pkزبان
گھر / علم / مواد

علم

Chimeric Human Papillomavirus-16 وائرس کی طرح کے ذرات جو HIV سے P18I10 اور T20 پیپٹائڈز پیش کرتے ہیں-1 لفافہ HPV16 اور HIV پیدا کرتے ہیں-1-BALB/c چوہوں میں مخصوص مزاحیہ اور T سیل میں ثالثی قوت مدافعت

Dec 07, 2023

خلاصہ:

اس مطالعہ میں، HIV-1 P18I10 CTL پیپٹائڈ جو HIV-1 gp120 کے V3 لوپ سے اخذ کیا گیا تھا اور HIV-1 gp41 کے T20 اینٹی فیوژن پیپٹائڈ کو HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین میں داخل کیا گیا تھا۔ chimeric HPV بنانے کے لیے: HIV (L1:P18I10 اور L1:T20) VLPs ممالیہ خلیوں کے اظہار کے نظام کا استعمال کرتے ہوئے۔ HPV: HIV VLPs کو کرومیٹوگرافی سے پاک کیا گیا تھا۔ ہم نے یہ ظاہر کیا کہ HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین کے DE لوپ میں P18I10 یا T20 پیپٹائڈس داخل کرنے سے وٹرو استحکام، خود اسمبلی، اور chimeric HPV: HIV VLPs کی شکل پر کوئی اثر نہیں پڑا۔ اہم بات یہ ہے کہ اس نے یا تو HIV-1 اینٹی باڈی ری ایکٹیویٹی کو ٹارگٹ کرنے والی ترتیب وار اور تعمیری P18I10 اور T20 پیپٹائڈس میں مداخلت نہیں کی جو chimeric HPV: HIV VLPs پر پیش کی گئی یا Vivo میں HPV16 L1- مخصوص اینٹی باڈیز کی شمولیت کے ساتھ۔ ہم نے مشاہدہ کیا کہ chimeric L1:P18I10/L1:T20 VLPs ویکسین HPV16- لیکن کمزور HIV-1-مخصوص اینٹی باڈی ردعمل اور ایلیٹڈ HPV16- اور HIV-1-مخصوص T- کو متاثر کر سکتی ہیں۔ BALB/c چوہوں میں سیل کے ردعمل۔ مزید یہ کہ، BCG.HIVA ویکسین کے ساتھ پرائمنگ کے بعد ہیٹرولوگس امیونائزیشن میں ایچ آئی وی کے مخصوص سیلولر ردعمل کو بڑھانے کے لیے ایک ممکنہ بوسٹر ہو سکتا ہے۔ یہ تحقیقی کام ناول chimeric HPV: HIV VLP پر مبنی ویکسین پلیٹ فارم HPV16 اور HIV-1 انفیکشن کو کنٹرول کرنے کے لیے، جس کی ترقی پذیر اور صنعتی ممالک میں فوری ضرورت ہے۔

Desert ginseng-Improve immunity (12)

مردوں کے لئے cistanche فوائد - مدافعتی نظام کو مضبوط

Cistanche Enhance Immunity مصنوعات دیکھنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

【مزید پوچھیں】 ای میل:cindy.xue@wecistanche.com / واٹس ایپ: 0086 18599088692 / وی چیٹ: 18599088692

مطلوبہ الفاظ:

ایچ آئی وی-1؛ HPV16; ویکسین وائرس جیسے ذرات؛ P18I10; T20 enfuvirtide؛ BCG.HIVA; مزاحیہ استثنیٰ؛ ٹی سیل ثالثی قوت مدافعت

1. تعارف

ہیومن امیونو ڈیفینسی وائرس-1 (ایچ آئی وی-1)، جو ایکوائرڈ امیونو ڈیفیسینسی سنڈروم (ایڈز) کا سبب بنتا ہے، 1980 کی دہائی کے اوائل میں دریافت ہوا تھا، اور تب سے یہ ایک عالمی وبا بن گیا ہے [1]۔ اگرچہ انتہائی فعال اینٹی ریٹرو وائرل علاج (HAART)، پری ایکسپوژر پروفیلیکسس (PrEP) کے ساتھ مل کر ایچ آئی وی-1 انفیکشن کے کنٹرول پر حقیقی اثر ڈال سکتا ہے، ویکسینیشن اب بھی عوامی فائدے کے لیے ایک بنیادی نقطہ نظر ہے۔ عالمی HIV-1 وبا کا خاتمہ [2]۔ تین دہائیوں سے زیادہ HIV-1 کی مکمل تحقیق اور متعدد ویکسین کے کلینکل ٹرائلز کے باوجود، ابھی تک ایک لائسنس یافتہ HIV{10}} ویکسین ابھی تک ناقابل حصول ہے۔ تھائی لینڈ میں RV144 کا ٹرائل پہلا کیس تھا جس نے HIV-1 انفیکشن کے حصول کے خلاف 31.2% کی معمولی افادیت کو ظاہر کیا [3]۔ دیگر ایچ آئی وی-1 ویکسین کے امیدواروں کی اکثریت جن کا کلینکل ٹرائل ہوا وہ بنیادی طور پر ڈی این اے، ریکومبیننٹ وائرل ویکٹرز، یا سبونائٹ پروٹین ماڈلز [4,5] پر مبنی تھے۔ مثالی طور پر، ایک موثر HIV-1 ویکسین پیدائشی طور پر مدافعتی ردعمل پیدا کرنے، وائرل انفیکشن کو روکنے کے لیے اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے کے ساتھ ساتھ متاثرہ خلیوں کو ختم کرنے کے لیے سائٹوٹوکسک ٹی لیمفوسائٹ (CTL) ردعمل کی صلاحیت رکھتی ہے [7]۔ تاہم، ہر جواب کو حاصل کرنے کے لیے ویکسین کی مختلف حکمت عملیوں کی ضرورت پڑسکتی ہے، جو علیحدہ لیکن متوازی ترقی کی کوششوں کی ضمانت دیتا ہے۔ امیونوجنز اور ڈیلیوری ویکٹرز کا انتخاب HIV-1 ویکسینز کے فنکشن اور مخصوصیت پر اہم اثرات مرتب کرے گا [8,9]۔ HIV-1 ویکسین کی نشوونما کے لیے معیاری طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے بار بار کی ناکامیوں کے نتیجے میں ڈلیوری ویکٹر کے انتخاب کی اہمیت، پرائم بوسٹ رجیمز، اور امیونوجن کی خصوصیت دونوں مزاحیہ اور سیلولر ردعمل میں پہچانی گئی۔ ہیومن پیپیلوما وائرس (HPV) کی 100 سے زیادہ اقسام پہلے ہی معلوم ہیں اور HPV جینوٹائپس 16 اور 18 کو دنیا بھر میں سروائیکل کینسر کے تقریباً 70% کے لیے ذمہ دار سمجھا جاتا ہے [10]۔ HPV L1 وائرس نما ذرات (VLPs)، جو سبونائٹ ویکسینز کی ایک قسم کے طور پر درجہ بندی کیے گئے ہیں، بنیادی طور پر جنگلی قسم کے وائرین کے لیے موازنہ L1- مخصوص مزاحیہ ردعمل اور T سیل کے ثالثی جوابات [11–13] کو بھی آمادہ کر سکتے ہیں۔ فی الحال، مارکیٹ میں تین HPV سے بچاؤ کی ویکسین کا لائسنس حاصل کیا گیا ہے اور وہ سبھی HPV L1 کیپسڈ پروٹین کے VLPs پر مبنی ہیں۔ ان میں سے دو، Gardasil (Merck, Rahway, NJ, USA) اور Gardasil-9 (Merck) خمیر (Saccharomyces cerevisiae) اظہار کے نظام کے ذریعے تیار کیے جاتے ہیں جبکہ دوسرے، Cervarix (GSK، Brentford، UK)، پیدا ہوتے ہیں۔ بیکولووائرس ایکسپریشن ویکٹر/کیڑے سیل (BEVS/IC) سسٹم کے ذریعے [14]۔ ابھی تک، ممالیہ کے اظہار کے نظام میں HPV16 L1 پروٹین کی پیداوار کے بہترین حالات اچھی طرح سے قائم نہیں ہوئے ہیں۔ اس طرح، ایک مشترکہ ویکسین کی تیاری جو HPV اور HIV کے انفیکشن سے حفاظت کرے گی، ان دو بڑے عالمی پیتھوجینز کے خلاف جنگ میں ایک منطقی کوشش ہے۔

وائرس نما ذرہ (VLP) پر مبنی HIV-1 ویکسینز کے ڈیزائن کے تصورات کے حوالے سے ہمارے پچھلے جائزہ پیپر کی اشاعت میں، ہم نے ذکر کیا کہ غیر لفافہ VLPs، جیسے پیپیلوما وائرس VLPs، پیش کرنے کے لیے ڈیلیوری ویکٹر کے طور پر ایک فعال کردار ادا کر سکتے ہیں۔ HIV-1 CTL یا غیر جانبدار اینٹی باڈی ایپیٹوپس [15,16]۔ اس مفروضے کی تصدیق کئی chimeric بوائین پیپیلوما وائرسز (BPV) L1 VLP میں ہوئی ہے جو Gp120 HIV-1 لفافہ پروٹین (Env) کے V3 لوپ سے P18I10 CTL ایپیٹوپ پیش کرتے ہیں اور 2F5 ایپیٹوپ یا Gp41 En HIV{12}} کے MPER علاقے [17-22]۔ انسانی پیپیلوما وائرس کی قسم-16 (HPV16) L1 کیپسڈ پروٹین کی ساختی خصوصیت BPV سے ملتی جلتی ہے اور خود کو سنگل لیئر L1 VLPs [23] میں جمع کر سکتی ہے۔ HPV16 L1 پروٹین میں سے پانچ ایک پینٹامر بناتے ہیں اور 72 پینٹامر خود کو HPV16 VLP میں جمع کرتے ہیں [24]۔ تاہم، ابھی تک اس بات کا کوئی واضح ثبوت نہیں ہے کہ chimeric HPV16: HIV کیپسڈ پروٹین وٹرو میں مستحکم ہو سکتے ہیں اور مورفولوجیکل طور پر انٹیگرل VLPs میں خود کو جمع کر سکتے ہیں۔ دوسری طرف، HPV16 L1 VLPs کو انتہائی امیونوجینک ہونے کا مظاہرہ کیا گیا ہے اور یہ اینٹیجن سے متعلق مخصوص T اور B-سیل کے مدافعتی ردعمل [11–13] کو دلانے کی صلاحیت رکھتے ہیں۔ یہ دیکھنا ابھی باقی ہے کہ آیا HPV کے ذریعے HIV-1 epitopes کی پیشکش: HIV VLPs امیونوجینک ہو سکتے ہیں۔ اس مطالعہ میں، ہمارا مقصد ایک chimeric VLP پر مبنی HPV: HIV ویکسین انسانی 293F خلیات کا استعمال کرتے ہوئے تیار کرنا ہے، جو ایک اچھی طرح سے قائم ممالیہ خلیوں کے اظہار کا نظام ہے۔ HPV 16 L1 پروٹین نے ساختی ویکسین سکیفولڈ کے طور پر کام کیا، اور P18I10 اور T20 پیپٹائڈس کو HIV-1 امیونوجن کے طور پر منتخب کیا گیا اور HPV 16 L1 پروٹین کے DE لوپ میں داخل کیا گیا۔ امیونوڈومیننٹ P18I10 CTL ایپیٹوپ جس میں 10 امینو ایسڈز شامل ہیں (311–320: RGP GRAFVTI) HIV-1 لفافے گلائکوپروٹین gp120 کے تیسرے متغیر ڈومین (V3) سے اخذ کیا گیا ہے۔ P18I10 پیپٹائڈ کی شناخت ایک H-2Dd-محدود MHC کلاس-I مالیکیول کے طور پر کی گئی ہے جو سائٹوٹوکسک ٹی لیمفوسائٹ (CTL) ردعمل [25,26] کو دلانے کے لیے ہے۔ T20 پیپٹائڈ، جسے Enfuvirtide کے نام سے جانا جاتا ہے اور ایک اینٹی ریٹرو وائرل ملٹیمیرک فیوژن پیپٹائڈ کے طور پر ڈیزائن کیا گیا ہے، ایک 36 امینو ایسڈ سیکوئنس (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) پر مشتمل ہے جو سی ٹرمینل ہیپٹاڈ ہیلکس کی ترتیب کی نقل کرتا ہے۔0 HIV-1 لفافہ گلائکوپروٹین 41 (gp41) [27] کا قریبی بیرونی علاقہ (MPER)۔ یہ دو HIV-1 T (P18I10) اور B (T20) سیل پر مبنی ایپیٹوپس کو chimeric VLP پر مبنی HPV: HIV ویکسین ڈویلپمنٹ پلیٹ فارم کے لیے نقطہ آغاز اور تصور کے تجربے کے ثبوت کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔

گزشتہ دہائی کے دوران، VLP پر مبنی HIV-1 ویکسین کے بہت سے مختلف پرائم بوسٹ فارمیٹس کا تجربہ کیا گیا ہے [15]۔ اگرچہ پچھلی HIV-1 VLP [28] یا chimeric BPV: HIV VLP [17–22] ویکسین کی حکمت عملی ہومولوجس پرائم بوسٹ ریگیمین کا استعمال کرتے ہوئے مدافعتی ردعمل پیدا کرنے پر مرکوز تھی، دو سابقہ ​​مطالعات نے تجویز کیا کہ ہیٹرولوگس امیونائزیشن recombinant پر مشتمل ہے۔مائکوبیکٹیریم بووسBacillus Calmette-Guérin (rBCG) HIV-1 Gag prime and HIV-1 Gag VLP فروغ T-cell کی قوت مدافعت کو بڑھانے میں معاون ثابت ہو سکتا ہے [29,30]۔ اپنے تحقیقی گروپ میں، ہم نے HIVA امیونوجن کے اظہار اور ریکومبیننٹ وائرل ویکٹر MVA کے ساتھ فروغ دینے والے rBCG کے ساتھ پرائمنگ کا مظاہرہ کیا ہے۔ HIVA محفوظ تھا اور BALB/c چوہوں [31–33] میں HIV-1-مخصوص T-cell مدافعتی ردعمل ظاہر کرتا تھا۔ HIVA امیونوجن، جسے ڈاکٹر ٹامس ہینکے نے ڈیزائن کیا ہے، مکمل طوالت کے HIV-1 Gag پروٹین پر مشتمل ہے جس میں متعدد CTL ایپیٹوپس بشمول C-ٹرمینس [34] پر P18I10 ایپیٹوپس شامل ہیں۔ لہذا، ہمارا مقصد یہ جانچنا تھا کہ آیا BCG.HIVA BALB/c چوہوں میں HIV: HPV (L1:P18I10) VLPs کے ذریعے T-cell کے مدافعتی ردعمل کو بڑھا سکتا ہے۔

اس مطالعہ میں، chimeric HPV: HIV (L1:P18I10 اور L1:T20) امیونوجنز کو 293F ایکسپریشن سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن اور تیار کیا گیا تھا۔ chimeric L1: P18I10 اور L1: T20 پروٹین اظہار کی تصدیق امیونوسٹیننگ سے ہوئی۔ HPV: HIV VLPs کو بعد میں ایک 3-مرحلہ کرومیٹوگرافک طریقہ سے پاک کیا گیا تھا، بشمول کیٹیشن (CEC)، سائز اخراج (SEC)، اور ہیپرین ایفینیٹی (H-AC) کرومیٹوگرافی۔ پھر، ان وٹرو استحکام، وٹرو سیلف اسمبلی میں، اور پیوریفائیڈ HPV کی شکل: HIV VLPs کی تصدیق بالترتیب SDS-PAGE، مالیکیولر ماس پرکھ، اور ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (TEM) سے ہوئی ہے۔ chimeric HPV پر پیش کردہ ترتیب وار اور تشکیلی P18I10 اور T20 پیپٹائڈس: HIV VLPs کو ویسٹرن بلاٹ اور بالواسطہ ELISA پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے وٹرو میں اینٹی HIV-1 gp120 V3 اور 2F5 مونوکلونل اینٹی باڈیز کی مزید خصوصیات تھیں۔ آخر میں، HPV کی مدافعتی صلاحیت: HIV VLPs کا BALB/c چوہوں کے ماڈل میں اندازہ کیا گیا۔ ہم نے یہ ظاہر کیا کہ chimeric L1:P18I10 اور L1:T20 VLP پر مبنی ویکسین HPV16- اور HIV-1-مخصوص اینٹی باڈی ردعمل پیدا کر سکتی ہیں اور chimeric L1:P18I10 VLPs HPV16- اور HIV{36}} کو متاثر کر سکتی ہیں۔ {37}}BALB/c چوہوں میں مخصوص T-cell کے جوابات۔ چونکہ ایک امیونوجینک HPV کی نشوونما اور تیاری: HIV ویکسین ابھی تک ناقابل حصول ہے، اس مطالعے نے ایک بنیادی حکمت عملی فراہم کی ہے جو HPV اور HIV{40}} انفیکشنز کو کنٹرول کرنے کے لیے نوول chimeric VLP پر مبنی ویکسین تیار کرنے کی عالمی کوششوں کی حمایت کرنے کے قابل ہو سکتی ہے۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 BCG.HIVA2auxo.int ویکسین سٹرین کی تعمیر

HIVA امیونوجن کا اظہار کرنے والا ریکومبیننٹ BCG پہلے E.coli-mycobacterial انٹیگریٹیو شٹل ویکٹر p2auxo.int کا استعمال کرتے ہوئے بنایا گیا تھا۔ HIVA اینٹیجن کا اظہار کرنے والے E. coli/mycobacterial vector کی تعمیر پہلے بیان کی گئی تھی [31-33]۔ BCG.HIVA2auxo.int کو PBS-Tween20 سے 2 × 107 cfu/mL میں پتلا کیا گیا، بیکٹیریل کلپس کو روکنے کے لیے سونیکیٹ کیا گیا، اور پچھلے فوڈ پیڈ یا BALB/c چوہوں (50 µL، 106 cfu/mouse) میں ٹیکہ لگایا گیا۔

Desert ginseng-Improve immunity (23)

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنائیں

2.2 بیکٹیریل کلچر اور تبدیلی

ڈاکٹر پاؤ فیرر کے ذریعہ فراہم کردہ E. coli، M151GlyA (انویٹروجن، والتھم، MA، USA) کے گلائسین آکسوٹروفک سٹرین کے سیلز کو کم سے کم M9-ڈیریویٹیو میڈیم (M9-D: Na2HPO4, 6.78 g/L; KH2PO4, 3 g/L; NaCl, {{10}}.5 g/L; NH4Cl, 1 g/L, گلوکوز, 1{{20 }} g/L؛ MgSO4، 2 mmol/L؛ CaCl2، 0.1 mmol/L؛ تھامین، 0.1 g/L؛ FeCl3، 0۔{56} }25 جی/ایل؛ AlCl3·6H2O، 0.13 ملی گرام/L؛ ZnSO4·7H2O، 2.6 mg/L؛ CoCl2·6H2O، 0.47 mg/L؛ CuSO4·H2O، 4.6 mg/L؛ H3BO3، 0۔ ، گلائسین (70 µg/mL) کے ساتھ ضمیمہ۔ E. coli M151Gly خلیات کو p2auxo.HIVA پلاسمڈ کے ساتھ الیکٹروپوریشن کے ذریعے تبدیل کیا گیا تھا۔ اس کے لیے، ای کولی کلچرز کو 600 nm پر 0.9 کی نظری کثافت تک بڑھایا گیا اور 2.5 kV، 25 µF، اور 200 Ω پر Bio-Rad جین پلسر الیکٹروپوریٹر کا استعمال کرتے ہوئے تبدیل کیا گیا۔ تبدیل شدہ خلیوں کو بعد میں M9-D آگر پلیٹوں پر (جزاء جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، جس میں 1.5% بیکٹواگر شامل کیا گیا تھا) پر انتخاب کے لیے گلائسین سپلیمنٹیشن کے بغیر یا کنٹرول کے طور پر گلائسین سپلیمنٹیشن کے ساتھ کلچر کیا گیا۔ لائسین آکسوٹروفک BCG سٹرین، BCG∆lys، برائے مہربانی WR Jacobs Jr.، BR بلوم، اور T. Hsu کی طرف سے فراہم کردہ الیکٹرو پورشن کے ذریعے p2auxo.HIVAint پلازمڈ DNA کے ساتھ تبدیل کیا گیا تھا۔ مائکوبیکٹیریا کو مڈل بروک 7H9 شوربے کے میڈیم میں یا مڈل بروک ایگر 7H10 میڈیم پر البومن-ڈیکسٹروز-کیٹالیس (ADC؛ Difco) کے ساتھ ملایا گیا جس میں 0.05% Tween 80 شامل ہیں۔ 40 µg/mL کے آخری ارتکاز پر بطور ضمیمہ استعمال کیا جاتا ہے۔ تبدیلی کے لیے، BCG کو 600 nm پر 1.5 کی آپٹیکل کثافت میں تبدیل کیا گیا اور 2.5 kV، 25 µF، اور 1000 Ω پر Bio-Rad جین پلسر الیکٹروپوریٹر کا استعمال کرتے ہوئے تبدیل کیا گیا۔ اس کے بعد ٹرانسفارمینٹس کو ADC کے اضافی مڈل بروک ایگر 7H10 میڈیم پر کلچر کیا گیا جس میں 0.05% Tween 80 بغیر لائسین سپلیمنٹیشن کے تھے۔

