Sevoflurane کی مختصر سانس نوزائیدہ چوہوں میں ہائپوکسک اسکیمک دماغی چوٹ کے بعد گلیل اسکار کی تشکیل کو کم کر سکتی ہے حصہ 1

خلاصہ

پچھلے مطالعات نے یہ ثابت کیا ہے کہ سیووفلورین پوسٹ کنڈیشننگ ہائپوکسک اسکیمک چوٹ کے بعد نیورو پروٹیکشن فراہم کرسکتی ہے اور چوہا دماغوں کی نشوونما میں سیکھنے اور میموری کے کام کو بہتر بنا سکتی ہے۔

ہائپوکسک اسکیمک چوٹ سے مراد دماغی اسکیمیا، ہائپوکسیا، میٹابولک ڈس آرڈر، اور قلبی اور دماغی نظام کی خرابی کی وجہ سے اعصابی خلیوں کو پہنچنے والے نقصان کی وجہ سے ہونے والی پیتھولوجیکل حالت ہے۔ سماجی ترقی اور طرز زندگی میں تبدیلیوں کے ساتھ، ہائپوکسک اسکیمک چوٹ زیادہ سے زیادہ عام ہوتی جارہی ہے۔ یہ حالت انسانی صحت کو بہت سے نقصان پہنچا سکتی ہے، جس میں کسی کی ذہانت اور یادداشت کو متاثر کرنا بھی شامل ہے۔

اگرچہ ہائپوکسیا اور اسکیمیا دماغی افعال میں کمی کا سبب بن سکتے ہیں، لیکن اس کا مطلب یہ نہیں ہے کہ یادداشت پر منفی اثر پڑے گا۔ اس کے برعکس، ہم صحیح طریقوں کے ذریعے یادداشت کو بہتر بنا سکتے ہیں اور دماغ کی کارکردگی کو بڑھا سکتے ہیں۔ آپ کی یادداشت کو بہتر بنانے میں مدد کرنے کے کچھ طریقے یہ ہیں:

1. صحت مند غذا: غذا کا حافظہ پر اثر بہت اہم ہے۔ پروٹین، وٹامنز اور معدنیات سے بھرپور غذائیں صحت مند اعصابی نظام اور سوچ کے کام کو برقرار رکھنے میں مدد کر سکتی ہیں۔

2. زیادہ ورزش کریں: جسمانی ورزش خون کی گردش کو فروغ دے سکتی ہے، آکسیجن کے بہاؤ کو بڑھا سکتی ہے، جسم کی قوت مدافعت کو بڑھا سکتی ہے اور بیماری کے خطرے کو کم کر سکتی ہے۔ ورزش کے ذریعے آپ اپنی یادداشت کو بہتر بنا سکتے ہیں۔

3. خود اعتمادی کو مضبوط کریں: اعتماد کسی شخص کی یادداشت کا ایک اہم عنصر ہے۔ اگر آپ کو یقین ہے کہ آپ کسی خاص کام کو مکمل کر سکتے ہیں، تو آپ آسانی سے اپنے مطلوبہ نتائج حاصل کر لیں گے، اور آپ اپنی یادداشت کو بھی مؤثر طریقے سے بہتر بنا سکتے ہیں۔

یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہائپوکسک اسکیمک چوٹ ایسی حالت نہیں ہے جس سے انسانی یادداشت کو لامحالہ نقصان پہنچے۔ جب تک ہم صحیح طریقوں پر عبور حاصل کرتے ہیں اور اپنے دماغ کی اچھی دیکھ بھال کرتے ہیں، ہم ایک مثبت رویہ کے ساتھ ایک صحت مند مستقبل کو اپنا سکتے ہیں۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے، اور Cistanche deserticola یادداشت کو نمایاں طور پر بہتر کر سکتا ہے کیونکہ Cistanche deserticola ایک روایتی چینی ادویاتی مواد ہے جس کے بہت سے منفرد اثرات ہیں، جن میں سے ایک یادداشت کو بہتر بنانا ہے۔ Cistanche deserticola کی افادیت ان متعدد فعال اجزاء سے آتی ہے جو اس میں شامل ہیں، بشمول tannic acid، polysaccharides، flavonoid glycosides، وغیرہ۔ یہ اجزاء مختلف راستوں سے دماغی صحت کو فروغ دے سکتے ہیں۔

