا تھا۔ منجمد ٹشو سیکشن کو 5 فیصد گدھے کے سیرم (کیٹ نمبر G1217‑5ML؛ ووہان سروس ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ) کا استعمال کرتے ہوئے کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے بلاک کیا گیا تھا اور پرائمری اینٹی باڈیز کے ساتھ رات بھر 4˚C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا: Anti‑ASK1 (ماؤس؛ 1:200؛ بلی نمبر 67072‑1‑Ig؛ ProteinTech Group, Inc.)، anti-NeuN (خرگوش؛ 1:200؛ بلی نمبر 26975‑1‑AP؛ ProteinTech Group, Inc.) ، اینٹی آئنائزڈ کیلشیم بائنڈنگ اڈاپٹر مالیکیول -1 (Iba-1؛ خرگوش؛ 1:200؛ بلی نمبر 10904‑1‑AP؛ پروٹین ٹیک گروپ، انکارپوریٹڈ)، اور اینٹی گلیل فائبریلری ایسڈک پروٹین (GFAP؛ GFAP؛ ؛ 1:200؛ بلی نمبر ab4674؛ Abcam)۔ اس کے بعد ٹشو سیکشنز کو کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے تک اسی فلوروسینٹ سیکنڈری اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا: Alexa Fluor® 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H plus L) (cat. no. 715-585-150; 150:150; ؛ Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti‑Rabbit IgG (H plus L) (بلی نمبر 711‑545‑152; 1:500; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) اور Alexa48، AffiniPure گدھا اینٹی چکن IgY (IgG) (H plus L) (cat. no. 703‑545‑155; 1:500; Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.)۔ اس کے بعد، انہیں 2 µg/ml DAPI (cat. no. G1012‑100ML؛ Wuhan Service Technology Co., Ltd.) کا استعمال کرتے ہوئے کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے سیل نیوکلی کے لیے داغ دیا گیا۔ حصوں کا اندازہ اولمپس BX53 فلوروسینس مائکروسکوپ (Olympus Corporation) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور تصاویر کی گئی تھیں۔

ڈائی ہائیڈروتھیڈیم (DHE) کا داغ۔دماغ کے آکسیڈیٹیو تناؤ (28) کا اندازہ کرنے کے لئے ڈی ایچ ای سٹیننگ کی گئی تھی۔ منجمد دماغی بافتوں کے حصوں کو 2 µmol/l DHE (تھرمو فشر سائنٹیفک، انکارپوریٹڈ) کے ساتھ اندھیرے میں 30 منٹ کے لیے 37˚C پر لگایا گیا تھا۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے 2 µg/ml DAPI کا استعمال کرتے ہوئے سیل نیوکلی پر داغ ڈالنے کے بعد، Olympus BX53 فلوروسینس مائیکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے حصوں کا اندازہ لگایا گیا۔ دماغ کے ہر ٹشو سے کل چھ حصے تصادفی طور پر منتخب کیے گئے تھے اور ہر حصے میں چھ علاقوں کو تصادفی طور پر امیجنگ کے لیے منتخب کیا گیا تھا۔ DHE-مثبت خلیوں کی تعداد کو ImageJ 1.4 سافٹ ویئر (نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ) کا استعمال کرتے ہوئے شمار کیا گیا تھا اور اوسط کا حساب لگایا گیا تھا اور ہر دماغی ٹشو سیکشن کے لیے حتمی فیصد کے طور پر لیا گیا تھا۔