2.3 سیل لائنز اور سیل کلچر

انسانی برانن گردے (HEK) 293 خلیوں سے اخذ کردہ 293F خلیات (Tibco) کو فری اسٹائل 293 ایکسپریشن میڈیم (Tibco) میں 5 mL/L پینسلن-اسٹریپٹومائسن (Tibco) کے ساتھ مکمل کیا گیا تھا اور 37 انکیوبیٹر میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ 125 rpm پر گھومنے والے مداری شیکر پلیٹ فارم پر 5% CO2 کا مرطوب ماحول۔

2.4 293F ایکسپریشن سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے L1:P18I10 اور L1:T20 پروٹین کی پیداوار

pCDNA3.1 کی تعمیر میں L1:P18I10 یا L1:T20 DNA کوڈنگ کے سلسلے بالترتیب chimeric L1:P18I10 اور L1:T20 پروٹینز سے ملتے ہیں۔ HIV-1 P18I10 CTL پیپٹائڈ (RGPGRAFVTI) یا T20 پیپٹائڈ (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) کو HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین کے DE لوپ میں داخل کیا گیا تھا۔ HPV16 L1 DE لوپ سیکوینس انکوڈنگ 130–136 امینو ایسڈ کو P18I10I10 یا T20 پیپٹائڈ سے تبدیل کیا گیا تھا۔ L1:P18I10 یا L1:T20 ڈی این اے کوڈنگ کے سلسلے کوزاک ترتیب کے ساتھ تبدیل کیے گئے، انسانی کوڈن کے ساتھ بہتر بنائے گئے، HindIII اور XbaI کی پابندی کے انزائم سائٹس کے ساتھ مل کر، اور GeneArt gene کا استعمال کرتے ہوئے pcDNA3.1(+) ویکٹر میں کلون کیا گیا۔ تھرمو فشر، والتھم، ایم اے، امریکہ)۔ ریکومبیننٹ پلاسمڈ ڈی این اے (پی ڈی این اے) کو ایمپلیفیکیشن کے لیے E. coli DH5 قابل خلیات (انویٹروجن) میں تبدیل کیا گیا اور پلاسمڈ میکسی کٹس (QIAGEN، ہلڈن، جرمنی) کا استعمال کرکے نکالا گیا۔ 293F خلیوں کو 30mL فری اسٹائل 293 ایکسپریشن میڈیم کے ساتھ 125mL Erlenmeyer فلاسک (Corning, New York, NY, USA) میں 1.0 × 106/mL کی کثافت کے ساتھ کلچر کیا گیا تھا اور عارضی طور پر L1:P18I10 یا L1 پی ڈی این اے کا استعمال کرتے ہوئے منتقل کیا گیا تھا۔ 25 kDa (PEI-25K) (Polysciences) کے MW کے ساتھ polyethyleneimine DNA سے PEI 1:3 (w/w) اور DNA ٹو کلچر میڈیم 1:1 (w/v) کے بہتر تناسب پر کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق [35]۔ منتقلی کے بعد 96 گھنٹے میں 293F خلیوں کی کٹائی کی گئی۔ 293F خلیے تقریباً 50% قابل عمل ہونے کے ساتھ 3.6 × 106 خلیات/mL کی سنگم کثافت تک پہنچ سکتے ہیں۔

2.5 امیونو فلوروسینس سٹیننگ

خلیوں کو شیشے کی سلائیڈ پر 100٪ کولڈ ایسٹون کے ساتھ پارگمیبلائز کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، فکسڈ سیلز کو اینٹی HPV16 L1 اینٹی باڈی CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, UK) سے جانچا گیا اور اینٹی ماؤس IgG-FITC (Sigma) کے ساتھ پکڑا گیا۔ مدافعتی داغ والے سیل monolayers کو PBS سے اچھی طرح دھویا گیا اور DAPI (Abcam) کے ساتھ بڑھتے ہوئے میڈیم سے ڈھانپ دیا گیا۔ امیونو فلوروسینس امیجز کا معائنہ الٹی مائکروسکوپ کے تحت 40 × میگنیفیکیشن پر کیا گیا۔ ٹرانسفیکشن کی کارکردگی کا تعین ایف آئی ٹی سی (سبز) - مثبت خلیات اور ڈی اے پی آئی (نیلے رنگ) کے داغ والے خلیوں کے تناسب سے کیا گیا تھا۔

2.6۔ HPV کی صفائی: HIV (L1:P18I10 اور L1:T20) VLPs

125 mL Erlenmeyer فلاسک (30 mL کلچر میڈیم/فلاسک) میں کل 108 منتقلی شدہ 293F خلیات کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے 1500 rpm پر 5 منٹ کے لیے جمع کیا گیا اور PBS کے ساتھ دو بار دھویا گیا۔ 1% ٹرائٹن X-100، ایک پروٹیز روکنے والا (1:100) (ملی پور)، اور بینزوناز (25 U/mL) (ملی پور) کے ساتھ تیار کردہ لیسیز بفر میں سیل پیلٹس کو دوبارہ معطل کیا گیا۔ سیل لائسیٹس کو 0.45 µm PVDF سرنج فلٹر (ملی پور) کے ساتھ واضح کیا گیا تھا۔ HPV: HIV (L1:P18I10 اور L1:T20) VLP نمونوں کو کیشن ایکسچینج (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, USA)، سائز کا اخراج (Capto Core 700, GE) اور وابستگی (HiTrap Heparin HP) کا استعمال کرتے ہوئے سیریلی طور پر صاف کیا گیا تھا۔ ، GE) کرومیٹوگرافی۔ کرومیٹوگرافک پروٹوکول کو ہمارے پچھلے مطالعات میں بیان کیا گیا تھا [36,37] اور کارخانہ دار کے پروٹوکول کی پیروی کی گئی تھی [38]۔ ہر پیوریفیکیشن سٹیپ میں L1 پروٹین سگنل کو ویسٹرن بلٹ تجزیہ کے ذریعے نمایاں کیا گیا تھا اور اینٹی HPV16 L1 اینٹی باڈی CAMVIR-1 [39] سے جانچا گیا تھا۔

2.7۔ غیر کم کرنے والا SDS-PAGE

HPV16 L1, L1:P18I10, اور L1:T20 VLPs کو 5% (v/v) 2-mercaptoethanol ({{11}) کی عدم موجودگی یا موجودگی میں 2× Laemmli سیمپل بفر (BIO-RAD) کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ }ME) اور کمرے کے درجہ حرارت (RT) پر 24 گھنٹے تک رد عمل ظاہر کیا۔ نمونوں کو 8–16٪ TGX داغ سے پاک پروٹین جیل (BIO-RAD) سے الگ کیا گیا تھا۔ پھر، جیلوں کو PVDF جھلیوں میں منتقل کیا گیا تھا۔ جھلیوں کی جانچ اینٹی HPV16 L1 CAMMVIR-1 mAb کے ساتھ 1:4000 کی کمی پر کی گئی۔ اس کے بعد، جھلیوں کو اینٹی ماؤس آئی جی جی پیرو آکسیڈیس کنجوگیٹ (سگما-الڈرچ، سینٹ لوئس، ایم او، یو ایس اے) کے ساتھ 1:4000 کی کمی پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ یہ سگنل ویسٹرن بلاٹ ای سی ایل سبسٹریٹ کٹ (بائیو راڈ، ہرکیولس، سی اے، یو ایس اے) کا استعمال کرتے ہوئے کیمیلومینیسینس کے ذریعے تیار اور تصور کیا گیا تھا۔ دھبے کی تصاویر اوڈیسی ایف سی امیجنگ سسٹم کا استعمال کرکے حاصل کی گئیں۔

2.8۔ مالیکیولر ماس تجزیہ

HPV16 L1, L1:P18I10, اور L1:T20 VLPs بغیر 2-ME علاج کے 1000 kDa مالیکیولر ویٹ کٹ آف (MWCO) الٹرا فلٹریشن ڈیوائسز (SARTORIUS) کے ذریعے فلٹر کیے گئے تھے۔ HPV16 L1, L1:P18I10, اور L1:T20 VLPs کے ساتھ 2-ME علاج 100 kDa MWCO الٹرا فلٹریشن ڈیوائسز (امیکون) سے گزرے تھے۔ ریٹینٹیٹس کو اصل حجم میں دوبارہ تشکیل دیا گیا تھا اور فلٹر ڈیوائس کے نمونے کے ذخائر سے جمع کیا گیا تھا، جبکہ فلٹریٹس سینٹرفیوج ٹیوب کے نیچے جمع کیے گئے تھے۔ L1 سگنل کو اینٹی HPV16 L1 mAb کے ساتھ پروب شدہ ڈاٹ بلاٹ کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا تھا اور اینٹی ماؤس IgG-peroxidase conjugate (Sigma-Aldrich) کے ذریعے پتہ چلا تھا۔ کیمیلومینیسینس چینل پر اوڈیسی ایف سی امیجنگ سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر حاصل کی گئیں۔

Desert ginseng-Improve immunity

cistanche tubulosa کے فوائد- مدافعتی نظام کو مضبوط کرنا

2.9 منفی سٹیننگ اور ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی

کاربن لیپت تانبے کے گرڈز (Sigma-Aldrich) کو الٹرا وائلٹ لائٹ کے تحت 5 منٹ تک چارج کرنے کے بعد، کمرشل HPV16 L1 (Abcam)، پیوریفائیڈ L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کو 20 mM Tris-HCl (pH 7.4,M3M3 Nam1) کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا ہے۔ ) کو 1 منٹ تک گرڈ پر جذب کیا گیا اور ملی کیو پانی سے تین بار دھویا گیا۔ HPV: HIV VLPs 1 منٹ کے لیے pH 4.5 (Sigma-Aldrich) پر 2% uranyl acetate کے ساتھ منفی داغ دار تھے۔ اضافی داغدار ایجنٹوں کو واٹ مین کوالیٹیو فلٹر پیپر (سگما-الڈرچ) کے ذریعہ ہٹا دیا گیا تھا۔ گرڈ کو مشاہدے سے کم از کم 2 گھنٹے پہلے ڈیہومیڈیفائر چیمبر میں رکھا گیا تھا۔ تصویریں بالترتیب SA135K (100 nm) اور SA59000 (200 nm) پر ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپ (Tecnai Spirit 120 kV) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کی گئیں۔

2.10 سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ – پولی کریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس اور مغربی بلوٹنگ تجزیہ

HPV16 L1 پروٹین (Abcam) کی مساوی مقدار (500 ng)، پیوریفائیڈ L1:P18I10، اور L1:T20 VLPs کو 2× Laemmli سیمپل بفر کے ساتھ ملایا گیا جس میں 5% 2-ME تھا اور 95 ◦C پر 5 منٹ کے لیے ابالا گیا۔ . نمونوں کو 8–16٪ TGX داغ سے پاک پروٹین جیلوں سے الگ کیا گیا تھا اور پھر سیمی ڈرائی ٹرانسفر ڈیوائس (بائیو ریڈ) کا استعمال کرتے ہوئے پی وی ڈی ایف جھلی (ملی پور، برلنگٹن، ایم اے، امریکہ) میں منتقل کیا گیا تھا۔ ٹی بی ایس ٹی میں 5% سکم دودھ کے ساتھ جھلی کو بلاک کر دیا گیا تھا۔ اس کے بعد، جھلیوں کو اینٹی HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb کے ساتھ 1:4000 کی کمی پر، اینٹی HIV-1 gp120 V3 لوپ mAb (NIBSC، EVA3012) کے ساتھ 1: 40 اور HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) بالترتیب 1:4000 کی کمی پر۔ اس کے بعد، جھلیوں کو اینٹی ماؤس آئی جی جی پیرو آکسیڈیس کنجوگیٹ (سگما-الڈرچ) کے ساتھ 1:4000 کی کمی پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ ویسٹرن ای سی ایل سبسٹریٹ کٹ (BIO-RAD) سگنل کی نشوونما کے لیے استعمال کی گئی تھی۔ کیمیلومینیسینس چینل پر اوڈیسی ایف سی امیجنگ سسٹم کا استعمال کرکے دھبے کی تصاویر حاصل کی گئیں۔

2.11۔ چوہوں کا امیونائزیشن، سیرا کا مجموعہ، اور اسپلینوسائٹس کا الگ تھلگ

یہ HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs) کی مدافعتی صلاحیت کو ظاہر کرنے کے لیے ایک ابتدائی ثبوت کا تصوراتی مطالعہ ہے۔ خوراک، انتظامیہ کا راستہ، اور ہمارے HPV کا پرائم بوسٹ وقفہ: HIV VLPs نے پچھلے مطالعات کا حوالہ دیا جس نے چوہوں کو بوائین پیپیلوما وائرس (BPV) کے ساتھ حفاظتی ٹیکے لگائے: اینٹی باڈی ردعمل [20,21] کو دلانے کے لئے HIV VLPs۔ Purified HPV: HIV VLPs کو مساوی حجم (225 µg فی ہر 0.5 mL خوراک) ایلومینیم ہائیڈروکسی فاسفیٹ سلفیٹ (تھرمو فشر) کے ساتھ ایملسیف کیا گیا تھا، تاکہ لائسنس یافتہ Gardasil-9 HPV ویکسین [40] سے ملتی جلتی تشکیل کو یقینی بنایا جا سکے۔ تمام ماؤس گروپس میں مساوی صنفی تقسیم تھی (مرد n=4 اور خواتین n=4 فی گروپ)۔ گروپ A اور B میں، BALB/c چوہوں کو 10 µg L1:P18I10 یا L1:T20 VLPs کے ساتھ بالترتیب ایک ہم جنس پرائم بوسٹ رجیم کی پیروی کرتے ہوئے انٹرامسکیولر (im) سے حفاظتی ٹیکے لگائے گئے۔ گروپ سی میں، چوہوں کو BCG.HIVA2auxo.int کے 106 cfu کے ساتھ انٹراڈرملی طور پر ٹیکہ لگایا گیا تھا (آئی ڈی، فوڈ پیڈ پر) اور 10 µg L1:P18I10 VLPs کے ساتھ انٹرمسکلر طور پر بڑھایا گیا تھا۔ گروپ D میں، مثبت کنٹرول چوہوں کو Gardasil- 9 prime کے ساتھ ٹیکہ لگایا گیا تھا جس کے بعد Gardasil-9 کو 10 µg HPV16 L1 VLPs کے ساتھ اندرونی طور پر فروغ دیا گیا تھا۔ گروپ ای میں، منفی کنٹرول چوہوں کو پی بی ایس بفر کے ساتھ دو بار حفاظتی ٹیکے لگائے گئے۔ پرائم بوسٹ وقفہ 2 ہفتوں کا تھا۔ 28 ویں دن چوہوں کی قربانی دی گئی۔ چوہوں کے دلوں سے خون کے نمونے لیے گئے۔ سیرا کو سینٹرفیوگریشن کے ذریعے بازیافت کیا گیا اور ELISA پرکھ کے لیے −20 ◦C پر محفوظ کیا گیا۔ 5 ملی لیٹر سرنج ربڑ پلنگر کے ساتھ سیل اسٹرینر (فالکن) کے ذریعے مورین تلیوں کو ہٹا دیا گیا اور انفرادی طور پر دبایا گیا۔ ACK lysing buffer (Lonza) کے ساتھ خون کے سرخ خلیات کو ہٹانے کے بعد، splenocytes کو دھویا گیا اور lymphocyte میڈیم R10 (RPMI 1640 کو 10% fetal calf serum (FCS) کے ساتھ ملایا گیا، penicillin-streptomycin، اور 20 m{1m HEPM 46}ME) 2 × 107 خلیات/ملی لیٹر کے ارتکاز میں۔

2.12۔ انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ

HPV16 L1- اور HIV-1-کیمریک HPV کے پابند مخصوص اینٹی باڈیز کی جانچ کرنے کے لیے: HIV VLP وٹرو میں بناتا ہے، 50 µL مساوی ارتکاز (200 ng/mL) ریکومبیننٹ HPV16 L1 پروٹین (Abcam, ab119880) )، پیوریفائیڈ L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs 50mM کاربونیٹ بائکاربونیٹ بفر (pH=9.6) (Sigma) میں 2-میکسسرب پلیٹوں (Nunc) پر سیریلی طور پر پتلا اور لیپت تھے۔ پلیٹوں کو رات بھر 4 ◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ پلیٹوں کو بلاک کرنے والے بفر (TBST میں 5% سکم دودھ) کے ساتھ 37 ◦C پر کم از کم 2 گھنٹے کے لیے بلاک کیا گیا تھا۔ TBST کے ساتھ دو بار دھونے کے بعد، VLP لیپت پلیٹوں کو 1:8000، 2F5 mAb (NIBSC، ARP3063) کے کم کرنے پر 1:8000 اور اینٹی HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ HIV-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) بلاکنگ بفر میں بالترتیب 1:40 کی کمی پر، 2 گھنٹے کے لیے 37 ◦C پر۔ TBST کے ساتھ تین بار دھونے کے بعد، پلیٹوں کو 1:4000 کی کمی پر ریکومبیننٹ پروٹین G peroxidase conjugate (تھرمو سائنٹیفک، والتھم، MA، USA) کے ساتھ 37 ◦C پر 1 گھنٹے کے لیے بلاک کیا گیا۔ TMB کا استعمال انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) سگنل تیار کرنے کے لیے کیا گیا تھا اور 2M H2SO4 کے 50 µL کے ساتھ روکا گیا تھا۔ ہر کنویں کی نظری کثافت (OD) کو EL × 800 جاذب مائکروپلیٹ ریڈر کا استعمال کرکے 450 nm کی طول موج پر ماپا اور ریکارڈ کیا گیا۔