یادداشت کو بہتر بنانے کے 10 طریقے جانیں پر کلک کریں۔

کلاسیکی رائس وانوچی ماڈل کا استعمال ہائپوکسک اسکیمک انجری کو دلانے کے لیے کیا گیا تھا اور نوزائیدہ (بعد از پیدائش دن 7) چوہوں کو ہائپوکسک اسکیمک چوٹ کے بعد 30 منٹ تک 2.4٪ سیووفلورین کے ساتھ علاج کیا گیا تھا۔

ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ سیوو فلورین پوسٹ کنڈیشننگ نے چوہوں کے سیکھنے اور یادداشت کے فنکشن کو نمایاں طور پر بہتر کیا، ایسٹروگلیوسس اور گلیاسکر کی تشکیل میں کمی، ڈینڈریٹک ریڑھ کی ہڈیوں کی تعداد میں اضافہ، اور ہپپوکیمپس کی ہسٹومورفولوجی کو محفوظ کیا۔ میکانکی طور پر، sevofluranepostconditioning نے hypoxia-inducible factor-1 کے Von Hippel-Lindau کے اظہار کو کم کیا اور DJ-1 کے اظہار میں اضافہ کیا۔

ہائپوکسک اسکیمک چوٹ سے 30 منٹ قبل ہائپوکسیا-انڈیکیبل فیکٹر-1 انحیبیٹر YC-1 (Lificiguat) کے 1.52 ug کا انجکشن بائیں لیٹرل وینٹرکل میں لگایا گیا جس نے سیووفلورین کے ذریعہ پیدا ہونے والے نیورو پروٹیکشن کو تبدیل کردیا۔ اس دریافت سے پتہ چلتا ہے کہ sevoflurane hippocampus میں astrogliosis کو مؤثر طریقے سے ختم کر سکتا ہے اور ہائپوکسک اسکیمک چوٹ کے بعد glial scar کی تشکیل کی وجہ سے سیکھنے اور یادداشت کی خرابی کو کم کر سکتا ہے۔

بنیادی میکانزم کا تعلق اپریگولیٹڈ DJ-1 اظہار، ہائپوکسیا-انڈیکیبل فیکٹر-1 کی ہر جگہ کم ہونے اور مستحکم ہائپوکسیا-انڈیکیبل فیکٹر-1 اظہار سے ہوسکتا ہے۔ یہ مطالعہ چائنا میڈیکل یونیورسٹی، چین کی لیبارٹری اینیمل کیئر کمیٹی (منظوری نمبر 2016PS337K) نے 9 نومبر 2016 کو منظور کیا تھا۔

کلیدی الفاظ: دماغی چوٹ؛ دماغ؛ مرکزی اعصابی نظام؛ جاندار کےاندر؛ چوٹ؛ ماڈل؛ پلاسٹکٹی چوہا؛ بحالی تخلیق نو مرمت چینی لائبریری کی درجہ بندی نمبر R453؛ R741; R614۔{3}}۔

تعارف

نوزائیدہ ہائپوکسک اسکیمک انسیفالوپیتھی (HIE) نوزائیدہ دور میں ایک عام پیچیدگی ہے جو بہت سے عوامل کی وجہ سے ہوتی ہے، جیسے کہ نوزائیدہ دم گھٹنے، انٹرا یوٹرن ڈسٹریشن، اور ہائیلین میمبرن کی بیماری (ڈگلس-ایسکوبار اور ویس، 2015؛ Barkhuizen et al., 2015)۔

