پوڈوکیٹس میں CD73 اوور ایکسپریشن: انسانی گردے کی بیماری میں پوڈوسائٹ کی چوٹ کا ایک نیا نشان
Feb 26, 2022
خلاصہ:CD73 پاتھ وے مختلف بیماریوں کی ترتیبات میں ایک اہم سوزش مخالف طریقہ کار ہے۔ ماؤس ماڈلز میں مشاہدات نے تجویز کیا کہ CD73 میں حفاظتی کردار ہو سکتا ہے۔گردے کا نقصان; تاہم، انسان میں اس کے کردار کا کوئی براہ راست ثبوت نہیں ہے۔گردے کی بیماریآج تک بیان کیا گیا ہے۔ یہاں، ہم نے قیاس کیا کہ انسان میں پوڈوسیٹ چوٹگردے کی بیماریوںCD73 اظہار کو تبدیل کرتا ہے جو پوڈو سائیٹوپیتھیس کی تشخیص کو آسان بنا سکتا ہے۔ ہم نے CD73 کے اظہار اور اس کے عملی طور پر اہم اہداف میں سے ایک، CC کیموکین ریسیپٹر ٹائپ 2 (CCR2) کا اندازہ کیا،گردہپوڈو سائیٹوپیتھی (بشمول فوکل سیگمنٹل گلوومیرولوسکلروسیس (ایف ایس جی ایس)، کم سے کم تبدیلی کی بیماری (ایم سی ڈی)، جھلیوں والے گلوومیرولونفرائٹس (ایم جی این) اور امیلائڈوسس) اور ایک کنٹرول گروپ کے ساتھ 39 مریضوں کی بایپسی۔ بیماری کے ہر گروپ میں پوڈوکیٹ CD73 اظہار کو کنٹرول کے مقابلے میں نمایاں طور پر بڑھایا گیا تھا (p < 0۔{4}}{{10}}1–p=""><0.0001)۔ مزید="" یہ="" کہ،="" cd73="" اور="" ccr2="" اظہار="" کے="" درمیان="" ایک="" نمایاں="" منفی="" تعلق="" تھا،="" جیسا="" کہ="" امیونو="" ہسٹو="" کیمسٹری="" اور="" امیونو="" فلوروسینس="" (pearson="" r="−" 0.5068,="" p="0.0031;" pearson="" r="سے" تصدیق="" شدہ="" ہے)="" 0.4705،="" p="0.0313،" بالترتیب)،="" اس="" طرح="" cd73="" کا="" حفاظتی="" کردار="" تجویز="" کرتا="">گردے کی چوٹ.آخر میں، ہم CD73 کی شناخت انسانی پوڈوسیٹوپیتھیز کے ایک نئے ممکنہ تشخیصی مارکر کے طور پر کرتے ہیں، خاص طور پر MCD کے جو کہ لائٹ مائیکروسکوپی اور امیونو ہسٹو کیمسٹری کے ذریعے پہچانے جانے والے پیتھولوجیکل خصوصیات کی کمی کے لیے بدنام ہیں۔
مطلوبہ الفاظ:پوڈو سائیٹ کم سے کم تبدیلی کی بیماری؛ CD73; CCR2;گردے کی چوٹ؛گردے خراب
تعارف
اڈینوسین ٹرائی فاسفیٹ (ATP) کا ارتقائی اہم کردار بطور ہر جگہ انٹرا سیلولر توانائی کے منبع کو تین دہائیوں سے زیادہ پہلے ایک انقلابی تصور کے ساتھ اپ ڈیٹ کیا گیا ہے کہ purinergic نظام کے ارکان (ATP، adenosine di- اور triphosphate (ADP اور AMP، بالترتیب) سیلولر تعاملات میں ثالثی کے لیے ایکسٹرا سیلولر سگنلز بھی فراہم کر سکتے ہیں [ 1 , 2 ]۔ یہ تصور یہ سمجھنے کا باعث بنتا ہے کہ purinergic نظام ریسیپٹر ایکسپریشن پروفائل، سائٹوکائن سراو، ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں کی پیداوار (ROS) کی ماڈیولیشن کے ذریعے مدافعتی ردعمل کی تشکیل میں حصہ لیتا ہے۔ انٹرا سیلولر پیتھوجین ہاضمہ [3–7]۔ ایکسٹرا سیلولر اے ٹی پی CD39 کے ذریعے ADP اور AMP میں تبدیلی/dephosphorylation سے گزرتا ہے (ecto-nucleosidtriphosphate diphosphohydrolase 1) اور آخر میں، AMP کو CD73 (ectonucle) کے ذریعے اڈینوسین میں تبدیل کر دیا جاتا ہے۔ CD73 جھلی کے پابند یا گھلنشیل شکل میں موجود ہو سکتا ہے۔ سی ٹرمینل سیرین اور گلائکوسائل فاسفیٹائل انوسیٹول (جی پی آئی) کے درمیان رابطے کے ذریعے پلازما جھلی [9]۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ CD39 سبسٹریٹس ATP اور ADP CD73 کے مسابقتی روکنے والے معلوم ہوتے ہیں [9 – 11]۔ CD73 اظہار اس طرح ایکسٹرا سیلولر اسپیس میں اڈینوسین کی سطح کو ٹیوننگ کرنے کے اہم راستے کی نمائندگی کرتا ہے۔ CD73 سیل یا عضو مخصوص مالیکیول نہیں ہے۔ مختلف اعضاء کے leukocytes، endothelium، epithelial یا mesenchymal خلیات پر اس کا اظہار (گردہ، پھیپھڑے، جگر، بڑی آنت، دماغ اور دل) اور سٹیم سیلز کو اچھی طرح سے دستاویز کیا گیا ہے [12 - 14]۔ جگر کی اسکیمیا سے متاثرہ چوٹ میں نائٹرک آکسائڈ (NO) - ترکیب کے راستے کے ذریعے اڈینوسین کے حفاظتی کردار کی اطلاع سب سے پہلے پیرلٹا ایٹ ال نے دی تھی۔ [15] ان اعداد و شمار کے مطابق، اس کے عمل کو پھیپھڑوں کے شدید نقصان، ایلوگرافٹ ایئر وے کو مسترد کرنے، شدید گرافٹ بمقابلہ میزبان بیماری اور سیپسس [4,16–19] کو کم کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے۔
CISTANCHE گردے/ گردوں کی خرابی کو بہتر کرے گا۔
جیسا کہ ماؤس کے کئی ماڈلز میں یقین سے دکھایا گیا ہے، CD73 ٹیوبولو گلومیرولر تعامل میں حصہ لے سکتا ہے۔گردہ. اسکیمیا-ریپرفیوژن نقصان کے دوران نلی نما اصل کے اے ٹی پی سے CD73 کے ذریعے حاصل کردہ اڈینوسین کی ثالثی کی CD73-ایڈینوسین کی نسل کو نیوٹروفیلز کے انفیکٹر فنکشن کی روک تھام کے ذریعے سوزش کو کم کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے [20]۔ مزید برآں، CD73-کی کمی والے چوہوں میں خود کار قوت مدافعت کی سوزش ہوتی ہے جس کے ساتھ پوڈوسائٹس اور اینڈوتھیلیل فینیسٹریشن کی تعداد کم ہوتی ہے [21]۔ یہ رجحان پرو سوزش والی سائٹوکائنز جیسے ٹیومر نیکروسس فیکٹر (TNF)-الفا یا کیموکائن CXC موٹف ligand 2 (CXCL-2) کے سیرم کی بڑھتی ہوئی سطح سے وابستہ تھا۔ انسان کی ترتیب میںگردے کی بیماری،یہ فرض کیا گیا ہے کہ پوڈوسائٹ کا نقصان ممکنہ طور پر پیتھولوجک محرکات کے سیلولر ردعمل کے انکولی اور تباہ کن میکانزم کے مرکب کی نمائندگی کرتا ہے، ضروری نہیں کہ وٹرو یا جانوروں کے ماڈلز سے شائع شدہ مشاہدات کی عکاسی کرے۔ پوڈوسائٹ کی چوٹ کی ایٹولوجی مکینیکل تناؤ (گلومیرولر ہائپر فلٹریشن)، آکسیڈیٹیو تناؤ (جیسے ہائی بلڈ پریشر یا ذیابیطس نیفروپیتھی، زہریلے چوٹ، سوزش کے خلیوں میں دراندازی یا کم سے کم تبدیلی کی بیماری کے جانوروں کے ماڈل) سے امیونولوجک تناؤ (یعنی، مدافعتی پیچیدہ اور تکمیلی ثالثی نقصان) سے مختلف ہوتی ہے۔ گلوومیرولونفرائٹس کے دوران) [22]۔ گلوومیرولونفرائٹس کی سوزش والی ترتیب پوڈوکیٹس کو مختلف سائٹوکائنز کی ترکیب کے لیے متحرک کر سکتی ہے، ممکنہ طور پر CC کیموکین ریسیپٹر 2 (CCR2) ثالثی سگنلنگ کے ذریعے۔ پھر بھی، انسان میں CD73 کے کردار کے بارے میں بہت کم معلوم ہے۔گردے کی بیماریخاص طور پر دائمی سوزش اور پوڈوسیٹ چوٹ کی ترتیب میں۔
موجودہ مطالعے میں، ہم نے یہ قیاس کیا کہ CD73 انسانی گلوومیرولر امراض کے روگجنن میں ایک کردار ادا کرتا ہے اور انسان میں پوڈوکیٹ CD73 اظہار کا تجزیہ کیا ہے۔گردہپوڈوسیٹوپیتھی سے متعلق پیتھالوجیز والے مریضوں کی بایپسی۔ ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ CD73 کا پوڈوسائٹ سرفیس ایکسپریشن پوڈوسائٹیڈامج کا ایک قابل اعتماد مارکر ہے، اس طرح کم سے کم تبدیلی کی بیماری (MCD) میں CD73 کی تشخیصی قدر کی حمایت کرتا ہے۔ مزید یہ کہ، ہم پوڈوسیٹ سی سی آر 2 اور سی ڈی 73 اظہار کے درمیان منفی ارتباط کی اطلاع دیتے ہیں، یہ تجویز کرتے ہیں کہ سی ڈی 73 کا اوور ایکسپریشن گلوومیرولر گھاووں کے لیے انکولی ردعمل کی نمائندگی کرتا ہے۔
