باب 2: گردوں کے نلی نما پیروکسومس گردے کے عام کام کے لیے قابل استعمال ہیں۔

مزید معلومات کے لیے۔ رابطہtina.xiang@wecistanche.com

بحث

زیڈ ایس ڈی والے مریضوں میں گردے کی اسامانیتاوں کی موجودگی کے ساتھ قریبی نلی میں پیروکسیزومز کی ایک اعلی کثرت نے سختی سے تجویز کیا ہے کہ پیروکسومس کے اہم کردارگردہ. مزید برآں، کئی پیروکسیسومل انزائمز کے گردے سے متعلق مخصوص اظہار نے اس خیال کی تائید کی ہے کہ گردوں کے پیروکسومس میں حیاتیاتی افعال جزوی طور پر دوسرے ٹشوز (15) سے مختلف ہوتے ہیں۔ ان مفروضوں کو جانچنے کے لیے، ہم نے جانچ کی۔گردوں کی تقریبچوہوں میں خاص طور پر پیروکسیزومز سے عاریگردوں کی نالی. پیروکسومس کے کردار کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیے گئے مختلف ماؤس ماڈلز میں سے، ہم نے چوہوں کا انتخاب کیا جو پیروکسوم کی تشکیل کے لیے ضروری PEX5 انکوڈنگ پیروکسوم بائیوجنسیس فیکٹر PEX5 کے مشروط جینیاتی غیر فعال ہونے کی اجازت دیتا ہے۔ اس ماڈل کا انتخاب اس لیے کیا گیا تھا کہ (i)Pex5-null چوہے ایک سے زیادہ بائیو کیمیکل اور فنکشنل اسامانیتاوں کی نمائش کرتے ہیں جو ZSD (11) اور (i) Pex5 کے ٹشو مخصوص خاتمے کے ساتھ ماؤس ماڈلز کا ایک بڑا سپیکٹرم کے مریضوں میں مشاہدہ کیا جاتا ہے۔ کا تجزیہ کیا گیا ہے (16)، اس طرح ہمیں گردوں کی نالی میں پیروکسیسومل کی کمی کے فنکشنل نتائج کا موازنہ دوسرے ٹشوز میں مشاہدہ کرنے والوں کے ساتھ کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ جیسا کہ Baes et al. کے ذریعہ ظاہر کیا گیا ہے، Pex5-null چوہوں نے انٹرا یوٹرن نمو میں رکاوٹ، دماغ کی خرابی، اور شدید ہائپوٹونیا کا مظاہرہ کیا اور زندگی کے پہلے 72 گھنٹوں کے اندر مر گئے (11)۔ بائیو کیمیکل تجزیوں سے ZSD کے کئی نشانات سامنے آئے، جن میں جگر اور دماغ میں پلازمالوجینز کی کمی اور VLCFA کے پلازما کی سطح میں زبردست اضافہ شامل ہے۔ P0.5 پر Pex{{10}}null چوہوں کے گردے میں کوئی cortical renal cysts نہیں پایا گیا، لیکن glomeruli کے intrauterine maturation میں رکاوٹ دیکھی گئی۔ کیلشیم آکسیلیٹ کے ذخائر کی موجودگی کی تحقیقات نہیں کی گئیں۔