ایچ آئی ای بچوں کی اموات کی سب سے بڑی وجہ اور اعصابی سیکویلی کا بنیادی ذریعہ ہے (ایڈورڈز ایٹ ال۔، 2010؛ ڈیسکلوکس ایٹ ال۔، 2015)۔ HIE سے بچ جانے والوں میں سے نوے فیصد طویل مدتی اعصابی خرابی کا شکار ہیں، جیسے سیکھنے، علمی، اور موٹر کی خرابی، اور مرگی (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019)۔ HIE کا موجودہ علاج بنیادی طور پر علامتی علاج پر مرکوز ہے، بشمول مکینیکل وینٹیلیشن، ہائپوٹینشن کی اصلاح، گلوکوز کی تکمیل، اور سیال کی مقدار کو محدود کرنا، جیسا کہ مناسب ہو۔

تاہم، طویل مدتی دماغی نقصان کو تبدیل کرنے یا کم کرنے کے قابل ایک مؤثر علاج کی ضرورت ہے (Stankowski and Gupta, 2011; Davidson et al., 2015)۔ سیکھنے اور پہچاننے کے ایک اہم حصے کے طور پر، ہپپوکیمپس، بشمول ڈینٹیٹ گائرس (DG) ، CA1، اور CA3 علاقے، اعصابی مراکز میں پردیی معلومات کو تبدیل کرنے اور انضمام کرنے میں حصہ لیتے ہیں (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020)۔

ہپپوکیمپس ہائپوکسک اسکیمک (HI) کو پہنچنے والے نقصان کے لیے انتہائی حساس ہے، جو ہپپوکیمپلنیورون کے اپوپٹوسس کو بھڑکا سکتا ہے، ضرورت سے زیادہ رد عمل والی گلیوسس کو متحرک کر سکتا ہے، اور گلیاسکر کی تشکیل کا باعث بن سکتا ہے (ہاپکنز اور ہالینڈ، 2004؛ وانگ ایٹ ال، 2012)۔ انفکشن کی جگہ کو سیل کرنے، ہپپوکیمپس کے ڈھانچے کو دوبارہ بنانے، اور شدید مرحلے کے دوران عارضی طور پر مقامی مدافعتی ردعمل کو کنٹرول کرنے کے لیے ایسٹروائٹس کا پھیلاؤ بہت ضروری ہے (رولز ایٹ ال۔، 2009)۔

تاہم، ہائپر ٹرافی اور گلیل داغ کی تشکیل غیر معمولی نیوروجینیسیس میں حصہ ڈالتی ہے، ریڑھ کی ہڈی کی نشوونما کو روکتی ہے، اور Synapse کی شکل کو روکتی ہے، سیکھنے اور پہچاننے کے افعال کو مزید خراب کرتی ہے (Yiuand He، 2006؛ Wanner et al.، 2008؛ Burda and Sofroniew؛ P2018؛ 2006؛ , 2014; Shi et al., 2017)۔

Glial fibrillary acidicprotein (GFAP) اور chondroitin سلفیٹ proteoglycans، جیسے نیوروکن، ایسٹروگلائیوسس اور گلیالسکرنگ کے پیتھولوجک مارکر ہیں جن کے اظہار کو انتہائی متحرک آسٹرو سائیٹس (پیکنی اور نیلسن، 2005؛ چوہدری، 2016) کے ذریعے اپ گریڈ کیا جا سکتا ہے۔ اس طرح، Astrogliosis اور glialscarring کی روک تھام HIE اور اس کے طویل مدتی اعصابی سلسلے کے لیے علاج کا ہدف ہو سکتا ہے۔

چوہوں میں HI کی چوٹ کو کم کرنے کے لیے sevoflurane کے استعمال کا مظاہرہ کیا گیا ہے۔ بالغ چوہوں اور نوزائیدہ چوہوں میں ہائپوکسیا-انڈیکیبل فیکٹر-1 (HIF-1) کو اپ گریڈ کرکے ایچ آئی کو پہنچنے والے نقصان کو کم کرنے کے لیے sevoflurane postconditioning (SPC) کی اہمیت کی تحقیقات کرنے والے مطالعات نے کئی ممکنہ میکانزم کی نشاندہی کی ہے (Wang et al., Yanget 2019) al., 2019; Du et al., 2020; Liu and Gong, 2020)۔