نتائج
کلینکل ڈیٹا اور پوڈوسائٹ نقصان کا الٹراسٹرکچرل امیجنگجدول 1 عمر، جنس، کریٹینائن اور پروٹینوریا کی کل اقدار کے حوالے سے مطالعہ میں شامل کیسز کی طبی پیش کش کا خاکہ پیش کرتا ہے۔ تمام FSGS مریضوں کا بنیادی NOS (بصورت دیگر مخصوص نہیں) فارم تھا۔ ایم جی این کے 12 مریضوں میں سے 5 فاسفولیپیس A2 ریسیپٹر (PLA2R) مثبت (42 فیصد) تھے۔ amyloidosis گروپ میں، 2 مریضوں کو AA-amyloidosis (16.7 فیصد) اور 10 AL-amyloidosis (83.3 فیصد)؛ 2 مریضوں میں AL-amyloidosis لائٹ چین کاپا واضح تھا (20 فیصد) اور 8 لیمبڈا کے لئے مثبت تھے (80 فیصد AL-amyloidosis گروپ)۔ MCD، FSGS، MGN اور amyloidosis والے تمام مریضوں میں، podocyte کے نقصان کا واضح طور پر الیکٹران مائیکروسکوپی (شکل 1) سے پتہ چلا۔
پیکر 1. بنیادی اور ثانوی پوڈوسیٹ نقصان کی الٹراسٹرکچرل امیج۔ (a) MCD کے معاملے میں پاؤں کے عمل کو پیچھے ہٹانے کے ساتھ گلومیرولر تہہ خانے کی جھلی (تیر) پر پوڈو سائیٹ باڈی کا پھیلنا۔ (b) پرائمری FSGS والے مریض میں وسیع پیمانے پر پوڈوسائٹ فٹ پراسیس ایفیسمنٹ (تیر) اور سائٹوپلاسمک ویکیولائزیشن (ستارہ)۔ (c) پرائمری میمبرینس گلوومیرولونفرائٹس میں بنیادی ایپی میمبرنس الیکٹران-گھنے مواد (ستارہ) کے ساتھ پاؤں کے عمل کو ختم کرنا (تیر)، ویکیولائزیشن اور نمایاں آرگنیلز (ڈبل ایرو)۔ ( d ) AL-amyloidosis (lambda) والے مریض میں لگاتار پوڈوسیٹ لاتعلقی (ناقابل واپسی پوڈوسیٹ نقصان کی علامت کے طور پر) کے ساتھ amyloid-fibrils (دو سروں والے تیر) کا subepithelial جمع ہونا۔ تمام الیکٹران مائیکرو گراف 4000 × میگنیفیکیشن پر پیش کیے گئے ہیں۔ داخل کرتا ہے — متعلقہ لائٹ مائکروسکوپی فوٹومیکروگرافس (40 × /0.65 NA؛ اسکیل بار سائز: 50 µm in (a,c,d) اور 100 µm in (b)؛ PAS-staining)۔
سی ڈی 73 کی سطح کا اظہار انسانی گردے کی بیماری میں پوڈوسائٹ کی چوٹ سے وابستہ ہے۔
یہ دریافت کرنے کے لیے کہ آیا پوڈوسائٹس جسمانی ترتیب میں CD73 کا اظہار کرتے ہیں اور CD73 کے پیٹرن کا جائزہ لینے کے لیے مختلف بیماریوں کی سیٹنگز سے متعلق ٹاپ پوڈوسائٹڈامیج، CD73 اظہار کا ویپرفارمڈممونہسٹو کیمیکل تجزیہ۔ الٹراسٹرکچرل تجزیے نے کم از کم پیروں کے عمل کو ختم کرنے کے ساتھ سائٹوسکیلیٹل بے قاعدگی کے طور پر پوڈوسیٹ نقصان کی تصدیق کی ہے (شکل 1)۔ ہمارے منفی کنٹرول گروپ میں پوڈوسیٹ گھاووں کے بغیر، اندرونی کنٹرول (پیریٹیوبلر کیپلیریوں) کی مثبتیت کے باوجود سی ڈی 73 کے کوئی اہم پوڈوسیٹ اظہار کا پتہ نہیں چل سکا جو عام طور پر مثبت داغ دیتا ہے (شکل 2)۔ دوسری طرف، پوڈوسائٹ ڈیمیج گروپس (MCD، FSGS، MGN اور amyloidosis) نے پوڈو سائیٹ CD73 (p < 0۔="" 001);="" منفی="" کنٹرول="" (p="" کم="" از="" کم=""><0.001) کے="" ساتھ="" واحد="" اداروں="" کا="" موازنہ="" کرتے="" وقت="" بھی="" نمایاں="" اضافہ="" مستقل="" تھا۔="" دلچسپ="" بات="" یہ="" ہے="" کہ،="" cd73="" اپ="" گریجولیشن="" کی="" حد="" mcd="" گروپ="" میں="" کم="" تھی،="" اگرچہ="" صرف="" mgn="" نمونوں="" (p="0.0043)" (شکل="" 2)="" کے="" مقابلے="" میں="" نمایاں="" طور="" پر="" کم="" ہے۔