Cistanche Deserticola Polysaccharide RANKL سگنلنگ اور ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں کی پیداوار کو روکنے کے ذریعے Osteoclastogenesis اور ہڈیوں کے ریزورپشن کو کم کرتا ہے۔

رابطہ:joanna.jia@wecistanche.com/ واٹس ایپ: 008618081934791

Dezhi Song et al

آسٹیوپوروسس ایک میٹابولک بیماری ہے جس کی خصوصیت آسٹیوپینیا اور ہڈیوں کی مائیکرو اسٹرکچرل خرابی ہے۔ آسٹیو کلاسٹس بنیادی اثر کرنے والے خلیات ہیں جو ہڈیوں کے میٹرکس کو کم کرتے ہیں اور ان کا غیر معمولی فعل آسٹیوپوروسس کی نشوونما کا باعث بنتا ہے۔ سیلولر میٹابولزم کے دوران ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کا جمع ہونا آسٹیو کلاس کے پھیلاؤ اور تفریق کو فروغ دیتا ہے، اس لیے آسٹیوپوروسس میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ(CDP) اینٹی ٹیومر، اینٹی سوزش، اور اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی رکھتا ہے۔ تاہم، osteoclasts پر CDP کا اثر واضح نہیں ہے۔ اس مطالعہ میں، ٹارٹریٹ مزاحم ایسڈ فاسفیٹیس سٹیننگ، امیونو فلوروسینس، ریورس ٹرانسکرپشن پولیمریز چین ری ایکشن، اور ویسٹرن بلاٹ تجزیہ کو یہ ظاہر کرنے کے لیے استعمال کیا گیا کہ CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)osteoclastogenesis اور hydroxyapatite resorption کو روکنا۔ اس کے علاوہ، CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)Ctsk، Mmp9، اور Acp5 سمیت osteoclast مارکر جینوں کے اظہار کو بھی روکتا ہے، اور جوہری عنصر κB (RANK) اظہار کے رسیپٹر ایکٹیویٹر پر کوئی اثر نہیں پڑا۔ میکانکی تجزیوں سے پتہ چلتا ہے کہ CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)آسٹیو کلاسٹس میں RANKL ثالثی ROS کی پیداوار کو کم کرنے کے لیے اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کے اظہار کو بڑھاتا ہے اور ایکٹیویٹڈ T سیلز اور mitogen-activated protein kinase ایکٹیویشن کے جوہری عنصر کو روکتا ہے۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ CDP ضرورت سے زیادہ آسٹیو کلاس سرگرمی کی وجہ سے آسٹیوپوروسس کے علاج کے لیے امیدوار کی دوائی کی نمائندگی کر سکتی ہے۔

مطلوبہ الفاظہڈیوں کی ریزورپشن،Cistanchedeserticolaپولی سیکرائڈ، ایم اے پی کے، آسٹیو کلاس، رد عمل آکسیجن پرجاتیوں

cistanche باڈی بلڈنگ

1|تعارف

ہڈیوں کی تشکیل کے درمیان توازن، آسٹیو بلوسٹس کے ذریعے ثالثی، اور ہڈیوں کی ریزورپشن، آسٹیو کلاسٹس کے ذریعے ثالثی، ہڈیوں کے میٹابولک ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے میں اہم کردار ادا کرتی ہے (Manolagas، 2000؛ Zhu et al.، 2018)۔ جب ہڈیوں کی ریزورپشن ہڈیوں کی تشکیل سے زیادہ ہو جاتی ہے تو، آسٹیوپوروسس ہوتا ہے، جس کی خصوصیت ہڈیوں کی کمیت اور ہڈیوں کے مائیکرو اسٹرکچرل نقصان سے ہوتی ہے (Ikeda، 2008)۔ آسٹیوپوروسس بزرگ افراد اور پوسٹ مینوپاسل خواتین میں ایک عام بیماری ہے اور اس کے روگجنن کو پوری طرح سے واضح نہیں کیا گیا ہے (کوپر اینڈ میلٹن، 1992)۔ ایسٹروجن کی کمی آسٹیوپوروسس کی بنیادی وجہ ہے (مینولاگاس، اوبرائن، اور المیڈا، 2013)۔ اس کے علاوہ، رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کو نیوکلیئر فیکٹر κB ligand (RANKL) کے ریسیپٹر ایکٹیویٹر کے ذریعے حوصلہ افزائی کی جا سکتی ہے اور یہ آسٹیو کلاس کی تشکیل (Yip et al.، 2005) سے وابستہ ہیں، اور اس طرح آسٹیوپوروسس (Manolagas) کی نشوونما میں حصہ ڈال سکتے ہیں۔ 2010)۔ کچھ مطالعات سے پتہ چلا ہے کہ Nrf2-اینٹی آکسیڈینٹ کی کمی ROS کی سطح کو بڑھاتی ہے اور RANKL-حوصلہ افزائی آسٹیو کلاس تفریق (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013) کو فروغ دیتی ہے۔ لہذا، آسٹیو کلاس تفریق کے دوران ROS کی پیداوار کو کم کرنے کا اندازہ آسٹیوپوروسس کے علاج کے لیے علاج کی حکمت عملی کے طور پر کیا جانا چاہیے۔