BALB/c چوہوں میں VLP سے متاثر اینٹی باڈیز کی پیمائش کرنے کے لیے، مائیکرو ٹائٹر پلیٹوں کو 50 µL 2 µg/mL ریکومبیننٹ HPV16 L1 پروٹین (Abcam، ab119880)، HIV-1 P18I10 پیپٹائڈ (NIBSC، ARP734)، کے ساتھ لیپت کیا گیا تھا۔ T20 پیپٹائڈ (NIBSC, ARP984) بالترتیب، 50 mM کاربونیٹ-بائکاربونیٹ بفر (pH=9.6) کے ساتھ۔ پلیٹوں کو رات بھر 4 ◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ پلیٹوں کو بلاک کرنے والے بفر (TBST میں 5% سکم دودھ) کے ساتھ 37 ◦C پر کم از کم 2 گھنٹے کے لیے بلاک کیا گیا تھا۔ ایک ہی وقت میں، گروپ AE سے امیونائزڈ چوہوں سے جمع کردہ سیرا کو 1:50 کے تناسب سے TBST میں 5% سکم دودھ کے ساتھ ملایا گیا۔ TBST کے ساتھ دو بار دھونے کے بعد، پلیٹوں کو 2 گھنٹے کے لیے 37 ◦C پر پتلی سیرا کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ TBST کے ساتھ تین بار دھونے کے بعد، پلیٹوں کو ریکومبیننٹ پروٹین G HRP کنجوگیٹ کے ساتھ بلاک کرنے والے بفر میں 1:4000 کی کمی پر شامل کیا گیا اور 1 گھنٹے کے لیے 37 ◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ TMB کو ELISA سگنل تیار کرنے کے لیے استعمال کیا گیا اور 2M H2SO4 کے 50 µL کے ساتھ روک دیا گیا۔ EL × 800 absorbance microplate reader (Biotek) کا استعمال کرتے ہوئے ہر کنویں کے OD کو 450 nm کی طول موج پر ماپا گیا۔

2.13۔ IFN- ELISpot Assay

انزائم سے منسلک مدافعتی جاذب جگہ (ELISpot) پرکھ کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق، تجارتی مورین IFN-ELISpot کٹ (Mabtech، Nacka Strand، Sweden) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ ELISpot پلیٹس (MISP4510، 96- پولی وینیلائیڈین ڈائی فلورائیڈ جھلیوں والی اچھی پلیٹیں، ملی پور، مڈل سیکس کاؤنٹی، MA، USA) کو 70% EtOH ٹریٹ کیا گیا اور پیوریفائیڈ اینٹی ماؤس انٹرفیرون- (IFN-) کیپچر مونوکلونل اینٹی باڈی کے ساتھ لیپت کیا گیا۔ فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) 5 µg/mL کے آخری ارتکاز میں 4 ◦C پر رات بھر۔ پھر، ہر کنویں میں 2.5 × 105 تازہ اسپلینوسائٹس شامل کی گئیں۔ اس کے بعد، گروپ A اور B کے خلیات کو بالترتیب HPV16 L1 VLPs اور HIV-1 P18I10 پیپٹائڈس کے 2 µg/mL کے ساتھ متحرک کیا گیا۔ تمام نمونے اور کنٹرول ڈپلیکیٹ کنوؤں میں چڑھائے گئے تھے۔ ELISpot asses 37 ◦C، 5% CO2 پر 16 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیے گئے تھے۔ بعد میں پلیٹوں کو پی بی ایس کے ساتھ 5 × دھویا گیا، 2 گھنٹے کے لیے بائیوٹینیلیٹڈ اینٹی IFN- مونوکلونل اینٹی باڈی (mAb) کے ساتھ پی بی ایس 2٪ فیٹل کلف سیرم (FCS) میں 2 µg/mL کی آخری ارتکاز تک 5 بار دھویا گیا۔ PBS میں، اور PBS 2% FCS میں streptavidin-alkaline phosphatase conjugate کے ساتھ انکیوبیٹڈ۔ اس کے بعد، پلیٹوں کو 100 µL 5-برومو-4-کلورو-3-انڈویل فاسفیٹ (BCIP)/نائٹرو بلیو ٹیٹرازولیم (NBT) سبسٹریٹ محلول (سگما-الڈرچ) کے ساتھ انکیوبیشن سے پہلے پی بی ایس کے ساتھ 5 بار دھویا گیا۔ ، سینٹ لوئس، MO، USA)۔ 5-10 منٹ کے بعد، پلیٹوں کو نلکے کے پانی سے دھویا گیا، خشک کیا گیا، اور نتیجے میں دھبوں کی گنتی ELISPOT ریڈر (AID، Autoimmun Diagnostika GmbH، Strasberg، Germany) کے ذریعے کی گئی۔ ہر جانور کے لیے، گروپوں کے درمیان IFN- سپاٹ بنانے والے خلیات (SFC)/106 کا موازنہ کرنے کے لیے تمام کنوؤں سے پس منظر کے ردعمل کا مطلب انفرادی طور پر منہا کیا گیا تھا۔ مثبت ردعمل کی وضاحت کرنے کے لیے، ایک حد کو کم از کم پانچ مقامات کے طور پر بیان کیا گیا تھا، اور منفی کنٹرول کنوؤں میں دھبوں کی اوسط تعداد سے زیادہ ردعمل کے علاوہ منفی کنٹرول کنوؤں کے تین معیاری انحراف۔

2.14 شماریاتی تجزیہ

تمام شماریاتی تجزیہ Prism 6 GraphPad سافٹ ویئر (CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ ہم نے 5 مختلف ELISA پلیٹ کوٹنگ ارتکاز (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) سے زیادہ کئے گئے تجربات سے ڈیٹا استعمال کیا جس میں ریکومبیننٹ HPV16 L1 پروٹین (Abcam, ab119880) اور HPV: HIV VLPs۔ ہم نے 2 گروپس (HPV16 L1 اور HPV: HIV VLPs) سے ڈیٹا اکٹھا کیا اور ہر کوٹنگ کے ارتکاز کے لیے تین نقلیں جمع کیں۔ Prism میں گراف نے ڈیٹا کو ایک سکیٹر پلاٹ کے طور پر دکھایا جس میں X-axis پر کوٹنگ کا ارتکاز (ng/mL) اور Y-axis پر OD450 ظاہر ہوتا ہے۔ چونکہ ہم نے یہ قیاس کیا کہ ہمارا ان وٹرو ELISA ڈیٹا ایک لکیری پیٹرن سے متعلق ہے، اس لیے ہم نے لکیری ریگریشن تجزیہ کیا اور اس ڈیٹا سیٹ-1 اور ڈیٹا سیٹ-2 کی تصدیق کرنے کے لیے دو لائنوں کی ڈھلوانوں کا موازنہ کیا (اینٹی باڈی HPV16 L1 اور HPV کے درمیان رد عمل: HIV VLPs) ان کے اعمال میں مختلف ہیں۔ ہم نے بہترین فٹ لائن کے ساتھ ساتھ 95% اعتماد کے وقفوں کا انتخاب کیا۔ پرزم نے ہمارے دونوں ڈیٹا سیٹس پر ایک لکیری ریگریشن لائن کو خود بخود اوورلی کیا ہے اور اس نے 95% اعتماد کے وقفوں کی نمائندگی کرنے والی ایک نقطے والی لائن بنائی ہے۔ لکیری رجعت کے تجزیے کے دوران، سافٹ ویئر نے ہمارے ڈیٹا سیٹ کی صرف اوسط Y قدر کا حساب لگایا جس نے فٹ ہونے کی خوبی کو ظاہر کیا۔ اس کے علاوہ، Prism نے ہمیں ایک کمنٹری دی، اس لیے ہم یہ نتیجہ اخذ کر سکتے ہیں کہ دونوں ڈھلوانوں کے درمیان فرق انتہائی اہم ہے۔

ہمارے پاس ماؤس کے حفاظتی ٹیکوں کے تجربات سے جمع کردہ ڈیٹا کے 5 سیٹ (ELISA) اور 4 سیٹ (ELISPOT) تھے۔ ان ڈیٹا سیٹس میں ہر گروپ میں برابر تعداد (مرد n=4 اور خواتین n=4) تھی۔ ہم نے Gardasil-9-کو حفاظتی ٹیکوں والے چوہوں کو ایک مثبت کنٹرول گروپ کے طور پر اور PBS-امیونائزڈ چوہوں کو منفی کنٹرول گروپ کے طور پر استعمال کیا۔ ہمارے ڈیزائن کردہ تجربات کا ڈیٹا مماثل یا جوڑا نہیں تھا۔ ہم نے تغیر (ANOVA) کا یک طرفہ تجزیہ کیا کہ آیا یہ ذرائع مختلف ہیں۔ ہم نے سب سے پہلے اپنے ڈیٹا کی جانچ پڑتال کی جو گاؤشیائی عام تقسیم کے مطابق ہے۔ ہم نے پایا کہ ELISA پرکھ میں ڈیٹا کے کچھ گروپوں نے Gaussian نارمل ڈسٹری بیوشن ٹیسٹ پاس نہیں کیا۔ لہذا، ہم نے ان اعداد و شمار کا غیر پیرامیٹرک شماریاتی تجزیہ کیا۔ اس کے برعکس، ELISPOT پرکھ میں ڈیٹا کے تمام گروپس گاوسی نارمل ڈسٹری بیوشن ٹیسٹ سے گزر چکے ہیں۔ اس طرح، ہم نے ان اعداد و شمار کا پیرامیٹرک شماریاتی تجزیہ کیا۔ اہمیت کی حد اور اعتماد کی سطح کو 0.05 پر سیٹ کیا گیا تھا (95% اعتماد کے وقفے کے برابر)۔ p قدر عام طور پر اس امکان کو ظاہر کرتی ہے کہ گروپوں کے درمیان اختلافات ہیں۔ چونکہ اس تجربے کے لیے ہماری بنیادی تشویش یہ ہے کہ ہمارے گروپوں کے درمیان کیا فرق ہے، اس لیے پرزم میں متعدد موازنہوں نے ہمیں تمام گروپوں میں ہر دوسرے گروپ کے ساتھ موازنہ کا نتیجہ دیا۔

2.15 اخلاقیات کے بیانات

چھ سے آٹھ ہفتے پرانے BALB/c چوہے Envigo (ایک Inotiv کمپنی، شکاگو، IL، USA) سے خریدے گئے تھے اور مقامی حکام (Generalitat de Catalunya، پروجیکٹ نمبر 11157) اور Universitat Autònoma de Barcelona Ethics Commitee سے منظور کیے گئے تھے۔ جانوروں کے تجربات جنریلیٹیٹ ڈی کاتالونیا کے جانوروں کی بہبود کے قانون کے مطابق ہیں۔ تمام تجربات کو مقامی ریسرچ ایتھکس کمیٹی (طریقہ کار 43.19، Hospital de la Val d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona) نے منظور کیا تھا۔

3. نتائج

3.1 L1:P18I10 اور L1:T20 کا ڈیزائن اور HPV کی تشخیص: 293F ایکسپریشن سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے HIV پروٹین کا اظہار

HIV-1 Env تھرڈ ویری ایبل ڈومین (V3) لوپ سے P18I10 پیپٹائڈ اور HIV-1 Env membrane کے proximal external region (MPER) سے T20 پیپٹائڈ کو HPV16 L1 DE لوپ پروٹین میں داخل کیا گیا تاکہ chimeric L1 پیدا کیا جا سکے۔ :P18I10 اور L1:T20 امیونوجن۔ chimeric L1:P18I10 اور L1:T20 DNA کوڈنگ کے سلسلے کو 293F خلیوں میں عارضی منتقلی کے لیے pcDNA3.1 (+) پلازمڈ DNA اظہار ویکٹر میں کلون کیا گیا تھا (شکل 1A)۔ HPV16 L1، chimeric L1:P18I10، اور L1: T20 کیپسڈ پروٹین کے مونومر ڈھانچے کی ابتدائی طور پر SWISS-ماڈل سرور (شکل 1B) کا استعمال کرتے ہوئے پیش گوئی کی گئی تھی۔ HPV16 میجر کیپسڈ پروٹین L1 (7cn2.1.R) کو HPV16 L1، L1:P18I10، اور L1:T20 کیپسڈ پروٹین ہومولوجی ماڈلنگ بنانے کے لیے ساختی ٹیمپلیٹ کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔ پچھلے مطالعہ [41] میں پابند P18I10 پیپٹائڈ کی تشکیل کے مقابلے میں، ہمارے chimeric L1 پر P18I10 پیپٹائڈ کی N سے C ٹرمینس مین چین سمت: P18I10 پروٹین دائیں سے بائیں چلتا ہے (شکل 1B، درمیانی اور اوپر والا پینل)، اور سامنے آنے والی P18I10 سائیڈ چینز ممکنہ طور پر T سیل ریسیپٹرز کے ساتھ تعامل کر سکتی ہیں (شکل 1B، درمیانی اور نیچے والا پینل)۔ پچھلے جائزے کے مقالے میں ایچ آئی وی-1 فیوژن انحیبیٹر پیپٹائڈ کی ساخت کے مقابلے [42]، HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین پر داخل کردہ T20 پیپٹائڈ کو ایک ہیلکس جیسی تشکیل کے طور پر پیش کیا گیا ہے (شکل 1B، دائیں اور اوپری پینل )، اور بے نقاب T20 سائیڈ چینز کو ممکنہ طور پر B سیل ریسیپٹرز (شکل 1B، دائیں اور نیچے والا پینل) کے ذریعے پہچانا جا سکتا ہے۔ چونکہ HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین 72 پینٹامریک کیپسومیرس کے ساتھ ایک T=7 icosahedral ذرہ میں یکساں طور پر جمع ہو سکتے ہیں [43]، P18I10 یا T20 پیپٹائڈز کا اعلی کثافت کا ڈسپلے chimeric HPV کی بیرونی سطح پر VLPMun کی ممکنہ طور پر اعلی کثافت ہے۔ ایپیٹوپ مخصوص مدافعتی ردعمل کو دلانے کے لیے۔

Figure 1. L1:P18I10 and L1:T20 immunogen design and construction of chimeric HPV: HIV VLPs by using 293F expression system. (A) The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 DNA coding sequences were cloned into pcDNA3.1+ expression vectors, respectively, for transient transfection in 293F cells. (B) Prediction of monomer structures of HPV16 L1 and chimeric HPV: HIV capsid proteins by using the SWISS-model server. HPV16 major capsid protein L1 (7cn2.1.R) was selected as the structural template to build the HPV16 L1 (left panel), L1:P18I10 (middle panel), and L1:T20 (right panel) capsid protein homology modeling. Secondary structural elements of HPV16 L1 capsid protein are labeled, with letters h1–h5 for the 5 α-helices. Loops of HPV16 L1 capsid protein between strands are labeled BC, CD, DE, EF, FG, and HI. Secondary structural elements of HIV-1 P18I10 and T20 peptides L1 are labeled by the arrows (top panel). The part of the P18I10 and T20 peptide that protrudes above the surface of the HPV16 L1 capsid protein is indicated by the arrows (bottom panel). (C) Immunofluorescence staining of L1 protein in 293F cells. The following pDNA.L1:P18I10 (left), pDNA.L1:T20 (middle), and pDNA.without insertion (right) were transfected in 293F cells. The transfected cells were probed with anti-HPV16 L1 mAb and detected with anti-mouse IgG-FITC (green channel). Cell nuclei were stained with DAPI (blue channel). Immunofluorescence images were merged by using Adobe Photoshop


شکل 1. L1:P18I10 اور L1: T20 امیونوجن ڈیزائن اور chimeric HPV: HIV VLPs 293F ایکسپریشن سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے۔ (A) chimeric L1:P18I10 اور L1:T20 DNA کوڈنگ کے سلسلے کو pcDNA3 میں کلون کیا گیا تھا۔{13}} اظہار ویکٹر، بالترتیب، 293F خلیوں میں عارضی منتقلی کے لیے۔ (B) HPV16 L1 اور chimeric HPV کے مونومر ڈھانچے کی پیشین گوئی: SWISS ماڈل سرور کا استعمال کرتے ہوئے HIV کیپسڈ پروٹین۔ HPV16 میجر کیپسڈ پروٹین L1 (7cn2.1.R) کو HPV16 L1 (بائیں پینل)، L1:P18I10 (درمیانی پینل)، اور L1:T20 (دائیں پینل) کیپسڈ پروٹین ہومولوجی ماڈلنگ بنانے کے لیے ساختی ٹیمپلیٹ کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔ HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین کے ثانوی ساختی عناصر کو 5 -ہیلیکس کے لیے حروف h1–h5 کے ساتھ لیبل لگایا گیا ہے۔ اسٹرینڈ کے درمیان HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین کے لوپس پر BC، CD، DE، EF، FG، اور HI کا لیبل لگا ہوا ہے۔ HIV-1 P18I10 اور T20 پیپٹائڈس L1 کے ثانوی ساختی عناصر پر تیروں (اوپر کا پینل) کا لیبل لگا ہوا ہے۔ P18I10 اور T20 پیپٹائڈ کا وہ حصہ جو HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین کی سطح کے اوپر پھیلا ہوا ہے تیر (نیچے پینل) سے ظاہر ہوتا ہے۔ (C) 293F خلیوں میں L1 پروٹین کا امیونو فلوروسینس سٹیننگ۔ درج ذیل pDNA.L1:P18I10 (بائیں)، pDNA.L1:T20 (درمیانی)، اور pDNA. بغیر اندراج (دائیں) کو 293F خلیوں میں منتقل کیا گیا تھا۔ منتقلی شدہ خلیوں کی جانچ اینٹی HPV16 L1 mAb سے کی گئی اور اینٹی ماؤس IgG-FITC (گرین چینل) سے پتہ چلا۔ سیل نیوکلی کو DAPI (بلیو چینل) سے داغ دیا گیا تھا۔ ایڈوب فوٹوشاپ کا استعمال کرتے ہوئے امیونو فلوروسینس امیجز کو ضم کیا گیا تھا۔

چونکہ HPV16 L1 پروٹین C ٹرمینل تسلسل انفیکشن کے دوران سیلولر جوہری درآمدی مشینری میں ثالثی کرتا ہے [44]، HPV16 L1 پروٹین کے نیوکلیئر لوکلائزیشن سگنلز (NLS) کو پہلے کے مطالعے میں شناخت کیا گیا ہے [45]۔ CAMVIR-1 مونوکلونل اینٹی باڈی کا انتخاب HPV16 L1 ایپیٹوپ (GFGAMDF, 230–236 aa) [39] کو پہچاننے کے لیے کیا گیا تھا، اور L1:P18I10 اور L1 کے اظہار کی نگرانی کے لیے فلوروسین پر مبنی ڈائی FITC کو بطور رپورٹر استعمال کیا گیا تھا۔ T20 پروٹین۔ Immunofluo rpresence images نے واضح طور پر ظاہر کیا کہ HPV16 L1 (سبز رنگ میں) بنیادی طور پر 293F خلیوں کے مرکزے (نیلے رنگ میں) میں مقامی تھا۔ کنٹرول پلازمیڈ ٹرانسیکٹڈ 293F سیل (pcDNA3.1 پلاسمڈ بغیر داخل کیے) میں کوئی L1 سگنل نہیں دیکھا گیا (شکل 1C)۔ نتائج نے تجویز کیا کہ دونوں chimeric L1:P18I10 اور L1:T20 کیپسڈ پروٹین کا اظہار پولیتھیلینیمین (PEI) - ثالثی ٹرانسفیکشن کا استعمال کرتے ہوئے کیا جا سکتا ہے اور HPV16 L1 CAMVIR-1 مونوکلونل اینٹی باڈی کے ذریعے پہچانا جاتا ہے۔

3.2 کرومیٹوگرافک طریقے استعمال کرکے L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کی صفائی

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa اور ایک ہیٹرولوگس لوئر بینڈ<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figure 2. Purification and characterization of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Schematic process flowchart of L1:P18I10 and L1:T20 VLP purification by chromatography. (B, C) Western blot analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLP samples from each purification step. The signal of L1 in each purification step was characterized by Western blot analysis probed with anti-HPV16 L1 mAb. The arrow indicates the molecular weight of ~56 kDa of L1:P18I10 and ~58 kDa of L1:T20 proteins. Lane 1: clarified cell lysate (CCL); Lane 2: flow-through (FT) from cation exchange chromatography (CEC) sample loading; Lane 3: CEC eluate; Lane 4: FT from CEC 2M NaCl regeneration step; Lane 5: size exclusion chromatography (SEC) FT-1; Lane 6: SEC FT-2; Lane 7: FT from heparin affinity chromatography (H-AC) sample loading; Lane 8: H-AC eluate; Lane 9: FT from H-AC 2M NaCl regeneration step; Lane 10: 10-fold diafiltration.


