کینورہابڈائٹس ایلیگنس میں سنسنی اور ایڈوانسڈ گلائکیشن اینڈ پروڈکٹس کے ایک غیر حملہ آور بائیو مارکر کے طور پر آٹو فلوروسینس

Caenorhabditis elegans میں sensence کے noninvasive biomarker کے طور پر autofluorescence کی افادیت کا اندازہ لگانے کے لیے، ہم نے spectrofluorimetry کا استعمال کرتے ہوئے انفرادی نیماٹوڈس کے آٹو فلوروسینس کی پیمائش کی۔ ہر کیڑے کی فلوروسینس عمر کے ساتھ بڑھتی گئی۔ کم فلوروسینس کی شدت والے جانور طویل عمر کی نمائش کرتے ہیں۔ جب کیڑے سے نکالے گئے پروٹین کو شکر کے ساتھ انکیوبیٹ کیا جاتا تھا، تو وقت کے ساتھ ساتھ فلوروسینس کی شدت اور اعلی درجے کی گلیکشن اینڈ پروڈکٹس (AGEs) کا ارتکاز بڑھتا جاتا ہے۔ رائبوس نے ان تبدیلیوں کو نہ صرف وٹرو میں بلکہ ویوو میں بھی بڑھایا۔ گلیکشن بلاکر رفیمپیسن نے فلوروسینس میں اس اضافے کو دبا دیا۔ ہائی ریزولوشن ماس اسپیکٹومیٹری نے انکشاف کیا کہ پرانے کیڑے میں وٹلوجینز جمع ہوتے ہیں، اور گلائکیٹیڈ وٹیلوجینز بولی وٹلوجیننز کے مقابلے میں چھ گنا زیادہ فلوروسینس خارج کرتے ہیں۔عمر بڑھنے کے ساتھ فلوروسینس میں اضافہ گلائکیٹیڈ مادوں سے ہوتا ہے۔اور اس وجہ سے AGEs کے ایک مفید غیر حملہ آور بائیو مارکر کے طور پر کام کر سکتا ہے۔Cistancheاینٹی AGE عوامل کو تلاش کرنے کے لیے ایک نئے ماڈل کے طور پر کام کر سکتا ہے۔اور AGEs اور سنسنی کے درمیان تعلق کا مطالعہ کرنا۔

سیستانکعمر مخالف عوامل کے لیے جڑی بوٹیاں

تعارف

پچھلی نصف صدی کے دوران ترقی یافتہ ممالک میں انسانوں میں اوسط عمر کو ڈرامائی طور پر بڑھایا گیا ہے۔ البتہ،عمر بڑھنے کے ساتھ ترقی پذیر نقصان جسمانی افعال پر نقصان دہ اثرات کا سبب بنتا ہے۔، جانا جاتا ہےجوانی، اورجوانی سے متعلق امراضمیں بھی اضافہ ہو رہا ہے۔لمبی عمر کے ساتھ تناسب. کی توسیع"صحت کی مدت" اب صرف عمر بڑھانے کی بجائے ضروری ہے۔ ایسی مداخلتیں جو حواس کو سست کرتی ہیں اور صحت کی مدت کو بڑھاتی ہیں۔ برینر وغیرہ۔ متعارف کرایاCaenorhabditis elegansجو کہ ایک چھوٹا، آزاد زندہ مٹی کا نیماٹوڈ ہے جو بیکٹیریا کو کھاتا ہے،تفریق اور ترقی کے مالیکیولر جینیٹکس اسٹڈیز۔

اس کے بعد، کیڑے کو حیاتیاتی مطالعات کے لیے تجرباتی نظام کے طور پر بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا، جس میں اس جانور کی وجہ سے سنسنی پر تحقیق بھی شامل ہے۔'s سادگی، شفافیت، کاشت میں آسانی، مختصر عمر، اور جینیاتی تجزیہ کے لیے موزوں2. کیڑے میں، جوانی کی جانچ لوکوموٹیو کی صلاحیت، تناؤ کے خلاف مزاحمت، علمی قابلیت، اور فارینجیل پمپنگ، اور نام نہاد عمر کے روغن لیپوفسن کے جمع ہونے سے کی جا سکتی ہے۔3–5 .