Osteoclasts monocyte یا macrophage hematopoietic نسب سے اخذ کیے گئے ہیں اور وہ واحد ملٹی نیوکلیٹیڈ خلیے ہیں جو ہڈیوں کی ریزورپشن انجام دیتے ہیں (Teitelbaum، 2000)۔ لہذا، ہڈیوں کے میٹابولزم کی بیماریوں کے لیے موثر علاج تیار کرنے میں آسٹیو کلاس کی تشکیل سے متعلق تحقیق بہت اہمیت کی حامل ہے (لورینزو، 2017)۔ میکروفیج کالونی محرک عنصر (M-CSF) اور RANKL، جو آسٹیو بلوسٹس اور ایکٹیویٹڈ ٹی سیلز کے ذریعے تیار ہوتے ہیں، اہم سائٹوکائنز ہیں جو آسٹیو کلاسٹوجینیسیس کو منظم کرتی ہیں (کم اور کم، 2016؛ ٹیٹیلبام اور راس، 2003)۔ RANKL ایکٹیویٹڈ T خلیات (NFATc1) کے جوہری عنصر کے اظہار کو اکساتا ہے، جو کہ ایک اہم ٹرانسکرپشن عنصر ہے جو آسٹیو کلاس کی تشکیل کے دوران فعال ہوتا ہے (Ishida et al.، 2002)۔ چالو NFATc1 آسٹیو کلاس مارکر جینوں کے اظہار کو فروغ دیتا ہے جیسے ٹارٹریٹ ریزسٹنٹ ایسڈ فاسفیٹیس (TRAcP) اور کیتھیپسن K (CTSK) جو آسٹیوکلاسٹوجنیسیس اور آسٹیوکلاسٹ فنکشن کو منظم کرتے ہیں (بلقان ایٹ ال۔، 2009؛ کروٹی ایٹ ال۔ 2008)۔

Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ(CDP) کے مانسل تنوں سے الگ تھلگ ہے۔Cistancheاور مدافعتی ضابطے، اینٹی ٹیومر، اینٹی ایجنگ، اور دیگر فارماسولوجیکل اثرات رکھتے ہیں (Guo et al.، 2016؛ Jia, Guan, Guo, & Du, 2012)۔ سی ڈی پی(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)ماؤس مائکروگلیئل سیلز (BV-2 سیل؛ نان ایٹ ال۔ اس کے علاوہ، ایک phenylethanoid-rich extract (ECD) کاCistancheپٹھوں کو پہنچنے والے نقصان کو کم کرکے، لیکٹک ایسڈ کے جمع ہونے میں تاخیر، اور توانائی کے ذخیرہ کو بہتر بنا کر چوہوں کی تیراکی کی صلاحیت کو بڑھایا (Cai et al.، 2010)۔ تاہم، osteoclast فنکشن اور سرگرمی پر CDP کے اثرات نامعلوم ہیں۔

اس مطالعہ میں، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)RANKL-حوصلہ افزائی آسٹیو کلاس تفریق اور ہڈیوں کی بحالی کو روکتا ہے۔ بنیادی طریقہ کار یہ تھا کہ سی ڈی پی(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)ROS کی پیداوار کو کم کرنے کے لیے اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کے اظہار کو بڑھاتا ہے، اور پھر RANKL- ایکٹیویٹڈ NFAT اور mitogen-activated protein kinase (MAPK) سگنلنگ جھرنوں کو دباتا ہے۔ یہ نتائج تجویز کرتے ہیں کہ CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)ضرورت سے زیادہ آسٹیو کلاسٹک ہڈیوں کی ریزورپشن کی وجہ سے آسٹیوپوروسس کے علاج کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔

maca ginseng cistanche

2|مواد اور طریقے

2.1|مواد

سی ڈی پی(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)(پاکیزگی> 98 فیصد) سولاربیو (بیجنگ، چین) سے خریدی گئی تھی اور فاسفیٹ بفرڈ نمکین (پی بی ایس) میں 1 ایم ایم کے اسٹاک حراستی پر تیار کی گئی تھی۔ اینٹی باڈیز c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, فاسفوریلیٹڈ (p)-ERK, p-p38, p-JNK, اور -edtain from Sanactin کے لیے مخصوص ہیں کروز بائیو ٹیکنالوجی (سان ہوزے، سی اے)۔ V‐ATPase d2 کے لیے اینٹی باڈیز تیار کی گئیں جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (H. Feng et al.، 2009)۔ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyphenyl) -2-(4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) اور luciferase پرکھ کے نظام آسٹریلیا سے حاصل کیے گئے تھے۔ . Recombinant M-CSF R&D سسٹمز (Minneapolis, MN) سے خریدا گیا تھا۔ ریکومبیننٹ GST-rRANKL پروٹین کا اظہار اور پاک کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (Xu et al.، 2000)۔

2.2|سیل کلچر

RAW264.7 خلیات (ماؤس میکروفیج سیل) امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن (اے ٹی سی سی، ماناساس، وی اے) سے حاصل کیے گئے تھے اور 10 فیصد فیٹل بووائن سیرم کے ساتھ ضمیمہ شدہ کم سے کم ضروری میڈیم (تھرمو فشر سائنٹیفک، اسکورسبی، آسٹریلیا) میں کلچر کیا گیا تھا۔ L-glutamine، 100 U/ml penicillin، اور 100 ug/ml streptomycin (مکمل میڈیم)۔ بون میرو سے ماخوذ monocytes (BMMs) کو 6 ہفتے پرانے C57BL/6J چوہوں سے الگ تھلگ کیا گیا تھا، جنہیں یونیورسٹی آف ویسٹرن آسٹریلیا کی اینیمل ایتھکس کمیٹی (RA/3/100/1244) کے منظور کردہ طریقہ کار کے مطابق خوش کیا گیا تھا۔ لمبی ہڈیوں کو نرم بافتوں سے پاک کیا گیا تھا اور ہڈیوں کے گودے کو فیمر اور ٹیبیا سے نکالا گیا تھا، جسے پھر M-CSF (50 ng/ml) کی موجودگی میں مکمل میڈیم میں کلچر کیا گیا تھا۔