شکل 2. L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کی صفائی اور خصوصیت۔ (A) کرومیٹوگرافی کے ذریعے L1:P18I10 اور L1:T20 VLP پیوریفیکیشن کا اسکیمیٹک پروسیس فلو چارٹ۔ (B, C) ہر پیوریفیکیشن سٹیپ سے L1:P18I10 اور L1:T20 VLP نمونوں کا مغربی بلٹ تجزیہ۔ ہر پیوریفیکیشن سٹیپ میں L1 کا سگنل اینٹی HPV16 L1 mAb کے ساتھ جانچنے والے ویسٹرن بلاٹ تجزیہ کی خصوصیت رکھتا تھا۔ تیر L1:P18I10 کے ~56 kDa اور L1:T20 پروٹین کے ~58 kDa کے مالیکیولر وزن کی نشاندہی کرتا ہے۔ لین 1: واضح سیل لیسیٹ (CCL)؛ لین 2: کیشن ایکسچینج کرومیٹوگرافی (CEC) نمونہ لوڈنگ سے بہاؤ کے ذریعے (FT)؛ لین 3: سی ای سی ایلویٹ؛ لین 4: CEC 2M NaCl کی تخلیق نو کے مرحلے سے FT؛ لین 5: سائز اخراج کرومیٹوگرافی (SEC) FT-1; لین 6: SEC FT-2; لین 7: ہیپرین ایفینیٹی کرومیٹوگرافی (H-AC) نمونہ لوڈنگ سے FT؛ لین 8: H-AC ایلویٹ؛ لین 9: H-AC 2M NaCl کی تخلیق نو کے مرحلے سے FT؛ لین 10: 10-فولڈ ڈیفلٹریشن۔

3.3 L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کی وٹرو استحکام اور خود اسمبلی میں

اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ پیوریفائیڈ HPV: HIV VLPs نے HPV16 L1 VLPs کی طرح وٹرو استحکام ظاہر کیا، ہم نے HPV: HIV کیپسڈ پروٹینز (شکل 3A) کے ڈسلفائیڈ کراس لنکنگ کا اندازہ کرنے کے لیے غیر کم کرنے والے SDS-PAGE کو انجام دیا۔ یہ معلوم ہے کہ پی ایچ، آئنک طاقت، درجہ حرارت [52]، اور ریڈوکس ماحول سبھی HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین [53] کے ڈسلفائیڈ بانڈز سے منسلک ہیں۔ HPV L1 VLPs کم پی ایچ اور اعلی آئنک طاقت پر خود کو جمع کرنے کا رجحان رکھتے ہیں۔ VLPs کے زیادہ سے زیادہ جدا کرنے کے لیے عام طور پر نسبتاً طویل مدت کے لیے 5% 2-mercaptoethanol (2-ME) کو کم کرنے والے ایجنٹ کی اعلیٰ ارتکاز کی ضرورت ہوتی ہے [54]۔ کم کرنے والے ایجنٹوں 2-ME کی غیر موجودگی میں، HPV-16 L1, L1:P18I10، اور L1:T20 پروٹین کا صرف ایک چھوٹا سا حصہ 55 kDa کے ظاہری مالیکیولر وزن (MW) کے ساتھ monomers میں منتقل ہوا۔ . تقریباً 70% L1 پروٹین بڑے ڈائمرز یا پینٹامرز میں ڈسلفائیڈ بندھے ہوئے تھے، جس میں 110 kDa اور 280 kDa (شکل 3A، لین 2، 4، اور 6) کی پیش گوئی کی گئی میگاواٹ تھی۔ اس کے برعکس، تقریباً تمام HPV-16 L1, L1:P18I10 اور L1:T20 پروٹین جدا کرنے والے بفر میں غیر کم کرنے والے SDS-PAGE (شکل 3A، لین 3، 5، اور 7) میں مونومیرک ڈھانچے دکھائی دیتے ہیں۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ پیوریفائیڈ L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کی وٹرو استحکام میں HPV16 L1 VLPs جیسے پی ایچ، آئنک طاقت، اور تھرمل حالات میں اسی طرح کے ڈسلفائیڈ کراس لنکنگ پیٹرن پیش کیے گئے۔ پیوریفائیڈ VLPs کو کم کرنے والے ایجنٹوں کے زیادہ ارتکاز کے طویل مدتی نمائش کے بعد پینٹامرز، ٹرمرز اور ڈائمرز کی سطح پر ٹوٹا ہوا دکھائی دیتا ہے۔ یہ اعداد و شمار پچھلے مطالعات کے مطابق ہیں [53,54] تاہم، HPV کی جداگانہ: HIV VLPs ابھی تک مکمل (monomers) سے دور تھی۔

Figure 3. In vitro stability of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Disulfide cross-linking of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in non-reducing SDS-PAGE. The HPV16 L1 VLPs, purified L1:P18I10, and L1:T20 VLPs were mixed with Laemmli sample buffer in the absence or presence of 2-mercaptoethanol (2-ME), respectively, and analyzed by non-reducing SDS-PAGE. The position of the L1 monomer (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), and L1 pentamer (280 kDa) are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 VLP; Lane 3: HPV16 L1 VLP treated with 2-ME; Lane 4: L1:P18I10 VLP; Lane 5: L1:P18I10 VLP treated with 2-ME; Lane 6: L1:T20 VLP; Lane 7: L1:T20 VLP treated with 2-ME. (B) Molecular mass analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. Assembled VLPs untreated with 2-ME (lanes 2, 4, and 6) were filtered out through 1000kDa molecular weight cutoff (MWCO) diafiltration devices (upper panel). Disassembled VLPs treated with 2-ME (lanes 3, 5, and 7) were filtered out through 100kDa MWCO centrifugal filter devices (lower panel). Retentates (R) were collected from filter device sample reservoirs, while the filtrates (F) were collected at the bottom of centrifuge tubes. The L1 protein signal was detected by using a dot blot probed with anti-HPV16 L1 mAb.


شکل 3. L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کی ان وٹرو استحکام۔ (A) غیر کم کرنے والے SDS-PAGE میں L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کا ڈسلفائیڈ کراس لنکنگ۔ HPV16 L1 VLPs، پیوریفائیڈ L1:P18I10، اور L1:T20 VLPs کو بالترتیب 2-mercaptoethanol (2-ME) کی عدم موجودگی یا موجودگی میں Laemmli نمونہ بفر کے ساتھ ملایا گیا، اور غیر کم کرنے کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ SDS-PAGE۔ L1 مونومر (55 kDa)، L1 dimer (110 kDa)، اور L1 پینٹامر (280 kDa) کی پوزیشن تیر سے ظاہر ہوتی ہے۔ لین 1: پروٹین مالیکیولر ویٹ مارکر؛ لین 2: HPV16 L1 VLP؛ لین 3: HPV16 L1 VLP 2-ME کے ساتھ علاج کیا گیا؛ لین 4: L1:P18I10 VLP؛ لین 5: L1:P18I10 VLP 2-ME کے ساتھ سلوک کیا گیا؛ لین 6: L1:T20 VLP؛ لین 7: L1:T20 VLP نے 2-ME کے ساتھ سلوک کیا۔ (B) L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کا مالیکیولر ماس تجزیہ۔ 2-ME (لین 2، 4، اور 6) کے ساتھ غیر علاج شدہ VLPs کو 1000kDa مالیکیولر ویٹ کٹ آف (MWCO) ڈائی فلٹریشن ڈیوائسز (اوپری پینل) کے ذریعے فلٹر کیا گیا۔ 2-ME (لین 3، 5، اور 7) کے ساتھ علاج کیے جانے والے الگ الگ VLPs کو 100kDa MWCO سینٹری فیوگل فلٹر ڈیوائسز (نچلے پینل) کے ذریعے فلٹر کیا گیا۔ ریٹینٹیٹس (R) کو فلٹر ڈیوائس کے نمونے کے ذخائر سے جمع کیا گیا تھا، جبکہ فلٹریٹس (F) سینٹرفیوج ٹیوبوں کے نیچے جمع کیے گئے تھے۔ L1 پروٹین سگنل کا پتہ اینٹی HPV16 L1 mAb کے ساتھ ایک ڈاٹ بلاٹ پروب کے ذریعے لگایا گیا تھا۔

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) اور ریٹینٹیٹس میں محفوظ تھے۔ پیٹرن اس ڈیٹا کے ساتھ موافق تھا جو غیر کم کرنے والے SDS-PAGE میں دیکھا گیا تھا۔ اگرچہ 2-ME کے ساتھ علاج کیے گئے تمام VLP گروپس کو غیر کم کرنے والے SDS-PAGE (شکل 3A، لین 3، 5 اور 7) میں ایک مونومیرک بینڈ (~55 kDa) میں دکھایا گیا تھا۔ تاہم، متعلقہ کم شدہ VLPs کو 100kDa الٹرا فلٹریشن جھلیوں (شکل 3B، نیچے پینل) کے ذریعے فلٹر نہیں کیا گیا تھا۔ ان نتائج نے تجویز کیا کہ chimeric HPV: HIV پروٹین بڑے ذرات میں خود کو جمع کرنے کی صلاحیت رکھتے تھے، لیکن VLPs کو monomers میں زیادہ سے زیادہ جدا کرنے کے لیے نہ صرف ڈسلفائیڈ بانڈز میں کمی بلکہ دیگر منحرف عوامل، جیسے pH یا ionic طاقت کی بھی ضرورت ہوتی ہے۔

3.4 L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کی مورفولوجیکل خصوصیات

ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی (TEM) کا استعمال HPV16 L1 اور HPV: HIV VLPs کی مورفولوجک تبدیلی کی جانچ کرنے کے لئے کیا گیا تھا۔ HIV-1 P18I10 اور T20 پیپٹائڈس کو بالترتیب HPV16 L1 پروٹین کے DE لوپس میں داخل کیا گیا تھا۔ یہ تجارتی HPV16 L1 اور chimeric HPV: HIV کیپسڈ پروٹین تقریباً 50–60 nm کے قطر میں وٹرو میں خود ساختہ VLPs میں جمع ہو سکتے ہیں (شکل 4A–C، دائیں پینل)۔ پچھلے مطالعات [55,56] میں شائع ہونے والے HPV16 L1 VLPs کے الیکٹران مائیکرو گرافس کے مقابلے میں، HPV16 L1، L1:P18I10، اور L1:T20 VLPs کا آئیکوشیڈرل ڈھانچہ یہاں کم برعکس اور مبہم تھا۔ اس کو منفی داغ ری ایجنٹ سے منسوب کیا جاسکتا ہے جو ہم نے اس مطالعے میں استعمال کیا تھا۔ پچھلے مطالعہ [37] میں شائع ہونے والی ہماری حالیہ تحقیق اور ہم مرتبہ جائزہ کے تحت ایک اور جاری مقالے میں (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)، ہمیں الیکٹران مائیکروگرافس کی اچھی کوالٹی اور ریزولوشن ملا ہے جب خمیر- اور بیکولووائرس سے ماخوذ L1:P18I10 VLPs (ایک ہی chimeric) کنسٹرکٹ) کو پی بی ایس میں متوازن کیا گیا تھا اور فاسفوٹونگسٹک ایسڈ (پی ٹی اے) کے ساتھ منفی داغ دیا گیا تھا۔ چونکہ ہم نے اس مطالعے میں مختلف VLP پروڈکشن اور پیوریفیکیشن سسٹمز کا استعمال کیا ہے، اس لیے ممالیہ سیل سے ماخوذ L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کو Tris-HCl کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا تھا اور یورینیل ایسیٹیٹ کے ساتھ منفی داغ دیا گیا تھا۔ اگرچہ الیکٹران مائیکرو گراف کو بہتر بنایا جا سکتا ہے، پھر بھی ہم ایک واضح نمونہ دیکھ سکتے ہیں کہ زیادہ تر HPV16 L1، L1:P18I10، اور L1: T20 کیپسڈ پروٹین TEM اسکرین کے نیچے مورفولوجیکل VLPs میں خود جمع ہو سکتے ہیں (شکل 4A–C، بائیں پینل۔ )۔ بنیادی طور پر، HPV VLPs اعلی نمک کی حالتوں میں جمع ہونے سے محفوظ ہیں [57]۔ HPV16 L1 اور HPV کی کچھ قابل شناخت جمع: کم نمک Tris-HCl بفر میں HIV VLPs کو نچلے میگنیفیکیشن (شکل 4A–C، بائیں پینل) کے نیچے دیکھا جا سکتا ہے۔ ان نتائج سے، ہم نے یہ نتیجہ اخذ کیا کہ HIV-1 P18I10 یا T20 پیپٹائڈس کے داخل کرکے جزوی L1 DE لوپ کی ترتیب میں ترمیم نے HPV: HIV VLPs کی شکل کو نمایاں طور پر متاثر نہیں کیا۔

Figure 4. Electron micrographs of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Morphology of HPV16 VLPs. (B) Morphology of L1:P18I10 VLPs. (C) Morphology of L1:T20 VLPs. Purified VLPs were absorbed on UV-charged carbon-coated copper grids, and negatively stained with 2% uranyl acetate. Images were acquired under transmission electron microscopy. The bar represents 200 nm at magnification 59,000 (left panel) and 100 nm at magnification 135K (right panels), respectively


شکل 4. L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کے الیکٹران مائکروگراف۔ (A) HPV16 VLPs کی شکلیات۔ (B) L1:P18I10 VLPs کی مورفولوجی۔ (C) L1 کی مورفولوجی: T20 VLPs۔ پیوریفائیڈ VLPs کو UV چارجڈ کاربن لیپت کاپر گرڈز پر جذب کیا گیا تھا، اور 2% یورینیل ایسیٹیٹ کے ساتھ منفی طور پر داغ دیا گیا تھا۔ ٹرانسمیشن الیکٹران مائکروسکوپی کے تحت تصاویر حاصل کی گئیں۔ بار میگنیفیکیشن 59،000 (بائیں پینل) پر بالترتیب 135K (دائیں پینل) پر 200 nm اور 100 nm کی نمائندگی کرتا ہے۔

3.5 HPV-16 اور HIV-1 Epitopes کی پیشکش اور رد عمل 

اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ ترتیب وار HIV-1 P18I10 یا 2F5 ایپیٹوپس کو کرومیٹوگرافی سے پیوریفائیڈ L1:P18I10 یا L1:T20 VLPs میں پیش کیا گیا تھا، ویسٹرن بلاٹ تجزیہ اور بالواسطہ ELISA کو ایپیٹوپ مخصوص mAbs کا استعمال کرتے ہوئے پیش کیا گیا تھا۔ ہم نے HPV16 L1 پروٹین [39,58] کے انتہائی محفوظ شدہ ایپیٹوپ (GFGAMDF, aa 230–236) کو پہچاننے کے لیے ایک معروف مونوکلونل اینٹی باڈی (mAb)، نامزد CAMVIR-1 کا انتخاب کیا۔ HIV-1 gp120 V3 لوپ ایپیٹوپ (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) کو ہدف بنانے والے پہلے شائع شدہ mAb کو ترتیب وار P18I10 ایپیٹوپس (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59] کا پتہ لگانے کے لیے منتخب کیا گیا تھا۔ دوسری طرف، وسیع نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈی (bnAb) کو ایچ آئی وی کو پہچاننے والا-1 gp41 2F5 ایپیٹوپ (ELDKWA) لیبارٹری ایچ آئی وی-1 کی وسیع اقسام کے خلاف T20 پیپٹائڈ کی خصوصیت کے لیے منتخب کیا گیا تھا۔ 60,61]۔ HPV16 L1 mAb کے ساتھ جانچ کی گئی ویسٹرن بلاٹ پرکھ نے بالترتیب HPV16 L1، L1:P18I10، اور L1: T20 پروٹین کے مطابق بینڈ 55، 56، اور 58 kDa دکھائے (شکل 5A، B، بائیں)۔ L1:P18I10 پروٹین کا سالماتی وزن (MW) HPV16 L1 پروٹین (شکل 5A، بائیں) سے ملتا جلتا تھا۔ L1 سے مماثل بینڈ: T20 پروٹین HPV16 L1 پروٹین سے تھوڑا زیادہ دیکھا گیا، جیسا کہ اضافی امینو ایسڈ کی ترتیب (شکل 5B، بائیں) سے پیش گوئی کی گئی ہے۔ تقریباً 56 اور 58 kDa کے بینڈ، L1:P18I10 اور L1:T20 پروٹین کے مطابق، بالترتیب اینٹی ایچ آئی وی-1 gp120 V3 اور 2F5 mAb (شکل 5A، B، دائیں) کے ساتھ جانچنے والے مغربی بلٹ پرکھ میں پائے گئے۔ )۔ ہم نے سوچا کہ اینٹی-2F5-سٹینڈ L1:T20 پروٹین کا مالیکیولر ویٹ (MW) درست تھا اور متوقع 58 kDa (شکل 5B، دائیں) پر فٹ تھا۔ تاہم، اینٹی ایچ آئی وی-1 gp120 V3-stained L1:P18I10 پروٹین کا میگاواٹ تھوڑا کم ہے (شکل 5A، دائیں)۔ یہ chimeric L1: P18I10 پروٹین کی متفاوت ساخت سے منسوب کیا جا سکتا ہے. چونکہ SDS-PAGE میں denaturing حالت کے تحت ترتیب وار ایپیٹوپ کی تشکیل ختم ہوسکتی ہے۔ لہذا، ہم نے اپنے chimeric L1: P18I10 VLPs (شکل 5E) پر مناسب طریقے سے پیش کردہ تعمیری P18I10 پیپٹائڈ کو ظاہر کرنے کے لیے بالواسطہ ELISA کا مظاہرہ کیا۔ دوسری طرف، اینٹی ایچ آئی وی-1 gp120 V3 لوپ اینٹی باڈی جسے ہم نے استعمال کیا ہے اس نے P18I10 کی بجائے پورے HIV{103}} V3 لوپ کو پہچان لیا۔ اس کے نتیجے میں، مجموعی طور پر اینٹی V3 سگنل کم تھا (شکل 5A، B، دائیں پینل)۔ اس کے باوجود، ان نتائج نے اشارہ کیا کہ ترتیب وار HIV-1 P18I10 اور T20 پیپٹائڈس HPV: HIV VLPs میں پیش کیے گئے ہیں۔

Figure 5. Presentation of HPV-16 and HIV-1 epitopes. (A, B) Sequential epitope detection of chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were analyzed by Western blot, using anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 and 2F5 mAb. The HPV16 L1 VLPs were used as a control. The molecular weight of the L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), and L1:T20 (58 kDa) proteins are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 protein; Lane 3: L1:P18I10 protein; Lane 4: L1:T20 protein. (C, D) Binding of HPV16 L1 mAb to chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (E) Binding of anti-HIV-1 gp120 V3 mAb to chimeric L1:P18I10 VLPs. (F) Binding of HIV-1 2F5 mAb to chimeric L1:T20 VLPs. The line graph of indirect ELISAs was performed to detect the conformational epitopes of recombinant HPV16 L1, L1:P18I10, and L1:T20 VLPs bound to anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 or 2F5 mAbs, respectively. Data are representative of three independent experiments. A simple linear regression test was done to compare the line difference of purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs with the standard curve of commercial L1 VLPs; ns: not significant; ** p < 0.01.