ہائپوکسیا کے کلیدی فزیولوجیکل سینسر کے طور پر، HIF-1 ایک ٹرانسکرپشن فیکٹر ہے جس میں سیکڑوں ڈاون سٹریم مالیکیولز شامل ہیں جس میں انسکیمک رواداری کے طریقہ کار شامل ہیں، جیسے ویسکولر اینڈوتھیلیل گروتھ فیکٹر اور اریتھروپوئٹین (Na et al.، 2015)۔ نوزائیدہ چوہوں کے دماغوں میں HI کے بعد ایسٹروسائٹ اور مائکروگلیئل ایکٹیویشن کو کم کرنے کے لئے ہائپوکسک پوسٹ کنڈیشننگ کی تصدیق کی گئی ہے (ٹیو ایٹ ال۔، 2015)۔

لہذا، ہم نے قیاس کیا کہ HIF-1 glial scars اور astrogliosis کی تشکیل کو کم کرنے میں معاون ثابت ہو سکتا ہے۔ HIF-1 نیوران میں جزوی طور پر موجود ہو سکتا ہے، جس کی وجہ سے یہ تیزی سے اظہار میں بڑھتا ہے اور ہائپوکسک حالات کے تحت جمع ہو جاتا ہے۔ تاہم، جب آکسیجن معمول پر آجاتی ہے، HIF1 اظہار کو اتنی زیادہ سطح پر برقرار نہیں رکھا جا سکتا ہے کہ مسلسل نیورو پروٹیکٹو اثر ڈالے کیونکہ پرول-ہائیڈروکسیلیس پروٹینز کے ذریعے آکسیجن پر منحصر انحطاط اور وان ہپیل-لنڈاؤ (VHL) پروٹین (البیرا، بیرا) کے ذریعے آکسیجن پر منحصر انحطاط۔ 2003؛ Zhang et al.، 2018)۔

DJ-1 (Encoded by Park7) مبینہ طور پر ایک نیورو پروٹیکٹو پروٹین ہے، خاص طور پر آکسیڈیٹیو حالات میں (Aleyasin et al., 2007, 2010)۔ VHL پروٹین جسمانی طور پر DJ-1 کے ساتھ تعامل کرتا ہے، جیسا کہ غیر جانبدارانہ ماس سپیکٹرو میٹری اسکرین کے ذریعے طے کیا گیا ہے اور پارکنسنز کی بیماری (PD) ماڈل میں تصدیق شدہ۔ اس کے علاوہ، Parsanejad et al. (2014) نے دکھایا کہ DJ-1 VHL پر منحصر ہر جگہ روکتا ہے اور HIF-1 اظہار کو مستحکم کرتا ہے۔

اس طرح، ہم نے قیاس کیا کہ Sevoflurane ہپپوکیمپس میں HIF-1 پروٹین کو مستحکم کرتا ہے DJ-1 کو اپریگولیٹ کر کے HIF-1 کو ہر جگہ روکتا ہے، اس طرح طویل مدتی سیکھنے اور میموری کے کام کو بہتر بناتا ہے۔

Sevoflurane اور Astrogliosis کے درمیان تعلق میں HIF-1 کے کردار کی تحقیقات کے لیے، ہم نے HIF-1 کے اظہار کو مکمل طور پر روکنے کے لیے YC-1 (Lificiguat)، HIF-1 کا انتخابی مخالف، استعمال کیا۔ نقل کے بعد کی سطح۔ اس مطالعہ میں، ہم نے SPC علاج شدہ HIE نوزائیدہ چوہوں کے نیورو پروٹیکشن میں HIF-1کے کردار کی تحقیقات کی۔