مختلف قسم کے کیمیکلز، بشمول اینٹی آکسیڈنٹس اور کئی ادویات، جوانی کو روکنے کے امیدوار ہیں۔6,7. مزید برآں، چونکہ ہم نے اطلاع دی ہے کہ پروبائیوٹک بیکٹیریا کو کھانا کھلانے سے نیماٹوڈس کی صحت کی مدت اور عمر کو بڑھایا جا سکتا ہے۔8,9فائدہ مند بیکٹیریا کے لمبی عمر کے اثرات کو بھی متعدد لیبارٹریوں نے ظاہر کیا ہے۔10–12. لمبی عمر کے اثرات کو بقا کے منحنی خطوط سے جانچا گیا ہے، لیکن کیڑوں میں اس طرح کے مطالعے میں نسبتاً کم عمر کے باوجود 3 ہفتوں سے زیادہ کا وقت درکار ہوتا ہے۔سی ایلیگنس. سنسنی کے خلاف مداخلتوں کے اثرات کا جائزہ لینے کے لیے، سنسنی کے آسان اور غیر حملہ آور اشارے انفرادی کیڑوں میں اور (بالآخر) انسانوں میں حتمی ہدف کے طور پر اثر کا پتہ لگانے کے لیے مطلوب ہیں۔

Lipofuscin، ایک نام نہاد عمر ورنک، بڑے پیمانے پر سنسنی کے اشارے کے طور پر استعمال کیا گیا ہے. تاہم، کیڑے میں آٹو فلوروسینس، سنسنی، اور عمر کے درمیان قطعی تعلق ابھی تک واضح نہیں ہے۔ Gerstbrein et al. نے اطلاع دی کہ عمر کے روغن نیماٹوڈ ہیلتھ اسپین کے درست رپورٹرز ہیں۔13، جبکہ Coburn et al. رپورٹ کیا کہ بلیو فلوروسینس (حوصلہ افزائی/اخراج طول موج 340/430 nm پر مرکوز) موت سے پہلے اور بعد میں کئی گھنٹوں تک موت کے نشان کے طور پر کام کرتی ہے۔سی ایلیگنس14. یہ تجویز کیا گیا ہے کہ عمر بڑھنے کی آبادی میں وقت کے ساتھ ساتھ نیلے رنگ کے آٹو فلوروسینس میں اضافہ دیکھا گیا ہے۔سی ایلیگنسہو سکتا ہے کہ آبادی کی عمر بڑھنے کی شرح یا صحت کی حالت کو ظاہر نہ کرے، بلکہ نمونے میں مردہ یا تقریباً مردہ افراد کا حصہ15.

اعلی درجے کی گلیکشن اینڈ پروڈکٹس (AGEs) نے سائنسی توجہ مبذول کی ہے۔16 کیونکہ وہ ذیابیطس کے معاملات میں زیادہ مقدار میں بنتے ہیں، بلکہ جسمانی عمر بڑھنے کے دوران بھی، اور آکسیڈیٹیو تناؤ کا باعث بنتے ہیں۔ AGEs پیچیدہ مرکبات ہیں جو پروٹین، لپڈز، یا نیوکلک ایسڈ میں شکر اور امینو گروپس کو کم کرنے کے درمیان غیر اینزیمیٹک رد عمل سے بنتے ہیں۔ اس کے بعد شیف بیس اور امادوری مصنوعات میلارڈ ری ایکشن کے ذریعے بنتی ہیں، جس سے AGEs حاصل ہوتے ہیں۔ ذیابیطس، رمیٹی سندشوت، الزائمر کے مریضوں میں AGE کا مواد زیادہ ہوتا ہے۔'کی بیماری، اور دیگر بیماریاں17–19. ذیابیطس کے مریضوں میں، AGE جمع مائکروواسکولر بیماری کی شدت کے ساتھ اچھی طرح سے تعلق رکھتا ہے اور عمر کے ساتھ بڑھتا ہے۔ تاہم، آیا AGEs روگجنن کی وجہ کی نمائندگی کرتے ہیں یا صرف ثانوی مصنوعات ہیں اس کی وضاحت کرنا باقی ہے۔ AGEs کو سنسنی کی ممکنہ وجوہات کے طور پر بھی سمجھا جاتا ہے۔20,21، جیسا کہ a میں نتائج سے تجویز کیا گیا ہے۔سی ایلیگنسشوگر زہریلا کا ماڈل22,23.

