Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides H22 Hepatocellular Carcinoma Cells میں Apoptosis کو اکساتا ہے خارجی اور اندرونی سگنلنگ دونوں راستوں کے ذریعے

رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com

پینگفی یوآن، جنیو لی، اڈیلا ایپائر، یی یانگ، لیجی زیا، ژنہوئی وانگ، یجی لی اور جنیاو لی

خلاصہ

پس منظر:Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight ایک روایتی چینی دوا ہے جو Tamarix کے پودے کی جڑوں کو طفیلی بناتی ہے اور اسے مردانہ کمزوری، بانجھ پن، جسم کی کمزوری، اور ٹانک کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ تاہم، ہیپاٹو سیلولر کارسنوما پر اس کا اینٹی ٹیومر اثر ابھی تک مضمر ہے۔ یہاں، ہم نے اینٹیٹیمر اثر کی تحقیقات کی۔C. tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG) H22 ہیپاٹو سیلولر کارسنوما خلیوں پر وٹرو اور ویوو دونوں میں اور اس کے میکانزم۔ طریقے: H22 خلیوں کی مورفولوجی، عملداری، اپوپٹوس، سیل سائیکل، اور مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت (Δψm) کا بالترتیب الٹی مائیکروسکوپی، MTT پرکھ، اور فلو سائٹومیٹری کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ اپوپٹوسس پاتھ وے میں پروٹین کے اظہار اور ایکٹیویشن کا پتہ مغربی بلاٹ کے ذریعے پایا گیا۔ ان ویوو اینٹیٹیمر اثر کا اندازہ ٹیومر ماؤس ماڈل میں کیا گیا تھا جو مرد کنمنگ چوہوں کا استعمال کرتے ہوئے قائم کیا گیا تھا۔ نتائج: CTPG علاج نے خوراک اور وقت پر منحصر انداز میں H22 سیل کی نشوونما کو نمایاں طور پر دبایا، جو G0/G1 اور G2/M مراحل میں بڑھتی ہوئی اپوپٹوس اور سیل سائیکل گرفتاری سے منسلک تھا۔ مزید یہ کہ سی ٹی پی جی سے علاج شدہ H22 خلیوں میں کروموسومل سنکشیشن دیکھی گئی۔ CTPG علاج نے نمایاں طور پر Bax/ Bcl تناسب میں اضافہ کیا، Δψm کو کم کیا، اور cytochrome c کی رہائی کو بڑھایا۔ خارجی اور اندرونی سگنلنگ دونوں راستوں میں کلیویڈ کیسپیس-8 اور کیسپیس-9 کی سطحوں میں نمایاں طور پر اضافہ کیا گیا تھا جس نے PARP کو ​​کلیو کرنے کے لیے ترتیب وار چالو کیسپیس-7 اور -3 کو بنایا۔ آخر میں، CTPG (Cistanchetubulosaphenylethanoid glycosides) چوہوں میں H22 خلیوں کی نشوونما کو روکتا ہے اور ٹیومر چوہوں کی بقا کی شرح کو بہتر بناتا ہے۔ نتیجہ: ان نتائج نے تجویز کیا کہ CTPG نے H22 سیل کی نشوونما کو خارجی اور اندرونی اپوپٹوسس دونوں راستوں سے دبایا۔