2.3|Osteoclastogenesis پرکھ

BMMs کو 96-کنویں کلچر پلیٹوں میں 6 × 103 سیل فی کنویں کی کثافت پر چڑھایا گیا تھا اور موجودگی میں M-CSF (50 ng/ml) اور GST-rRANKL (100 ng/ml) پر مشتمل ایک مکمل میڈیم کے ساتھ علاج کیا گیا تھا۔ سی ڈی پی کی مختلف ارتکاز کی عدم موجودگی(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>تین نیوکللی) کو آسٹیو کلاسٹس کے طور پر شناخت کیا گیا تھا۔

2.4|Cytotoxicity asses

BMMs کو 96 کنویں کی پلیٹوں میں 6 × 103 سیل فی کنواں پر سیڈ کیا گیا اور راتوں رات اس پر قائم رہنے کے لیے چھوڑ دیا گیا۔ اگلے دن، خلیوں کو سی ڈی پی کی مختلف حراستی کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ). مزید 48 گھنٹے کے بعد، MTS محلول (20 µl/well) شامل کیا گیا اور 2 گھنٹے کے لیے خلیوں کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ 490 nm پر جاذبیت کا تعین مائکروپلیٹ ریڈر کے ساتھ کیا گیا تھا (ملٹی اسکین اسپیکٹرم؛ تھرمو لیب سسٹمز، چنٹیلی، VA۔

2.5|امیونو فلوروسینٹ داغ

BMMs کو راتوں رات M-CSF (50 ng/ml) کی موجودگی میں 6 × 103 سیل فی کنویں کی کثافت پر سیڈ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد خلیوں کو M-CSF اور GST-rRANKL (100 ng/ml) کے ساتھ متحرک کیا گیا جب تک کہ بالغ آسٹیو کلاسٹس نہیں بن جاتے۔ اس کے بعد osteoclasts کا علاج CDP کی مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)4 فیصد پیرافارمیلڈہائڈ کے ساتھ فکسنگ سے پہلے 48 گھنٹے تک، 0.1 فیصد ٹریٹن X-100–PBS کے ساتھ پارمیبلائزنگ، اور PBS میں 3 فیصد بوائین سیرم البومین کے ساتھ بلاک کرنا۔ تیار شدہ خلیوں کو 45 منٹ تک اندھیرے میں rhodamine-conjugated phalloidin کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تاکہ F-actin پر داغ لگ سکے۔ اس کے بعد خلیوں کو پی بی ایس سے دھویا گیا، نیوکلی کو 4′،6‐diamidino‐2-phenylindole (DAPI) کے ساتھ کاؤنٹرسٹین کیا گیا، اور کنفوکل مائکروسکوپی کے لیے کور سلپس کے ساتھ نصب کیا گیا۔

cistanche تجربہ

2.6|ہائیڈروکسیپیٹائٹ ریسورپشن پرکھ

آسٹیو کلاس سرگرمی کی پیمائش کرنے کے لیے BMMs (1 × 105 سیل فی کنواں) چھ کنویں کولیجن لیپت پلیٹوں (BD Biocoat؛ تھرمو فشر سائنٹیفک) کو GST-rRANKL (100 ng/ml) اور M-CSF (50 ng/ml) کے ساتھ متحرک کیا گیا تھا۔ ml) جب تک کہ پختہ آسٹیو کلاسٹس تیار نہ ہوں (Zhou et al.، 2016)۔ اس کے بعد خلیوں کو سیل ڈسوسی ایشن سلوشن (سگما-الڈرچ) کا استعمال کرتے ہوئے پلیٹ سے آہستہ سے الگ کر دیا گیا اور ہائیڈروکسیپیٹائٹ لیپت 96 کنویں کی پلیٹوں (کارننگ اوسٹیوسے، کارننگ، NY) میں برابر تعداد میں بالغ آسٹیو کلاسٹس کو انفرادی کنوؤں پر سیڈ کیا گیا۔ بالغ آسٹیو کلاسٹس کو سی ڈی پی کے ساتھ یا اس کے بغیر GST-rRANKL اور M-CSF پر مشتمل میڈیم میں انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)اشارہ شدہ ارتکاز پر۔ 48 گھنٹے کے بعد، TRAcP سرگرمی کے لیے آدھے کنویں کو امیونو ہسٹو کیمیکل طور پر داغ دیا گیا تھا، جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، تاکہ فی کنویں میں ملٹی نیوکلیٹیڈ خلیوں کی تعداد کا اندازہ لگایا جا سکے۔ بقیہ کنوؤں کو 10 منٹ کے لیے بلیچ کیا گیا تاکہ خلیوں کو ہٹایا جا سکے اور ریزوربڈ علاقوں کی پیمائش کی جا سکے۔ ریزوربڈ علاقوں کی تصویر معیاری لائٹ مائیکروسکوپی کے تحت لی گئی تھی اور امیج جے سافٹ ویئر (نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ، بیتھسڈا، ایم ڈی) کا استعمال آسٹیو کلاسٹس کے ذریعہ ریزورب شدہ ہائیڈروکسیپیٹائٹ سطح کے فیصدی رقبے کو درست کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔

2.7|لوسیفریز رپورٹر اسیسز

NFATc1 ٹرانسکریشنل ایکٹیویشن کی تحقیقات کے لیے، RAW264.7 سیلز کو NFATc1-ریسپانسیو لوسیفریز رپورٹر کنسٹرکٹ (چینگ ایٹ ال۔، 2018؛ وین ڈیر کران ایٹ ال۔، 2013) کے ساتھ مستحکم طور پر تبدیل کیا گیا تھا۔ منتقلی شدہ خلیوں کو 48 کنویں پلیٹوں میں 1.5 × 105 خلیات فی کنواں کی کثافت پر کلچر کیا گیا تھا اور CDP کی مختلف تعداد کے ساتھ پہلے سے علاج کیا گیا تھا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)1 گھنٹے کے لیے پری ٹریٹمنٹ کے بعد، خلیوں کو 24 گھنٹے کے لیے GST-rRANKL (100 ng/ml) کے ساتھ متحرک کیا گیا، اور لوسیفریز کی سرگرمی کو مینوفیکچرر کے پروٹوکول (پرومیگا) کے مطابق لوسیفریز رپورٹر پرکھ کے نظام کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔

2.8|مقداری ریورس ٹرانسکرپشن پولیمریز چین ری ایکشن (RT-PCR) تجزیہ

مینوفیکچرر کے پروٹوکول (تھرمو فشر سائنٹیفک) کے مطابق کل آر این اے کو ٹریزول ریجنٹ کا استعمال کرتے ہوئے خلیوں سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ تکمیلی ڈی این اے کو مولونی مورین لیوکیمیا وائرس ریورس ٹرانسکرپٹیس کا استعمال کرتے ہوئے 1 ug RNA ٹیمپلیٹ اور oligo-dT پرائمر کے ساتھ ترکیب کیا گیا تھا۔ مندرجہ ذیل پروگرام کا استعمال کرتے ہوئے مخصوص ترتیب کے پولیمریز چین ری ایکشن کو بڑھاوا دیا گیا: 5 منٹ کے لیے 94 ڈگری، اس کے بعد 40 سیکنڈ کے لیے 94 ڈگری کے 30 چکر، 40 سیکنڈ کے لیے 60 ڈگری، اور 40 سیکنڈ کے لیے 72 ڈگری، اور آخری توسیعی مرحلہ۔ 72 ڈگری پر 5 منٹ مخصوص پرائمر کی تفصیلی معلومات جدول 1 میں دکھائی گئی ہے۔ رشتہ دار میسنجر آر این اے کی سطحوں کا حساب گھر کی کیپنگ جین Hmbs کے اظہار کو نارملائزیشن کے ذریعے کیا گیا۔

2.9|مغربی دھبے کا تجزیہ

BMMs کو چھ کنویں پلیٹوں میں M-CSF کے ساتھ مکمل میڈیم میں کلچر کیا گیا تھا اور بیان کردہ اوقات کے لئے GST-rRANKL (100 ng/ml) کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی تھی۔ خلیوں کو ریڈیو امیونوپریسیپیٹیشن لیسس بفر میں لیس کیا گیا تھا اور پروٹین کو سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ-پولیاکریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس کے ذریعہ حل کیا گیا تھا اور پولی (ونیلائڈین فلورائڈ) جھلیوں (جی ای ہیلتھ کیئر، سلور واٹر، آسٹریلیا) میں منتقل کیا گیا تھا۔ جھلیوں کو 5 فیصد سکم دودھ میں 1 گھنٹہ تک روک دیا گیا اور پھر 4 ڈگری پر رات بھر ہلکے ہلکے ہلکے ساتھ مختلف مخصوص بنیادی اینٹی باڈیز کے ساتھ جانچ کی گئی۔ جھلیوں کو دھویا گیا اور اس کے بعد ہارسریڈش پیرو آکسیڈیس کنججٹیڈ سیکنڈری اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ اس کے بعد اینٹی باڈی ری ایکٹیویٹی کو بہتر کیمیلومینیسینس ری ایجنٹ (ایمرشام فارماسیا بائیوٹیک، پسکاٹا وے، این جے) کے ساتھ پتہ چلا اور امیج کوانٹ ایل اے ایس 4000 (جی ای ہیلتھ کیئر) کے ساتھ تصور کیا گیا۔

2.10|انٹرا سیلولر ROS کا پتہ لگانا

انٹرا سیلولر آر او ایس کی سطح کا پتہ 2 ′ ، 7′ - ڈیکلوروفلووریسین ڈائی کاسیٹیٹ سیلولر آر او ایس کا پتہ لگانے پرکھ کٹ (ابکیم ، میلبورن ، آسٹریلیا) کا استعمال کرتے ہوئے پتہ چلا۔ BMMs (5 × 103 سیل فی کنویں) کو 96 کنویں پلیٹوں میں کلچر کیا گیا تھا اور RANKL (100 ng/ml)، M-CSF (50 ng/ml)، اور CDP کے ساتھ 72 گھنٹے کے لیے علاج کیا گیا تھا۔ انٹرا سیلولر آر او ایس کی سطح کو 2 ′ ، 7′ - Dichlorofluorescein diacetate کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا ، جو ROS کی موجودگی میں فلوروسینٹ DCF میں آکسائڈائز کرتا ہے۔ خلیوں کو ہانک کے بفر میں دھویا گیا اور 10 µM DCFH-DA کے ساتھ اندھیرے میں 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ کنفوکل مائکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر حاصل کی گئیں۔