شکل 5. HPV-16 اور HIV-1 epitopes کی پیشکش۔ (A, B) chimeric L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کی ترتیب وار ایپیٹوپ کا پتہ لگانا۔ پیوریفائیڈ L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کا تجزیہ مغربی بلاٹ کے ذریعے کیا گیا، اینٹی HPV16 L1، اینٹی HIV-1 gp120 V3 اور 2F5 mAb کا استعمال کرتے ہوئے۔ HPV16 L1 VLPs کو بطور کنٹرول استعمال کیا گیا تھا۔ L1 (55 kDa)، L1:P18I10 (56 kDa)، اور L1:T20 (58 kDa) پروٹین کا مالیکیولر وزن تیر سے ظاہر ہوتا ہے۔ لین 1: پروٹین مالیکیولر ویٹ مارکر؛ لین 2: HPV16 L1 پروٹین؛ لین 3: L1:P18I10 پروٹین؛ لین 4: L1: T20 پروٹین۔ (C, D) HPV16 L1 mAb کا chimeric L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs سے بائنڈنگ۔ (E) اینٹی ایچ آئی وی-1 gp120 V3 mAb کو chimeric L1:P18I10 VLPs سے بائنڈنگ۔ (F) HIV-1 2F5 mAb کا chimeric L1:T20 VLPs سے بائنڈنگ۔ بالواسطہ ELISAs کے لائن گراف کو بالترتیب اینٹی L1، اینٹی HIV-1 gp120 V3 یا 2F5 mAbs کے پابند ریکومبیننٹ HPV16 L1, L1:P18I10، اور L1:T20 VLPs کے کنفرمیشنل ایپیٹوپس کا پتہ لگانے کے لیے انجام دیا گیا تھا۔ ڈیٹا تین آزاد تجربوں کا نمائندہ ہے۔ پیوریفائیڈ L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کے لائن فرق کا کمرشل L1 VLPs کے معیاری وکر کے ساتھ موازنہ کرنے کے لیے ایک سادہ لکیری ریگریشن ٹیسٹ کیا گیا تھا۔ ns: اہم نہیں؛ ** p <0.01۔

مزید برآں، اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا ایچ آئی وی{{{{50}}}} HPV پر پیش کیے گئے کنفرمیشنل ایپیٹوپس: HIV VLPs کی شناخت gp120 V3 اور 2F5 وٹرو میں اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے کے ذریعے کی جا سکتی ہے، ہم نے جانچنے کے لیے بالواسطہ ELISA پرکھ کی ایپیٹوپ بائنڈنگ مخصوصیت اور رد عمل۔ جیسا کہ شکل 5C، D، HPV16 L1، L1:P18I10، اور L1:T20 VLPs میں دکھایا گیا ہے اینٹی L1 mAb کے ذریعے پہچانا گیا۔ ہم نے ہر ایک کمزور لائن کی ڈھلوان کا موازنہ کرنے کے لیے لکیری ریگریشن تجزیہ کیا۔ نتائج نے انکشاف کیا کہ L1 کی L1 ایپیٹوپ بائنڈنگ خصوصیت L1:P18I10 یا L1:T20 VLPs HPV16 L1 VLPs سے مختلف نہیں تھی۔ مزید یہ کہ، اینٹی ایچ آئی وی-1 gp120 V3 mAb L1:P18I10 VLPs کو باندھنے کے قابل تھا، لیکن HPV16 L1 VLPs نہیں (شکل 5E)۔ اس کے علاوہ، 2F5 mAb L1:T20 VLPs کو پہچان سکتا ہے، لیکن HPV16 L1 VLPs (شکل 5F) کو نہیں۔ لکیری ریگریشن تجزیہ کے بعد، L1:P18I10 اور HPV16 L1 کے درمیان gp120 V3 ایپیٹوپ بائنڈنگ مخصوصیت میں فرق انتہائی اہم تھا (p <0.01%)۔ L1:T20 VLPs کی 2F5 ایپیٹوپ بائنڈنگ خصوصیت HPV16 L1 VLPs (p <0.01%) سے نمایاں طور پر مختلف تھی۔ اس پیٹرن سے پتہ چلتا ہے کہ ہائیڈروفوبک سیلولر لپڈز 2F5-کو اینٹی باڈیز کو HPV: وٹرو میں HIV VLPs کو بے اثر کرنے کے پابند کرنے کے لیے ضروری نہیں تھے۔ اگرچہ اینٹی ایچ آئی وی-1 gp120 V3 اور 2F5 کی رد عمل HPV: HIV VLPs کو غیر جانبدار کرنے والی اینٹی باڈیز نسبتاً ہلکی ہے، لیکن اینٹی HIV-1 gp120 V3 اور 2F5 mAb کی HPV سے پابندی: HIV VLPs نمایاں طور پر تھے۔ epitope مخصوص.

3.6۔ BALB/c چوہوں کے حفاظتی ٹیکوں کے بعد L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کی مدافعتی صلاحیت

ہم نے L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کے ساتھ BALB/c چوہوں کے حفاظتی ٹیکوں کے بعد HPV16- اور HIV-1-مخصوص مدافعتی ردعمل کا جائزہ لیا۔ امیونائزیشن کا شیڈول تصویر 6A میں دکھایا گیا ہے۔ چونکہ بلغمی انتظامیہ کے بعد VLP کی حوصلہ افزائی مدافعتی صلاحیت عام طور پر مندرجہ ذیل نظامی انتظامیہ کے مقابلے میں کمزور تھی، چوہوں کو Gardasil-9 HPV16 L1 خوراک [22,62] کے چھٹے حصے کے ساتھ اندرونی طور پر حفاظتی ٹیکے لگائے گئے تھے۔ chimeric HPV کی ایک خوراک (10 µg/100 µL) کے لیے ایلومینیم ہائیڈروکسی فاسفیٹ سلفیٹ: HIV VLPs کو اسی ارتکاز (1 mg/1 mL) میں Gardasil-9 کے لیے ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ ویکسینیشن کے نتائج میں جنسی فرق کا اندازہ لگانے کے لیے، مرد (n=4) اور مادہ (n=4) چوہوں کے درمیان اینٹی باڈی ردعمل کا موازنہ کیا گیا۔ L1:P18I10 VLP، L1:T20 VLP اور Gardasil-9 کے گروپ میں، مادہ چوہوں کے اینٹی HPV16 L1 اینٹی باڈی ردعمل اوسطاً ان نر چوہوں سے زیادہ تھے (شکل 6B)۔ 4 میں سے 2 (50%) L1:P18I10 VLP سے حفاظتی ٹیکوں والی خواتین، 4 میں سے 3 (75%) L1:T20 VLP سے حفاظتی ٹیکوں والی خواتین اور تمام (100%) Gardasil-immunized مادہ چوہوں نے اینٹی L1 اینٹی باڈیز کا زیادہ ٹائٹر حاصل کیا۔ نر چوہوں کے مقابلے میں۔ Gardasil-9 گروپ میں مادہ چوہوں کی طرف سے پیدا کردہ اینٹی L1 ردعمل نر چوہوں کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھے (p=0.0041) (شکل 6B)۔ BCG.HIVA پرائمنگ اور L1:P18I10 VLP بوسٹنگ کے گروپ میں اینٹی L1 اینٹی باڈی ردعمل کی انتہائی کم سطح کا پتہ چلا۔ یہ نمونہ پچھلے نتائج سے مطابقت رکھتا ہے جس میں یہ بیان کیا گیا ہے کہ BCG بنیادی طور پر IgG کی پیداوار کے بجائے T-cell کے ردعمل کو اکساتا ہے [63]۔

Figure 6. Induction of humoral immune responses by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A) All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Groups A and B: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 or L1:T20 VLPs intramuscularly (i.m.); Group C: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group D: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group E: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Sera were collected and diluted at a titer of 1:50 for ELISA assay. (B) HPV L1-specific IgG in male and female mice. (C–E) Epitope-specific IgG induced by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. ELISA was performed to analyze anti-L1, anti-P18I10, and anti-T20 IgG induced by BALB/c mice following different prime-boost combinations as described above. Data are shown as mean ± S.D. One-way ANOVA (nonparametric) test was done to compare differences between groups. OD: opticaldensity. Ns not significant; ** p < 0.01


شکل 6. BALB/c چوہوں میں L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کے ذریعے مزاحیہ مدافعتی ردعمل کی شمولیت۔ حفاظتی ٹیکوں کا شیڈول (A) میں دکھایا گیا ہے تمام ماؤس گروپس میں مساوی صنفی تقسیم تھی (مرد n=4 اور خواتین n=4)۔ گروپس A اور B: 10 µg L1:P18I10 یا L1:T20 VLPs کے ساتھ ہومولوگس پرائم بوسٹ امیونائزیشن انٹرماسکلرلی (im)؛ گروپ C: 106 cfu rBCG کے ساتھ پرائمنگ۔ HIVA انٹراڈرمللی (id) اور 10 µg L1:P18I10 VLPs im کے ساتھ بڑھانا؛ گروپ D: Gardasil-9 کے ساتھ ہومولوس پرائم بوسٹ ویکسینیشن جس میں 10 µg HPV16 L1 VLPs im؛ گروپ ای: پی بی ایس بفر کے ساتھ دو بار امیونائزیشن۔ پرائم بوسٹ وقفہ 2 ہفتوں کا تھا۔ اس مقدمے کا اختتامی نقطہ 28 دن تھا۔ ELISA پرکھ کے لیے سیرا کو 1:50 کے ٹائٹر پر اکٹھا کیا گیا اور اسے گھٹا دیا گیا۔ (B) نر اور مادہ چوہوں میں HPV L1-مخصوص IgG۔ (C-E) Epitope-specific IgG L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کے ذریعے حوصلہ افزائی کی۔ ELISA کو اینٹی L1، اینٹی P18I10، اور اینٹی T20 IgG کا تجزیہ کرنے کے لیے انجام دیا گیا تھا جو BALB/c چوہوں کے ذریعے مختلف پرائم بوسٹ امتزاج کے بعد ہوا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔ ڈیٹا کو اوسط ± SD کے طور پر دکھایا گیا ہے ایک طرفہ ANOVA (نان پیرا میٹرک) ٹیسٹ گروپوں کے درمیان فرق کا موازنہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ OD: آپٹیکل کثافت۔ Ns اہم نہیں؛ ** p <0.01

ہم نے اندازہ کیا کہ کیا L1: P18110 اور L1: T20 VLPs کے ساتھ حفاظتی ٹیکے لگائے گئے چوہوں BALB/c چوہوں میں HPV-16 L1-مخصوص اور HIV-1 ایپیٹوپ مخصوص اینٹی باڈیز پیدا کر سکتے ہیں۔ مورین سیرا میں VLP سے حوصلہ افزائی IgG اینٹی باڈیز کی پیمائش بالترتیب ریکومبیننٹ HPV16 L1 پروٹین، P18I10، یا T20 پیپٹائڈس کے ساتھ لیپت ELISA کے ذریعہ کی گئی۔ PBS کنٹرول گروپ (p=0.0039) کے مقابلے میں Gardasil-9 گروپ میں 1:50 کے سیرم ٹائٹر پر L1-مخصوص IgG میں شماریاتی فرق کا پتہ چلا۔ Gardasil-9، L1:P18I10، اور L1:T20 VLP-امیونائزڈ چوہوں کے درمیان اینٹی L1 ردعمل ایک جیسے تھے اور نمایاں طور پر مختلف نہیں تھے (شکل 6C)۔ BCG.HIVA2auxo.int پرائم اور L1:P18I10 VLP بوسٹ چوہوں نے اینٹی L1 IgG کی انتہائی کم سطح کو حاصل کیا۔ ان نتائج نے تجویز کیا کہ HPV: HIV VLP سے حفاظتی ٹیکوں والے چوہوں نے اسی سطح کا اینٹی L1 IgG تیار کیا جس طرح Gardasil-9-ٹیکے لگائے گئے چوہوں (شکل 6C)۔ اگرچہ L1:P18I10 VLP گروپ عددی طور پر دوسرے حفاظتی گروپوں کے مقابلے P18I10 ایپیٹوپ مخصوص IgG کی اعلی سطح کی طرف رجحان رکھتا ہے، یہ اختلافات اعدادوشمار کے لحاظ سے اہم نہیں تھے (شکل 6D)۔ کچھ L1:P18I10 VLP سے حفاظتی ٹیکوں والے چوہوں میں (8 میں سے 4، 50%)، Gardasil-9-ٹیکے لگائے گئے چوہوں کے مقابلے زیادہ P18I10 بائنڈنگ اینٹی باڈیز دیکھی گئیں۔ متبادل طور پر، ایک T-ٹیسٹ تجزیہ سے پتہ چلا کہ L1:P18I10 VLP اور Gardasil-9 گروپ کے درمیان فرق اہم تھا (p=0.005) (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔ L1:T20 VLP گروپ میں، Gardasil-9 گروپ (p=0.0083) کے مقابلے T20 پیپٹائڈ کے خلاف نمایاں طور پر زیادہ اینٹی باڈی ردعمل کا پتہ چلا۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP، اور BCG.HIVA پرائم L1:P18I10 VLP بوسٹ گروپس (شکل 6E) کے ساتھ مل کر اینٹی T20 ٹائٹرز ناقابل شناخت تھے۔ T20 پیپٹائڈ مخصوص اینٹی باڈی کا ٹائٹر نسبتاً کم تھا۔ یہ ممکنہ طور پر اس وجہ سے ہے: (1) T20 ایک ذیلی پیپٹائڈ ہے؛ (2) ایم پی ای آر یا 2 ایف 5 کو نیوٹرلائز کرنے والے اینٹی باڈیز کو نکالنے کے لیے پیپٹائڈ لیپڈ کنجوگیٹس کی ضرورت ہوتی ہے (شکل 6E)۔ مجموعی طور پر، ہمارے نتائج نے ظاہر کیا کہ L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs HPV16- لیکن کمزور HIV-1-مخصوص اینٹی باڈی ردعمل کو چوہوں میں آمادہ کر سکتے ہیں۔

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنائیں

چوہوں میں HPV اور HIV مخصوص T-cell کے مدافعتی ردعمل کا جائزہ لینے کے لیے، ہم نے شکل 7A میں دکھائے گئے حفاظتی ٹیکوں کے شیڈول پر عمل کیا۔ اس کے علاوہ، heterologous BCG.HIVA2auxo.int پرائمنگ اور L1:P18I10 VLPs کو فروغ دینے کا موازنہ homologous L1:P18I10 VLP پرائم اور بوسٹ امیونائزیشن کے ساتھ کیا گیا تاکہ مخصوص-HPV16 اور HIV-1 T-سیل کے مدافعتی ردعمل کی تعدد کا اندازہ لگایا جا سکے۔ HPV16 L1 VLPs کے ساتھ splenocyte stimulation کے بعد IFN- سراو کے حوالے سے Gardasil-9 اور PBS گروپس کے درمیان کوئی فرق نہیں تھا۔ L1- مخصوص IFN- سراو میں فرق بھی L1:P18I10 VLP اور Gardasil-9 گروپوں کے درمیان اہم نہیں تھے۔ ہم نے اندازہ لگایا کہ کمزور L1-مخصوص IFN- سراو کو محرک کے طور پر استعمال ہونے والے HPV16 L1 VLPs کی کم ارتکاز (2 µg/mL) سے منسوب کیا جا سکتا ہے۔ BCG.HIVA2auxo.int پرائم اور L1:P18I10 VLP کے گروپ نے IFN- سیکریٹنگ اسپلینوسائٹس کی اعلی تعدد کو فروغ دیا اور IFN- رطوبت میں نمایاں فرق دیکھے گئے جب ان چوہوں کے مقابلے میں Gardasil-9 گروپ کے ساتھ ٹیکے لگائے گئے (p {{36) }}.0103)۔ 8 میں سے 3 چوہوں (~38%) نے سب سے زیادہ L1- مخصوص IFN- جوابات حاصل کیے (شکل 7B)۔ ہمارے پچھلے مطالعات [64-66] کے مطابق اس کی وجہ BCG کی غیر مخصوص موافقت سے منسوب کی جاسکتی ہے۔ واضح پرائمنگ اثر، یہاں تک کہ جنگلی قسم کے BCG کے ذریعے بھی، rBCG مشتق کی صلاحیت کے مطابق ہے جو بعد میں آنے والی ویکسینز کے لیے طاقتور معاون کے طور پر کام کر سکتا ہے [64,65]۔ HIV-1-مخصوص T-cell کے ردعمل کے بارے میں، IFN- سپاٹ بنانے والے خلیات (SFC)/106 splenocytes کی سب سے زیادہ کُل شدت BCG.HIVA2auxo.int پرائمڈ چوہوں میں Gardasil حاصل کرنے والے چوہوں کے مقابلے میں دیکھی گئی{{54} } ویکسین یا L1:P18I10 VLPs۔ چوہوں کو BCG.HIVA کے ساتھ پرائم کیا گیا اور L1:P18I10 VLPs کے ساتھ بڑھایا گیا L1:P18I10 VLP ہومولوس پرائم بوسٹ (p=0.0268) کے ساتھ ٹیکے لگائے گئے چوہوں کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ IFN- سراو پیدا ہوا۔ اس کے علاوہ، L1:P18I10 VLPs کے ٹیکے لگائے گئے چوہوں میں ایک نمایاں طور پر زیادہ IFN- رطوبت دیکھی گئی جو چوہوں کو Gardasil-9 ویکسینز حاصل کرنے والے چوہوں کے مقابلے میں (p=0.0157) (شکل 7C)۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، IFN- سراو Gardasil-9 اور PBS گروپس میں ناقابل شناخت تھا۔ ان نتائج نے ظاہر کیا کہ (1) L1:P18I10 VLPs نے HIV-1-مخصوص T-cell کے مدافعتی ردعمل کو حاصل کیا۔ (2) L1:P18I10 VLPs نے HPV-مخصوص T-cell کے مدافعتی ردعمل کو حاصل کیا اور (3) BCG.HIVA2auxo.int L1:P18I10 VLP کے ذریعے حاصل کردہ HIV-1-مخصوص ٹی سیل مدافعتی ردعمل کو بڑھا سکتا ہے۔

Figure 7. Induction of HPV16 and HIV-1 specific T cell responses by chimeric L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A). All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Group A: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 VLPs intramuscularly (i.m.); Group B: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group C: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group D: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Splenocytes were isolated for IFN-γ ELISpot assay. T-cell immune responses to HPV16 and HIV-1 were assessed ex vivo by IFN-γ ELISpot after splenocyte stimulation with HPV16 L1 VLP and P18I10 peptide. (B, C) HPV16 L1- and HIV-1 P8I10-specific T-cell responses elicited by L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA prime combined with L1:P18I10 VLP boost. Data are shown as median ± S.D. A one-way ANOVA test was done to compare differences between groups. Ns not significant; * p < 0.05.