پس منظر

جگر کا کینسر کینسر کے واقعات میں چھٹا اور دنیا بھر میں کینسر سے ہونے والی اموات میں چوتھے نمبر پر ہے۔ مزید یہ کہ، یہ کینسر کے واقعات کے لیے چوتھے اور کم سماجی آبادیاتی انڈیکس والے ممالک میں کینسر کی شرح اموات کے لیے پہلے نمبر پر ہے [1]۔ چین میں، جگر کا کینسر 2015 میں کینسر سے متعلق موت کی تیسری بڑی وجہ ہے [2]۔ دنیا میں 90 فیصد سے زیادہ بنیادی جگر کے کینسر ہیپاٹو سیلولر کارسنوما (HCC) ہیں [3]۔ فی الحال، ہیپاٹک ریسیکشن ایچ سی سی کے علاج کے لیے اہم آپشن ہے۔ تاہم، ایچ سی سی کے 30 فیصد سے بھی کم مریض علاجی ہیپاٹک ریسیکشن کے معیار پر پورا اترتے ہیں، اور اعادہ کی بلند شرح کی وجہ سے مجموعی طور پر 5- سال کی بقا کی شرح اب بھی کم ہے 35-50 فیصد [4, 5 ] انٹرمیڈیٹ سے ایڈوانس ایچ سی سی والے مریضوں کے لیے علاج کے اختیارات کی دستیابی بہت محدود ہے۔ صرافینیب، ایک مالیکیولر ٹارگٹ ڈرگ، کو ایف ڈی اے نے ایڈوانسڈ ایچ سی سی کے لیے پہلی لائن علاج کے طور پر منظور کیا ہے۔ تاہم، صرافینیب صرف 3 ماہ کی بقا کو طول دیتا ہے اور ردعمل کی شرح 4 فیصد سے کم ہے [6, 7]۔ ایچ سی سی کے خلاف نئی دوائیں یا حکمت عملی تیار کرنے کی اشد ضرورت ہے۔ روایتی چینی ادویات (TCM) کو اکیلے یا دیگر حکمت عملیوں کے ساتھ HCC کے علاج کے لیے استعمال کیا گیا ہے اور طبی فوائد کو دکھایا گیا ہے جس میں طویل عرصے تک زندہ رہنے کا وقت، زندگی کے معیار میں بہتری، منفی ردعمل میں کمی، اور اسی طرح [8، 9] شامل ہیں۔Cistanche، TCM کی ایک قسم، کے مختلف حیاتیاتی افعال ہوتے ہیں، جیسےاینٹی آکسیڈیشن، اینٹی سوزش، اینٹی ایجنگ،اور نیورو پروٹیکشن [10، 11]۔ Phenylethanoid glycosides کو اہم فعال اجزاء سمجھا جاتا ہے۔Cistanche، جس میں مختلف سرگرمیاں ہوتی ہیں جن میں اینٹی آکسیڈیشن، اینٹی سوزش، ہیپاٹو پروٹیکشن، اور نیورو پروٹیکشن [12–15] شامل ہیں۔ ہمارے گروپ نے اس کی اطلاع دی ہے۔Cistanche tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG) میلانوما B16-F10 خلیوں میں apoptosis پیدا کر سکتا ہے اور چوہوں میں ٹیومر کی نشوونما کو روک سکتا ہے [16]۔ اس مطالعے میں، ہم نے وٹرو اور ویوو دونوں میں HCC H22 خلیوں پر CTPG کے اینٹیٹیمر اثر کی پیمائش کی اور اس کے طریقہ کار کی چھان بین کی۔ ہم نے پایا کہ CTPG نے H22 خلیوں میں apoptosis کو خارجی اور اندرونی سگنلنگ راستوں کے ذریعے حوصلہ افزائی کی اور چوہوں میں H22 ٹیومر کی نشوونما کو دبا دیا۔

طریقے

سیل لائن

ماؤس H22 ہیپاٹو سیلولر کارسنوما خلیات سنکیانگ کلی لیبارٹری آف بائیولوجیکل ریسورسز اینڈ جینیٹک انجینئرنگ، سنکیانگ یونیورسٹی (ارمچی، سنکیانگ، چین) سے حاصل کیے گئے تھے اور RPMI 1640 میڈیم (Gibco) میں 100 U/ml 100 U/ml penicill کے ساتھ مکمل کیے گئے تھے۔ اسٹریپٹومائسن، اور 5 فیصد CO2 کے مرطوب ماحول میں 37 ڈگری پر 10 فیصد حرارت سے غیر فعال فیٹل بووائن سیرم (Gibco)۔