cistanche جڑی بوٹی کے فوائد جاننے کے لیے یہاں کلک کریں۔

cKOm چوہوں میں، گردوں کی نالی میں پیروکسیسومل بائیوجنسیس کا خاتمہ کسی بھی بڑے فینو قسم کا سبب نہیں بنا، سوائے شیرخوار cKOm چوہوں میں KW اور BW میں کمی اور بالغ cKOm چوہوں میں KW/BW تناسب میں کمی کے۔ cKOf چوہوں میں، رینل ٹرانسکرپٹوم اور میٹابولوم پر Pex5 ڈیلیٹ ہونے کے بہت ہلکے اثر کے ساتھ ساتھ floxed Pex5 ایلیل کے نامکمل اخراج نے تجویز کیا کہ کچھ بقایا پیروکسومس رینل ٹیوبول میں رہ سکتے ہیں۔ البتہ،جنسگردے میں پیروکسیسومل افعال کی مخصوصیت کو بھی مسترد نہیں کیا جا سکتا۔ ہمیں cKOm چوہوں کے گردوں میں کوئی خاص مورفولوجیکل فرق نہیں ملا جو کم KW یا KW/BW تناسب کی وضاحت کر سکے۔ تاہم، قریبی سیل کی چوڑائی میں کمی کا رجحان اس فرق کی ممکنہ وجہ ہو سکتا ہے۔ اہم بات یہ ہے کہ رینل ہومیوسٹیٹک فنکشن cKOm چوہوں میں آئنوں، پانی، امینو ایسڈز، نامیاتی anions اور کیشنز، فاسفیٹ، urate، اور megalin ثالثی کثیر الثانی میں ٹرانسپیٹیلیئل ٹرانسپورٹ میں شامل ٹرانسکرپٹس انکوڈنگ پروٹینز کے اظہار کی سطح میں نمایاں تبدیلیوں کے باوجود برقرار رکھا گیا۔ Gand endocytic راستہ. قابل ذکر بات یہ ہے کہ ڈاون ریگولیٹڈ ٹرانسکرپٹس کی اکثریت انکوڈڈ ٹرانسپورٹرز کا اظہار قربت والے ٹیوبول میں کرتی ہے جبکہ زیادہ تر اپریگولیٹڈ ٹرانسکرپٹس انکوڈڈ ٹرانسپورٹرز کا اظہار نیفران کے زیادہ دور دراز حصوں میں ہوتا ہے۔ مثال کے طور پر، Nkcc2، Clc-Kb، Ncc، اور ENaC ٹرانسکرپٹس کے بڑھتے ہوئے اظہار نے بعد از قربت سوڈیم ری ایبسورپشن میں معاوضہ اپ گریجشن کا مشورہ دیا۔ رینل ٹرانسکرپٹوم اور میٹابولوم کے مربوط تجزیے سے سیلولر میٹابولزم، لپڈ میمبرین کمپوزیشن، اور ریڈوکس ہومیوسٹاسس سے متعلق متعدد سیلولر راستوں میں گہری تبدیلیوں کا انکشاف ہوا۔ cKOm چوہوں کے گردوں میں، تقریباً 8 فیصد ٹرانسکرپٹوم اور تقریباً 24 فیصد دریافت شدہ میٹابولائٹس Ctrl چوہوں کے مقابلے میں مختلف سطحوں کی نمائش کرتے ہیں۔ جیسا کہ توقع کی گئی ہے، ان میں سے بہت سے ٹرانسکرپٹس اور میٹابولائٹس پیروکسیسومل فنکشن سے متعلق تھے۔ ایتھر فاسفولیپڈ پلازمالوجینز کی کثرت میں ڈرامائی کمی دیکھی گئی جو پیروکسیسومز میں ترکیب کی جاتی ہیں (cKOm چوہوں میں ~ 67 فیصد اور cKOf چوہوں میں ~ 50 فیصد، تمام پتہ لگانے والے پلازمالوجن پرجاتیوں کی غیر وزنی رقم)۔ Plasmalogens اہم سیل میمبرین فاسفولیپڈز ہیں جن میں منسوب افعال کی بڑھتی ہوئی تعداد ہے، بشمول جھلی کی سالمیت، سیلولر سگنلنگ، اور اینٹی آکسیڈینٹ دفاع۔ گردے میں، پلازمالوجن کل فاسفولیپڈز (17) کے تقریباً 20 فیصد کی نمائندگی کرتے ہیں، اس طرح یہ تجویز کرتے ہیں کہ فاسفولیپڈ مرکب کا کم از کم 10 فیصد cKOm اور cKOf چوہوں کے گردوں میں متعلقہ کنٹرول سے مختلف ہے۔ پلازمالوجینز کی کمی کو ممکنہ طور پر ساختی طور پر ملتے جلتے فاسفیٹائیڈیلتھانولامینز (PEs) کی کثرت اور فاسفیٹائیڈیلچولینز (PCs) کے ذریعے معاوضہ دیا گیا، جس نے cKOm اور cKOf دونوں چوہوں کے گردوں میں کافی افزودگی کا مظاہرہ کیا۔ قابل ذکر بات یہ ہے کہ ZSD (17) والے مریضوں کے گردوں میں PEs اور PCs میں اسی طرح کا معاوضہ اضافہ دیکھا گیا۔