TUNEL داغاپوپٹوٹک نیوران (29) کی فیصد کا اندازہ کرنے کے لئے ٹونیل داغ کا استعمال کیا گیا تھا۔ منجمد ٹشو سیکشن کو کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے 5 فیصد گدھے کے سیرم کا استعمال کرتے ہوئے بلاک کیا گیا تھا اور پرائمری اینٹی باڈی اینٹی-نیو این (خرگوش؛ 1:200؛ بلی نمبر 26975‑1‑AP؛ ProteinTech Group, Inc) کے ساتھ رات بھر 4˚C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ .) اس کے بعد ٹشو سیکشنز کو فلوروسینٹ سیکنڈری اینٹی باڈی الیکسا فلور 488 AffiniPure Donkey Anti‑Rabbit IgG (H plus L) (بلی نمبر 711‑545‑152؛ 1:500؛ جیکسن امیونو ریسرچ لیبارٹریز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ کمرے کے درجہ حرارت پر. مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق ون سٹیپ ٹونیل اپوپٹوس ایسے کٹ (بلی نمبر C1090؛ بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیوٹیکنالوجی) کا استعمال کرتے ہوئے ٹونیل سٹیننگ کی گئی تھی۔ آخر میں، کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے 2 µg/ml DAPI کا استعمال کرتے ہوئے سیل نیوکللی کے لیے ٹشو سیکشنز کو داغ دیا گیا۔ TUNEL گنتی کے مقامات کا بے ترتیب انتخاب اور ہر سیکشن کے لیے TUNEL- مثبت نیوران کا حساب DHE گنتی کے لیے مذکورہ بالا طریقہ استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔

ویسٹرن بلوٹنگ (WB)۔ڈبلیو بی کا استعمال پروٹین کے اظہار کی سطح کو نیم مقدار میں کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ دماغ کے بافتوں سے خون نکالنے کے لیے دل سے 4˚C نمکین کے پرفیوژن کے بعد، برقرار دماغی ٹشو حاصل کیا گیا۔ پچھلے مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ SAH ماڈل، بائیں طرف کے اینڈو ویسکولر پنکچر کے ذریعے پیدا کیا گیا ہے، جس کے نتیجے میں خون بہنے والے واقعات کی طرف ایک حد تک تعصب ہوتا ہے اور بائیں طرف والے دماغی بافتوں کو پہنچنے والے نقصان کے لحاظ سے نسبتاً شدید ہو سکتا ہے (30)۔ لہذا، SAH ماڈلنگ کے بعد پیتھولوجیکل نقصان کا اندازہ کرنے کے لئے بائیں طرف والے دماغ کے ٹشو کا استعمال کیا گیا تھا۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق RIPA lysis سلوشن (cat. no. P0013B؛ Beyotime Institute of Biotechnology) کا استعمال کرتے ہوئے دماغ کے ٹشو پروٹین نکالے گئے تھے۔ نمونوں کی پروٹین کی حراستی کا تعین BCA پرکھ (کیٹ نمبر P0012؛ بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیوٹیکنالوجی) کے ذریعے کیا گیا تھا اور اس کے بعد مختلف مقدار میں ڈبل ڈسٹلڈ پانی شامل کرکے 5 µg/µl میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ 5 µl کے 5 µg/µl پروٹین کے نمونے ہر لین میں شامل کیے گئے تھے اور ان پروٹین کے نمونوں کو SDS-PAGE الیکٹروفورسس کے ذریعہ 10 فیصد جیلوں پر الگ کیا گیا تھا اور PVDF جھلیوں میں منتقل کیا گیا تھا۔ 