شکل 7. BALB/c چوہوں میں chimeric L1:P8I10 VLPs اور BCG.HIVA کے ذریعے HPV16 اور HIV-1 مخصوص T سیل ردعمل کی شمولیت۔ حفاظتی ٹیکوں کا شیڈول (A) میں دکھایا گیا ہے۔ تمام ماؤس گروپس میں مساوی صنفی تقسیم تھی (مرد n=4 اور خواتین n=4)۔ گروپ A: 10 µg L1:P18I10 VLPs کے ساتھ ہومولوگس پرائم بوسٹ امیونائزیشن (im); گروپ بی: 106 cfu rBCG کے ساتھ پرائمنگ۔ HIVA انٹراڈرمللی (id) اور 10 µg L1:P18I10 VLPs im کے ساتھ بڑھانا؛ گروپ C: Gardasil-9 کے ساتھ ہومولوگس پرائم بوسٹ ویکسینیشن جس میں 10 µg HPV16 L1 VLPs im؛ گروپ ڈی: پی بی ایس بفر کے ساتھ دو بار امیونائزیشن۔ پرائم بوسٹ وقفہ 2 ہفتوں کا تھا۔ اس ٹرائل کا اختتامی نقطہ 28 دن تھا۔ IFN-ELISpot پرکھ کے لیے Splenocytes کو الگ تھلگ کر دیا گیا تھا۔ HPV16 اور HIV-1 کے خلاف T-سیل کے مدافعتی ردعمل کا اندازہ IFN-ELISpot کے ذریعے HPV16 L1 VLP اور P18I10 پیپٹائڈ کے ساتھ اسپلینوسائٹ محرک کے بعد کیا گیا۔ (B, C) HPV16 L1- اور HIV-1 P8I10-L1:P8I10 VLPs اور BCG.HIVA پرائم L1:P18I10 VLP فروغ کے ساتھ مل کر حاصل کردہ مخصوص T-سیل ردعمل۔ ڈیٹا کو میڈین ± SD کے طور پر دکھایا گیا ہے گروپوں کے درمیان فرق کا موازنہ کرنے کے لیے ایک طرفہ ANOVA ٹیسٹ کیا گیا تھا۔ Ns اہم نہیں؛ * p <0.05۔

4. disکشن

HPV16 اور HIV-1 دونوں ہی جنسی طور پر منتقل ہونے والی بیماریاں ہیں اور فی الحال ویکسین کے بہت سے مطالعات کا مرکز ہیں۔ اگرچہ HPV پروفیلیکٹک ویکسین کو تجارتی بنا دیا گیا ہے اور HIV-1 کی منتقلی کو اینٹی ریٹرو وائرل ٹریٹمنٹ (ART) اور PrEP کے ذریعے بہت حد تک کنٹرول کیا گیا ہے، ایک موثر، محفوظ، اور سستی کیمریک HPV: دونوں وائرسوں کے خلاف HIV ویکسین کی فوری ضرورت ہے۔ اس مطالعہ میں، (1) ہم نے یہ ظاہر کیا کہ 293F اظہار کا نظام اور کرومیٹوگرافک پیوریفیکیشن کا طریقہ chimeric L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs پیدا کرنے اور پاک کرنے کے لیے قابل عمل نقطہ نظر ہو سکتا ہے۔ (2) ہم نے تصدیق کی کہ HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین کے DE لوپ میں P18I10 یا T20 پیپٹائڈز کے داخل ہونے سے وٹرو استحکام، خود اسمبلی اور chimeric HPV کی شکل پر کوئی اثر نہیں پڑا: HIV VLPs؛ (3) ترتیب وار اور تعمیری P18I10 یا T20 پیپٹائڈس جو chimeric HPV کے DE لوپس کے سامنے آتے ہیں: HIV VLPs کا پتہ اینٹی HIV-1 gp120 V3 اور 2F5 وٹرو میں اینٹی باڈیز کو بے اثر کرنے سے لگایا جا سکتا ہے۔ (4) chimeric L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs BALB/c چوہوں میں HPV لیکن کمزور HIV-1-مخصوص پابند اینٹی باڈیز کو نکال سکتے ہیں۔ مزید برآں، HPV16 L1 پروٹین میں HIV-1 P18I10 یا T20 پیپٹائڈس کے داخل ہونے سے HPV16 L1-ویوو میں مخصوص اینٹی باڈی انڈکشن پر کوئی اثر نہیں پڑا۔ (5) L1:P18I10 VLPs دونوں HPV16 اور HIV-1-مخصوص T-cell کے ردعمل کو آمادہ کر سکتے ہیں۔ (6) BCG.HIVA پرائم اور L1:P18I10 VLP بوسٹ نے BALB/c چوہوں میں L1:P18I10 VLPs ہومولوجس پرائم بوسٹ کے مقابلے میں IFN پیدا کرنے والے اسپلینوسائٹس کی سب سے زیادہ شدت کو حاصل کیا۔ ان نتائج نے rBCG اور chimeric HPV: HIV VLPs پر مبنی HIV-1 ویکسینز کی مزید ترقی کی حمایت کی۔ مجموعی طور پر، یہ مطالعہ ایک بنیادی حکمت عملی فراہم کرتا ہے جو HPV اور HIV انفیکشن کو کنٹرول کرنے کے لیے نوول chimeric VLP پر مبنی ویکسین تیار کرنے کی عالمی کوششوں کی حمایت کرنے کے قابل ہو سکتی ہے۔

اس مطالعہ میں، L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs اسی سطح کے اینٹی HPV16 L1 بائنڈنگ اینٹی باڈیز کو HPV Gardasil-9 ویکسین کے طور پر پیدا کر سکتے ہیں۔ تاہم، L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs صرف P18I10 اور T20 ایپیٹوپ مخصوص ایچ آئی وی بائنڈنگ اینٹی باڈی ردعمل کی کم سطحوں کو ظاہر کرتے ہیں۔ ہم نے قیاس کیا کہ ELISA پرکھ پلیٹوں کو بالترتیب HPV16 L1 پروٹین، HIV-1 P18I10 پیپٹائڈ، اور HIV-1 T20 پیپٹائڈ کے ساتھ لیپت ہونے کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ ہمارے L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کے ذریعہ تیار کردہ مورین اینٹی L1 اینٹی باڈیز L1 پروٹین کے متعدد پابند ایپیٹوپس کو نشانہ بنا سکتی ہیں۔ اس کے برعکس، ہمارے L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs کے ذریعے اخذ کردہ مورائن اینٹی ایچ آئی وی-1 اینٹی باڈیز صرف ایک HIV پیپٹائڈ (P18I10 یا T20) کو HPV: HIV VLPs پر نشانہ بناتے ہیں۔ نتیجتاً، اینٹی HIV-1 بائنڈنگ اینٹی باڈیز کی مجموعی زیادہ سے زیادہ OD450 قدریں اینٹی HPV16 L1 اینٹی باڈیز سے بہت کم تھیں۔

اس وجہ سے کہ ہم نے HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین DE لوپ کو HIV-1 امیونوجن کے ابتدائی اندراج کے علاقے کے طور پر منتخب کیا جس نے پچھلے مطالعہ کا حوالہ دیا جس نے چوہوں کو بوائین پیپیلوما وائرس (BPV) سے بچایا: اینٹی باڈی ردعمل [20] کو دلانے کے لئے HIV VLPs۔ یہ معلوم ہے کہ HPV L1 میجر کیپسڈ پروٹینز کی سطح سے ظاہر ہونے والے DE اور FG لوپ کے اندر واقع ایپیٹوپس غالب طور پر ویکسین سے متاثر کراس نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈیز [67] میں حصہ ڈالتے ہیں۔ مزید برآں، پچھلے مطالعات سے یہ دکھایا گیا ہے کہ BPV L1 DE لوپ میں HIV-1 MPER کا داخل کرنا جزوی طور پر غیرجانبدار اینٹی باڈیز پیدا کر سکتا ہے جو خاص طور پر HIV-1 Env [20] میں MPER کی مقامی شکل کو پہچانتے ہیں۔ تاہم، کوئی ڈیٹا نہیں دکھایا گیا ہے کہ آیا ریکومبیننٹ BPV L1:MPER VLP BPV L1 پروٹین میں HIV-1 MPER داخل کرنے کے بعد BPV کے خلاف مدافعتی اور غیرجانبداری کو متاثر کرتا ہے۔ HPV16 L1 VLPs کو HIV اینٹیجن ڈیلیوری ویکٹر کے طور پر استعمال کرتے ہوئے ہمارے مطالعے میں، ہم نے مشاہدہ کیا ہے کہ HIV-1 پیپٹائڈ داخل کرنے سے HPV L1 کی ساخت میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی ہے، اور یہ کہ chimeric HPV: HIV پروٹین اب بھی VLPs بنانے کی صلاحیت رکھتے ہیں۔ اس کے علاوہ، ہم نے HPV: HIV VLP امیدوار (ہمارا) اور منظور شدہ VLP پر مبنی HPV ویکسین (لائسنس یافتہ Gardasil-9) کے درمیان تقابلی مدافعتی ردعمل کو ظاہر کرنے کے لیے امیونو برجنگ کے تصور کو انجام دیا۔ ہمارے ڈیٹا سے پتہ چلتا ہے کہ ایچ آئی وی-1 P18I10 یا T20 پیپٹائڈ کا chimeric HPV میں داخل کرنا: HIV VLPs HPV Gardasil-9 کے مقابلے HPV16 L1-مخصوص بائنڈنگ اینٹی باڈیز کا ایک جیسا ٹائٹر نکال سکتا ہے۔ ویکسین HPV Gardasil-9 VLP ویکسین کے chimeric ورژن کے مقابلے لائسنس یافتہ HPV Gardasil-9 VLP ویکسین کے ساتھ مشاہدہ کردہ قسم کے مخصوص اینٹی HPV16 L1 بائنڈنگ اینٹی باڈیز ہمارے ڈیٹا کے مطابق تھیں۔

HPV16 L1 VLPs میں شامل زیادہ سے زیادہ HIV-1 غیر ملکی اینٹیجن کی لمبائی اور سائٹ اور نتیجے میں chimeric HPV کی وٹرو استحکام: HIV VLPs کی تصدیق چوہوں سے حفاظتی ٹیکوں سے پہلے کی جانی چاہیے۔ ہمارے موجودہ مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ HPV16 L1 پروٹین میں P18I10 یا T20 پیپٹائڈس کے داخل ہونے سے وٹرو استحکام، خود اسمبلی، اور chimeric HPV: HIV VLPs کی شکل پر کوئی اثر نہیں پڑا۔ یہ نتائج پچھلے مطالعات کے موافق تھے جو یہ بتاتے ہیں کہ BPV L1 DE لوپ ترتیب میں HIV-1 MPER ڈومین داخل کرنے سے BPV L1 کیپسڈ پروٹین کی خود ساختہ VLPs [20] کی صلاحیت کو متاثر نہیں کیا گیا۔ بنیادی طور پر، HPV L1 کیپسڈ پروٹینز کے سطح سے ظاہر ہونے والے DE اور FG لوپس کے اندر واقع ایپیٹوپس غالب طور پر L1-مخصوص کراس نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈیز [67] کو شامل کرنے میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ یہاں، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ HIV-1 P18I10 یا T20 پیپٹائڈس کو HPV16 L1 DE لوپ میں داخل کرنے سے L1-کیمرک HPV: HIV VLPs کے ذریعے چوہوں کے حفاظتی ٹیکوں کے بعد مخصوص اینٹی باڈی انڈکشن کو متاثر نہیں کیا گیا۔ اس کے علاوہ، HIV-1 P18I10 یا T20 ایپیٹوپس HPV16 DE لوپس پر chimeric HPV: HIV VLPs کا پتہ وٹرو میں پایا گیا تھا اور vivo میں امیونوجینک تھے۔ HPV16 L1 VLPs HIV-1 کی دلچسپی کی سطحی نمائش کے لیے ایک ممکنہ سہارہ تشکیل دیتے ہیں۔ اس مطالعہ میں، ہم نے اپنے chimeric HPV: HIV VLPs کی سطح پر پیش کردہ تعمیری P18I10 اور T20 پیپٹائڈ کو ظاہر کرنے کے لیے بالواسطہ ELISA انجام دیا ہے۔ مستقبل میں، مدافعتی الیکٹران مائکروسکوپی P18I10 یا T20 اینٹیجن ساختی لوکلائزیشن اور HPV: HIV VLPs کے اندر تنظیم کو ظاہر کرنے کے لیے ایک اضافی نقطہ نظر بھی ہو سکتی ہے۔

سیلف اسمبلی HPV16 L1 VLPs کے ان وٹرو استحکام کا ایک نمائندہ انڈیکس ہے۔ یہ جانا جاتا ہے کہ پی ایچ، آئنک طاقت، درجہ حرارت [52]، اور ریڈوکس ماحول سبھی HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین [53] کے ڈسلفائیڈ بانڈز سے منسلک ہیں۔ پیپیلوما وائرس VLPs پر پہلے کاموں نے L1 میجر کیپسڈ سیلف اسمبلی [68,69] کے لیے ڈسلفائیڈ بانڈز کی اہمیت کا مشورہ دیا۔ ڈسلفائڈ کی تشکیل نے ایک مناسب جیومیٹری میں L1 کیپسڈ پروٹین کے اعلی سیسٹین کی نشاندہی کی [53]۔ یہ ڈسلفائیڈ کراس لنکس 175 اور 428 (HPV16 کے لیے) باقیات کو جوڑتے ہیں جو HPV virions اور VLPs کو مستحکم کرتے ہیں [70]۔ اس مطالعے میں، ہم نے اپنے L1:P18I10 اور L1:T20 کیپسڈ پروٹین کو وٹرو میں خود سے جمع کرنے کے رجحان کو ثابت کرنے کے لیے بالواسطہ ثبوت کے طور پر بین مالیکیولر ڈسلفائیڈ کراس لنکنگ پیٹرن کا تجزیہ کیا۔ شکل 3A میں، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ پیوریفائیڈ L1:P18I10 اور L1:T20 VLPs نے اسی پی ایچ، آئنک طاقت، اور تھرمل حالات کے تحت HPV16 L1 VLPs کے طور پر اسی طرح کے بین مالیکیولر ڈسلفائیڈ کراس لنکنگ پیٹرن پیش کیے ہیں۔ شکل 3B میں، ہم نے مزید یہ ظاہر کیا کہ پیوریفائیڈ L1:P18I10 اور L1:T20 پروٹینز وٹرو میں بڑے ذرات (L1 پینٹامر MW 280 kDa سے بڑے) میں خود کو جمع کرنے کے قابل تھے۔ لہٰذا، شکل 4 میں مشاہدہ کیے گئے مورفولوجیکل سیلف اسمبلی وی ایل پی پیٹرن کے ساتھ (حالانکہ icosahedral ڈھانچہ کافی اچھا نہیں تھا)، ہم نے اپنے پیوریفائیڈ chimeric HPV کا نتیجہ اخذ کیا: HIV VLPs وٹرو میں مستحکم ہے۔ VLP استحکام کے علاوہ، بہت سے دوسرے اہم عوامل جو chimeric HPV کی مدافعتی صلاحیت کو متاثر کر سکتے ہیں: HIV VLPs پر غور کیا جانا چاہئے، جیسے VLPs کے مختلف لوپس میں امیونوجن داخل کرنے کی جگہ [71]، خوراک، پرائم بوسٹ وقفے، اور انتظامیہ کا راستہ [22] وغیرہ

HIV-1 gp120 V3 لوپ سے اخذ کردہ P18I10 پیپٹائڈز HIV سے متاثرہ خلیوں میں بڑے ہسٹو کمپیٹیبلٹی کمپلیکس (MHC-I) کلاس I مالیکیولز [26] کے ذریعے پیش کیے جاتے ہیں۔ CD8+، cytotoxic T lymphocytes (CTL)، MHC-I- محدود P18I10 اینٹیجنز کو پہچان سکتا ہے اور HIV سے متاثرہ خلیوں کو ختم کرنے کے لیے IFN- جیسے مختلف قسم کے سائٹوکائنز کو خارج کر سکتا ہے [72–75]۔ ریکومبیننٹ وائرل یا پلاسمڈ DNA میزبان خلیوں میں P18I10 پیپٹائڈز کا اظہار کرنے اور MHC-I راستے [76–79] کے ذریعے P18I10-مخصوص سیلولر ردعمل کو دلانے کے لیے ویکسین کی اچھی گاڑیاں ہیں۔ مثال کے طور پر، DNA پرائم اور موڈیفائیڈ ویکسینیا وائرس انقرہ (MVA) کا ایک مشترکہ طریقہ P18I10 ایپیٹوپ [79] کے خلاف IFN- اور CTL ردعمل کو شامل کرنے کے لیے کافی تھا۔ اس کے برعکس، خارجی P18I10 پیپٹائڈز کو MHC-I پاتھ وے [80,81] کے ذریعے CD8+ T-cells کو مؤثر طریقے سے پیش نہیں کیا جاتا ہے اور اس کے لیے مناسب معاونین [82–85] یا اینٹیجن کیریئرز کی شرکت کی ضرورت ہوتی ہے، جیسے VLPs مثال کے طور پر، مصنوعی P18I10 پیپٹائڈس کی امیونوجنیسیٹی جو ضمنی اجزاء کے ساتھ اضافی تھی T-Helper determinants [82–85] کی عدم موجودگی کی وجہ سے معمولی تھی۔ یہ پہلے بتایا گیا ہے کہ HIV-1 Gag VLPs [86]، ہیپاٹائٹس بی سطح کا اینٹیجن (HBsAg) VLPs [87]، parvovirus VP2 VLPs [88]، اور papillomavirus L1 VLPs [17–19] Vivo میں MHC-I-محدود CTL ایپیٹوپ پریزنٹیشن کے لیے ڈیلیوری ویکٹر کے طور پر کام کر سکتا ہے۔ اگرچہ VLP-حوصلہ افزائی MHC-I-محدود ٹی سیل ردعمل کا طریقہ کار ابھی تک واضح نہیں ہے، VLPs کی ذرات کی ساخت میکروفیجز یا ڈینڈریٹک خلیوں کے اینڈو سائیٹک اپٹیک کو فائدہ پہنچا سکتی ہے، اس طرح سائٹوسول تک رسائی حاصل کرتی ہے اور اس کے بعد عام MHC-I راستے میں داخل ہوتی ہے [89, 90]۔ اس کے علاوہ، MHC-I-محدود P18I10 تعین کنندہ کو MHC-II راستے [91,92] کے ذریعے CD4+ مددگار T-سیل کے ردعمل کو دلانے کے لیے مشاہدہ کیا گیا۔ ہائبرڈ BPV1 L1 VLPs کو MHC-I اور MHC-II راستوں [17,19] کے ذریعے علاج سے متعلق وائرس سے متعلق مخصوص CTL ردعمل حاصل کرنے کے لیے اینٹی جینک ایپیٹوپ کیریئرز کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے، جو وائرل انفیکشن کو کنٹرول کرنے کے لیے ویکسین ڈیزائن کے لیے ایک امید افزا حکمت عملی فراہم کرتا ہے۔ کچھ ابتدائی مطالعات نے BPV L1 VLPs کی نشاندہی بھی کی ہے جو HPV16 E7 ایپیٹوپ یا P18I10 HIV-1 gp120 V3 لوپ سے متاثرہ میوکوسل سطحوں کا اظہار کرتے ہیں اور نظامی VLP ایپیٹوپ کے ساتھ مخصوص مزاحیہ اور ٹی سیل مدافعتی [18]۔ پچھلے مطالعات کے مطابق، ہم نے ابتدائی طور پر یہ ظاہر کیا ہے کہ ہمارا چائمرک HPV: HIV (L1:P18I10) VLPs P18I10 پیپٹائڈ کے ساتھ splenocyte stimulation کے بعد BALB/c چوہوں میں HIV-مخصوص T-cell مدافعتی ردعمل پیدا کر سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، BCG.HIVA پرائمنگ نے چوہوں میں HIV-1-مخصوص T-cell کے مدافعتی ردعمل کو بڑھایا۔ تاہم، L1:P18I10 VLPs کی طرف سے پیدا ہونے والے ملٹی فنکشنل ٹی سیل مدافعتی ردعمل کو مزید امیونولوجیکل مطالعات کی ضرورت ہوگی۔