ایم ٹی ٹی پرکھ

CTPG کو Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, China) سے خریدا گیا تھا اور CTPG کے بڑے مرکبات اعلی کارکردگی والے مائع کرومیٹوگرافی [16] کے ذریعے کوالیفائیڈ اور مقدار درست کیے گئے تھے۔ سیل کی قابل عملیت کا اندازہ 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Sigma, St. Louis, MO سے کیا گیا تھا۔ ، USA) پرکھ۔ H22 خلیوں کو 2 × 1 کی کثافت پر 96-کنویں کی پلیٹوں میں ٹیکہ لگایا گیا0100 ul میڈیم فی کنواں میں 4 سیل اور 37 ڈگری پر کلچر کیا گیا۔ 24 گھنٹے کے بعد، خلیوں کو بالترتیب 24، 48 اور 72 گھنٹے کے لیے CTPG (0، 100، 200، 300 اور 400 ug/ml) یا 0.3 فیصد DMSO (400 ug/ml CTPG کے برابر) کے ساتھ علاج کیا گیا۔ . 7 منٹ کے لیے 1000 rpm پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، سپرناٹینٹ کو ضائع کر دیا گیا اور ہر کنویں میں 100 ul MTT محلول (5 mg/ml) شامل کیا گیا۔ پلیٹوں کو 4 گھنٹے کے لیے 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا اور تشکیل شدہ فارمازان کرسٹل کو تحلیل کرنے کے لیے 100 ul DMSO شامل کیا گیا۔ OD490 قدروں کا پتہ ایک 96- ویل مائکروپلیٹ ریڈر (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) کے ذریعے لگایا گیا تھا۔ سیل کی قابل عملیت کا حساب اس فارمولے کے مطابق کیا گیا تھا: سیل کی عملداری ( فیصد )=(OD علاج شدہ/ OD غیر علاج شدہ) × 100 فیصد۔

اپوپٹوسس کا پتہ لگانا

H22 خلیوں کا علاج CTPG کی مختلف ارتکاز (0, 100, 200, 300, اور 400 ug/ml) یا 0.3 فیصد DMSO کے ساتھ 24 گھنٹے کے لیے کیا گیا، اور پھر Annexin V FITC/ کے ساتھ داغ دیا گیا۔ پروپیڈیم آئوڈائڈ (PI) اپوپٹوس ڈیٹیکشن کٹ (YEASEN، چین) کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق۔ نمونوں کا تجزیہ بہاؤ سائٹوومیٹری (BD FACSCalibur، USA) کے ذریعے کیا گیا۔

مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت کا پتہ لگانا

H22 خلیوں کو 24 گھنٹے کے لیے CTPG (0, 200، اور 400 ug/ml) کے مختلف ارتکاز کے ساتھ علاج کیا گیا، اور پھر 20 کے لیے جھلی پارمیبل JC-1 ڈائی (بیو ٹائم، چین) سے داغ دیا گیا۔ 37 ڈگری پر منٹ JC-1 بفر کے ساتھ دو بار دھونے کے بعد، نمونوں کو 300 ul JC-1 بفر کے ساتھ دوبارہ معطل کیا گیا اور فلو سائٹومیٹری (BD FACSCalibur، USA) کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔

سیل سائیکل کا تجزیہ

H22 خلیوں کو 60 ملی میٹر کلچر ڈشز میں ٹیکہ لگایا گیا تھا اور CTPG کی مختلف ارتکاز (0، 100، 200، 300 اور 400 ug/ml) یا 0.3 فیصد DMSO کے ساتھ علاج کیا گیا تھا۔ 24 گھنٹے تمام خلیوں کو جمع کیا گیا تھا اور پی بی ایس کے ساتھ دو بار دھویا گیا تھا۔ سیلز کو 70 فیصد آئس کولڈ ایتھنول میں −20 ڈگری پر 2 گھنٹے کے لیے طے کیا گیا تھا اور پی بی ایس کے ساتھ دو بار دھویا گیا تھا، پھر 300 ul Propidium iodide/RNase سٹیننگ بفر (BD Biosciences) میں دوبارہ معطل کر دیا گیا تھا۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے بعد، فلو سائٹومیٹری (BD FACSCalibur، USA) کے ذریعے نمونے جمع کیے گئے اور ModFit LT 3.0 سافٹ ویئر کے ساتھ سیل سائیکل کی تقسیم کا تجزیہ کیا گیا۔