2.11|شماریاتی تجزیہ

تمام اعداد و شمار کم از کم تین تجربات کے نمائندے ہیں جو سہ رخی میں کیے گئے ہیں جب تک کہ دوسری صورت میں اشارہ نہ کیا جائے۔ ڈیٹا کو اوسط ± SD کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ تغیر کا یکطرفہ تجزیہ جس کے بعد طالب علم – نیومین – کیولس پوسٹ ہاک ٹیسٹ کا استعمال نتائج کے درمیان فرق کی اہمیت کا تعین کرنے کے لیے کیا گیا، جس میں p < 0.05="" کو="" اہم="" سمجھا="" جاتا="">

3|نتائج

3.1|سی ڈی پی RANKL-حوصلہ افزائی osteoclastogenesis اور osteoclast کے فیوژن کو روکتا ہے۔

اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)RANKL-حوصلہ افزائی آسٹیوکلاسٹ کی تشکیل کو دبا سکتا ہے، ہم نے سب سے پہلے ماؤس BMMs (Liu et al.، 2013؛ Song et al.، 2016) کا استعمال کرتے ہوئے ایک osteoclastogenesis پرکھ کا مظاہرہ کیا۔ BMMs کا علاج RANKL اور M-CSF کے ساتھ 5 دن تک CDP کی بڑھتی ہوئی تعداد کے ساتھ کیا گیا۔ CDP نے TRAcP-مثبت ملٹی نیوکلیٹیڈ سیلز کی تعداد کو کم کیا جب CDP کا ارتکاز(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)5 µM یا اس سے زیادہ تک پہنچ گئی (شکل 1a، b)۔ سی ڈی پی کا اندازہ کرنے کے لیے(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)زہریلا اور اس بات کی تصدیق کریں کہ یہ نتائج سیل کی موت یا تعداد کا عکاس نہیں تھے، ہم نے ایم ٹی ایس پرکھ کی۔ BMMs کا علاج RANKL اور M-CSF کے ساتھ 48 گھنٹے تک CDP کی مختلف خوراکوں کے ساتھ کیا گیا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ). 15 µM یا اس سے کم ارتکاز پر CDP کا BMM پھیلاؤ پر کوئی اثر نہیں ہوا (شکل 1c)۔

سی ڈی پی کے اثرات کو جانچنے کے لیے(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)آسٹیو کلاس فیوژن پر، آسٹیو کلاسٹس کو RANKL اور M-CSF علاج کے ساتھ، CDP کی مختلف خوراکوں کے ساتھ یا اس کے بغیر شامل کیا گیا تھا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ). آسٹیو کلاسٹس کو روڈامین فیلوڈین اور ڈی اے پی آئی سے داغ دیا گیا تھا تاکہ فی آسٹیو کلاس (شکل 2a) کے نیوکلی کی تعداد کا اندازہ کیا جاسکے۔ سی ڈی پی کے بعد آسٹیو کلاس نمبر اور نیوکلی فی آسٹیو کلاس دونوں کی اوسط تعداد میں کمی واقع ہوئی۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)علاج (5–10 µM؛ شکل 2b,c)۔ لہذا، CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)خوراک پر منحصر انداز میں RANKL-حوصلہ افزائی آسٹیوکلاسٹوجنیسیس اور آسٹیوکلاسٹ فیوژن پر روکنے والے اثرات تھے۔

3.2|سی ڈی پی(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)RANKL-حوصلہ افزائی آسٹیو کلاسک ہائیڈروکسیپیٹائٹ ریسورپشن سرگرمی کو کم کرتا ہے۔

سی ڈی پی کے اثر کا پتہ لگانے کے لئے ایک ہائیڈروکسیپیٹائٹ ریسورپشن پرکھ کی گئی تھی۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)آسٹیو کلاس فنکشن پر (شکل 3a)۔ 24 گھنٹے کے انکیوبیشن کے بعد، فی کنواں آسٹیو کلاسٹس کی تعداد میں کوئی تبدیلی نہیں آئی جبکہ کنٹرول گروپس (شکل 3b،c) کے مقابلے میں 5 اور 10 µM CDP کے ساتھ علاج کے ذریعے ہائیڈروکسیپیٹائٹ ریسورپشن ایریا میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ یہ نتائج ظاہر کرتے ہیں کہ CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)بغیر کسی سائٹوٹوکسک اثرات کے آسٹیوکلاسٹ کی تشکیل اور آسٹیو کلاس ریزورپشن سرگرمی دونوں پر مضبوط روک تھام کے اثرات ہیں۔

3.3|سی ڈی پی(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)آسٹیو کلاس مارکر جین کے اظہار کو روکتا ہے۔

سی ڈی پی کے روکنے والے اثرات کی مزید تحقیقات کے لیے(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)osteoclastogenesis اور osteoclastic bone resorption پر، BMMs کا علاج RANKL اور M-CSF کے ساتھ 5 دن تک CDP کی مختلف تعداد کے ساتھ کیا گیا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ). RT-PCR پھر آسٹیو کلاس مارکر جینوں کے اظہار کا پتہ لگانے کے لیے کیا گیا۔ Nfatc1 کا اظہار، osteoclastogenesis کے دوران ایک اہم ٹرانسکرپشن عنصر، CDP کے ذریعے روکا گیا تھا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)خوراک پر منحصر انداز میں (شکل 4a)۔ اس کے علاوہ، CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)(5 اور 10 µM) نے ہڈیوں کی ریزورپشن سے متعلق جینوں کے اظہار کو کم کیا، بشمول Mmp9، Ctsk، اور Acp5 (شکل 4b–d)۔