ایک منظم انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) طریقہ کئی AGE مرکبات کے لیے مخصوصیت کے ساتھ اینٹی باڈیز کو استعمال کرکے تیار کیا گیا ہے۔24–26. تاہم، AGE کی سطحوں کے کسی نہ کسی اندازے کی اجازت دینے کے لیے غیر حملہ آور طریقوں کی بھی ضرورت ہے۔ چونکہ متعدد AGEs مبینہ طور پر ہیں۔fluorescent اور ان سے منسلکfluorescence کی شدت ایک نشانی ظاہر کرتی ہے۔fifiELISA کے ذریعہ ماپا جانے والی سطحوں سے کوئی تعلق نہیں ہے۔27، ہم نے جانچ کی کہ آیا یہflAGEs کی حیثیت کا پتہ لگانے کے لیے uorescence کو متبادل مارکر کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔سی ایلیگنسماڈل

اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ آیا مشاہدہ کیا گیا ہے۔فلوروسینسصرف موت کی عکاسی کرتا ہے۔فلوروسینسCoburn et al. کی طرف سے رپورٹ کیا گیا ہے، کیڑے کا سراغ لگا کر معائنہ کیا گیا تھاflانفرادی کیڑے کی uorescence جبکہمتعلقہ جانوروں کی موت کا وقت۔ مزید برآں، theپر AGE کی تشکیل کے روکنے والوں کے اثراتفلوروسینسکی افادیت کی توثیق کرنے کے لیے اور AGE جمع کی بھی چھان بین کی گئی۔سی ایلیگنسAGE تحقیق کے لیے ایک ماڈل جانور کے طور پر۔

نتائج

کیڑے میں عمر بڑھنے اور AGEs کے بائیو مارکر کے طور پر نکالے گئے پروٹین کا آٹو فلوروسینس

نکالے گئے پروٹین کی فلوروسینس سپیکٹرو فوٹومیٹری نے اشارہ کیا کہ 325 پر جوش–365 nm بنائے گئے 17- دن پرانے کیڑےfl400 میں سب سے زیادہ اخراج کے ساتھ uoresce–430 nm (چوٹی 420 nm) وقفہ (تصویر 1)1a)۔ نیلاflنوجوانی کے دوران یوروسیسنس نسبتاً کم تھا (3-دن سے لے کر 5-دن کی عمر تک) لیکن وقت کے ساتھ ساتھ بڑھتا گیا (7-دن پرانے جانوروں میں) (تصویر 1)۔1ب)۔ Lipofuscin، ایک نام نہاد عمر ورنک، سرخ رنگ کا اخراج کرتا ہے۔fluorescence (530 پر جوش–560 nm، اخراج 585 پر–645 این ایم)15; ہماری پچھلی تحقیق میں، اس مارکر کا پتہ دیر سے زندگی میں (13-دن سے زیادہ پرانے) کیڑوں میں پایا گیا تھا۔9. 

آٹو کے بعد سےflموجودہ مطالعے میں پایا جانے والا یوروسینس پہلے مرحلے میں ظاہر ہوا اور وقت کے ساتھ ساتھ بلیو آٹو میں اضافہ ہوا۔flتوقع کی جارہی تھی کہ سنسنی کا سراغ لگانے کے لئے یوورسینس ایک بہتر بائیو مارکر ہوگا۔ چونکہ کئی AGE مرکبات آٹو فلوروسینٹ27 کے طور پر جانے جاتے ہیں، اس لیے ہم نے AGE مواد اور نیلے رنگ کے درمیان تعلق کا جائزہ لیا۔flویسٹرن بلوٹنگ کے ذریعے uorescence جس میں ایک اینٹی باڈی ٹو اینε- (carboxymethyl) lysine (CML)، ایک نمائندہ AGE، استعمال کیا گیا تھا۔ بلوٹنگ سے پتہ چلتا ہے کہ وقت کے ساتھ ساتھ ایک شاندار بینڈ کو بڑھا دیا گیا تھا (تصویر 1)۔1c اور ضمنی شکل 1)۔ درحقیقت، خطے کی مقدار نے AGE میں اضافہ کا اشارہ کیا (تصویر 2)۔1d)، اگرچہ CML آٹو نہیں ہے۔fluorescent