5 فیصد غیر چکنائی والے پاؤڈر دودھ (بلی نمبر P0216‑300g؛ بیو ٹائم انسٹی ٹیوٹ آف بائیوٹیکنالوجی) کا استعمال کرتے ہوئے کمرے کے درجہ حرارت پر جھلیوں کو 2 گھنٹے کے لیے بلاک کر دیا گیا تھا۔ جھلیوں کو رات بھر 4˚C پر پرائمری اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیو کیا گیا تھا: Anti-p‑ASK1 (Ser‑83؛ 1:1،000؛ بلی نمبر MA5‑28020؛ تھرمو فشر سائنٹیفک، Inc .), anti-ASK1 (1:1,000; بلی نمبر 8662; سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی, Inc.), anti-p‑p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (1:1) ,000؛ بلی نمبر 9216؛ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، انکارپوریشن، اینٹی-p38 MAPK (1:1,000؛ بلی نمبر 8690؛ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، انکارپوریٹڈ)، اینٹی فاسفو سٹریس ایکٹیویٹڈ پروٹین کناز/جون امینو ٹرمینل کناز (فاسفو-SAPK/JNK) (Thr183/Tyr185؛ 1،000؛ بلی نمبر 9255؛ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، انکارپوریٹڈ)، اینٹی SAPK/JNK (JNK؛ 1:1،000؛ بلی نمبر 9252؛ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، انکارپوریٹڈ)، اینٹی-4 ہائیڈروکسینونل (4‑HNE؛ 1:1 ,000؛ بلی نمبر ab46545؛ Abcam)، اینٹی ہیم آکسیجن 1 (HO‑1؛ 1:1،000؛ بلی نمبر 82206؛ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، انکارپوریشن) اینٹی-Bcl‑2 (1:1،000؛ بلی نمبر 26593‑1‑AP؛ پروٹین ٹیک گروپ، انکارپوریشن)، اینٹی-بیکس (1,1000؛ بلی نمبر۔ 60267‑1‑Ig؛ ProteinTech Group, Inc.) اور اینٹی ایکٹین (1:2،000؛ بلی نمبر۔ 4970; سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، انکارپوریٹڈ)۔ اس کے بعد کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے مناسب ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز کنجوگیٹڈ سیکنڈری اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیشن کیا گیا: بکری اینٹی ماؤس IgG‑HRP (بلی نمبر sc‑2005؛ 1:5،000؛ سانتا کروز بائیو ٹیکنالوجی , Inc.) یا بکری مخالف خرگوش IgG‑HRP (cat. no. sc‑2004; 1:5,000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)، اور مخصوص بینڈز کو ECL کٹ (cat. no. P0018AS; Beyotime Institute of Biotechnology) اور UVP Che Studio PLUS سسٹم (Analytik Jena GmbH) کا استعمال کرتے ہوئے تصویر بنائی گئی۔ ڈبلیو بی بینڈز کا رشتہ دار کثافت کا تجزیہ امیج جے 1.4 سافٹ ویئر (NIH) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا اور پروٹین ایکسپریشن لیول کو ایکٹین کے خلاف معمول بنایا گیا تھا۔