="" پوڈوسیٹ="" کو="" پہنچنے="" والے="" نقصان="" کے="" گروپوں="" میں،="" بائنری="" (نیفروٹک/نان="" نیفروٹک)="" یا="" مقداری="" (g/24="" h)="" کی="" سطح="" (spearman="" r="−" 0.0807,="" p="0" پر="" نیم="" مقداری="" cd73="" سکور="" اور="" پروٹینوریا="" کے="" درمیان="" کوئی="" تعلق="" نہیں="" تھا۔="" .6302="" اور="" spearman="" r="−" 0.076,="" p="0.6497،" بالترتیب؛="" شکل="" 3a)۔="" مجموعی="" طور="" پر،="" cd73="" سکور="" اور="" کریٹینائن="" لیول="" کے="" درمیان="" کوئی="" تعلق="" نہیں="" تھا="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" شکل="" 3b)۔="" مزید="" برآں،="" ہم="" cd73="" اظہار="" اور="" ہائی="" بلڈ="" پریشر="" (spearman="" r="−" 0.03024,="" p="0.8384)" یا="" ذیابیطس="" mellitus="" (spearman="" r="−" 0.1784,="" p="" {4)="" کے="" درمیان="" اہم="" ارتباط="" کا="" پتہ="" نہیں="" لگا="" سکے۔="">
انسانی گلوومیرولر بیماری میں پوڈوکیٹ سے ماخوذ CD73 کا اپ گریجشن منفی طور پر CCR2 ریسیپٹر کے اظہار کے ساتھ تعلق رکھتا ہے اور نیفرین اور پوڈوسن اظہار کے ساتھ کوئی تعلق نہیں رکھتا ہے۔اسٹیم سیل ماڈل میں CD73 اوور ایکسپریشن کے بعد میکروفیج CCR2 اظہار کی کمی پر شائع شدہ اعداد و شمار کی تعریف کرتے ہوئے، ہم نے یہ قیاس کیا کہ پوڈوسیٹ چوٹ کے دوران CD73 کی اپ گریجشن پرو سوزش CCR2 کے اظہار کے ساتھ الٹا تعلق رکھتی ہے اور امیونو ہسٹو کیمیکل CCR2 تجزیہ کیا۔ کنٹرول گروپ میں، ایک ہی نمونے میں CD73 دستخط کے مقابلے میں ایک اہم تضاد کے بغیر، CCR2 کا کوئی یا صرف ہلکا اظہار نہیں پایا جا سکا۔ اس کے برعکس، سطح CCR2 کی زیادہ تر اہم اپ گریجشن (ابھی تک مختلف شدت کے) پوڈوسیٹ کو پہنچنے والے نقصان کے بایپسیوں کے نمونوں کی اکثریت میں دیکھا جا سکتا ہے اور عام طور پر کنٹرول گروپ (p=0.0206؛ ضمنی اعداد و شمار کے مقابلے میں اپ گریڈ کیا گیا تھا۔ S1)۔ بیماری کے گروپ اس سلسلے میں ایک دوسرے سے نمایاں طور پر مختلف نہیں تھے۔
ہم نے CD73 اور CCR2 کے اظہار کی شدت کے درمیان ممکنہ ارتباط کا مزید تجزیہ کیا۔ درحقیقت، پوڈوسیٹ انجری بائیوپسی کوہورٹ سے CD73 اور CCR2 اسکورز کا موازنہ کرتے ہوئے، ایک نمایاں منفی ارتباط دیکھا جا سکتا ہے (Spearman r=− 0.4821, p=0۔{18} }052)، (شکل 4)۔ قابل غور بات یہ ہے کہ CD73-مثبت پوڈو سائیٹس کے ساتھ گلومیرولی نہ صرف پوڈوسیٹس میں بلکہ ارد گرد کے خلیات میں بھی کم CCR2 اظہار کو ظاہر کرتا ہے، جیسا کہ parietal epithelial خلیات (شکل 4)۔ الٹا ارتباط کی تصدیق کنفوکال مائکروسکوپی (Spearman r=− 0.4478, p=0.0282)، (شکل 5) کے ذریعے خراب پوڈوسیٹس میں CD73/CCR2 کے لیے امیونو فلوروسینٹ کو-سٹیننگ کی تشخیص سے ہوئی۔ CD73 مثبتیت اور پوڈوکیٹ مخصوص پروٹین کے اظہار کے درمیان حتمی ایسوسی ایشن کو حل کرنے کے لیے، ہم نے نیفرین اور پوڈوسن کے لیے اضافی امیونو فلو ریسنٹ سٹیننگز کیے اور کنٹرول، MCD اور FSGS گروپس (شکل 6a) کے ساتھ ساتھ ان کے اظہار کے پیٹرن کا بھی جائزہ لیا۔ CD73 کے ساتھ پوڈوسیٹ گھاو کے نمونوں میں (شکل 6b–e)۔ ہم ایک طرف پوڈوسن یا نیفرین اظہار کی اوسط فلوروسینس کی شدت اور دوسری طرف CD73 کے اوسط اظہار کے درمیان اہم ارتباط کا پتہ نہیں لگا سکے (n=39, Spearman r=0.212, p=0 }.1948 برائے پوڈوسن اور n=60، اسپیئر مین r=0.01906، p=0.8851 نیفرین کے لیے)۔