مواد اور طریقے

جانور
جانوروں کی تحقیق چوٹوں کی نشوونما کے synaptic مرحلے پر کی گئی تھی، جو بعد از پیدائش کے دن 7 (P7) سے شروع ہوتی ہے، جو کہ انسانی شیر خوار بچوں کی پیدائش کے بعد حمل سے لے کر پیدائش کے 3 سال تک کے دورانیے کے مطابق ہوتی ہے (Jevtovic-Todorovic et al.، 2003)۔ 20 حاملہ چوہوں میں سے 12-16 گرام وزنی سات دن پرانے اسپراگ ڈولی چوہوں کا انتخاب کیا گیا تھا (شینگجنگ ہسپتال، چائنا میڈیکل یونیورسٹی، چین کی لیبارٹری سے خریدا گیا؛ مرد/خواتین کا تناسب، 1:1)۔

تمام چوہے پانی اور خوراک تک آزادانہ طور پر رسائی حاصل کرنے کے قابل تھے، اور لیبارٹری میں معیاری نمی اور درجہ حرارت پر، 12-گھنٹہ روشنی/اندھیرے (8am/8p.m.) کے چکروں کے ساتھ۔ تمام جانوروں کے تجربات نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ (بیتھیسڈا، ایم ڈی، یو ایس اے) لیبارٹری جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کے رہنما خطوط کے مطابق کیے گئے تھے۔

چائنا میڈیکل یونیورسٹی کی لیبارٹری اینیمل کیئر کمیٹی نے 9 نومبر 2016 کو بیان کردہ تجربات (شینیانگ، چین؛ منظوری نمبر 2016PS337K) کو باضابطہ طور پر منظوری دی۔

25 حاملہ چوہوں میں سے، 249 P7 چوہوں کا انتخاب کیا گیا اور بے ترتیب تعداد کی میز کی بنیاد پر گروپوں میں تقسیم کیا گیا (وانگ ایٹل۔، 2019a)۔ ہمارے آخری تجزیے میں کل 201 نوزائیدہ بچے شامل تھے۔ ایچ آئی کے علاج کے بعد اموات کی شرح 19% تھی۔

ان 201 نوزائیدہ چوہوں کو تصادفی طور پر چار گروپوں میں تقسیم کیا گیا: sham(n=54)، HI (n=54)، HI + sevoflurane (HIS) (n=54)، اور HIS+ YC{{ 6}} (n=39) گروپس۔ ہر گروپ میں، 24 چوہوں کو ویسٹرن بلٹ پرکھ کے لیے استعمال کیا گیا، 5 کو امیونو ہسٹو کیمسٹری اور گولگی کے داغ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا، اور 10 کو رویے کی جانچ کے لیے استعمال کیا گیا۔ بقیہ 45 چوہوں کو شام، HI، اور HIS گروپوں میں ریورس ٹرانسکرپشن پولیمریز چین ری ایکشن (RT-) کے لیے استعمال کیا گیا۔ پی سی آر)۔

تجرباتی ڈیزائن اور اینستھیٹک کی نمائش

ملازم HIE ماڈل کو پہلے بیان کیا گیا تھا (Zhao etal., 2007; Grandvuillemin et al., 2017)۔ مقعد اور تولیدی اعضاء کے درمیان فاصلے کی بنیاد پر، بعد از پیدائش چوہوں کی جنس کی شناخت مکمل کی گئی۔ HIE ماڈل کو قائم کرنے کے لیے، ہر P7 چوہے کے سر کو ایک شفاف پلاسٹک پائپ میں ڈالا گیا تھا، جسے سیوو فلورانی کے جاری ہونے سے پہلے روئی سے بند کر دیا گیا تھا (وانگ ایٹ ال۔، 2019a؛ زیو ایٹ ال۔، 2019)۔