تجرباتی نمونہ

SAH کے بعد ASK1 کے اظہار کی تبدیلی اور سیلولر لوکلائزیشن۔ کل 36 چوہوں کو تصادفی طور پر چھ گروپوں (n=6/گروپ) کو اس طرح تفویض کیا گیا تھا: i) شام سے چلنے والا (شام)، ii) 3 گھنٹے بعد SAH، iii) 6 گھنٹے بعد SAH، iv ) 12 گھنٹے بعد SAH، v) 24 گھنٹے بعد SAH اور vi) 72 گھنٹے بعد SAH۔ WB کا استعمال endogenous ASK1 اور p-ASK1 کے پروٹین اظہار کی سطح میں تبدیلیوں کا اندازہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ کل 4 اضافی چوہوں کو sham (n=2) اور SAH 24 h (n=2) گروپس میں تقسیم کیا گیا تھا اور IF سٹیننگ کا استعمال ASK1 کے شریک لوکلائزیشن کا اندازہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔

SAH کے بعد مختصر اور طویل مدتی اعصابی فعل پر ASK1 inhibitor NQDI-1 کے علاج کے اثرات۔ مجموعی طور پر 30 چوہوں کو 5 گروپس (n=6/گروپ) میں اس طرح تقسیم کیا گیا تھا: i) شام، ii) SAH پلس گاڑی، iii) SAH جمع 1۔{9}} µg /kg NQDI‑1, iv) SAH جمع 3۔{12}} µg/kg NQDI‑1 اور v) SAH جمع 10.0 µg/kg NQDI‑1۔ ترمیم شدہ گارسیا اور بیم بیلنس اسکور SAH کے بعد 24 گھنٹے کے مختصر مدتی اعصابی فنکشن کا جائزہ لینے کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ قلیل مدتی اعصابی بہتری کی حد کی بنیاد پر، 3.0 µg/kg NQDI-1 کو سب سے زیادہ مناسب خوراک گروپ سمجھا گیا اور NQDI-1 کی اس خوراک کو بعد کے تجربات میں استعمال کیا گیا۔ کل 30 چوہوں کو 3 گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا (n{21}}) مندرجہ ذیل: i) شام، ii) SAH پلس گاڑی، اور iii) SAH پلس NQDI‑1۔ SAH کے بعد 7، 14 اور 21 دنوں کو طویل مدتی اعصابی فعل کا اندازہ کرنے کے لیے روٹروڈ تجربہ استعمال کیا گیا تھا، اور طویل مدتی اعصابی فعل کا اندازہ لگانے کے لیے SAH کے بعد ہفتہ 4 میں مورس واٹر میز ٹیسٹ کیا گیا تھا۔

آکسیڈیٹیو تناؤ اور اپوپٹوسس پر ASK1 inhibitor NQDI-1 کے علاج کے اثرات۔ کل 12 چوہوں کو 3 گروپس (n=4/گروپ) میں اس طرح تقسیم کیا گیا تھا: i) شام، ii) SAH پلس وہیکل، اور iii) SAH پلس NQDI‑1۔ (دی) داغ آکسیڈیٹیو تناؤ کا اندازہ کرنے کے لئے انجام دیا گیا تھا اور SAH کے 24 گھنٹے بعد نیورونل اپوپٹوسس کا اندازہ کرنے کے لئے TUNEL داغ کا استعمال کیا گیا تھا۔

NQDI-1 کے علاج کے اثرات میں ASK1/p38 اور JNK سگنلنگ پاتھ وے کا کردار۔ کل 48 چوہوں کو 8 گروپس (n=6/گروپ) میں اس طرح تقسیم کیا گیا تھا: i) شام، ii) SAH، iii) SAH پلس گاڑی، iv) SAH پلس NQDI‑1، v) SAH پلس سکیمبلڈ (Scr) مختصر مداخلت (si)RNA، vi) SAH پلس ASK1 siRNA، vii) SAH پلس BMS‑582949 اور viii) SAH پلس SP600125 گروپس۔ ASK1 siRNA، p38 inhibitor BMS-582949، اور JNK inhibitor SP600125 کو یہ جانچنے کے لیے انجکشن لگایا گیا تھا کہ آیا ASK1، p38، اور JNK NQDI-1 کے نیورو پروٹیکٹو اثرات میں شامل تھے۔

شماریاتی تجزیہ. اعداد و شمار کو اوسط ± معیاری انحراف کے طور پر پیش کیا گیا تھا اور WB کا تجرباتی ڈیٹا 6 آزاد نقلوں میں حاصل کیا گیا تھا، جبکہ DHE سٹیننگ اور TUNEL سٹیننگ کو 4 آزاد نقل کے طور پر انجام دیا گیا تھا۔ SPSS ورژن 17 (SPSS, Inc.) کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔ مورس واٹر میز ٹیسٹ کے ڈیٹا کا اندازہ مخلوط انووا/دو طرفہ بار بار اقدامات انووا کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا، اس کے بعد LSD پوسٹ ہاک ٹیسٹ۔ بقیہ تجربات کے ڈیٹا کو عام تقسیم کے لیے Shapiro-Wilk نارمل ڈسٹری بیوشن ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے جانچا گیا جس کے بعد یک طرفہ ANOVA اور اس کے بعد Tukey کا پوسٹ ہاک متعدد موازنہ ٹیسٹ۔ گراف پیڈ پرزم 7 (گراف پیڈ سافٹ ویئر، انکارپوریٹڈ) کا استعمال کرتے ہوئے گراف تیار کیے گئے تھے۔ پی<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