قربت والی نلی کا میٹابولزم بنیادی طور پر فیٹی ایسڈ آکسیڈیشن پر انحصار کرتا ہے، جس کی خصوصیت ROS کی ایک اعلی نسل سے ہوتی ہے جو مائٹوکونڈریا اور پیروکسیزومز دونوں میں پیدا ہوتی ہے۔ cKO چوہوں میں، فیٹی ایسڈز کے انحطاط/بائیو سنتھیسس سے متعلق راستے کافی حد تک اپ گریڈ کیے گئے تھے، جو ممکنہ طور پر ان ذیلی جگہوں سے مائٹوکونڈریل توانائی کی پیداوار میں معاوضہ بڑھانے کا مشورہ دیتے ہیں۔ چونکہ پیروکسیسم کے اہم کاموں میں سے ایک آر او ایس کا سم ربائی ہے، اس لیے ہم نے قیاس کیا کہ پیروکسوم بائیوجنسیس کا خاتمہ اس کی حوصلہ افزائی کرے گا۔اوکسیڈیٹیو تناؤcKO چوہوں کے گردوں میں۔ تاہم، سالماتی تجزیوں نے اینٹی آکسیڈینٹ کی صلاحیت اور آکسیڈیٹیو تناؤ کے بائیو مارکر میں تبدیلیوں کو ظاہر نہیں کیا۔ HFD کے ساتھ چیلنج نے فنکشنل فینوٹائپ میں ردوبدل پیدا نہیں کیا، سوائے پیشاب کے حجم میں ہلکے سے اضافے اور cKOm چوہوں میں کیلشیم اور یوریٹ کے پیشاب کے اخراج کے۔ انٹیگریٹڈ ٹرانسکرپٹوم اور میٹابولوم تجزیہ نے گلوٹاتھیون پاتھ وے کی شناخت کو ایک ممکنہ معاوضہ کے طریقہ کار کے طور پر گردوں کے قربت والے ٹیوبول خلیوں میں مجموعی طور پر اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت کو برقرار رکھنے کی اجازت دی جس میں پیروکسومس کی کمی ہے۔

جنین کے جگر (12)، لبلبے کے خلیات (18) میں، اور مرکزی اعصابی نظام کے مختلف خلیوں کی اقسام میں (ریفریٹ 16 میں جائزہ لیا گیا) میں Pex5 کا مشروط طور پر حذف ہونا متغیر لیکن زیادہ تر سنگین اعضاء کے مخصوص فنکشنل بگاڑ کا سبب بنتا ہے۔ گردے میں ایسا نہیں تھا۔ اس مطالعے میں، ہم نے گردوں کے کئی اندرونی میکانزم کی نشاندہی کی جو ممکنہ طور پر پیروکسیسم کی کمی سے نمٹنے کی اجازت دیتے ہیں۔ چونکہ گردہ ایک ایسا عضو ہے جو خون کے اخراج کی بلند شرح کو ظاہر کرتا ہے، اس لیے ایک اور امکان میٹابولائٹس کے کم از کم ایک حصے کی ماورائی ماخذ میں مضمر ہے جسے گردہ پیروکسیسم کی عدم موجودگی میں پیدا نہیں کرتا ہے لیکن یہ گردوں کے معمول کے کام کے لیے ضروری ہے۔ اجتماعی طور پر، ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ رینل ٹیوبلر پیروکسومس رینل فنکشن کے لیے قابل استعمال ہیں اور زیڈ ایس ڈی والے مریضوں کے گردوں میں پیتھو فزیوولوجیکل تبدیلیاں غیر معمولی ہیں۔