اگر آٹو کا تعین کرنے کے لئےfluorescence بالواسطہ طور پر اشارہ کیامیلارڈ ری ایکشن، پروٹین کے ذریعے بننے والے AGEs میں اضافہکیڑے سے نکالے گئے ہوموجنیٹس کو گلوکوز، رائبوز، اور فرکٹوز جیسی شکر کو کم کرنے کے ساتھ 4 ہفتوں تک غیر محفوظ طریقے سے انکیوبیٹ کیا گیا۔ دیflشکر کی موجودگی میں وقت کے ساتھ ساتھ پروٹینوں کی افزائش میں اضافہ ہوا، جبکہ اس میں کوئی واضح اضافہ نہیں ہوا۔flشوگر کے بغیر کیے جانے والے رد عمل میں urorescence (تصویر 2)۔2a)۔ ورم پروٹین بن گئے۔flوٹرو میں بھی glycation کے ذریعے uorescent. تین شکروں میں سے ہر ایک کے ساتھ ہونے والے رد عمل میں، رائبوز والے افراد نے سب سے زیادہ پیداوار کی۔fluorescence، اس کے بعد دو دیگر شکر۔ یہfinding کی وضاحت بُن اور ہِگنس کی ایک رپورٹ کے ذریعے کی جا سکتی ہے جس میں ہر مونو سیکرائیڈ کا امینو گروپس کے ساتھ شِف بیس لنکیجز بنانے کے لیے رد عمل کا انحصار اس حد تک ہے کہ یہ انگوٹھی کے بجائے کھلے (کاربونیل) ڈھانچے میں موجود ہے۔ hemiacetal یا hemiketal) ڈھانچہ، اور رد عمل کی شرحیں رائبوز (10.0)، فریکٹوز (4.5)، اور گلوکوز (0.6) (×10) کی ترتیب میں بڑھ گئیں۔−3 mM−1 h−1 ) بالترتیب28.

تصویر 1 فلوروسینس سپیکٹرو فوٹومیٹری اور ورم پروٹین کے نمونوں کی AGEs۔ ایکاکسیٹیشن ایمیشن میٹرکس (EEM) 3- دن پرانے اور 17- دن پرانے والے کیڑوں سے آٹو فلوروسینس کے پلاٹ۔ دیflEEM پلاٹوں میں اخراج طول موج پر uorescence کی سطحیں رنگین ہیٹ میپ کے طور پر ظاہر ہوتی ہیں۔ 3-دن پرانے اور 17-دن پرانے میں سے ہر ایک سو کیڑے (جنگلی قسم کے N2) کو 3 µL lysis بفر اور 4 µL 15 فیصد SDS میں ڈالا گیا۔ پروٹین کو منجمد پگھلنے کے چکروں کے ذریعہ جاری کیا گیا تھا ، اور فوٹولومینیسینٹ سپیکٹرا کو ایک کے ساتھ جمع کیا گیا تھا۔fluorescence spectrophotometer (Hitachi FL-4500)۔ EEM کا استعمال کرتے ہوئے lysed nematodes کی فلوروسینس خصوصیات کا تجزیہ کیا گیا۔flیوروسینس سپیکٹروسکوپی 325 پر جوش–365 nm بنائے گئے 17- دن پرانے کیڑےfl400 میں سب سے زیادہ اخراج کے ساتھ uoresce–کی ایک سیریز کے طور پر 430 nm وقفہ متعلقہ رفتارfluorescence کی شدت، جبکہ 3- دن پرانے نوجوان کیڑے نہیں کرتے تھے۔fluoresce متعدد تجزیہfluorometry) سے EEM پلاٹ ملے جو سنگل اسکین اکسیٹیشن پر مشتمل ہیں۔b آٹو کی سطحfluorescence (ex 340/em 360–600) ہر عمر گروپ کے جانوروں سے نکالے گئے ورم پروٹین کے نمونوں کے ذریعے (3–13 دن پرانا)۔ کیڑے (جنگلی قسم کے N2) کو ٹیوبوں میں جمع کیا گیا، دھویا گیا۔پانچاوقات، اور ہر ٹیوب میں lysed. اس کے بعد پروٹین کو چھوڑنے کے لیے ایک منی کورڈ لیس گرائنڈر (فناکوشی، ٹوکیو، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے نمونے گراؤنڈ کیے گئے۔ پروٹین کے مواد کو مقداری طور پر ماپا گیا جیسا کہ طریقوں میں بیان کیا گیا ہے۔ اےflہر ایک 30-µL نمونے کے لیے uorescence سپیکٹرم کا تعین کیا گیا تھا (1.5 پر مشتملμکل پروٹین کا g) ملٹی موڈ گریٹنگ مائکروپلیٹ ریڈر ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے SH-9000لیب (کورونا الیکٹرک، ایباراکی، جاپان)۔ ہر پیمائش تین بار کی گئی۔c مختلف عمروں کے کیڑے (جنگلی قسم کے N2) سے نکالے گئے نمونوں میں AGE CML کا مغربی بلوٹنگ تجزیہ۔ تین تولیدی تجربات کی نمائندہ تصویر دکھائی گئی ہے۔ دھبے ایک ہی جیل کے مختلف حصوں سے اخذ کیے گئے تھے (ضمیمہ تصویر 1 میں دکھایا گیا ہے) اور ان پر متوازی کارروائی کی گئی تھی۔ڈی مقدارکثافت کی پیمائش کا استعمال کرتے ہوئے مغربی بلاٹس میں AGEs کا۔ تصویر میں مستطیل فریموں سے گھرے ہوئے بینڈ۔1c کی مقدار طے کی گئی تھی، اور تین تولیدی تجربات کے اعداد و شمار کو اوسط ± SE کے طور پر دکھایا گیا ہے۔