نتائج

اموات اور SAH کی شدت۔ موجودہ مطالعے میں کل 191 SD چوہوں کا استعمال کیا گیا تھا، جن میں سے 8 چوہوں کو صرف ہلکے SAH (SAH گریڈنگ سکور 8 سے کم یا اس کے برابر) کی وجہ سے خارج کر دیا گیا تھا۔ تجربات میں استعمال ہونے والے SD چوہوں میں سے 34 چوہے شام گروپ میں تھے اور 149 چوہوں کی SAH ماڈلنگ ہوئی۔ شام گروپ میں کوئی چوہا نہیں مرا۔ تاہم، SAH ماڈلنگ (موت کی شرح 15.4 فیصد) (ٹیبلز SI‑V) کے بعد 23 چوہے مر گئے۔ شیم گروپ کے مقابلے میں، سبارکنوئڈ اسپیس میں جمنے بنیادی طور پر ولیس رنگ کے قریب اور ایس اے ایچ ماڈلنگ (تصویر 1 اے) کے بعد بیسلر آرٹری کے دونوں طرف واقع تھے۔ SAH گریڈنگ سکور 24 گھنٹے بعد SAH ماڈلنگ نے تمام غیر شام گروپوں کے درمیان نکسیر کی شدت میں کوئی خاص فرق ظاہر نہیں کیا اور شام اور تمام غیر شام گروپوں کے درمیان ایک اہم فرق (تصویر 1B)۔

SAH کے بعد پروٹین کے اظہار میں تبدیلی اور ASK1 کی سیلولر لوکلائزیشن۔ ASK1 کے پروٹین ایکسپریشن کی سطح میں اضافہ ہوا اور SAH (تصویر 1C اور D) کے بعد دماغ میں 24 گھنٹے کی بلندی پر پہنچ گیا۔ تاہم، p‑ASK1/ASK1 کے پروٹین ایکسپریشن کے تناسب نے کوئی خاص فرق نہیں دکھایا (تصویر 1C اور E)۔ NeuN-مثبت نیوران، Iba-1-مثبت مائیکروگلیہ، اور GFAP-مثبت آسٹروسائٹس کے ساتھ ASK1 کی سیلولر لوکلائزیشن کا مظاہرہ شام اور SAH 24 h گروپ (تصویر 1F-H) دونوں میں کیا گیا تھا۔

ASK1 inhibitor NQDI-1 SAH کے 24 گھنٹے بعد قلیل مدتی اعصابی افعال کو بہتر بناتا ہے۔ NQDI‑1 (1, 3, اور 10 µg/kg) کو SAH کے 1 گھنٹہ بعد انٹراسیریبروینٹریکولر انجیکشن لگایا گیا تھا۔ SAH ماڈلنگ سے گزرنے والے چوہوں نے SAH ماڈلنگ کے بعد 24 گھنٹے بعد ترمیم شدہ گارسیا اور بیم بیلنس اسکور کو نمایاں طور پر کم کر دیا تھا۔ تاہم، NQDI-1 کی تینوں خوراکیں مختصر مدت کے اعصابی فعل (تصویر 2A اور B) میں نمایاں جزوی بہتری کا باعث بنیں۔ SAH پلس NQDI‑1 (3{16}} µg/kg) گروپ میں SAH پلس NQDI‑1 (1.0 µg/kg) گروپ کے مقابلے میں ترمیم شدہ گارسیا کے اسکور نمایاں طور پر زیادہ تھے۔ تاہم، SAH پلس NQDI‑1 (10.0 µg/kg) گروپ (تصویر 2A اور B) کے مقابلے میں اعداد و شمار کے لحاظ سے کوئی اہم فرق ظاہر نہیں کیا گیا، جس نے تجویز کیا کہ NQDI‑1 کے ارتکاز میں مزید اضافہ ہوا۔ SAH کے بعد قلیل مدتی اعصابی فعل میں مزید بہتری نہیں لاتا۔ لہذا، NQDI-1 (3.0 µg/kg) کو مؤثر زیادہ سے زیادہ ارتکاز سمجھا جاتا تھا اور اسے بعد کے تجربات میں استعمال کیا جاتا تھا۔