طریقے

جانور. Pex5a/la/Pax8-ntTA/LC-1 Cre چوہوں کو بنانے کے لیے استعمال ہونے والے طریقہ کار کو پہلے بیان کیا گیا تھا (13)۔ اس مطالعے میں استعمال ہونے والی 3 ماؤس لائنیں نسلی تناؤ ہیں، جو C57BL/6J ماؤس (دی جیکسن لیبارٹری) کے جینیاتی پس منظر پر پیدا کی گئی ہیں۔ تمام تجربات سے پہلے، چوہوں کو ایک 12-گھنٹہ روشنی/12-گھنٹہ تاریک دور میں ڈھال لیا گیا تھا۔ تمام تجربات سرکیڈین وقت ZT3 پر کیے گئے تھے (ZT0وہ وقت ہوتا ہے جب لائٹ آن ہوتی ہے، اور ZT12 وہ وقت ہوتا ہے جب لائٹ بند ہوتی ہے)۔

Pex5bxlo/Pax{8-rtTA/LC1 ٹرپل ٹرانسجینک نر یا مادہ چوہے (جسے cKOm اور cKOf کہا جاتا ہے) اور Pex5l/a چوہوں (جسے Ctrl یا Ctrl کہا جاتا ہے) استعمال کیے گئے۔ نوزائیدہ بچوں میں Pex5 کا دوبارہ ملاپ ان کے حمل کے 14ویں دن سے شروع کرتے ہوئے 2 ہفتوں تک حاملہ چوہوں کے پینے کے پانی میں 0.2 فیصد DOX اور 2 فیصد سوکروز کے اضافے سے انجام دیا گیا۔ بالغ چوہوں میں Pex5 دوبارہ ملاپ کے لیے، DOX اور sucrose کو 8- ہفتے پرانے چوہوں کے پینے کے پانی میں شامل کیا گیا۔ گردوں کی ساخت اور فنکشن کا جائزہ DOX علاج کے اختتام کے 4 ہفتے بعد4-ہفتہ پرانے شیرخوار چوہوں یا 14-ہفتہ پرانے بالغ چوہوں میں کیا گیا۔ 3 ہفتوں میں ان کے دودھ چھڑانے کے بعد، چوہوں کو معیاری کنٹرول ڈائیٹ کھلائی گئی جس میں 4.2 فیصد چکنائی (سنیف کم چکنائی والی خوراک) یا جب ذکر کیا جائے تو 4 ہفتوں تک مماثل HFD کے ساتھ 20.7 فیصد چکنائی (زیادہ تر LCFAs) پر مشتمل ہے۔

میٹابولک کیجز اور خون اور پیشاب کی کیمسٹری۔ چوہوں کو انفرادی میٹابولک پنجروں (ٹیکنیپلاسٹ) میں رکھا گیا تھا۔ پیشاب جمع کرنا 3- دن کے موافقت کی مدت کے بعد انجام دیا گیا تھا۔ پیشاب اور خون کی کیمسٹری کا تجزیہ کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (19)۔ پلازما اور پیشاب کی ساخت کی پیمائش Laboratoire Central de Chimie Clinique، Center Hospitalier Universitaire Vaudoise University Hospital (Lausanne, Switzerland) میں کی گئی۔