ایک سے زیادہ محفوظ شدہ CTL ایپیٹوپس کے خلاف وسیع تر CD8+ T-cell کے ردعمل HIV-1 جینیاتی تنوع پر قابو پانے اور [7,93–100] سے بچنے کے لیے فائدہ مند ہیں۔ HIV-1 T-cell immunogens کے عقلی ڈیزائن، جیسے HIVA، میں متعدد CTL ایپیٹوپس [34] کا جواب دینے کی صلاحیت ہونی چاہیے۔ ایچ آئی وی-1 ایچ آئی وی امیونوجن، جسے ڈاکٹر ٹامس ہینکے نے ڈیزائن کیا ہے، مکمل طوالت کے ایچ آئی وی-1 گیگ پروٹین پر مشتمل ہے جس میں سی ٹرمینس [34] پر P18I10 ایپیٹوپس سمیت متعدد CTL ایپیٹوپس شامل ہیں۔ ڈی این اے، ایم وی اے، اور آر بی سی جی کو ایچ آئی وی اے امیونوجن ڈیلیوری وہیکلز کے طور پر منتخب کیا گیا تھا اور ماؤس اور نان ہیومن پرائمیٹ (NHP) ماڈلز میں ہیٹرولوگس پرائم بوسٹ رجیم کا استعمال کرکے CTL ایپیٹوپ مخصوص سیلولر ردعمل کی اعلی شدت اور وسعت پیدا کی گئی تھی [34,101]۔ ہمارے پہلے کے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ BCG.HIVA پرائم MVA.HIVA کے ساتھ مل کر BALB/c چوہوں [31–33,102] میں HIV-1-مخصوص IFN پیدا کرنے والے CD8+ T-خلیات کو بڑھاتا ہے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ VLPs rBCG [29,30] یا DNA ویکسینز [103,104] کے ساتھ ہیٹرولوگس امیونائزیشن میں HIV-مخصوص سیلولر ردعمل کو بڑھانے کے لیے ایک ممکنہ بوسٹر ہو سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، HIV-1 Gag پروٹین کا اظہار کرنے والا rBCG NHP ماڈلز [29,30] میں Gag VLPs کے ساتھ فروغ دینے کے لیے T-cell کے مدافعتی نظام کو مؤثر طریقے سے پرائم کر سکتا ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، ہم نے یہ ظاہر کیا ہے کہ BCG.HIVA پرائمنگ HPV: HIV (L1:P18I10) VLPs کے ذریعے T-cell کے مدافعتی ردعمل کو بڑھا سکتی ہے۔ ہم پولی فنکشنل CD4+، CD8+، اور اس rBCG پرائم اور VLP بوسٹ رجیم کے ذریعہ تیار کردہ میموری T-سیل ردعمل کی شدت کی مزید چھان بین کریں گے۔

Cistanche deserticola-improve immunity -

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنائیں

فی الحال، ہمارا تحقیقی گروپ امید افزا rBCG کی ترقی پر توجہ مرکوز کر رہا ہے: HIV کی ویکسین جو کہ HIV-1 T-cell immunogens کا اظہار کرتی ہیں، جیسے کہ THIVconsvX اور HIVACAT (HTI) T-cell immunogen، HIV کو بہتر بنانے کے لیے-1 ویرینٹ میچ اور ٹی سیل رسپانس بریڈتھ۔ دوسری نسل کے HIVconsvX امیونوجینز کو گروپ M کے محفوظ علاقوں کی نئی تعریف کرتے ہوئے اور عالمی مختلف حالتوں میں ویکسین میں ممکنہ 9-میر T-cell epitopes کے میچ کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے دو ہموار موزیک ڈیزائن کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیا گیا تھا [64]۔ HTI امیونوجن کو T-cell کے اہداف کا احاطہ کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا تھا جس کے خلاف T-cell کے ردعمل بنیادی طور پر HIV-1-متاثرہ افراد میں کم HIV-1 وائرل بوجھ [65,66] میں دیکھے جاتے ہیں۔ چونکہ پیپیلوما VLPs کو ایک سے زیادہ CTL ایپیٹوپ کیریئرز ثابت کیا گیا ہے [17]، ہمارا مقصد chimeric HPV16 L1 VLPs بنانا ہے جس میں ایک سے زیادہ محفوظ HIV-1 CTL ایپیٹوپس کو rBCG کے ساتھ ملا کر ThivconsvX یا HTIOgr to imduce میں T-munenser کو ظاہر کیا جائے۔ HIV کے خلاف CTL مدافعتی ردعمل-1۔ اعلی کثافت اور ایچ آئی وی-1 سی ٹی ایل ایپیٹوپ کی متعدد کاپیاں چیمرک HPV پر پیش کی گئی ہیں: HIV VLPs مدافعتی نظام میں اینٹیجن کی ترسیل کو بہتر بنا سکتے ہیں اور CTL ردعمل کی اعلی تعدد کو آمادہ کر سکتے ہیں۔ اس کے برعکس، recombinant BCG Vivo میں سست نقل کی وجہ سے CTL ردعمل کی کم تعدد پیدا کرنے کا زیادہ امکان ہے۔ چونکہ BCG کا T خلیات کی تفریق پر ایک الگ اثر ہے، جس کا مطلب ہے کہ BCG CD8+ T-helper خلیات [105] کی شرکت کے ذریعے CD8+ T خلیات کی میموری کو متاثر کر سکتا ہے، یہ امیونوجینک خاصیت ہیٹرولوگس پرائم بوسٹ ریگیمینز میں BCG کو پرائمنگ ایجنٹ کے طور پر موزوں بنا سکتا ہے۔ اس طرح، ہم نے توقع کی تھی کہ ہمارے HPV: HIV VLPs HIV-1 CTL ردعمل کی وسعت اور وسعت کو بڑھانے کے لیے ایک امید افزا بوسٹر ثابت ہو سکتے ہیں جب ایک ریکومبیننٹ BCG کو ظاہر کرنے والے ناول HIV-1 T-cell immunogen .

T20 پیپٹائڈ ایک انتہائی محفوظ لکیری ایپیٹوپ 2F5 (ELDKWA) پر مشتمل ہے۔ طویل مدتی ایچ آئی وی سے متاثرہ مریضوں سے جمع کردہ 2F5 اینٹی باڈی میں وسیع پیمانے پر افادیت کو غیر جانبدار کرنے کی اطلاع دی گئی ہے [106,107]۔ جی پی 41 کے ایم پی ای آر کو کمزور امیونوجینک سمجھا جاتا ہے، شاید اس کا تعلق سیلولر اور وائرل فاسفولیپڈ بائلیئر [108] کے قریب ہونے سے ہے۔ لپڈ ماحول میں MPER پیش کرنے والے DNA ویکٹر کا استعمال gp41-مخصوص nAbs [109–111] کو دلانے کے لیے فائدہ مند ہے۔ مثال کے طور پر، ایچ آئی وی-1 ٹی20-انکوڈنگ ڈی این اے ویکسین، جو ڈاکٹر بریٹا وہرین کی طرف سے ڈیزائن کی گئی ہیں، کو کراس کلیڈ نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈی (این اے بی) ردعمل [109] کی حوصلہ افزائی کے لیے دکھایا گیا ہے۔ اس کے برعکس، پیپٹائڈ یا سبونائٹ ویکسین کی حکمت عملیوں کا استعمال کرتے ہوئے nAbs کو gp41 کو نشانہ بنانے کی بہت سی ابتدائی کوششیں ناکام ہوئیں [112-116]۔ حال ہی میں، کچھ مطالعات نے اشارہ کیا کہ BPV L1 VLPs کا اظہار 2F5 ایپیٹوپ یا MPER کا HIV-1 gp41 induced 2F5-چوہوں میں مخصوص اینٹی باڈیز کا نتیجہ کراس کلیڈ نیوٹرلائزیشن [20,21] میں ہوا۔ اسی طرح کا امیونوجنیسیٹی پیٹرن پایا گیا جب ہیپاٹائٹس بی سطح کے اینٹیجن (HBsAg) کو HIV-1 2F5 ایپیٹوپ یا MPER [59,117–119] کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ یہاں، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ ہمارے chimeric HPV16 L1 VLP میں HIV-1 T20 اور P18I10 پیپٹائڈ کی پیشکش HIV-1 اور HPV16 کے خلاف اینٹی باڈی ردعمل پیدا کر سکتی ہے۔ تعمیراتی سہاروں پر مستحکم ایپیٹوپس کو بے اثر کرنا، جیسے HIV-1 فنکشنل اسپائکس یا VLPs، وسیع غیرجانبدار اینٹی باڈیز (bnAbs) [93] کو حاصل کرنے کے لیے B-cell امیونوجن ڈیزائن کا مرکزی دھارا ہو سکتا ہے۔ تاہم، زیادہ تر ناول بی این اے بی ایپیٹوپس (تقریباً 90%) غیر متواتر اور تشکیل شدہ علاقے ہیں جو 3-جہتی ترتیبوں میں اکٹھے کیے گئے ہیں [120]۔ اگرچہ ایک پروٹین اسکافولڈ پر منقطع ایپیٹوپس کی پیشین گوئی کمپیوٹیشنل ماڈلنگ [121] کے ذریعہ کی جاسکتی ہے ، لیکن ان bnAb ایپیٹوپس کو غیر لفافہ HPV16 L1 پروٹین اسکافولڈ میں سرایت کرنے کا چیلنج کیا جاسکتا ہے۔ اس کے برعکس، HIV-1 B-cell immunogens کی ایک اقلیت، جیسے HIV-1 gp41 کا MPER (2F5) یا gp120 کا V3 لوپ (P18IIB)، لکیری نیوٹرلائزنگ ایپیٹوپس پر مشتمل ہوتا ہے اور اس کے لیے موزوں ہو سکتا ہے۔ HPV: HIV پروٹین ریڑھ کی ہڈی۔ لہٰذا، ہم نے لکیری 2F5 نیوٹرلائزنگ ایپیٹوپ کو منتخب کیا جو کہ HIV-1 MPER کے ایک توسیعی T20 پیپٹائڈ میں شامل ہے - ہیلکس کی تشکیل [122] کے لیے سازگار ساخت کے لحاظ سے۔ T20 پیپٹائڈس کو L1 کیپسڈ اسکافولڈز پر فیوز اور مستحکم کیا جا سکتا ہے تاکہ اینٹی باڈی کے ردعمل کو بے اثر کیا جا سکے اگر 2F5 ایپیٹوپ کی مقامی ترتیب پیش کی جا سکے۔ اس مطالعہ میں، ہم نے پایا کہ 2F5 nAbs chimeric HPV: HIV (L1:T20) VLPs ان وٹرو کے پابند تھے۔ مزید برآں، L1:T20 VLPs BALB/c چوہوں میں T20-مخصوص پابند اینٹی باڈیز بھی پیدا کر سکتے ہیں۔ اس بات کے بڑھتے ہوئے ثبوت تھے کہ HIV-1 فیوژن انحیبیٹری (T20) پیپٹائڈ سے متاثرہ اینٹی باڈیز میں اینٹی ایچ آئی وی-1 فیوژن پیپٹائڈ اینفیوورٹائیڈ جیسی خصوصیات ہیں جو کہ ہائیڈروفوبک ٹرانس میمبرین T20 باقیات کو باندھنے کے لیے جی پی 41 کے MPER میں ایچ آئی وی-1 فیوژن اور وائرل کنٹرول میں شراکت [109,123,124]۔ ہمارے پچھلے جائزوں کے مطابق، ایچ پی وی اور ایچ آئی وی کے لیے مخصوص نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈی اور CTL ردعمل کو آمادہ کرنے کے لیے چیمرک VLP پر مبنی ویکسین کے عقلی ڈیزائن کو ہمیشہ امیونوجن کے انتخاب، اینٹیجن ڈیلیوری ویکٹرز، اور پرائم بوسٹ رجیم کے لحاظ سے غور کرنے کی ضرورت ہوگی۔ آخر میں، اس مطالعہ نے ایک متبادل ممالیہ سیل پر مبنی اظہار کا پلیٹ فارم اور ایک قابل توسیع کرومیٹوگرافک پیوریفیکیشن طریقہ دکھایا ہے جو chimeric HPV: HIV VLPs کو انجینئر کرتا ہے۔ ہم سمجھتے ہیں کہ ہمارے نئے صاف کرنے کے طریقے اینٹی جینک HPV کی بازیابی میں مدد کریں گے: ممالیہ جانوروں کے خلیوں سے HIV VLPs جس کا مقصد وقت، لاگت اور محنت کو کم کرنا ہے جبکہ صنعتی پیداوار کی صلاحیت میں اضافہ کرنا ہے۔ ایچ آئی وی-1 پیپٹائڈ اینٹیجن کو لے جانے کے لیے ڈیلیوری پلیٹ فارم کیونکہ HPV16 L1 کیپسڈ پروٹین کے DE لوپ میں P18I10 یا T20 پیپٹائڈز کے داخل ہونے سے chimeric HPV کی وٹرو استحکام، خود اسمبلی، اور مورفولوجی پر کوئی اثر نہیں پڑا: HIV VLPs اور کیا Vivo میں HPV16 L{107}}مخصوص اینٹی باڈی انڈکشن میں مداخلت نہ کریں۔ دوسری طرف، chimeric HPV: HIV VLPs دونوں وائرسوں کے خلاف HPV16 اور HIV کے مخصوص B اور T-سیل کے مدافعتی ردعمل کو ظاہر کر سکتے ہیں۔ اس رپورٹ نے HIV-1 ویکسین تیار کرنے کے امکان کو دریافت کیا ہے جس کی بنیاد پر ریکومبیننٹ BCG ظاہر کرنے والے HIV-1 امیونوجنز اور HPV: HIV VLPs، جو بچپن کے HIV-1 امیونائزیشن کے لیے استعمال کیے جا سکتے ہیں۔ چونکہ HPV16 اور HIV-1 کے خلاف ایک موثر chimeric ویکسین کی تیاری اب بھی ایک چیلنج ہے، اس لیے یہ کام ناول chimeric HPV کی ترقی کی طرف ایک قدم کا حصہ ہے: HIV VLP پر مبنی ویکسین پلیٹ فارم HPV16 اور HIV کو کنٹرول کرنے کے لیے{118 }} انفیکشن، جس کی ترقی پذیر اور صنعتی ممالک میں فوری ضرورت ہے۔

حوالہ جات

1. UNAIDS کے عالمی HIV & AIDS کے اعدادوشمار-2018 فیکٹ شیٹ۔ 2019. آن لائن دستیاب: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (15 جون 2020 کو رسائی)۔

2. بیٹن، JM PrEP برائے HIV: ثبوت کے لیے گریڈ A لیکن اثر کے لیے زیر التواء۔ نیٹ Rev. Urol. 2019، 16، 570–571۔ [کراس ریف]

3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum، P.؛ نیتایافن، ایس. کیو کنگوال، جے۔ چیو، جے؛ پیرس، آر. پریمسری، این. Namwat, C.; ڈی سوزا، ایم. ایڈمز، ای. ET رحمہ اللہ تعالی. تھائی لینڈ میں HIV-1 انفیکشن کو روکنے کے لیے ALVAC اور AIDSVAX کے ساتھ ویکسینیشن۔ این انگلش جے میڈ 2009، 361، 2209–2220۔ [کراس ریف]

4. Ng'uni، T.؛ چسارا، سی۔ Ndhlovu، ZM ایچ آئی وی ویکسین کی ترقی میں اہم سائنسی رکاوٹیں: تاریخی تناظر اور مستقبل کی سمت۔ سامنے والا۔ امیونول۔ 2020، 11، 590780۔ [کراس ریف]

5. رابنسن، ایچ ایل ایچ آئی وی/ایڈز ویکسین: 2018۔ کلین۔ فارماکول۔ وہاں 2018، 104، 1062–1073۔ [کراس ریف]

6. وانگ، Q.؛ Zhang, L. HIV-1 انفیکشن کے خلاف وسیع پیمانے پر اینٹی باڈیز اور ویکسین ڈیزائن کو بے اثر کرنا۔ سامنے والا۔ میڈ. 2020، 14، 30-42۔ [کراس ریف]

7. کولنز، ڈی آر؛ Gaiha, GD; واکر، BD CD8+ T خلیات HIV کنٹرول، علاج اور روک تھام میں۔ نیٹ Rev. Immunol. 2020، 20، 471–482۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

8. پولارڈ، اے جے؛ بیجکر، EM ویکسینولوجی کے لیے ایک گائیڈ: بنیادی اصولوں سے نئی ترقی تک۔ نیٹ Rev. Immunol. 2021، 21، 83-100۔ [کراس ریف]

9. شاپیرو، SZ ایک HIV ویکسین تیار کرنے کی کوششوں سے ویکسینولوجی کی عمومی تحقیق کے لیے اسباق۔ ویکسین 2019، 37، 3400–3408۔ [کراس ریف]

10. احمد، HG؛ Bensumaidea, SH; الشمری، ایف ڈی؛ الینازی، ایف ایس ایچ؛ المطلق، بی اے؛ الترکستانی، ایم زیڈ؛ Aladani، IA سروائیکل کینسر کے یمنی مریضوں میں ہیومن پیپیلوما وائرس ذیلی قسم 16 اور 18 کا پھیلاؤ۔ ایشین پیسیفک جے کینسر پریو۔ 2017، 18، 1543–1548۔ [کراس ریف]

11. Olcese, VA; چن، وائی؛ Schlegel, R.; یوآن، H. HPV16 L1 لوپ ڈومینز کی خصوصیت ایک قسم کے مخصوص، کنفرمیشنل ایپیٹوپ کی تشکیل میں۔ بی ایم سی مائکروبیول۔ 2004، 4، 29۔ [کراس ریف]

12. Dupuy، C.؛ بوزونی گیٹ، ڈی۔ Touze, A.; لی کین، پی. بوٹ، ڈی. Coursaget، P. HPV 16 L1 وائرس نما ذرات کے ذریعے چوہوں میں خلیے کی ثالثی کی قوت مدافعت۔ مائکروب پیتھوگ 1997، 22، 219-225۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

13. شلر، جے؛ لوئی، ڈی. HPV پروفیلیکٹک ویکسین کی اعلی طاقت کی وضاحت۔ ویکسین 2018، 36، 4768–4773۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

14. مارکووٹز، ایل ای؛ شلر، جے ٹی ہیومن پیپیلوما وائرس ویکسینز۔ J. انفیکٹ۔ ڈس 2021, 224, S367–S378۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

15. چن، سی ڈبلیو؛ ساوبی، این. Joseph-Munné، J. وائرس نما ذرہ پر مبنی HIV-1 ویکسین کے تصورات ڈیزائن کریں۔ سامنے والا۔ امیونول۔ 2020، 11، 573157۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

16. ایٹو، وائی۔ ساوبی، این. فیرر، پی. جوزف، جے انسانی پیپیلوما وائرس اور ایچ آئی وی کے لیے چائمرک وائرس نما پارٹیکل پر مبنی ویکسین ڈیزائن کرنا: سیکھے گئے سبق۔ ایڈز Rev. 2019, 21, 218–232۔ [کراس ریف]

17. لیو، ڈبلیو جے؛ لیو، ایکس ایس؛ Zhao, KN; لیگیٹ، جی آر؛ فریزر، ایک سے زیادہ سائٹوٹوکسک ٹی سیل ایپیٹوپس کی ترسیل کے لیے IH Papillomavirus وائرس نما ذرات۔ وائرولوجی 2000، 273، 374–382۔ [کراس ریف]

18. لیو، ایکس ایس؛ عبدالجبار، I.؛ کیوئ، وائی ایم؛ فریزر، آئی ایچ؛ Zhou, J. پیپیلوما وائرس جیسے ذرات کے ساتھ میوکوسل امیونائزیشن چوہوں میں سیسٹیمیٹک اور میوکوسل مدافعتی پیدا کرتی ہے۔ وائرولوجی 1998، 252، 39–45۔ [کراس ریف]

19. پینگ، ایس. فریزر، آئی ایچ؛ فرنینڈو، جی جے؛ Zhou, J. Papillomavirus وائرس نما ذرات MHC کلاس I کے راستے میں طے شدہ CTL ایپیٹوپس پہنچا سکتے ہیں۔ وائرولوجی 1998، 240، 147–157۔ [کراس ریف]

20. Zhai, Y.; Zhong، Z.؛ Zariffard, M.; سپیئر، جی ٹی؛ Qiao, L. بووائن پیپیلوما وائرس نما ذرات جو HIV-1 gp41 کی حوصلہ افزائی شدہ میوکوسل اور سیسٹیمیٹک اینٹی باڈیز کے جھلی-قریبی بیرونی علاقے سے محفوظ شدہ ایپیٹوپس پیش کرتے ہیں۔ ویکسین 2013، 31، 5422–5429۔ [کراس ریف]