بالترتیب

براہ راست اندازہ لگانے کے لیے کہ آیا میں اضافہ ہوتا ہے۔flشکر کی موجودگی میں urescence AGE کی تشکیل کی وجہ سے تھا، ELISA کا استعمال نمائندہ AGE کمپاؤنڈ CML کا پتہ لگانے کے لیے کیا گیا تھا۔ ان رد عمل میں سی ایم ایل میں اضافہ ہوا، اور رائبوز سے لگائے گئے نمونوں کی سطح 4 ہفتوں تک بغیر شوگر کے انکیوبیٹ کنٹرولز کے مقابلے میں تقریباً سات گنا زیادہ تھی۔2ب)۔ رائبوز کے مقابلے میں، گلوکوز یا فرکٹوز کے ساتھ پیدا ہونے والی سی ایم ایل کی مقدار کم تھی، جو کنٹرول میں سی ایم ایل کی طرح تھی۔ یہتلاش کرناپچھلی رپورٹ سے ہم آہنگ ہے۔29.

Vivo میں عمر بڑھنے اور AGEs کے بائیو مارکر کے طور پر آٹو فلوروسینس

ہم نے اگلا تجربہ کیا کہ آیاfluorescence کا پتہ نہ صرف نکالے گئے پروٹین سے بلکہ زندہ کیڑوں میں بھی پایا جا سکتا ہے۔ جب ملٹی موڈ گریٹنگ مائیکرو پلیٹ ریڈر کے ساتھ کنویں پلیٹوں پر پھیلی ہوئی پلاسٹک کی لپیٹ فلم پر انفرادی کیڑے کے آٹو فلوروسینس کو پڑھا گیا، تو سپیکٹرو فوٹومیٹری کے نتائج نکالے گئے پروٹین (تصویر 1) سے ملتے جلتے تھے۔3a)۔ نیلے رنگ کی انفرادی شدتflوقت کے ساتھ ساتھ uorescence میں اضافہ ہوا (تصویر3b اور ضمنی شکل 2)، جبکہ کوئی سرخ نہیں۔flاس طریقہ کے ساتھ uorescence کا پتہ چلا۔ نیلے رنگ کے بعد سےfluorescence (340/430 یا 350/460 nm) پہلے موت کے ساتھ منسلک ہونے کی اطلاع دی گئی ہے14,15، تجزیہ جانور سے 2 دن پہلے کے اندر حاصل کردہ ڈیٹا کو چھوڑ کر کیا گیا تھا۔'کی موت. تاہم، نیلےflوقت کے ساتھ ساتھ کیڑے کے urorescence میں اب بھی اضافہ ہوا: کا اضافہflلہذا uorescence جزوی طور پر موت سے آزاد ہونا چاہئے۔fluorescence یہ جانچنے کے لیے کہ آیا آٹو فلوروسینس سنسنی کا بائیو مارکر ہو سکتا ہے، ہم نے جانچا کہ 13- دن پرانے کیڑے پر آٹو فلوروسینس کی پیمائش کے بعد کیڑے کتنے دن زندہ رہ سکتے ہیں۔ ہر کیڑے کی متوقع زندگی کا الٹا تعلق آٹو فلوروسینس کی شدت سے تھا (تصویر 2 اے)۔3c).