ASK1 inhibitor NQDI-1 SAH کے بعد طویل مدتی اعصابی افعال کو بہتر بناتا ہے۔ روٹروڈ ٹیسٹ کے لیے 5 یا 10 rpm کی ابتدائی رفتار کا استعمال کرتے ہوئے، SAH پلس گاڑی کے گروپ میں شیم گروپ کے مقابلے میں زوال میں تاخیر نمایاں طور پر کم ہوئی، جب کہ SAH پلس گاڑی کے مقابلے NQDI-1 کے intraracerebroventricular انجیکشن کے بعد زوال میں تاخیر نمایاں طور پر طویل ہوئی۔ گروپ (تصویر 2C اور D)۔ مزید برآں، SAH کے بعد ہفتہ 4 میں مورس واٹر میز ٹیسٹ کے تربیتی مرحلے کے 1-5 دنوں کے دوران، SAH پلس گاڑیوں کے گروپ نے شام گروپ کے مقابلے میں نمایاں طور پر طویل فرار میں تاخیر اور تیراکی کی دوری کا مظاہرہ کیا، جبکہ NQDI-1 علاج نے ایک SAH پلس گاڑیوں کے گروپ (تصویر 2E‑G) کے مقابلے میں نمایاں کمی۔ پانی کے اندر سرکلر پلیٹ فارم کو ہٹانے کے ساتھ جانچ کے مرحلے میں، تین گروہوں (تصویر 2H) کے درمیان تیراکی کی رفتار میں کوئی خاص فرق نہیں دیکھا گیا۔ SAH پلس وہیکل گروپ میں پروب کواڈرینٹ کا دورانیہ شم گروپ کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم تھا اور NQDI-1 کے علاج نے SAH پلس وہیکل گروپ (تصویر 2I) کے مقابلے میں ایکسپلوریشن کے وقت کو نمایاں طور پر طول دیا۔

ASK1 inhibitor NQDI-1 آکسیڈیٹیو تناؤ اور نیورونل اپوپٹوسس 24 گھنٹے بعد SAH کو کم کرتا ہے۔ ڈی ایچ ای سٹیننگ کا استعمال کرتے ہوئے آکسیڈیٹیو تناؤ کی سطح کی پیمائش کی گئی اور SAH کے بعد 24 گھنٹے TUNEL- مثبت نیوران کی فیصد کا استعمال کرتے ہوئے apoptotic نیوران کے تناسب کا اندازہ لگایا گیا۔ DHE-مثبت خلیوں کا فیصد SAH پلس گاڑیوں کے گروپ میں شام گروپ کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھا اور NQDI-1 کے علاج نے SAH پلس گاڑیوں کے گروپ (تصویر 3A اور) کے مقابلے میں اس میں نمایاں کمی کی۔ شم گروپ کے مقابلے SAH پلس گاڑیوں کے گروپ میں TUNEL- مثبت نیوران کا فیصد نمایاں طور پر زیادہ تھا۔ تاہم، SAH پلس گاڑیوں کے گروپ (تصویر 3B اور D) کے مقابلے NQDI-1 کے ساتھ علاج کے بعد TUNEL- مثبت نیوران کی فیصد میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔

ASK1 siRNA، BMS-582949، اور SP600125 مختصر مدت کے اعصابی افعال کو 24 گھنٹے بعد SAH بہتر بناتے ہیں۔ SAH plus Scr siRNA گروپ یا SAH پلس وہیکل گروپ کے مقابلے میں، ASK1 siRNA، BMS‑582949 یا SP600125 کی انتظامیہ نے ترمیم شدہ گارسیا اور بیم بیلنس سکور (تصویر 4A اور B) میں نمایاں بہتری کا مظاہرہ کیا۔