Hoechst 33,258 سٹیننگ

H22 سیل نیوکلی کی شکلیاتی تبدیلیوں کا تجزیہ جھلی سے چلنے والے ڈی این اے بائنڈنگ ڈائی ہوچسٹ 33,258 سٹیننگ کے ذریعے کیا گیا۔ H22 خلیات کو 1 × 1 کے ارتکاز پر 6-کنویں پلیٹ میں05 خلیات/کنویں 2 ملی لیٹر میڈیم میں سیڈ کیا گیا تھا۔ 60 فیصد ~ 70 فیصد سنگم کے بعد، خلیوں کا علاج CTPG (0، 100، 200، 300 اور 400 ug/ml) سے 24 گھنٹے تک کیا گیا۔ خلیوں کو جمع کیا گیا اور 10 منٹ کے لئے 4 ڈگری پر 4 فیصد آئس کولڈ پیرافارمیلڈہائڈ کے ساتھ طے کیا گیا۔ پی بی ایس سے دھونے کے بعد، خلیات کو ہوچسٹ 33,258 (بیو ٹائم، چین) سے 10 منٹ کے لیے 4 ڈگری پر داغ دیا گیا۔ نمونے ایک الٹی فلوروسینس مائکروسکوپ (نیکون ایکلیپس Ti-E، جاپان) کے ذریعے دیکھے گئے۔

مغربی دھبہ

اینٹی کیسپیس-3، اینٹی کلیویڈ کیسپیس-3، اینٹی بی سی ایل-2، اور اینٹی بیکس کو Beyotime Biotech Co., Ltd. (شنگھائی، چین) سے خریدا گیا تھا۔ اینٹی کیسپیس-7، اینٹی کلیویڈ-کیسپیس-7، اینٹی کیسپیس-8، اینٹی کلیویڈ-کیسپیس-8، اینٹی کیسپیس-9، اینٹی -کلیویڈ-کیسپیس-9، اینٹی PARP، اینٹی کلیویڈ PARP، اینٹی ماؤس IgG-HRP، اور اینٹی خرگوش IgG-HRP سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی سے خریدے گئے تھے۔ اینٹی- -ایکٹین بیجنگ ComWin Biotech Co., Ltd. (بیجنگ، چین) سے خریدی گئی تھی۔

H22 خلیوں کا علاج CTPG کے مختلف ارتکاز (0, 100, 200, 300 اور 400 ug/ml) یا 24 گھنٹے کے لیے 0.3 فیصد DMSO کے ساتھ کیا گیا۔ سیلز کو سیل لائسس سلوشن RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) کے ساتھ 30 منٹ تک برف پر جمع کیا گیا اور لیس کیا گیا۔ سپرنٹینٹس کو جمع کرنے کے لیے نمونے (12,000 g 15 منٹ کے لیے 4 ڈگری پر) کاٹے گئے اور BCA کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک، USA) کے ذریعے پروٹین کی تعداد کی پیمائش کی گئی۔ ہر نمونے میں پروٹین کی مساوی مقدار کو 12 فیصد SDS-PAGE کے ذریعے الگ تھلگ کر کے PVDF جھلیوں (Biosharp، China) میں منتقل کر دیا گیا تھا۔ ٹی بی ایس ٹی بفر کے ساتھ بلاک کرنے کے بعد 5 فیصد نان فیٹ دودھ پر مشتمل تھا، جھلیوں کو بالترتیب ہارسریڈش پیرو آکسیڈیز (HRP) سے منسلک بنیادی اینٹی باڈیز اور سیکنڈری اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ ٹی بی ایس ٹی کے ساتھ دھونے کے بعد، ای سی ایل پرکھ کٹ (بیو ٹائم، چین) کے ذریعے ٹارگٹ پروٹینز کا پتہ چلا۔

جانوروں اور اخلاقیات کا بیان

6-8 ہفتے پرانے نر کنمنگ چوہوں کو اینیمل لیبارٹری سنٹر، سنکیانگ میڈیکل یونیورسٹی (ارمچی، سنکیانگ، چین) سے خریدا گیا تھا۔ چوہوں کو سنکیانگ یونیورسٹی کی معیاری درجہ حرارت پر قابو پانے والے، ہلکے سائیکل والے جانوروں کی سہولت میں رکھا گیا تھا۔ تمام جانوروں کی تحقیق سنکیانگ یونیورسٹی کی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی کے رہنما اصولوں کے مطابق کی گئی۔ پروٹوکول کو سنکیانگ یونیورسٹی کی سنکیانگ کلی لیبارٹری آف بائیولوجیکل ریسورسز اینڈ جینیٹک انجینئرنگ (BRGE-AE001) کی جانوروں کے تجربات کی اخلاقیات سے متعلق کمیٹی نے منظور کیا۔