3.4|CDP NFATc1 سرگرمی اور بہاو پروٹین اظہار کو دباتا ہے۔

سی ڈی پی کے اثر کو جانچنے کے لیے(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)RANKL-حوصلہ افزائی NFATc1 سرگرمی پر، ایک لوسیفریز رپورٹر پرکھ کی گئی تھی۔ CDP کے ساتھ علاج(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)، 5 µM اور اس سے زیادہ کے ارتکاز پر، نمایاں طور پر RANKL کی حوصلہ افزائی NFATc1 سرگرمی کو روکتا ہے (شکل 5a)۔ اس کے علاوہ، مغربی دھبے کے تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)BMMs میں NFATc1 اور c-Fos کا نمایاں طور پر دبایا گیا پروٹین ایکسپریشن RANKL اور M-CSF کے ساتھ 3 اور 5 دن تک علاج کیا گیا (شکل 5b)۔ مزید یہ کہ آسٹیوکلاسٹ فنکشن سے متعلق پروٹینز، جیسے V-ATPase-d2 اور CTSK کے اظہار کو CDP کی موجودگی میں کم کر دیا گیا تھا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)کنٹرول گروپوں کے مقابلے میں تاہم، RANK اظہار (شکل 5b) پر CDP کا کوئی اثر نہیں ہوا۔

3.5|سی ڈی پی RANKL-حوصلہ افزائی osteoclastogenesis کے دوران ROS کی پیداوار کو ختم کرنے کے لیے اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کے اظہار کو فروغ دیتا ہے۔

سی ڈی پی پر منحصر آسٹیو کلاسٹوجینیسیس کی روک تھام کے بنیادی طریقہ کار کو دریافت کرنے کے لیے، بی ایم ایم کا علاج پی بی ایس یا سی ڈی پی کے ساتھ مل کر RANKL (100 ng/ml) اور M-CSF (50 ng/ml) کے ساتھ کیا گیا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)72 گھنٹے کے لیے ہم نے RANKL کے ذریعہ متحرک انٹرا سیلولر ROS پروڈکشن پر CDP کے اثر کی جانچ کی۔ RANKL علاج کے ذریعہ انٹرا سیلولر ROS کی سطح میں اضافہ کیا گیا تھا ، جسے CDP (5 اور 10 µM؛ شکل 6a) کے ذریعہ کم کیا گیا تھا۔ ROS-مثبت خلیوں کی تعداد اور ROS داغ کی شدت دونوں کو خوراک پر منحصر انداز میں CDP علاج سے کم کیا گیا تھا (شکل 6b، c)۔ مغربی دھبے کے تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)BMMs میں inducible nitric oxide synthase (NOS2) کے اظہار کو دباتے ہوئے thioredoxin (TRX1) اور glutathione reductase (GSR) اظہار کو فروغ دیا جس کا علاج RANKL اور M-CSF کے ساتھ 3 دن تک کیا گیا تھا (شکل 6d)۔

مزید دریافت کرنے کے لیے اگر CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)ROS کی پیداوار کو کم کر کے آسٹیوکلاسٹ تفریق کو دبایا، پھر ہم نے BMMs کا پیرو آکسائیڈ (10 µM) سے علاج کیا تاکہ خلیوں میں ROS کی اعلی حیثیت کی تقلید کی جا سکے۔ BMMs کو RANKL اور M-CSF کے ذریعہ 3 دن کے لئے حوصلہ افزائی کی گئی تھی اور مغربی بلاٹ تجزیہ اور RT-PCR کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ پیرو آکسائیڈ نے کنٹرول گروپوں کے مقابلے میں NFATc1 اور c-Fos اظہار کو فروغ دیا۔ شکل 5 کے نتائج سے ہم آہنگ، NFATc1 اور c-Fos کے اظہار کو CDP نے دبا دیا تھا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)جبکہ پیرو آکسائیڈ نے CDP کے روکے ہوئے اثر کو بچایا (شکل 6e،f)۔ ان اعداد و شمار نے اشارہ کیا کہ CDP نے ROS کی پیداوار کو ختم کرکے NFATc1 اور c-Fos کے اظہار کو دبایا۔

3.6|سی ڈی پی(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)RANKL-حوصلہ افزائی osteoclastogenesis کے دوران MAPK کے راستوں کو دباتا ہے

اگلا، ہم نے CDP کے اثر کی تحقیقات کی۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)RANKL-ثالثی TRAF6 اظہار اور MAPK پاتھ وے ایکٹیویشن پر علاج۔ سیرم فری میڈیم میں 2 گھنٹے تک انکیوبیشن کے بعد، BMMs کو RANKL کے ساتھ، CDP کے ساتھ یا اس کے بغیر، 60 منٹ تک متحرک کیا گیا۔ CDP (10 µM) کے ساتھ محرک کا TRAF6 اظہار پر کوئی اثر نہیں ہوا اور JNK2 اور ERK1/2 کے 10 اور 20 منٹ پر فاسفوریلیشن کو کم کیا گیا (شکل 7)۔ مزید برآں، p38 فاسفوریلیشن کو CDP کے ذریعے نمایاں طور پر روکا گیا تھا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)کنٹرول گروپس کے مقابلے میں 60 منٹ کا علاج (شکل 7)۔ یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)RANKL-حوصلہ افزائی MAPK سگنلنگ پاتھ ویز کو دباتا ہے، آسٹیوکلاسٹ کی تشکیل اور سرگرمی پر اس کے روکنے والے اثر کے مطابق۔