دیflریبوز کے ساتھ اگائے جانے والے کیڑوں میں بھی یوروسینس کی شدت کو بڑھایا گیا تھا (تصویر 2)۔4a) ان کیڑوں کی عمر کتنی تھی۔fifiکنٹرول کیڑے کے مقابلے میں بہت چھوٹا (تصویر4ب)۔ اس کے برعکس، رفیمپیسن پر مشتمل درمیانے درجے پر اگنے والے کیڑے، ایک AGEs بلاکر، کم خارج ہوتے ہیں۔flrifampicin کے بغیر اگائے جانے والے کنٹرول کیڑے کے مقابلے میں uorescence (تصویر 2)4c) رفیمپیسن کے لمبی عمر کے اثرات کی پہلے اطلاع دی جا چکی ہے۔30. مزید برآں،daf-2، ایک نمائندہ حامی لمبی عمر کا اتپریورتی، جنگلی قسم کے مقابلے میں خود کار طریقے سے فلورسڈ بھی ہوتا ہے (تصویر 2)۔4d)، جبکہflعمر بڑھنے کے ساتھ جنگلی قسم کی urorescence کی شدت میں اضافہ ہوا۔

کا ایک حصہflجانوروں کی موت کے ساتھ مل کر پیدا ہونے والے مرکبات سے uorescence حاصل کیے جانے کی امید ہے۔ نیلاfluorescence موت کا نشان ہو سکتا ہے کہ Coburn et al. میں مشاہدہ کیاسی ایلیگنسموت سے پہلے اور بعد میں کئی گھنٹے؛ نیلی روشنی اینتھرانیلک ایسڈ سے آئے گی جو کیڑے کے مرنے کے فوراً بعد بنتی ہے۔14. اطلاعات کے مطابق موتflکینورینین پاتھ وے کے ذریعہ تیار کردہ اینتھرانیلک ایسڈ کی گلائکوسلیٹ شکل سے یوورسینس خارج ہوتا ہے14. کیو-1اتپریورتی کیڑے، جن میں kynureninase کی کمی ہوتی ہے، اس کے مطابق موت کے اخراج کی توقع نہیں کی جاتی تھی۔fluorescence تاہم، اس اتپریورتن کی موجودگی میں بھی، عمر رسیدہ کیڑے اب بھی زیادہ خارج ہوتے دکھائی دیتے ہیں۔فلوروسینسچھوٹے کیڑے کے مقابلے میں (تصویر5a)، اور نیماٹوڈ گروتھ میڈیم (این جی ایم) پر اگائے جانے والے کیڑے جو رائبوز کے ساتھ ضمیمہ ظاہر کرتے ہیںfifiبہت زیادہflضمیمہ رائبوز کی غیر موجودگی میں یا کنٹرول شوگر سوربیٹول (تصویر 1) کے ساتھ اگنے والوں کے مقابلے میں یوروسینس۔5ب)۔ رائبوز کے ساتھ برقرار رکھنے والے کیڑے کی عمر ظاہر ہے کہ دوسروں کی نسبت کم تھی (تصویر 1)۔5c)، کیڑے میں AGEs کے عمر رسیدہ اثرات کی تجویز کرتا ہے۔