ٹیومر ماؤس کا مطالعہ

ٹیومر ماؤس ماڈل کی شمولیت کے لیے، نر کنمنگ چوہوں کو 1 × 10100 ul PBS میں 6 H22 خلیات کے ساتھ دائیں طرف کے اندر داخل کیا گیا۔ 3 دن کے بعد، چوہوں کو تصادفی طور پر 3 گروپوں (7 چوہوں / گروپ) میں تقسیم کیا گیا۔ کنٹرول گروپ کو ٹیومر کے ارد گرد 0.1 ملی لیٹر ڈی ایم ایس او کے ساتھ انجکشن لگایا گیا تھا۔ CTPG-200 اور CTPG- 400 گروپوں کو ٹیومر کے ارد گرد 0.1 ملی لیٹر DMSO میں 200 یا 400 mg/kg CTPG کے ساتھ ذیلی طور پر انجیکشن لگایا گیا تھا۔ چوہوں کا علاج ہر 2 دن میں 21 دن تک کیا جاتا تھا۔ ٹیومر کے سائز کو 25 دن تک کیلیپرز کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا اور ٹیومر کے حجم کا حساب فارمولے کے مطابق کیا گیا: ٹیومر کا حجم (mm3 )=(لمبائی × چوڑائی 2 )/2۔ 25 دن کے بعد، اس تحقیق کے اختتام تک ٹیومر چوہوں کی بقا کی ہر روز نگرانی کی گئی۔

شماریاتی تجزیہ

شماریاتی اہمیت کا تخمینہ علاج اور کنٹرول گروپس کے درمیان فرق کے یک طرفہ تجزیہ سے لگایا گیا۔ تمام اعداد و شمار کو اوسط ± معیاری انحراف (SD) کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔ p < 0.05="" کو="" شماریاتی="" لحاظ="" سے="" اہم="" سمجھا="" جاتا="">

نتائج

CTPG نے وٹرو میں H22 خلیوں کی عملداری کو کم کیا۔

HCC پر CTPG کے اینٹی ٹیومر اثر کو دریافت کرنے کے لیے، H22 خلیوں کا علاج وٹرو میں CTPG (0, 100, 200, 300, اور 400 ug/ml) کے مختلف ارتکاز کے ساتھ کیا گیا۔ 24 گھنٹے کے بعد، ایک الٹی خوردبین کا استعمال کرتے ہوئے H22 خلیوں کی شکل کا مشاہدہ کیا گیا۔ ہم نے پایا کہ CTPG علاج کے ذریعہ H22 خلیوں کی شکل کو ڈرامائی طور پر تبدیل کیا گیا تھا۔ بڑھتی ہوئی CTPG ارتکاز کے ساتھ، خلیات چھوٹے اور گول ہو گئے اور سیل نمبر بھی بہت کم ہو گئے (تصویر 1a)۔ MTT پرکھ بالترتیب 24، 48، اور 72 h کے لئے CTPG علاج کے بعد H22 خلیوں کی عملداری کا تجزیہ کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ سی ٹی پی جی نے خوراک پر منحصر اور وقت پر منحصر انداز میں H22 سیل کی عملداری کو نمایاں طور پر کم کیا (تصویر 1b)۔ CTPG 300 ug/ml پر بہترین روک تھام کی شرح پر پہنچا (تصویر 1c)۔ H22 سیلز کے لیے CTPG کے IC50 کی قدریں 24 h پر 236 ug/ml اور 48 h پر 169.8 ug/ml ہیں۔