الیکٹران مائکروسکوپی. گردے کے نمونوں کو تقریباً 1 ملی میٹر کے ٹکڑوں میں کاٹا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت (RT) پر 2 گھنٹے کے لیے گلوٹرالڈہائیڈ سلوشن (EMS) 2.5 فیصد فاسفیٹ بفر (PB,0.1 M pH7.4) (MilliporSigma) میں طے کیا گیا۔ پھر، انہیں PB بفر میں 3 بار، 5 منٹ ہر ایک میں دھویا گیا اور پھر RT پر 2 گھنٹے کے لیے PB میں osmium tetroxide 1 فیصد (EMS) کے 1.5 فیصد پوٹاشیم فیروکیانائیڈ (MilliporSigma) کے ساتھ تازہ مرکب کے ذریعے پوسٹ فکس کیا گیا۔ اس کے بعد نمونوں کو آست پانی میں 3 بار دھویا گیا اور درجہ بندی کے ارتکاز (30 فیصد 90 منٹ؛ 70 فیصد 90 منٹ؛ 100 فیصد 120 منٹ؛ 100 فیصد 240 منٹ) میں ایسٹون محلول (ملی پور سگما) میں پانی کی کمی کی گئی۔ اس کے بعد ایپون رال (ملی پور سگما) میں درجہ بندی کی تعداد میں دراندازی ہوئی (ایپون/ایسیٹون [1/3؛ v/v] 4 گھنٹے؛ ایپون/ایسیٹون [3/1؛ v/v] 4 گھنٹے، ایپون/ایسیٹون [1] /1;v/v] 8 گھنٹے؛ ایپون/ایسیٹون [1/1؛ v/v] 24 گھنٹے) اور آخر میں ایک تندور میں 60 ڈگری پر 48 گھنٹے تک پولیمرائزیشن۔ 50 nm کے الٹراتھن حصوں کو Leica Ultracut (Leica Mikrosystem GmbH) پر کاٹا گیا اور ایک تانبے کے سلاٹ گرڈ، 2×1 mm (EMS) پر اٹھایا گیا، جسے پولی اسٹیرین فلم (MilliporSigma) کے ساتھ لیپت کیا گیا۔ حصوں کو 10 منٹ کے لیے H, O میں 2 فیصد uranyl acetate (MilliporSigma) سے داغ دیا گیا، کئی بار H, O کے ساتھ 10 منٹ تک رینالڈس لیڈ سائٹریٹ کے ساتھ دھویا گیا، اور H, O سے کئی بار دھویا گیا۔

سٹیریالوجی. سٹیریولوجی تجزیہ کے لیے، فی ماؤس کے 3 گردے کارٹیکس کے ٹکڑوں کا تجزیہ کیا گیا، 4.08 این ایم کے پکسل سائز کے ساتھ 15 مائیکرو گراف فی نمونہ، ٹرانسمیشن الیکٹران مائیکروسکوپ (فلپس سی ایم 100، تھرمو فشر سائنٹیفک) کے ساتھ ایک منظم یکساں بے ترتیب نمونے کا استعمال کرتے ہوئے TVIPS TemCam-F416 ڈیجیٹل کیمرہ (TVIPS GmbH) کے ساتھ kV۔