4|بحث

Cistanche، جسے "desert ginseng" کے نام سے جانا جاتا ہے، نے حال ہی میں اپنی قوت مدافعت کو تبدیل کرنے اور بڑھاپے اور آکسیڈیٹیو تناؤ کے دوران حفاظتی طور پر کام کرنے کی صلاحیت کے لیے بہت زیادہ توجہ مبذول کی ہے (Jia et al.، 2012؛ Snytnikova et al.، 2012)۔ Phenylpropanoid-متبادل گلائکوسائیڈز، Cistanche کے اہم فعال اجزاء، کو میکروفیجز (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017) میں کوئی سرگرمی روکتے ہوئے دکھایا گیا ہے۔ اس کے علاوہ، اےCistancheاسکیمیا کے بعد ریپرفیوزڈ مایوکارڈیم میں آکسیڈیٹیو تناؤ کو کم کیا اور کارڈیو پروٹیکشن (یو، لی، اور کاو، 2016) کی طرف جانے والے اپوپٹوٹک راستوں کی روک تھام میں اہم کردار ادا کیا۔ Cistanche، CDP کے ایک اہم جزو کے طور پر(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)فارماسولوجیکل افعال کی ایک قسم ہے. ہمارے موجودہ مطالعے سے معلوم ہوا ہے کہ CDP نے ROS پروڈکشن کے ساتھ ساتھ NFAT اور MAPK ایکٹیویشن کو کم کرکے RANKL- ایکٹیویٹڈ آسٹیو کلاس تفریق اور ایکٹیویشن کو دبایا۔

ایسڈ فاسفیٹیس کے طور پر، TRAcP مختلف قسم کے خلیوں میں موجود ہے اور یہ آسٹیو کلاسٹس اور الیوولر میکروفیجز (Snipes, Lam, Dodd, Grey, & Cohen, 1986) میں وافر مقدار میں موجود ہے۔ TRAcP آسٹیو کلاسٹس کا ایک خصوصیت والا انزائم ہے اور اس کا اظہار آسٹیوکلاسٹ فنکشن سے گہرا تعلق رکھتا ہے، جسے آسٹیوکلاسٹ کی سرگرمی اور ہڈیوں کی بحالی کا اشارہ سمجھا جاتا ہے (منکن، 1982)۔ ہمارے مطالعہ میں، CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)TRAcP-مثبت خلیوں کی تعداد کو روکتا ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ RANKL-حوصلہ افزائی osteoclastogenesis کو CDP نے روک دیا تھا۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ). آسٹیو کلاسٹس کے ذریعہ ہڈیوں کے میٹرکس کے انحطاط کا انحصار کیتھیپسن K (CTSK) اور MMPs (Gruber، 2015) پر ہوتا ہے۔ یہاں، CDP نے Mmp9، Ctsk، اور Acp5 جیسے آسٹیوکلاسٹ فنکشنل جین کے اظہار کو نمایاں طور پر کم کیا۔

آسٹیو کلاس تفریق اور فنکشن ایک سے زیادہ سگنلنگ پاتھ ویز (بوئل، سائمونیٹ، اور لیسی، 2003) کے ذریعے منظم ہوتے ہیں۔ RANK کے پابند ہونے کے بعد، RANKL NFATc1 کے اظہار کو چالو کرنے کے لیے اڈاپٹر پروٹین TRAF6 کو بھرتی کرتا ہے، جو آسٹیو کلاس کی تشکیل کے لیے ایک اہم ٹرانسکرپشن عنصر ہے، جس سے آسٹیوکلاسٹ کے مخصوص جین کے اظہار کو متاثر ہوتا ہے، بشمول TRAcP اور CTSK (X. Feng; alkayanagi, 200. 2002)۔ اس مطالعہ میں، ہم نے پایا کہ CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)آسٹیو کلاسٹس میں RANK اور TRAF6 اظہار پر کوئی اثر نہیں ہوا۔ تاہم، CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)BMMs کے osteoclastogenesis کے دوران RANKL-حوصلہ افزائی NFATc1 ایکٹیویشن کو روکتا ہے۔ اس کے علاوہ، یہ ظاہر کیا گیا کہ ROS، الیکٹرانوں کی فراہمی کے عمل میں مائٹوکونڈریا کے ذریعہ تیار کیا گیا، آسٹیو کلاسٹس کے پھیلاؤ اور تفریق کو فروغ دیتا ہے اور ہڈیوں کے میٹرکس کے انحطاط کو منظم کرتا ہے (Ha et al.، 2004)۔ ایک حالیہ مطالعہ سے پتا چلا ہے کہ RANKL نے Bach1 جوہری درآمد کی حوصلہ افزائی کی اور Nrf2 ثالثی اینٹی آکسیڈینٹ انزائم کی پیداوار کو کم کیا، اس طرح چوہوں میں انٹرا سیلولر ROS اظہار اور آسٹیو کلاسٹوجینیسیس کو بڑھایا (کنزاکی ایٹ ال۔، 2017)۔ اس کے علاوہ، ہومو سسٹین کے ذریعہ انٹرا سیلولر ROS جنریشن میں اضافہ آسٹیوکلاسٹ کی تشکیل اور سرگرمی (Koh et al.، 2006)۔ ہمارے مطالعے سے معلوم ہوا ہے کہ CDP نے NOS2 اظہار کو روک کر اور TRX1 اور glutathione reductase جیسے اینٹی آکسیڈینٹ انزائمز کے اظہار کو فروغ دے کر آسٹیو کلاسٹس میں ROS کے جمع ہونے کو کم کیا۔ جب ہم نے انٹرا سیلولر ROS جمع کو بڑھانے کے لیے پیرو آکسائیڈ کے ساتھ BMMs کا علاج کیا تو ان نتائج سے ROS میں اضافہ ہوا NFATc1 اظہار کو بہتر بنا سکتا ہے کہ ROS NFATc1 کے اوپری حصے میں تھا۔ ہم نے یہ بھی پایا کہ پیرو آکسائیڈ نے NFATc1 اظہار پر CDP کے روکنے والے اثر کو بچایا۔ لہذا، ہمارے اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ CDP NFATc1 اظہار کو روکنے کے لیے ROS جمع کو دباتا ہے، پھر آسٹیوکلاسٹ کی تشکیل اور فنکشن کو دبانے کے لیے۔