CTPG H22 خلیوں میں apoptosis کی حوصلہ افزائی کرتا ہے۔

اس بات کی جانچ کرنے کے لیے کہ آیا H22 خلیوں کی کم ہونے والی عملداری میں apoptosis کی شمولیت سے ثالثی کی گئی ہے، H22 خلیوں کا علاج CTPG کی مختلف ارتکاز (0, 100, 200, 300, اور 400 ug/ml) کے ساتھ 24 گھنٹے تک کیا گیا اور داغدار PI اور Annexin V کے ساتھ۔ بہاؤ سائٹوومیٹری کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ CTPG نے خوراک پر منحصر انداز میں H22 خلیات (بشمول ابتدائی اور دیر سے apoptosis) کے apoptosis کو نمایاں طور پر متاثر کیا (تصویر 2a)۔ اگرچہ CTPG کی زیادہ خوراک نے H22 خلیات کے نیکروسس میں بھی نمایاں اضافہ کیا، لیکن اپوپٹوسس (52.6 فیصد) کے مقابلے میں اس کے کم تناسب (8.3 فیصد) کی وجہ سے نیکروسس H22 خلیوں کی نشوونما کو روکنے میں ایک معمولی کردار ادا کرتا ہے۔ مزید، H22 خلیوں کے کل پروٹین کو CTPG علاج کے بعد الگ تھلگ کر دیا گیا تھا اور اینٹی اپوپٹوٹک B سیل لیمفوما 2 (Bcl-2) اور پرو اپوپٹوٹک BCL-2-سے وابستہ X پروٹین (بیکس) کے تاثرات کا پتہ چلا تھا۔ مغربی دھبہ۔ گرے اسکیل اسکیننگ ڈیٹا نے ظاہر کیا کہ Bax اور Bcl-2 کے اظہار کی سطحیں بالترتیب بڑھی اور کم ہوئیں۔ Bax/Bcl-2 تناسب میں نمایاں اضافہ ہوا تھا (تصویر 2b)۔ یہ نتائج تجویز کرتے ہیں کہ CTPG H22 خلیوں میں apoptosis کو اکساتا ہے۔

CTPG H22 خلیوں میں کروموسومل سنکشیشن اور سیل سائیکل گرفتاری کو اکساتا ہے۔

یہ اطلاع دی گئی ہے کہ منشیات کے ذریعہ ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان اور سیل سائیکل گرفتاری ٹیومر سیل کی نشوونما کو روک سکتی ہے اور ٹیومر خلیوں میں اپوپٹوس کا سبب بن سکتی ہے [17، 18]۔ 24 گھنٹے کے لئے CTPG علاج کے بعد H22 خلیوں میں نیوکلی کی شکل کا پتہ لگانے کے لئے، H22 خلیوں کو Hoechst 33,342 نے داغ دیا اور الٹی فلوروسینٹ مائکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے مشاہدہ کیا۔ سی ٹی پی جی کے علاج شدہ خلیات نے نیوکلی کے چمکدار گاڑھا کرومیٹن کی خوراک پر منحصر اضافہ دکھایا، جب کہ علاج نہ کیے جانے والے خلیوں نے یکساں طور پر داغ دار نیوکللی (تصویر 3 اے) کو دکھایا۔ H22 خلیوں میں سیل سائیکل کی تقسیم کا مزید تجزیہ پی آئی سٹیننگ کے ذریعے 24 گھنٹے تک CTPG علاج کے بعد کیا گیا۔ جیسا کہ تصویر 3b میں دکھایا گیا ہے، CTPG علاج نے G0/G1- اور G2/M-فیز سیلز کے تناسب کو نمایاں طور پر بڑھایا اور S-phase سیلز کے تناسب میں نمایاں کمی کی، یہ تجویز کرتا ہے کہ CTPG کی حوصلہ افزائی G 0/G1 اور G2/M فیز گرفتاری H22 سیلز میں۔ CTPG کی اعلی خوراک نے ذیلی G1 خلیوں کے تناسب میں بھی نمایاں اضافہ کیا۔

سی ٹی پی جی نے مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت کو کم کیا اور سائٹوکوم سی کی رہائی میں اضافہ کیا۔

مائٹوکونڈریل پر منحصر راستہ اپوپٹوسس [19، 20] کو شامل کرنے میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے۔ مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل (Δψm) کی تبدیلیوں کو JC-1 کی وجہ سے داغدار ہونے کی وجہ سے مانیٹر کیا جا سکتا ہے JC-1 ایگریگیٹ (ریڈ فلوروسینس) Δψm [21] کی کمی کے ساتھ مونومر (گرین فلوروسینس) میں ٹوٹ سکتا ہے۔ 24 گھنٹے کے لیے CTPG علاج کے بعد، H22 خلیات کو JC- 1 ڈائی سے داغ دیا گیا۔ فلو سائٹومیٹری ڈیٹا سے پتہ چلتا ہے کہ FL-2 چینل میں سرخ فلوروسینس اور FL-1 چینل میں سبز فلوروسینس میں نمایاں طور پر کمی اور CTPG علاج پر اضافہ ہوا ہے۔ PE− FITC پلس خلیات کے تناسب میں نمایاں اضافہ ہوا (تصویر 4a)، تجویز کرتا ہے کہ CTPG نے H22 خلیوں میں Δψm کو کم کیا۔ یہ بڑھے ہوئے Bax/Bcl-2 تناسب سے مطابقت رکھتا ہے۔ نتیجتاً، ہم نے مشاہدہ کیا کہ CTPG علاج (تصویر 4b) پر سائٹوکوم سی کی رہائی میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ سی ٹی پی جی جزوی طور پر مائٹوکونڈریل پر منحصر (اندرونی) راستے کے ذریعہ H22 خلیوں میں اپوپٹوس کو آمادہ کرسکتا ہے۔