ٹرانسکرپٹومک تجزیہ۔ تمام ترتیب دینے والا ڈیٹا NIH جین ایکسپریشن اومنیبس (الحاق نمبر GSE179202) کے ذریعے عوامی طور پر دستیاب ہے۔ RNA-Seq لائبریریوں کو گردے کے کل RNA کے 200 ng کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا جیسا کہ نیکولاوا ایٹ ال میں بیان کیا گیا ہے۔ (19)۔ Illumina TruSeq SR کلسٹر کٹ v4 ری ایجنٹس استعمال کیے گئے تھے۔ مس musculus کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دینے والے ڈیٹا پر کارروائی کی گئی۔ GRCm38۔{6}} جین تشریح، شماریاتی تجزیہ R (ورژن 3.4.0) میں کیا گیا تھا۔ کم شماروں والی نقلیں کم از کم 1 نمونے میں 1 کاؤنٹ فی ملین (CPM) کے اصول کے مطابق فلٹر کی گئیں۔ لائبریری کے سائز کو ٹی ایم ایم نارملائزیشن کا استعمال کرتے ہوئے چھوٹا کیا گیا تھا اور ووم (20) کا استعمال کرتے ہوئے لاگ ان کو سی پی ایم میں تبدیل کیا گیا تھا۔ پرنسپل اجزاء کے تجزیے نے نقل کے نمونوں کے درمیان ایک چھوٹا سا تغیر ظاہر کیا۔ سی کے او اور سی ٹی آر ایل چوہوں کے مابین تفریق کا اظہار لیمما (21) کا استعمال کرتے ہوئے 1 ایف ٹیسٹ میں کیا گیا تھا۔ P اقدار کو ایڈجسٹ کیا گیا جیسا کہ بیان کیا گیا ہے (22) FDR اقدار میں متعدد موازنہ پر غور کرنے کے لئے، مردوں اور عورتوں میں تمام ٹرانسکرپٹس کے نتائج یا منتخب ٹرانسپورٹرز کے نتائج یا صرف مردوں میں پیروکسیسومل متعلقہ ٹرانسکرپٹس کا استعمال کرتے ہوئے۔ FDR کے ساتھ ٹرانسکرپٹس<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">

میٹابولومک تجزیہ. منجمد گردے کے نمونوں سے میٹابولائٹس کی شناخت الٹرا ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی-ٹینڈم ماس سپیکٹروسکوپی کے ذریعے کی گئی اور AUC (Metabolon Inc) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئی۔ خام اقدار کو لاگ میں تبدیل کیا گیا تھا اور خام رقبہ کی گنتی کے لحاظ سے معمول بنایا گیا تھا۔ بائیو کیمیکلز کی شناخت کے لیے دو طرفہ انووا کنٹراسٹ ٹیسٹ استعمال کیے گئے جو دونوں جنسوں کے cKO اور Ctrl چوہوں کے درمیان نمایاں طور پر مختلف تھے۔ P اقدار کو ایڈجسٹ کیا گیا جیسا کہ بیان کیا گیا ہے (22) FDR اقدار میں متعدد موازنہوں پر غور کرنے کے لئے، اور FDR کے ساتھ میٹابولائٹس<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">

مشترکہ ٹرانسکرپٹوم میٹابولوم تجزیہ. جین ایکسپریشن اور میٹابولومکس اسٹڈیز سے حاصل کردہ نتائج کو یکجا کرنے والا ایک مربوط میٹابولک پاتھ وے تجزیہ MetaboAnalyst 5۔{1}} ویب سائٹ(24) پر مشترکہ پاتھ وے تجزیہ ماڈیول کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ میٹابولائٹس کا مرکب نام اور ٹرانسکرپٹس کی باضابطہ جین علامت نمایاں طور پر کم و بیش پرچر (FDR<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">