ہر چوہے کی بائیں عام کیروٹڈ شریان مستقل طور پر بند تھی، اور دونوں ligations کے درمیان، شریان کاٹ دی گئی تھی۔ ہر سرجری 5 منٹ کے اندر ختم ہو گئی تھی۔ اس کے بعد، چوہوں کو اینستھیزیا کا کوئی اثر نہیں ہوا اور 2 گھنٹے کے لیے ان کی ماؤں کے پنجروں میں واپس رکھا گیا۔ ایک ڈکٹ نے وینٹیلیشن میں مدد کی، جبکہ دوسری نے گیس کے نمونے کو چیمبر سے باہر مانیٹر تک پہنچایا۔

شیم گروپ کے لیے 2 گھنٹے کے لیے چیمبر کو 30% O2 اور 70% N2 کے ساتھ ہوادار کیا گیا تھا، جب کہ HI گروپ کو 2 گھنٹے کے لیے 8% O2 اور 92% N2 کا انتظام کیا گیا تھا۔ HI کے فوراً بعد SPC کا آغاز ہوا: 2.4% sevoflurane (1 کم از کم alveolarconcentration) چوہوں کے ذریعے چیمبر میں 30% O2 اور 70% N2 اور ہوا کے بہاؤ کی شرح 2 L/min 30 منٹ کے لیے سانس لی گئی۔ ہیٹنگ پول نے چیمبر کے اندر درجہ حرارت کو 37 ڈگری پر مستحکم کیا۔

منشیات کی انتظامیہ

HI سے ٹھیک 30 منٹ پہلے، 1.52 ug of HIF-1 inhibitor (YC1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) کا استعمال کرتے ہوئے بائیں لیٹرل وینٹریکل (Paxinos and Franklin, 2013) میں انجکشن لگایا گیا تھا۔ ایک 5-μL ہیملٹن سرنج (ینگ ویڈا ٹیکنالوجی، بیجنگ، چین)۔ جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، YC-1 کو 0.304 ug/μL (Shen et al., 2012; Na et al., 2015) کے ارتکاز میں مصنوعی دماغی اسپائنل سیال میں تحلیل کیا گیا تھا۔

مغربی دھبے کا تجزیہ

P7 چوہوں کو 2٪ sevoflurane کے ذریعے بے ہوشی کی گئی، اور ہپپوکیمپل ٹشوز کو 12، 24، اور 48 گھنٹے، اور سرجری کے 28 دن بعد پِلوں سے نکالا گیا۔ نکالنے کے بعد، ٹشوز کو فوری طور پر برف پر رکھا گیا۔

کل سپرنٹنٹ پروٹینز کو ریڈیو امیونوپریسیپیٹیشن اسایاجنٹ (بیو ٹائم، ہیمن، چین) شامل کرکے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ پروٹین کی تعداد کا تعین ون بی سی اے کٹ (بیو ٹائم) سے کیا گیا تھا۔

اس کے بعد، نمونوں کو 12.5٪ سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ-پولیاکریلامائڈ جیلوں پر الگ کیا گیا اور نائٹروسیلوز میمبرینز میں منتقل کیا گیا۔ 4 ڈگری پر 5% بوائین سیرم البومین (سگما-الڈرچ) کے ساتھ بلاک کرنے کے بعد، جھلی کو مناسب بنیادی اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا، بشمول اینٹی گلیسرالڈیہائڈ 3- فاسفیٹ ڈیہائیڈروجنیز (GAPDH؛ 1:2000؛ Cat# 5174Signaling)؛ ٹیکنالوجی , Danvers, MA, USA), اینٹی DJ-1 (1:1000;Cat# ab18257; Abcam, Cambridge, UK), اینٹی VHL (1:5000; polyclonal; Cat# ab77262; Abcam), مخالف -HIF-1 (1:900؛ پولی کلونل؛ Cat# ab2185؛ Abcam)، اینٹی نیوروکن (1:200؛ مونوکلونل؛ Cat# sc-33663؛ سانتا کروز بائیوٹیکنالوجی، ڈلاس، TX، USA) , anti postsynaptic density protein 95 (PSD95; 1:1000; monoclonal; Cat. No 3409S; سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی)، antigrowth وابستہ پروٹین 43 (GAP43; 1:2000; polyclonal; Cat# 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology ، شکاگو، IL، USA)، اور اینٹی GFAP (1:5000، پولی کلونل، Cat# ab53554؛ Abcam)۔