آٹو فلوروسینٹ مواد کی شناختان مادوں کی شناخت کے لیے جوflعمر رسیدہ جانوروں میں uresced، ایک LC MALDI پرکھ نکالے گئے پروٹین پر کی گئی۔ ہر نمونے میں پائے جانے والے چھ سب سے زیادہ پرچر پروٹین ٹیبل میں درج ہیں۔1; خاص طور پر، سب سے اوپر کے درمیان وٹلوجینز اور لمبا عوامل کو افزودہ کیا گیا تھا-45flپرانے کیڑے میں پروٹین کی urescing. مزید برآں، ہائی ریزولوشن MS اور Mascot کمپیوٹیشنل ماحول کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے ایسے پروٹینوں کی تلاش کی جو 15- دن پرانے کیڑے میں 3- دن پرانے کیڑے کی نسبت زیادہ پائے گئے اور 180 پروٹین کی نشاندہی کی (ضمنی جدولیں 1۔–3)۔ اگرچہ وٹلوجیننز دوبارہ افزودہ ہو گئے تھے (نوجوان بالغوں کی نسبت بڑی عمر کے کیڑوں میں چھ گنا زیادہ سطح پر موجود ہیں)، دونوں گروہوں میں لمبائی کے عوامل کی سطح ایک جیسی تھی (ضمیمہ تصویر 3)۔ اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ آیا ان پروٹینوں کو آٹو فلوروسینٹ AGEs بنانے کے لیے گلائکیٹ کیا جا سکتا ہے، پیوریفائیڈ لونگیشن فیکٹر اور وٹیلوجینن کو وٹرو میں رائبوز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ گلائکیٹیڈ وٹیلوجینز سے خارج ہونے والے فلوروسینس نے سپیکٹرا کی نمائش کی جو کہ 17- دن پرانے کیڑے (تصویر 1) سے برآمد ہونے والے خام عرق کے ساتھ حاصل کی گئی تھی۔6a)۔ اگرچہ رائبوفلاوین کو جانا جاتا ہے۔fluoresce، ہم نے پایا کہ رائبوفلاوین کی اخراج طول موج مختلف تھی۔کہ کیڑے کے عرق کا۔ گلائکیٹیڈ وٹیلوجینن اور ایلوگیشن فیکٹر کا FL فلوروسینس وٹرو میں 23 دن تک چھ اور تین گنا (بالترتیب) غیر گلائکیٹیڈ پروٹینوں میں سے تھا۔6b).

اینٹی سی ایم ایل اینٹی باڈیز کے ساتھ ویسٹرن بلوٹنگ کے ذریعے پائے جانے والے AGEs میں بھی وقت کے ساتھ ساتھ 3-دن پرانے سے 13- دن کے پرانے کیڑے Vivo میں اضافہ ہوا (تصویر۔1c)۔ اینٹی وٹیلوجینن اینٹی باڈیز کے ساتھ بیک وقت مغربی بلوٹنگ کے ذریعے، ہم نے پایا کہ اینٹی سی ایم ایل سگنل ایک ہی سائز کے بینڈ تھے جیسا کہ وٹیلوجیننز (تصویر 2 اے)۔6c)۔ اگرچہ اس مدت کے دوران عمر کے ساتھ ساتھ وٹیلوجینینز YP170 اور YP115 جمع ہوئے، AGE سگنلز کی شدت وٹیلوجینن YP170 (تصویر 1) کی مقدار میں اضافے سے زیادہ بڑھ گئی۔6d)۔ فلوروسینس مائکروسکوپی نے انکشاف کیا کہ 13- دن پرانے کیڑے (تصویر7d–f، کالم 2 اور 3) خارج شدہ نشانfifi3-دن کی عمر کے نوجوان بالغوں سے زیادہ شدید نیلی روشنی (تصویر7a–c، کالم 2 اور 3؛ انجیر.7g)؛ گوناڈز بھی روشن دکھائی دے رہے تھے (تصویر 4۔7d–f، کالم 1 اور 2)۔ CML ایک نمائندہ AGE ہے، حالانکہ CML خود ft فلوروسینٹ نہیں ہے۔ پینٹوسیڈین، ایک اور AGE، فلوروسینٹ کے طور پر جانا جاتا ہے۔ تاہم، نہ تو اینٹی سی ایم ایل اور نہ ہی اینٹی پینٹوسیڈین اینٹی باڈیز کے ساتھ امیونوسٹیننگ نے بوڑھے اور نوجوان کیڑے کے درمیان نمایاں فرق فراہم کیا (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔ تاہم اینٹی سی ایم ایل نے بافتوں میں پھیلنے والے پھیلاؤ کو دکھایا، جبکہ اینٹی پینٹوسیڈین نے شاید ہی یہ دکھایا۔