NQDI-1 ASK1، p38، اور JNK کے فاسفوریلیشن میں کمی کے ذریعے SAH کے بعد آکسیڈیٹیو تناؤ اور apoptosis کو کم کرتا ہے۔ ASK1، p-p38، p-JNK، 4-HNE، HO-1، Bax، اور Bcl-2 کی پروٹین ایکسپریشن لیول SAH کے بعد شیم گروپ کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھے۔ تاہم، p‑ASK1/ASK1 کا تناسب نمایاں طور پر مختلف نہیں تھا (تصویر 5A‑M)۔ گاڑی یا Scr siRNA کے انجیکشن نے SAH گروپ کے مقابلے میں پروٹین کے اظہار کی سطح میں اہم فرق پیدا نہیں کیا۔ SAH پلس گاڑیوں کے گروپ کے مقابلے میں، NQDI-1 کا استعمال کرتے ہوئے علاج سے p-ASK1/ASK1، p-p38، p-JNK، 4-HNE، اور Bax کے پروٹین اظہار کی سطح میں نمایاں کمی واقع ہوئی، جبکہ HO کے پروٹین اظہار کی سطح ‑1 اور Bcl-2 میں نمایاں اضافہ ہوا۔ SAH پلس Scr siRNA گروپ کے مقابلے میں، ASK1 کے پروٹین اظہار کی سطح میں ASK1 siRNA کے انجیکشن کے بعد نمایاں کمی واقع ہوئی۔ ASK1 siRNA کے ساتھ علاج کے نتیجے میں p‑p38، p‑JNK، 4‑HNE، اور Bax کے پروٹین کے اظہار کی سطح میں بھی نمایاں کمی واقع ہوئی اور SAH پلس Scr siRNA کے مقابلے HO‑1 اور Bcl‑2 اظہار میں نمایاں اضافہ ہوا۔ گروپ

p38 inhibitor BMS-582949 p-p38 کے پروٹین اظہار کی سطح کو کم کرتا ہے لیکن p-ASK1، ASK1، یا p-JNK پروٹین اظہار کی سطح کو متاثر نہیں کرتا ہے۔ p38 inhibitor BMS-582949 کے ساتھ علاج نے p-p38، 4-HNE، اور Bax کے پروٹین اظہار کی سطح میں نمایاں کمی کا مظاہرہ کیا اور SAH پلس گاڑیوں کے گروپ کے مقابلے میں HO-1 اور Bcl-2 کے پروٹین کے اظہار میں نمایاں اضافہ کیا۔ تاہم، ASK1، p‑ASK1/ASK1 اور p‑JNK کے پروٹین ایکسپریشن کی سطحوں نے کوئی خاص فرق نہیں دکھایا (تصویر 6A‑M)۔ JNK inhibitor SP600125 p‑JNK کے پروٹین اظہار کی سطح کو کم کرتا ہے لیکن p‑ASK1، ASK1، یا p‑p38 پروٹین کے اظہار کی سطح کو متاثر نہیں کرتا ہے۔ JNK inhibitor SP600125 کے ساتھ علاج سے p‑JNK، 4‑HNE، اور Bax کے پروٹین کے اظہار کی سطح میں نمایاں کمی واقع ہوئی اور SAH پلس گاڑیوں کے گروپ کے مقابلے میں HO‑1 اور Bcl‑2 پروٹین کے اظہار کی سطح میں نمایاں اضافہ ہوا۔ تاہم، ASK1، p‑ASK1/ASK1، اور p‑p38 کے پروٹین ایکسپریشن کی سطح کو نمایاں طور پر تبدیل نہیں کیا گیا (تصویر 7A‑M)۔

【مزید معلومات کے لیے: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】