اس کے بعد، اینٹی خرگوش IgG (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Beijing, China) اورینٹی ماؤس IgG (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao) کے ساتھ دھبے لگائے گئے۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے۔

پروٹین کے دھبوں کو بہتر کیمیلومینیسینس ڈیٹیکشن ریجنٹس (سپر سگنل ویسٹ پیکو؛ پیئرس، راک فورڈ، IL، USA) کے ساتھ تصور کیا گیا تھا۔ امیج جے سافٹ ویئر (نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ) کے ساتھ پروٹین بینڈ کی مقدار درست کی گئی۔ مغربی دھبوں کے تجزیہ کے لیے، ڈیٹا کو GAPDH میں معمول بنایا گیا تھا۔

امیونو ہسٹو کیمسٹری

سرجری کے اٹھائیس دن بعد، چوہوں کو اوپر بیان کردہ طریقہ استعمال کرتے ہوئے بے ہوشی کی دوا دی گئی، جس میں 4% فارمیلین شامل تھی، اور ان کے دماغوں سے امیونو فلوروسینس داغ ہٹا دیے گئے۔

دماغوں کو 4 ڈگری پر 4 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ میں 48 گھنٹے تک ڈبو دیا گیا، بعد ازاں درجہ بندی شدہ ایتھنول سیریز میں پانی کی کمی ہوئی، اور آخر میں پیرافین کو سرایت کر دیا گیا۔ اس کے بعد، پیرافین سے جڑے ٹشوز کو 2 میں کاٹا گیا تھا۔

ہر ایک دماغ کو مسلسل سیکشن کیا گیا تھا، اور NeuN (نیورون مارکر)، GFAP (اسٹرو سائیٹ مارکر) اور نیوروکن (گلیئل داغ مارکر) داغ لگانے کے لیے تین منقطع دماغی حصوں کو منتخب کیا گیا تھا۔ GFAP(1:250؛ پولی کلونل؛ Cat# ab53554؛ Abcam)، خرگوش کے اینٹیجنز (1:100؛ بلی # 12943؛ سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی)، اور/یا ماؤس اینٹی نیوروکن (1:200؛ مونوکلونل؛ Cat# sc{{ 10}}؛ سانتا کروز بائیوٹیکنالوجی) نمی والے چیمبر میں رات بھر 4 ڈگری پر۔

اس کے بعد، حصوں کو 0.1 ایم فاسفیٹ بفرڈ نمکین سے دھویا گیا اور مناسب ثانوی اینٹی باڈیز کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا، بشمول اینٹی خرگوش IgG کو الیکسا فلور سے جوڑ دیا گیا-594 (1:200؛ زندگی ٹیکنالوجیز، گرینڈ آئی لینڈ، NY، USA)، اینٹی ماؤس IgGconjugated to Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies)، اور anti-goat IgG کو fluorescein isothiocyanate (1:200; Life Technologies) سے ملایا گیا۔

سیل نیوکلی کے انسداد کو 5 منٹ کے لیے 4′،6-diamidino-2-phenylindole (Beyotime) کے ساتھ لاگو کیا گیا۔

ایک Olympus BX51 مائکروسکوپ (OlympusCorporation, Tokyo, Japan) کو داغ دار حصوں کے مشاہدے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ بائیں ہپپوکیمپس کے نظارے کے تین فیلڈز کو فوٹو گرافی کے لیے ہر ایک سلائس سے تصادفی طور پر منتخب کیا گیا تھا۔ امیج جے سافٹ ویئر کو مقداری اجتماعیت کا تخمینہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا اور اس لیے مینڈرز کے اوورلیپ کوفیشینٹ کا حساب لگایا گیا تھا۔

For more information:1950477648nn@gmail.com