ERK، JNK، اور p38 کا تعلق MAPK خاندان سے ہے، جو آسٹیو کلاس تفریق کے ضابطے میں بھی شامل ہے (Seger & Krebs, 1995)۔ RANKL ERK، JNK، اور p38 (Mizukami et al.، 2002) کے فاسفوریلیشن کو بڑھا کر MAPK کے راستے کو متحرک کرتا ہے۔ ہم نے مظاہرہ کیا کہ سی ڈی پی(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)MAPK پاتھ وے میں کلیدی پروٹینوں کے RANKL-ثالثی فاسفوریلیشن کو دبایا، اس طرح آسٹیو کلاس مارکر جینوں کے اظہار پر CDP کے روکنے والے اثر میں حصہ ڈالا۔ ہمارے علم کے مطابق، یہ پہلا مطالعہ ہے جس میں CDP کے روکنے والے اثرات دکھائے گئے ہیں۔(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)ROS پروڈکشن، NFAT، اور MAPK ایکٹیویشن پر، وٹرو میں CDP کے عمل کے نئے میکانزم کی نمائندگی کرتا ہے۔

خلاصہ میں، ہم نے ظاہر کیا کہ CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)osteoclastogenesis اور hydroxyapatite resorption، اور Ctsk، Mmp9، اور Acp5 سمیت آسٹیوکلاسٹ مارکر جینز کے اظہار کو کم کرتا ہے۔ سی ڈی پی(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)RANKL ثالثی ROS پروڈکشن کے ساتھ ساتھ NFAT اور MAPK ایکٹیویشن (شکل 8) کو دبانے کے قابل تھا۔ اجتماعی طور پر، ہمارے نتائج تجویز کرتے ہیں کہ CDP(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)آر او ایس کی زیادہ پیداوار کے ساتھ آسٹیو کلاس سے متعلقہ حالات کے علاج کے لیے امیدوار دوائی کی نمائندگی کر سکتی ہے۔

تصویر 8 سی ڈی پی کا اسکیمیٹک خاکہ(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)آسٹیو کلاس تفریق میں فنکشن۔ سی ڈی پی(Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ)RANKL-حوصلہ افزائی ROS کی پیداوار کے ساتھ ساتھ NFATc1 اور MAPK ایکٹیویشن کو دباتا ہے، اس وجہ سے آسٹیو کلاسٹوجینس کو روکتا ہے۔ سی ڈی پی،Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈ; MAPK، mitogen-activated protein kinase؛ NFATc1، فعال T سیل کا جوہری عنصر؛ RANKL، جوہری عنصر κB ligand کا رسیپٹر ایکٹیویٹر؛ آر او ایس، ری ایکٹو آکسیجن پرجاتیوں [کلر فگر کو wileyonlinelibrary.com پر دیکھا جا سکتا ہے]

اعترافات

اس مطالعہ کی حمایت نیچر سائنس فاؤنڈیشن آف چائنا (81572164)، چین کے قومی کلیدی ٹیکنالوجی ریسرچ اینڈ ڈویلپمنٹ پروگرام (2017YFC1103300)، گوانگسی صوبے کی نیچرل سائنس فاؤنڈیشن (2016GXNSFAA380295)، اور گوانگسی کی یونیورسٹی سائنس اور ٹیکنالوجی ریسرچ پروجیکٹ نے کی۔ صوبہ (KY2015YB054)۔ گوانگسی سائنٹیفک ریسرچ اینڈ ٹیکنالوجی ڈویلپمنٹ پلان پروجیکٹ (GKG13349003، 1598013-15)، ویسٹرن آسٹریلیا میڈیکل اینڈ ہیلتھ ریسرچ انفراسٹرکچر فنڈ، آرتھرائٹس آسٹریلیا فاؤنڈیشن، دی یونیورسٹی آف ویسٹرن آسٹریلیا (UWA) ریسرچ کولیبریشن ایوارڈز، اور آسٹریلین ہیلتھ اینڈ میڈیکل ریسرچ کونسل (NHMRC، نمبر 1107828 اور 1027932)۔

مفادات میں تضاد

مصنفین اعلان کرتے ہیں کہ مفادات کا کوئی تنازعہ نہیں ہے۔

منجانب:'Cistanchedeserticolaپولی سیکرائیڈڈیزی سونگ ایٹ ال کے ذریعہ RANKL سگنلنگ اور رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کی پیداوار کو روکنے کے ذریعے آسٹیو کلاسٹوجینیسیس اور ہڈیوں کی ریسورپشن کو کم کرتا ہے۔

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol۔ 2018؛ 233:9674–9684