بحث
ہم یہاں پہلی بار انسان میں زخمی پوڈوسائٹس کی سطح پر CD73 کے اظہار کی وضاحت کرتے ہیں۔گردوں کی بیماری. تجزیہ کرناگردوںایم سی ڈی، ایف ایس جی ایس، ایم جی این اور امائلائیڈوسس جیسے نمایاں پوڈوسیٹ نقصان والے مریضوں کی بایپسی، ہم کنٹرول کے مقابلے میں ان گروپوں میں سے ہر ایک میں پوڈوسیٹ CD73 اظہار کی نمایاں اپ گریجشن کی اطلاع دیتے ہیں۔گردے،پوڈوسیٹ نقصان کی ایٹولوجی سے آزاد۔ مزید برآں، ہم پوڈوسیٹ ڈیمیج گروپس کے پوڈوسائٹس کے ذریعہ CD73 اور CCR2 اظہار کے درمیان الٹا تعلق کی اطلاع دیتے ہیں۔ بڑھا ہوا پوڈوسائٹ مخصوص CCR2 ذیابیطس میں ثالثی کے لیے دکھایا گیا ہے۔گردوں کی چوٹچوہوں میں [23]۔ اس کے علاوہ، ایف ایس جی ایس کے ایڈریامائسن کی حوصلہ افزائی شدہ مورین ماڈل میں سی سی آر 2 کی ناکہ بندی پروٹینوریا اور گلوومیرولر چوٹ کو کم کرنے کی اطلاع دی گئی ہے [24]۔ Lee et al. کی طرف سے ایک حالیہ مطالعہ — جو ایک ماؤس ماڈل کا بھی استعمال کرتا ہے — اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ CCR2 کی کمی آکسیڈیٹیو تناؤ اور لپڈ جمع کی ناکہ بندی کے ذریعے موٹاپے کی وجہ سے البومینوریا کو بہتر بنا سکتی ہے [25]۔ درحقیقت، ایک ان وٹرو سسٹم میں جس میں مرین پیریکارڈیل ٹشو سے mesenchymal اسٹیم سیلز (MSC) کو استعمال کیا جاتا ہے، یہ دکھایا گیا ہے کہ CD73-زیادہ سے زیادہ کارکردگی کا مظاہرہ کرنے والے MSCs انسداد سوزش کی سرگرمی کے ذریعے اصلاحی عمل کا حکم دیتے ہیں، دوسرے عوامل کے علاوہ CCR کی روک تھام کی وجہ سے بھی۔ {9}مثبت میکروفیج دراندازی [ 13 ]۔ لہذا، ہمارے نتائج اور شائع شدہ اعداد و شمار کی روشنی میں، یہ فرض کرنا پرکشش ہے کہ پوڈوکیٹس کے ذریعہ CD73 اظہار حفاظتی کام کر سکتا ہے۔گردے کی چوٹ، ممکنہ طور پر راستوں کے ذریعے جو CCR2 کو کم کرتے ہیں۔ CCR2 سگنلنگ کا میکروفیج آسنجن اور ایکٹیویشن سے گہرا تعلق ہے [ 26 , 27 ]۔ جیسا کہ میکروفیجز پوڈوسیٹوپیتھی سے وابستہ روگجنن کو متاثر کرسکتے ہیں۔گردے کی بیماریوں(پرائمری ایم جی این کی طرح، جہاں CD68 پلس، CCR2 پلس میکروفیجز کی دراندازی کو اختتامی مرحلے کے ایک اہم اشارے کے طور پر تسلیم کیا گیا ہے۔گردے خراب[ 28 ])، monocyte/macrophage مواد، اصل (دراندازی بمقابلہ رہائشی)، ایکٹیویشن پروفائلز (M1—proinflammatory بمقابلہ M2—متبادل طور پر چالو) اور CD73 اظہار کے درمیان تعلق کے مزید مطالعےگردے کی بیماریمورین ماڈلز کے پچھلے ڈیٹا کے ساتھ ہمارے نتائج کے مطابق جانچنا ضروری ہے۔
سوزش والے مائیکرومیلیو میں جو ہائپوکسیا میں دیکھا جا سکتا ہے، اسکیمیا-ریپرفیوژن یا آٹو امیون ٹشوز کو نقصان پہنچانے سے متعدد خلیات پیورینرجک سگنلنگ سسٹم کے ارکان کو خارج کرتے ہیں، بنیادی طور پر پرو انفلامیٹری ATP یا ADP کی شکل میں [29, 30]۔ ان ترتیبات میں، ایکٹو نیوکلیوٹائڈیس سی ڈی 73 اور پروڈکٹاڈینوسین اہم عوامل میں مدافعتی ردعمل کے ضابطے اور خاموشی جانوروں کے ماڈلز میں، CD73 کو حفاظتی طور پر دکھایا گیا ہے۔گردہاسکیمیا ریپرفیوژن کی چوٹ اور اس کی کمی کی وجہ سے پوڈوسیٹ کی خرابی پیدا ہوتی ہے، جس سے خود کار قوت مدافعت کی سوزش ہوتی ہے اورگردے کی بیماری[21، 31]۔ ویوو تجربات میں دوسرے ماؤس نے اسکیمیا ریپرفیوژن-انجری کا استعمال کرتے ہوئے CD73 کے اہم انسداد سوزش اثر کا انکشاف کیا جس کا اظہار قربت والے نلی نما اپکلا خلیات اور اس میں اس کے اہم عمل سے ہوتا ہے۔