داغ. گردے کے عالمی ڈھانچے کے داغ، کیلشیم آکسالیٹ کے ذخائر، یا غیر جانبدار لپڈ ڈپازیشن ٹرانسورس کڈنی سلائسز پر کیے گئے تھے جو 5 μm موٹے تھے۔ غیر جانبدار لپڈ سٹیننگ کے علاوہ، چوہوں کو بے ہوشی کی گئی تھی، اور ان کے بائیں گردے کو پیٹ کی شہ رگ کے ذریعے ٹشو کی کٹائی سے پہلے 4 فیصد پیرافارمیلڈہائڈ محلول کے ساتھ پرفیوز کیا گیا تھا۔ گردے کے عالمی ڈھانچے کے تجزیہ کے لیے، پیرافین میں سرایت شدہ گردے کے ٹکڑوں کو ڈیپرافینائز کیا گیا، ری ہائیڈریٹ کیا گیا، H&E سے داغ دیا گیا، پانی کی کمی کی گئی اور ROTI Histokitt (Carl Roth GmbH) میں نصب کیا گیا۔ آئل ریڈ او سلوشن کا استعمال کرتے ہوئے OCT کمپاؤنڈ (ٹشو ٹیک) میں سرایت شدہ گردے کے ٹکڑوں میں غیر جانبدار لپڈ داغے ہوئے تھے۔ کیلشیم آکسالیٹ کے ذخائر پیزولاٹو (25) کے بیان کردہ طریقہ کے مطابق داغدار تھے۔ مختصراً، پیرافین میں سرایت شدہ گردے کے ٹکڑوں کو ڈیپرافینائز اور ری ہائیڈریٹ کیا گیا، پھر سلور نائٹریٹ 5 فیصد w/v اور ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ 30 فیصد کے 1:1 محلول میں ڈبو دیا گیا اور 30 ​​منٹ کے لیے 60 W کے لائٹ بلب کے نیچے رکھا گیا۔ سلائیڈوں کو آست پانی میں اچھی طرح دھویا جاتا تھا اور نیوکلیئر فاسٹ ریڈ (ملی پور سگما) سے اس کا مقابلہ کیا جاتا تھا، پھر اندر جانے سے پہلے پانی کی کمی ہوتی تھی۔روٹی ہسٹوکیٹ. کیلشیم آکسالیٹ نیفروپیتھی انڈسڈ ڈائیٹ (1.5 فیصد کیلشیم اور 1.5 فیصد ہائیڈروکسائپرولین معیاری چاؤ میں 3 ہفتوں تک ملا کر) کے ساتھ علاج کیے گئے ماؤس کے طول بلد گردے کے ٹکڑے کیلشیم آکسیلیٹ گردے کے ذخائر کے مثبت کنٹرول کے طور پر کام کرتے ہیں۔ Zeiss AxioScan.Z1 سلائیڈ سکینر کا استعمال کرتے ہوئے نتائج کا تجزیہ 100× یا 200× اصل میگنیفیکیشن پر کیا گیا۔

ELISA اور Trolox پرکھ۔{0}}HNE کو Abcam (ab238538) سے Lipid Peroxidation(4-HNE)Assay Kit کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ ابکم (ab65329) کی ٹرولوکس پرکھ کٹ کے ذریعہ کل اور غیر اینزیمیٹک اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیتوں کا اندازہ لگایا گیا۔

شماریات. تمام ڈیٹا کو اوسط ± SEM کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ اعداد و شمار کے ٹیسٹ اور اہمیت کی حد کو فگر لیجنڈز یا مناسب طریقوں کے سیکشن میں بیان کیا گیا ہے۔ شماریاتی تجزیہ R پیکجز یا گراف پیڈ پرزم سافٹ ویئر ورژن 8.2.1 کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ تمام ٹی ٹیسٹ 2 ٹیلڈ تھے۔

مطالعہ کی منظوری. جانوروں کے ساتھ تمام تجربات جانوروں کی دیکھ بھال کے لیے سوئس رہنما خطوط کے ذریعے کیے گئے، جو نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ جانوروں کی دیکھ بھال کے رہنما خطوط کے مطابق ہیں، اور سوئس کینٹونل (کینٹن ڈی واؤڈ) اور وفاقی ویٹرنری حکام (اجازت 31827 سے ڈی ایف) (ڈائریکشن جنرل) سے منظور شدہ de P'Agriculture, de la viticulture et des affairs vetérinaires, Epalinges, Switzerland)۔

پیشگی اشاعت: اس کام کا ایک حصہ امریکن سوسائٹی آف نیفروولوجی کے 2021 کے سالانہ اجلاس میں خلاصہ کے طور پر جمع کرایا گیا ہے (4 نومبر 2021۔https://www.asn-online.org/education/kidney-week/2021 /program-abstract.aspx?controlId=3605774)۔