21. ژانگ، ایچ. ہوانگ، Y. فیاد، آر. سپیئر، جی ٹی؛ Qiao, L. بوائین پیپیلوما وائرس-HIV-1 gp41 چائمرک وائرس نما ذرات کے ساتھ زبانی امیونائزیشن کے ذریعے ہیومن امیونو وائرس ٹائپ 1 (HIV-1) کے خلاف میوکوسل اور سیسٹیمیٹک نیوٹرلائزنگ اینٹی باڈیز کی شمولیت۔ جے ویرول۔ 2004، 78، 8342–8348۔ [کراس ریف]

22. Xiao, SL; وین، جے ایل؛ کانگ، NZ؛ یو، ایچ ایل؛ لیگیٹ، جی؛ فریزر، chimeric BPV1 VLP کی انتظامیہ کا IH روٹ حوصلہ افزائی مدافعتی ردعمل کے کردار کا تعین کرتا ہے۔ امیونول۔ سیل بائیول۔ 2002، 80، 21-29۔ [کراس ریف]

23. Kirnbauer, R.; Taub، JANET؛ گرین اسٹون، ہیدر؛ روڈن، رچرڈ؛ Dürst, M.; Gissmann, L.; لووی، ڈی آر؛ شلر، JT Efficient Self-Sembly of Human Papillomavirus Type 16 LI اور L1-L2 میں وائرس جیسے ذرات۔ جے ویرول۔ 1993، 67، 6929–6936۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

24. زاؤ، ق. پوٹر، CS؛ کیراگر، بی؛ لینڈر، جی؛ سویرین، جے؛ ٹاؤن، وی. ابراہیم، ڈی. ڈنکن، پی. واشاباغ، میگاواٹ؛ سیٹرین، کرائیو ٹرانسمیشن الیکٹران مائیکروسکوپی کے ذریعے GARDASIL® میں وائرس نما ذرات کی RD خصوصیت۔ ہم امیونودر ویکسینز۔ 2014، 10، 734–739۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

25. اچور، اے. Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; زگوری، جے ایف؛ مکرم، ج. ولر، اے. Beix, F.; برنی، اے. Zagury, D. HIV-1 gp160 اینٹیجن اور مصنوعی P18IIIB پیپٹائڈ کے لیے مخصوص سائٹوٹوکسک ٹی لیمفوسائٹس ایک HLA-A11- حفاظتی ٹیکوں والے فرد میں۔ ایڈز ریس ہم ریٹرو وائرس 1994، 10، 19-25۔ [کراس ریف]

26. ناکاگاوا، وائی۔ کیکوچی، ایچ. تاکاہاشی، H. P18-I10-کا استعمال کرتے ہوئے TCR اور پیپٹائڈ/MHC تعامل کا مالیکیولر تجزیہ ایک واحد D-امینو ایسڈ متبادل کے ساتھ پیپٹائڈس حاصل کیا۔ بائیوفیس۔ J. 2007, 92, 2570-2582. [کراس ریف]

27. کیو، زیڈ؛ چونگ، ایچ. یاو، ایکس؛ Su, Y.; Cui, S.; وہ، Y. HIV کے N-trimer پر ذیلی جیب کی شناخت اور خصوصیت-1 Gp41: وائرل انٹری اور منشیات کے ہدف کے لیے مضمرات۔ ایڈز 2015، 29، 1015–1024۔ [کراس ریف]

28. پیٹرز، بی ایس؛ Cheingsong-Popov, R.; کالو، ڈی. فاکسال، آر. پٹو، جی؛ Hodgkin, K.; ویبر، جے این ایک پائلٹ مرحلہ II کا مطالعہ HIV p17/p24 کی حفاظت اور مدافعتی صلاحیت: VLP (p24-VLP) غیر علامتی HIV سیروپازیٹو مضامین میں۔ J. انفیکٹ۔ 1997، 35، 231–235۔ [کراس ریف]

29. Chege, GK; برگر، WA؛ Stutz, H.; میئرز، اے ای؛ چیپ مین، آر. Kiravu, A.; بنجن، آر. شیفرڈ، ای جی؛ جیکبز، ڈبلیو آر؛ Rybicki، EP؛ ET رحمہ اللہ تعالی. ایک غیر انسانی پرائمیٹ ماڈل میں آکسوٹروفک مائکوبیکٹیریم بووس BCG-VLP پرائم-بوسٹ ایچ آئی وی ویکسین کے امیدوار کے لیے مضبوط استثنیٰ۔ جے ویرول۔ 2013، 87، 5151–5160۔ [کراس ریف]

30. Chege, GK; تھامس، آر. شیفرڈ، ای جی؛ میئرز، اے. بورن، ڈبلیو. ولیمسن، سی. میکلین، جے؛ گرے، سی ایم؛ Rybicki، EP؛ ولیمسن، AL ایچ آئی وی کی قسم 1 ذیلی قسم سی پر مبنی ریکومبیننٹ BCG اور Pr55gag وائرس جیسی پارٹیکل ویکسین کا استعمال کرتے ہوئے ایک اہم فروغ دینے والے حفاظتی ٹیکوں کا طریقہ کامیابی کے ساتھ بابونوں میں گیگ سے متعلق مخصوص ردعمل نکالتا ہے۔ ویکسین 2009، 27، 4857–4866۔ [کراس ریف]

31. جوزف، جے؛ ساوبی، این. آئی ایم، ای جے؛ فرنانڈیز-لوریس، آر. گل، او۔ کارڈونا، پی جے؛ گیٹیل، جے ایم؛ ہانکے، ٹی. نوزائیدہ چوہوں کو BCG.HIVA222 + MVA.HIVA کے ساتھ ویکسینیشن HIV-1-مخصوص مدافعتی ردعمل کو بڑھاتی ہے: عمر اور حفاظتی ٹیکوں کے راستوں کا اثر۔ کلین دیو امیونول۔ 2011، 2011، 516219۔ [کراس ریف]

32. صاوبی، این. Gea-Mallorquí, E.; فیرر، پی. Hurtado, C.; Sánchez-ubeda, S.; Eto, Y.; گیٹیل، جے ایم؛ ہانکے، ٹی. جوزف، جے انجینئرنگ ایچ آئی وی-ٹی بی پیڈیاٹرک ویکسین کے لیے نئی مائکوبیکٹیریل ویکسین ڈیزائن جو BCG کے لائسین آکسوٹروف کے ذریعے ویکٹر کی گئی ہے۔ مول وہاں طریقے کلین۔ دیو 2014، 1، 14017۔ [کراس ریف]

33. مہنت، اے. ساوبی، این. Eto, Y.; گٹارٹ، این. گیٹیل، جے ایم؛ ہانکے، ٹی. Joseph, J. BCG.HIVA2auxo.int کی پری کلینیکل ڈیولپمنٹ، ایچ آئی وی-ٹی بی پیڈیاٹرک ویکسین کے لیے ایک انٹیگریٹیو ایکسپریشن ویکٹر کی مدد کرتا ہے۔ استحکام اور مخصوص HIV-1 T-cell کی قوت مدافعت میں اضافہ۔ ہم امیونودر ویکسینز۔ 2017، 13، 1798–1810۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

34. ہانکے، ٹی. McMichael, AJ کینیا میں ایک سال کے لیے ایک تجرباتی HIV-1 ویکسین کا ڈیزائن اور تعمیر-2000 کلینیکل ٹرائل۔ نیٹ میڈ. 2000، 6، 951–955۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

35. ڈوروچر، وائی. Perret, S.; کامن، A. معطلی سے بڑھنے والے انسانی 293-EBNA1 خلیات کی عارضی منتقلی کے ذریعے اعلی سطحی اور اعلی تھرو پٹ ریکومبیننٹ پروٹین کی پیداوار۔ نیوکلک ایسڈ Res. 2002، 30، E9۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

36. کم، ایچ جے؛ کم، ایس وائی؛ لم، ایس جے؛ کم، جے وائی؛ لی، ایس جے؛ کم، HJ Saccharomyces cerevisiae سے انسانی پیپیلوما وائرس کی قسم 16 L1 پروٹین کی ایک قدمی کرومیٹوگرافک پیوریفیکیشن۔ Protein Expr. پیوریف۔ 2010، 70، 68–74۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

37. ایٹو، وائی۔ ساوبی، این. فیرر، پی. Joseph-Munné, J. pichia pastoris میں chimeric HPV-HIV پروٹین L1P18 کا اظہار؛ وائرس جیسے ذرات کی پاکیزگی اور خصوصیت۔ فارماسیوٹکس 2021، 13، 1967۔ [کراس ریف]

38. جی ای۔ کیپٹو ٹی ایم کور 700 اور کیپٹو کیو امپریس کا استعمال انسانی پیپیلوما وائرس جیسے ذرات کو صاف کرنے میں۔ جے ایشیا کا فارم۔ بایوفارم۔ Ind. 2014, 1–4.

39. میک لین، سی ایس؛ چرچر، ایم جے؛ مینکے، جے؛ اسمتھ، جی ایل؛ Higgins, G.; اسٹینلے، ایم؛ منسن، AC پروڈکشن اور ریکومبیننٹ ویکسینیا وائرس کا استعمال کرتے ہوئے ہیومن پیپیلوما وائرس ٹائپ 16 میں مونوکلونل اینٹی باڈی کی خصوصیت۔ جے کلین پاتھول۔ 1990، 43، 488–492۔ [کراس ریف]

40. Merck Canada Inc. پروڈکٹ مونوگراف Gardasil®۔ پیداوار مونوگر مونوپریل پروڈکٹ مونوگر 2015، 1–71۔

41. اچور، اے. پرسن، K.؛ حارث، RA؛ سنڈ بیک، جے؛ سینٹ مین، سی ایل؛ Lindqvist, Y.; شنائیڈز، جی۔ Kärre, K. H-2D(d) MHC کلاس I کا کرسٹل ڈھانچہ 2.4 Å ریزولوشن پر HIV-1- ماخوذ پیپٹائڈ P18-110 کے ساتھ پیچیدہ: T سیل اور NK سیل کے لیے مضمرات پہچان استثنیٰ 1998، 9، 199–208۔ [کراس ریف]

42. پینگ، ڈبلیو. ٹام، ایس سی؛ ژینگ، YT کرنٹ پیپٹائڈ HIV قسم-1 فیوژن روکنے والے۔ اینٹی ویر. کیم کیمودر 2009، 20۔ [کراس ریف]

43. چن، ایکس ایس؛ گارسیا، آر ایل؛ گولڈبرگ، I.؛ کیسینی، جی؛ ہیریسن، انسانی پیپیلوما وائرس کے L1 پروٹین سے جمع چھوٹے وائرس نما ذرات کا SC ڈھانچہ 16. Mol. سیل 2000، 5، 557–567۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

44. دن، شام؛ Weisberg, AS; تھامسن، سی ڈی؛ ہیوز، ایم ایم؛ Pang, YY; لووی، ڈی آر؛ شلر، جے ٹی ہیومن پیپیلوما وائرس 16 کیپسڈز انفیکشن کے دوران نیوکلیئر انٹری میں ثالثی کرتے ہیں۔ جے ویرول۔ 2019، 93، ای00454-19۔ [کراس ریف]

45. چاؤ، جے؛ دروازہ، جے. سورج، XY؛ کرافورڈ، ایل وی؛ میک لین، سی ایس؛ فریزر، IH انسانی پیپیلوما وائرس قسم 16 L1 پروٹین کے جوہری لوکلائزیشن سگنل کی شناخت۔ وائرولوجی 1991، 185، 625–632۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

46. ​​Vlps, A.; مڈلبرگ، اے پی جے؛ Lua، LHL وائرس نما پارٹیکل بائیو پروسیسنگ: چیلنجز اور مواقع۔ فارم۔ بائیو پروسیس۔ 2013، 1، 407–409۔

47. بوسرگین، ایل. Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. ہیپران سلفیٹ ریسیپٹر کے ذریعے ہدف کے خلیات میں جین کی منتقلی میں ثالثی کے لیے انسانی پیپیلوما وائرس قسم 16 کیپسڈ پروٹین کے مثبت چارج شدہ سلسلے کافی ہیں۔ جے جنرل ویرول 2003، 84، 157–164۔ [کراس ریف]

48. ساساگاوا، ٹی. پشکو، پی. سٹیرز، جی. Gschmeissner, SE; ناصر حاجی باغیری، ایم اے؛ فنچ، جے؛ کرافورڈ، ایل. Tommasino، M. انسانی پیپیلوما وائرس ٹائپ 6 اور ٹائپ 16 کے وائرس نما ذرات کی ترکیب اور انشقاق خمیر Schizosaccharomyces pombe میں۔ وائرولوجی 1995، 206، 126-135۔ [کراس ریف]

49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher، P.؛ ولمٹزر، ایل۔ مولر، ایم. ٹرانسجینک پودوں میں ہیومن پیپیلوما وائرس کی قسم 16 وائرس جیسے ذرات کی پیداوار۔ جے ویرول۔ 2003، 77، 9211–9220۔ [کراس ریف]

50. زہین، ایم. جوہ، جے؛ کھنال، ایس. بھوسی، اے. میسن، ایچ. وارزیچا، ایچ. گھم، ایس جے؛ ملر، ڈی ایم؛ متوبہ، این۔ جینسن، AB تمباکو کے پتوں سے HPV16 L1 پروٹین اور VLPs کی توسیع پذیر پیداوار۔ PLOS ONE 2016, 11, e0160995۔ [کراس ریف]

51. آئرس، کے اے؛ Cianciarullo, AM; کارنیرو، ایس ایم؛ ولا، ایل ایل؛ بوکارڈو، ای. Pérez-Martinez, C.; پیریز-آریلانو، I.؛ اولیویرا، ایم ایل ایس؛ ہو، PL ہیومن پیپیلوما وائرس ٹائپ 16 L1 وائرس نما ذرات کو دوبارہ پیدا کرنے والے لییکٹوباسیلس کیسی سیلز کے ذریعے۔ اپل ماحولیات۔ مائکروبیول 2006، 72، 745–752۔ [کراس ریف]

52. شینک-ریٹزلف، ایم ایل؛ زاؤ، ق. اینڈرسن، سی. ہیم، ایم؛ ہائی، K.؛ Nguyen، M.؛ وانگ، ایف. وانگ، این. وانگ، بی؛ وانگ، وائی؛ ET رحمہ اللہ تعالی. Gardasil® کے تھرمل استحکام کا اندازہ۔ ہم ویکسین. 2006، 2، 147–154۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

53. مکھرجی، ایس. تھورسٹینسن، ایم وی؛ جانسٹن، ایل بی؛ ڈی فلپس، PA؛ Zlotnick, A. انسانی پیپیلوما وائرس 16 وائرس جیسے ذرات کی ان وٹرو اسمبلی کی مقداری تفصیل۔ جے مول بائول 2008، 381، 229–237۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

54. McCarthy، MP؛ سفید، WI؛ پامر ہل، ایف۔ Koenig, S.; سوزیچ، جے اے کوانٹیٹیٹو ڈس اسمبل اور ہیومن پیپیلوما وائرس کی قسم 11 وائرس نما ذرات ان وٹرو میں۔ جے ویرول۔ 1998، 72، 32–41۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

55. Kirnbauer, R.; بوائے، ایف۔ چینگ، این. لووی، ڈی آر؛ شلر، JT Papillomavirus L1 میجر کیپسڈ پروٹین خود کو وائرس جیسے ذرات میں جمع کرتا ہے جو انتہائی امیونوجینک ہوتے ہیں۔ پروک ناٹل اکاد۔ سائنس USA 1992, 88, 12180-12184. [کراس ریف]

56. پٹیل، ایم سی؛ پاٹکر، کے کے؛ باسو، اے. موہن داس، کے ایم؛ Mukhopadhyaya, R. امیونوجینک انسانی پیپیلوما وائرس-16 بڑے کیپسڈ پروٹین سے اخذ کردہ وائرس نما ذرات کی پیداوار۔ بھارتی جے میڈ Res. 2009، 130، 213–218۔

57. ش، ایل. سانیال، جی؛ نی، اے. لوو، زیڈ؛ Doshna, S.; وانگ، بی؛ گراہم، TL؛ وانگ، این. وولکن، ڈی بی غیر آئنک سرفیکٹینٹس کے ذریعے انسانی پیپیلوما وائرس جیسے ذرات کا استحکام۔ جے فارم۔ سائنس 2005، 94، 1538-1551۔ [کراس ریف]

58. کارٹر، جے جے؛ Wipf, GC; بینکی، ایس ایف؛ کرسٹینسن، این ڈی؛ گیلوے، DA انسانی پیپیلوما وائرس کی قسم کی شناخت 16-میجر کیپسڈ پروٹین L1 کے سی ٹرمینل بازو پر مخصوص ایپیٹوپ۔ جے ویرول۔ 2003، 77، 11625–11632۔ [کراس ریف]

59. وان برون، اے. برانڈ، ایم؛ Reichhuber, C.; Morys-Wortmann، C.؛ Deinhardt, F.; Schdelt, F. HIV-I کا پرنسپل نیوٹرلائزنگ ڈومین انتہائی امیونوجینک ہے جب ہیپاٹائٹس بی کے بنیادی ذرات کی سطح پر ظاہر ہوتا ہے۔ ویکسین 1993، 11، 817-824۔ [کراس ریف]

60. ڈینیسن، ایس ایم؛ انستی، K.؛ Searce, RM; سدرلینڈ، ایل۔ پارکس، آر. زیا، ایس ایم؛ لیاو، ایچ-ایکس؛ گورنی، ایم کے؛ Zolla-Pazner, S.; ہینس، بی ایف؛ ET رحمہ اللہ تعالی. HIV کو غیرجانبدار بنانا-1 gp41 لفافہ کلسٹر II ہیومن مونوکلونل اینٹی باڈیز فاسفولیپڈز اور پروٹین آٹو اینٹیجنز کے پابند ہونے کے لیے پولی ایکٹیویٹی دکھاتے ہیں۔ جے ویرول۔ 2011، 85، 1340–1347۔ [کراس ریف]

61. ترکولا، اے. کسٹر، ایچ. Rusert، P.؛ جوس، بی۔ فشر، ایم. لیمن، سی۔ مینریک، اے. ہیوبر، ایم؛ ریہر، ایم. Oxenius, A.; ET رحمہ اللہ تعالی. انسانی بے اثر اینٹی باڈیز کی غیر فعال منتقلی کے ذریعے اینٹی ریٹرو وائرل تھراپی کے خاتمے کے بعد HIV-1 کی بحالی میں تاخیر۔ نیٹ میڈ. 2005، 11، 615-622۔ [کراس ریف]

62. شینک-ریٹزلف، ایم. وانگ، ایف. مورلی، ٹی. اینڈرسن، سی. ہیم، ایم؛ براؤن، ایم؛ Rowland, K.; پنکاری، جی؛ زورمان، جے؛ لو، آر. ET رحمہ اللہ تعالی. انسانی پیپیلوما وائرس ٹائپ 16 وائرس نما ذرات اور گارڈاسل ویکسین کے نمونوں کے لیے ماؤس کی طاقت اور ان وٹرو رشتہ دار طاقت کے درمیان تعلق۔ ہم ویکسین. 2005، 1، 191-197۔ [کراس ریف] [پب میڈ]

63. Kilpeläinen, A.; مایا ہویوس، ایم. Saubí, N.; Soto, CY; جوزف مونے، جے۔ ریکومبیننٹ مائکوبیکٹیریم بووس بی سی جی پر مبنی ایچ آئی وی ویکسین کی ترقی میں پیشرفت اور چیلنجز: اسباق سیکھے گئے۔ ماہر Rev. ویکسینز 2018، 17، 1005–1020۔ [کراس ریف] [پب میڈ]




شاید آپ یہ بھی پسند کریں