گردہذیابیطس نیفروپیتھی کے دوران ایڈینوسین – اینڈوتھیلیل ایڈورا 2 بی ریسیپٹر سگنلنگ کے ذریعے تحفظ [20,32]۔ پوڈو سائیٹوپیتھیس گلومیرولر گھاووں کا سب سے زیادہ کثرت سے گروپ ہیں جو پروٹین یوریا کا باعث بنتے ہیں۔ MCD، ایک پروٹو ٹائپ 'پرائمری' پوڈو سائیٹوپیتھی، 1 سال سے زیادہ عمر کے بچوں میں نیفروٹک پروٹینوریا کی سب سے عام وجہ ہے [33, 34]۔ ایم سی ڈی کے روگجنن کے بارے میں موجودہ مفروضے پوڈوسیٹ-گلومیرولر بیسمنٹ جھلی کی سالمیت میں خلل میں سائٹوکائنز اور دیگر مدافعتی ثالثوں کے اہم کردار کی تجویز کرتے ہیں [35 – 38]۔ ہلکی مائکروسکوپی میں نظر آنے والی تبدیلیوں کی عدم موجودگی اور شدید پروٹینوریا کے درمیان فرق MCD کی پہچان ہے۔ الیکٹران مائیکروسکوپی کے ذریعہ پوڈوسیٹ کو پہنچنے والے نقصان کے الٹراسٹرکچرل ثبوت اس طرح آج تک MCD کی تشخیص کے لیے ایک شرط ہے۔ یہ تشخیصی الگورتھم اس سلسلے میں مزید فرسٹ لائن تشخیصی ٹولز کی اہمیت پر زور دیتا ہے۔ CD73 اظہار کی جانچ، خاص طور پر الیکٹران مائیکروسکوپی کی محدود دستیابی کی ترتیب میں، اس طرح گلومیرولر (یعنی، پوڈو سائیٹوپیتھک) اور ایکسٹرا گلومیرولر (مثلاً، نلی نما یا پیراپروٹینیمک) پروٹینوریا کے ذرائع کے درمیان فرق کرنے میں مدد مل سکتی ہے۔ ہمارے مطالعے میں امیونو ہسٹو کیمسٹری اور امیونو فلوروسینس کے درمیان موازنہ مؤخر الذکر کے حق میں بات کرے گا۔
CISTANCHE گردے/ گردوں کی بیماری کو بہتر کرے گا۔
متعدد اشاعتوں نے قائل طور پر متنوع تقسیم اور پوڈوسیٹ مخصوص پروٹینوں کے نقصان کی دستاویز کی ہے۔گردے کی بیماریوہ ترتیبات جن میں پوڈوسیٹ انجری اور پروٹینوریا شامل ہیں، جیسا کہ حال ہی میں جائزہ لیا گیا ہے [39]۔ ہمارے مطالعے میں، پوڈوسیٹ کو پہنچنے والے نقصان کے گروپ کے اندر، ہم پوڈوسن/نیفرین فلوروسینس کی شدت اور CD73 اظہار کی شدت کے درمیان ایک اہم ارتباط کا پتہ نہیں لگا سکے۔ تاہم، مخصوص حدود پوڈوسن/نیفرین بمقابلہ CD73 شماریاتی ڈیٹا کی پیتھوفزیولوجیکل تشریح کو روکتی ہیں۔ سب سے پہلے، فلوروسینس کی شدت کی تشخیص کے لیے ہم نے کنفوکل مائکروسکوپی کی تکنیکی میگنیفیکیشن اور ریزولوشن کی صلاحیتوں کا استعمال کرتے ہوئے پوڈوسائٹس کا انتخاب کیا۔ اگرچہ یہ حالات آسانی سے پوڈوسائٹ جسموں کا پتہ لگانے کے قابل بناتے ہیں، بڑے عمل اور خاص طور پر پاؤں کے عمل غیر واضح رہتے ہیں، اس لیے ممکنہ طور پر نشان زد/تجزیہ نہیں کیا جاتا۔ دوسرا، پورے گلوومیرولی میں CD73 اور پوڈوکیٹ مخصوص پروٹین کے اظہار کے درمیان ارتباط کو جائز قرار نہیں دیا جا سکتا: اگرچہ اس سطح پر پوڈوسن اور نیفرین کا اندازہ جائز ہوگا (جیسا کہ یہ سمجھنا مناسب ہے کہ کوئی دوسرا گلومیرولر سیل ان پروٹینوں کا اظہار نہیں کرتا) ایسا نہیں ہو سکتا۔ CD73 کے لئے دعوی کیا گیا ہے جس کا جزوی طور پر کم از کم اینڈوتھیلیل خلیوں کے ذریعہ اظہار کیا جاتا ہے۔ تیسرا، پوڈوکیٹ انجری کے آزاد مارکر کے طور پر صرف اوسط فلوروسینس کی شدت کا اندازہ قابل اعتراض ہے، کیونکہ یہ گلوومیرولس کے اندر پوڈوسن اور نیفرین کے پیتھولوجیکل، دانے دار تقسیم کے پیٹرن کا احاطہ نہیں کرتا، جس کا ہم شکل 6 میں واضح طور پر مشاہدہ کر سکتے ہیں۔ لہذا، ہم ہچکچاتے ہیں۔ ہمارے تجزیے میں CD73-پوڈوسن اور CD73-نیفرین کے باہمی تعلق کی عدم موجودگی کو ان مارکروں کے مختلف مالیکیولر راستوں سے منسوب کرنا۔ ان سگنلنگ جھرنوں کے درمیان حتمی مداخلت کو دریافت کرنے کے لیے وٹرو اور جانوروں کے مطالعے میں مزید پوڈوسیٹ ضروری ہیں۔