سی ٹی پی جی نے کیسپیس پاتھ وے کو چالو کیا اور ڈی این اے کی مرمت کو روکا۔

اگلا، خارجی اور اندرونی سگنلنگ دونوں راستوں کے ذریعے CTPG کے ذریعہ کیسپیس کی ایکٹیویشن کا تجزیہ کیا گیا۔ 24 گھنٹے کے لئے CTPG علاج کے بعد، کل پروٹین کو H22 خلیوں سے الگ تھلگ کر دیا گیا تھا اور مغربی دھبے سے پرو اور کلیویڈ کیسپیس کی سطح کا پتہ چلا تھا۔ علاج نہ کیے جانے والے یا DMSO کنٹرول کے مقابلے میں، CTPG ٹریٹمنٹ نے نہ صرف کلیویڈ کیسپیس کی سطح کو نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا-8 (خارجی راستہ) بلکہ کلیویڈ کیسپیس-9 (انٹرنسک پاتھ وے) (تصویر 1) کی سطح کو بھی۔ 5)۔ ترتیب وار، ایکٹیویٹڈ کیسپیس-8 اور -9 نے بہاو پرو کیسپیس کو کلیو کیا-3 اور -7 جو کہ تصویر 5 میں دیکھا گیا تھا۔ ایکٹیویٹڈ کیسپیس-3 نے ڈی این اے کو کلیو کیا۔ پولی (ADP-ribose) پولیمریز (PARP) کا انزائم مرمت کریں تاکہ DNA کی مرمت کو روکا جا سکے اور DNA کے نقصان کو جمع کیا جا سکے جیسا کہ تصویر 3a میں دیکھا گیا ہے۔

ان نتائج نے اشارہ کیا کہ CTPG نے H22 خلیوں میں بیرونی اور اندرونی سگنلنگ راستوں کے ذریعے اپوپٹوسس کی حوصلہ افزائی کی۔

CTPG Vivo میں H22 HCC کی ترقی کو دباتا ہے اور ٹیومر چوہوں کی بقا کی شرح کو بہتر بناتا ہے۔

آخر میں، HCC پر CTPG کے اینٹیٹیمر اثر کا اندازہ ٹیومر ماؤس ماڈل میں کیا گیا، جو H22 خلیوں کے subcutaneous انجیکشن کے ذریعے قائم کیا گیا تھا۔ H22 سیل انجیکشن کے 3 دن کے بعد، ٹیومر چوہوں کا CTPG سے 8 بار علاج کیا گیا۔ چوہوں کے جسمانی وزن اور ٹیومر کے سائز کی نشاندہی کردہ ٹائم پوائنٹس پر نگرانی کی گئی۔ جیسا کہ تصویر 6a میں دکھایا گیا ہے، ہر گروپ میں چوہوں کے جسمانی وزن میں کوئی خاص فرق نہیں ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ CTPG کی منتخب خوراکوں کے کوئی واضح ضمنی اثرات نہیں ہیں۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ 200 mg/kg اور 400 mg/kg CTPG دونوں کے ساتھ علاج کیے گئے چوہوں میں ٹیومر کی نشوونما کو نمایاں طور پر روکا گیا تھا (تصویر 6b)۔ مزید یہ کہ، CTPG علاج کی دو خوراکوں نے تجربے کے اختتام پر کنٹرول گروپ (0/7) کے مقابلے میں ٹیومر چوہوں (3/7، 3/7) کی بقا کو بہت بہتر بنایا (تصویر 6b)۔ ہم نے یہ بھی پایا کہ CTPG نے خوراک پر منحصر انداز میں نر کنمنگ چوہوں سے الگ تھلگ splenocytes کے پھیلاؤ کو نمایاں طور پر بڑھایا (تصویر 6c)، یہ تجویز کرتا ہے کہ CTPG کا مدافعتی اثر ہے۔