ایک ساتھ مل کر، چھوٹے نمونے کے سائز کو اپنے مطالعے کی بنیادی حد کے طور پر تسلیم کرتے ہوئے، ہم یہاں زخمی پوڈو سائیٹس کے ذریعہ CD73 کے اوور ایکسپریشن کا مظاہرہ کرتے ہیں اور CD73 کو پوڈو سائیٹوپیتھی کے ایک نئے تشخیصی مارکر کے طور پر تجویز کرتے ہیں۔ کم سے کم تبدیلی کی بیماری میں، ہمارے نتائج خراب پوڈوسائٹس کی شناخت کرنے میں مدد کر سکتے ہیں اور اس کے نتیجے میں کم وقت اور لاگت لینے والا تشخیصی عمل ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، ہمارے نتائج مورین تجرباتی نقطہ نظر سے شائع شدہ ڈیٹا کے مطابق ہیں اور انسانوں میں CD73 اور CCR2 کے درمیان حفاظتی تعامل کا مشورہ دیتے ہیں۔گردے کی بیماری. انسانوں میں CD73 سگنلنگ کے طریقہ کار کو حل کرنے کے لیے مریضوں کے بڑے گروہوں کے ساتھ مزید ملٹی سینٹر اسٹڈیز ضروری ہیں۔گردہبیماری اور اس کی تشخیصی قدر۔ اسی طرح، بیماری کی شدت اور CD73 اظہار کے درمیان ممکنہ ارتباط قائم کرنے کے لیے بڑی تعداد کی ضرورت ہوگی۔
مواد اور طریقے
کوہورٹ کا مطالعہ کریں۔1 جنوری 2018 سے 31 دسمبر 2019 کے درمیان یونیورسٹی آف ہیڈلبرگ کے یونیورسٹی ہاسپٹل مینہیم میں 49 مختلف مریضوں کی اس تحقیق میں شامل کل 49 بایپسیوں کی تشخیص ہوئی۔ مزید انتخاب کا معیار ایک نمائندہ بایپسی تھا جس میں امیونو ہسٹو کیمسٹری اور EM کے ساتھ ٹرپل تشخیص کرنے کا امکان، مناسب طبی معلومات، واضح تشخیص اور اس مطالعہ کے لیے کافی مواد تھا۔ تمام مریض بالغ اور کاکیشین تھے۔ تحقیقات نے مختلف ایٹولوجیز کے پوڈوسیٹ چوٹ والے مریضوں کی 39 بایپسی منسلک کیں (پرائمری فوکل سیگمنٹل گلوومیرولوسکلروسیس کے مریضوں سے 7 بایپسی-FSGS؛ 8 کم سے کم تبدیلی کی بیماری سے-MCD؛ 12 جھلیوں والے گلوومیرولونفرائٹس کے مریضوں سے؛ MGN کے مریضوں سے؛ 12 amoidosis کے ساتھ)۔ منفی کنٹرول تھے۔گردہ10 مریضوں کی بایپسی بغیر پوڈوسیٹ گھاو کے اور پروٹینوریا کے بغیر (ہلکے نیفروسکلروسیس کے 6 مریض، بیچوالا ورم گردہ کے 2 مریض اور پیتھولوجیکل تبدیلیوں کے بغیر 2 مریض)۔ مذکورہ بالا تمام بایپسی پوڈوسیٹ CD73 اظہار کے تجزیہ میں شامل کی گئی تھیں۔ سی سی آر 2 کے لیے، غیر سکلیروٹک گلوومیرولی کی ناکافی تعداد کے ساتھ پیرافین سیکشنز کے اخراج کے بعد (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
ہسٹولوجی، امیونو ہسٹو کیمسٹری، امیونو فلوروسینس اور الیکٹران مائکروسکوپی1 µm سیریل سیکشن پیرافن ایمبیڈڈ پر کیے گئے تھے۔گردہبایپسی اور ہیماتوکسیلین/ایوسین (H/E)، پیریڈک ایسڈ-شِف (PAS)، میسن کے ٹرائیکروم سٹیننگ کے ساتھ ساتھ تشخیصی مقاصد کے لیے معیاری روٹین امیونو ہسٹو کیمسٹری کے ساتھ داغدار۔ امیونو ہسٹو- کیمیکل اور امیونو فلوروسینٹ سٹیننگ آف فارملین فکسڈ پیرافین ایمبیڈڈ بایپسیوں کے لیے دستی طور پر خرگوش اینٹی ہیومن CD73 مونوکلونل اینٹی باڈی (کلون D7F9A، سیل سگنلنگ، فرینکفرٹ ایم مین، جرمنی) اور ماؤس مونوکلونل اینٹی ہیومن (CCR2 اینٹی ہیومن) ابکم، کیمبرج، یوکے)، خرگوش پولی کلونل اینٹی ہیومن اینٹی باڈی ٹو نیفرین (ابکم، کیمبرج، یوکے) اور خرگوش اینٹی ہیومن پوڈوسن اینٹی باڈی (سگما، سینٹ لوئس، ایم او، یو ایس اے)، کارخانہ دار کے پروٹوکول کے مطابق۔ امیونو ہسٹو کیمسٹری کے ذریعہ پوڈوسیٹ CD73 اظہار کے تجزیے میں تمام بایپسی شامل تھیں۔ سی سی آر 2 کے لیے، غیر سکلیروٹک گلوومیرولی کی ناکافی تعداد کے ساتھ پیرافین سیکشن (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