بحث

TCM ایک طویل تاریخ سے کینسر سمیت مختلف بیماریوں کے علاج کے لیے استعمال ہوتا رہا ہے۔ یہ اطلاع دی گئی ہے کہ ٹی سی ایم ٹیومر کے خلیوں کی مختلف اقسام میں اپوپٹوس کو متاثر کر سکتا ہے دونوں خارجی (ڈیتھ ریسیپٹر ثالثی) اور اندرونی (مائٹوکونڈریا پر منحصر) سگنلنگ راستوں کے ذریعے اینٹیٹیمر اثرات [22–25]۔ دو راستے بالترتیب کیسپیس-8 اور -9 کو چالو کر سکتے ہیں [24, 26]۔ یہاں، ہم نے پایا کہ CTPG نے اپوپٹوسس اور سیل سائیکل گرفتاری کی شمولیت کے ذریعے H22 سیل کی نمو کو نمایاں طور پر دبایا۔ کلیویڈ کیسپیس-8 اور -9 کی سطحوں کو CTPG ٹریٹمنٹ کے ذریعے نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا، یہ تجویز کرتا ہے کہ اپوپٹوس کی شمولیت میں خارجی اور اندرونی سگنلنگ راستے دونوں شامل تھے۔ ہمارے پچھلے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ CTPG نے میلانوما B16-F10 خلیوں میں مائٹوکونڈریا پر منحصر راستے کے ذریعے apoptosis کی حوصلہ افزائی کی جس نے کلیویڈ کیسپیس کی سطح کو بڑھایا-9 لیکن کیسپیس نہیں-8 [16]۔ CTPG مختلف قسم کے ٹیومر سیلز میں سگنلنگ کے الگ الگ راستوں کو چالو کر سکتا ہے۔

مائٹوکونڈریل جھلی کی سالمیت کو BCL-2 پروٹین فیملی کے اراکین بشمول Bax اور Bcl-2 [27, 28] کے ذریعے سختی سے منظم کیا جاتا ہے۔ بیکس سے Bcl-2 کا تناسب مائٹوکونڈریا پر منحصر اپوپٹوسس پاتھ وے [29] میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ CTPG کے ذریعے علاج کیے گئے H22 خلیوں میں، Bax/Bcl-2 تناسب کو نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا گیا تھا، جو Δψm کی کمی اور اس مطالعے میں مشاہدہ کردہ سائٹوکوم c کی رہائی کا سبب بن سکتا ہے۔ نتیجتاً، پرو کیسپیس-9 کو کلیو کر کے فعال کر دیا گیا تھا۔ آخر کار، ایکٹو کیسپیس کے شروع کرنے والوں نے-8 اور -9 نے ڈی این اے کی مرمت کو روکنے کے لیے PARP کو ​​صاف کرنے کے لیے کیسپیس-3 کے پھانسی دینے والے کو چالو کیا۔ ایک ساتھ مل کر، ان نتائج نے تجویز کیا کہ CTPG نے H22 خلیوں میں خارجی اور اندرونی سگنلنگ دونوں راستوں کے ذریعے apoptosis کی حوصلہ افزائی کی۔

ٹیومر ماؤس ماڈل میں، CTPG نے H22 HCC کی نمو کو نمایاں طور پر دبایا اور ٹیومر چوہوں کی بقا کو بہت بہتر کیا۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ، CTPG خوراک پر انحصار کرتے ہوئے کنمنگ چوہوں سے splenocytes کے پھیلاؤ کو فروغ دیا، جو ہمارے پچھلے مطالعہ کے مطابق ہے [16]۔

ان نتائج نے تجویز کیا کہ CTPG براہ راست اینٹیٹیمر اثر اور بالواسطہ مدافعتی اضافہ دونوں کے ذریعہ چوہوں میں H22 HCC کی نشوونما کو دبا سکتا ہے۔

نتائج

سی ٹی پی جی نے وٹرو اور ویوو دونوں میں H22 خلیوں کی نشوونما کو دبایا اور H22 خلیوں میں بیرونی اور اندرونی سگنلنگ راستوں کے ذریعے اپوپٹوسس کی حوصلہ افزائی کی۔ ان اعداد و شمار نے اشارہ کیا کہ CTPG HCC کے علاج کے لیے ممکنہ امیدوار ہو سکتا ہے۔