CISTANCHE گردے/ گردوں کے کام کو بہتر بنائے گا۔
ہلکی مائکروسکوپی اور مورفومیٹرک تجزیہتصویر کا حصول اور تجزیہ PreciPoint سکیننگ مائکروسکوپ M8 کے ساتھ Olympus PlanCN 40 × /0.65 مقصد اور MicroPoint سافٹ ویئر (v.5 مئی 2016؛ PreciPoint, Freising) کے ساتھ کیا گیا تھا۔ ، جرمنی)۔ امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ میں پوڈوسیٹ CD73 سطح کے اظہار کی نیم مقداری تشخیص کا اندازہ 0-3 اسکورنگ اسکیل (0-کوئی اظہار نہیں؛ 1-فوکل سیگمنٹل مثبتیت) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">میں 50 فیصد پوڈوکیٹس مثبت ہیں۔<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50 فیصد گلومیرولی)۔ CD73 مثبت اور منفی پوڈوسائٹس کا تجزیہ CCR2 شریک اظہار کے لیے شدت پر مبنی نیم مقداری اسکورنگ سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا (0—کوئی اظہار نہیں، 1—کمزور اظہار، 2—اعتدال پسند اظہار اور 3—مضبوط اظہار، بایپسی-اندرونی CCR2 مثبت کنٹرول کے مطابق— اینڈوتھیلیم اور دراندازی مدافعتی خلیات)۔ تشخیص آزادانہ طور پر دو پیتھالوجسٹ (SP اور ZP) نے اندھے طریقے سے کیا تھا۔
کنفوکل مائیکروسکوپیCD73 (Alexa Fluor 488)، CCR2 (Alexa Fluor 594) اور Podocytes کے نیوکلیائی (DAPI) کی تصاویر ترتیب وار Olympus FV1000 موٹرائزڈ کنفوکل مائکروسکوپ کے ساتھ حاصل کی گئی تھیں جو HeNem 594 سے لیس تھیں۔ Argon 488 nm اور ایک UV diode 405 nmlaser اور photomultiplier tubes (PMTs) 60 × /1.35 UPlanSApo مقصد کا استعمال کرتے ہوئے، FluoView سافٹ ویئر کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے۔ 512 × 512 پکسل فریم کے ساتھ بٹ امیجز اور جائزہ کے لیے 0.41 µm پکسل سائز اور ہائی ریزولوشن کے لیے 0.10 µm مائکروسکوپ پر تمام ترتیبات کو مستقل رکھ کر حاصل کی گئیں۔ تصاویر کو مزید نیم خود کار طریقے سے پروسیس کیا گیا اور اندرون ملک تیار کردہ امیج جے میکرو کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا (تاریخ رسائی: 15 دسمبر 2020)۔ جلد ہی، تصاویر کو انفرادی پوڈوسائٹس کے لیے تقسیم کیا گیا، حد کا اطلاق کیا گیا، اور مطلب کی شدت کی پیمائش، شماریاتی تجزیہ اور منصوبہ بندی کی گئی۔ تمام امیجز کو مستقل سیٹنگز کے ساتھ پروسیس کیا گیا تھا اور ضم شدہ امیجز پر انفرادی چینلز کے لیے یکساں طور پر یکساں طور پر ایڈجسٹ شدہ سیوڈو کلر کے ساتھ ڈسپلے کیا گیا تھا۔
شماریاتی تجزیہGraphPadPrismv کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی تجزیہ کیا گیا۔ 8.4.3سافٹ ویئر(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)۔ تمام ڈیٹا کو اوسط ± SEM کے طور پر رپورٹ کیا گیا ہے۔ اعداد و شمار کے فرق کا حساب جوڑا یا غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ کے ساتھ ساتھ پیئرسن ارتباطی تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا، جیسا کہ اشارہ کیا گیا ہے۔
