Cistanche Tubulosa سے Chalcone Synthase کی کلوننگ، فنکشنل شناخت اور اظہار کا تجزیہ

خلاصہ: مقصد

کے فنکشن کا مطالعہ کرناCistanche tubulosa سے chalcone synthaseاور سفید، سرخ اور جامنی رنگ کے پھولوں میں CTCHS جین کا اظہار پیٹرن۔

طریقےCtCHS جین کا کلون RT-PCR کے ذریعے کیا گیا اور بائیو انفارمیٹکس تجزیہ کیا گیا۔ PET-28a-CtCHS پلاسمڈ کو ایسچریچیا کولی میں منتقل کیا گیا تھا تاکہ IPTG کے ذریعہ پروٹین کے اظہار کی حوصلہ افزائی کی جا سکے۔ CtCHS ریکومبیننٹ پروٹین کو سبسٹریٹس p-coumaroyl CoA اور malonyl CoA کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا، اور HPLC اور MS کے ذریعہ مصنوعات کا پتہ چلا تھا۔ pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS پلازمڈ کو Arabidopsis thaliana کے پروٹوپلاسٹ میں منتقل کیا گیا تاکہ CtCHS پروٹین کے ذیلی خلوی لوکلائزیشن کا مشاہدہ کیا جا سکے۔ تین رنگوں والے C. tubulosa کے پھولوں میں CtCHS جین کے اظہار کا نمونہ qRT-PCR سے پتہ چلا۔

نتائجایک CTCHS جین کلون کیا گیا تھا۔ اوپن ریڈنگ فریم (ORF) کی لمبائی 1173 bp تھی، جس میں 390 امینو ایسڈ کو انکوڈنگ کیا گیا تھا، اور پروٹین کا سالماتی وزن 42 8000 تھا۔

30% ایکچیناکوسائیڈ اور 12% ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ آرگینک سیسٹانچ ایکسٹریکٹ

CTCHS میں اتپریرک باقیات Cys164, His303, Asn336 شامل تھے، جو چالکون سنتھیس میں محفوظ تھے۔ CtCHS پروٹین کا اظہار E. coli میں کیا گیا تھا اور دوبارہ پیدا ہونے والے پروٹین کو حاصل کرنے کے لیے پاک کیا گیا تھا۔ سی ٹی سی ایچ ایس پروٹین پی-کومارول CoA اور میلونیل CoA کو نارینجنن چالکون پیدا کرنے کے لیے اتپریرک کر سکتا ہے۔ سی ٹی سی ایچ ایس پروٹین بنیادی طور پر سائٹوپلازم میں مقامی تھا۔ جامنی اور سرخ پھولوں میں CtCHS جین کا بہت زیادہ اظہار کیا گیا تھا، اور متعلقہ اظہار کی سطح سفید رنگ کے پھولوں کے مقابلے میں بالترتیب 8.44 اور 3.21 گنا زیادہ تھی۔

نتیجہ C. tubulosa کے پھول سے CtCHS جین کا کلون کیا گیا اور پروٹین کا اظہار کیا گیا۔ CtCHS پروٹین میں چالکون سنتھیز کا کام ہوتا ہے، اور گہرے پھولوں میں CtCHS جین کا اظہار زیادہ ہوتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ CtCHS جین C. tubulosa کے پھولوں کے رنگ کو ریگولیٹ کر سکتا ہے، جو C کے پھولوں کے رنگ کے ریگولیشن میکانزم پر مزید تحقیق کی بنیاد رکھتا ہے۔ ٹیوبلوسا

کلیدی الفاظ: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; چالکون سنتھیس؛ انزائم سرگرمی کا تجزیہ؛ subcellular لوکلائزیشن؛ اظہار تجزیہ

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT جینس Pyreal پلانٹ ہے، جو قدرتی طور پر جنوبی سنکیانگ [1] میں سنکیانگ کے ہیٹیان علاقے میں تقسیم کیا جاتا ہے [2]۔ پائپ کے پھول دواؤں کی قیمت میں بہت زیادہ ہیں۔ اس کے گوشت کے تنے 2020 ورژن کے ذرائع میں سے ایک ہیں۔چینی فارماکوپیا". [3] پائپ کے پھولوں پر تحقیق میں اضافہ ہوا ہے، لیکن اس کے پھولوں پر حیاتیاتی تحقیق نسبتاً کم ہے۔ پائپ کے پھولوں کے پھول آنے کا دورانیہ اپریل سے مئی تک ہوتا ہے [4]، بنیادی طور پر سفید کے تین رنگ ہوتے ہیں۔ , سرخ اور جامنی رنگ کے پھول رنگ میں امیر ہیں، لیکن ان کے پھولوں کے رنگ ریگولیشن کے طریقہ کار کا تعلق پنکھڑیوں کے بافتوں کی ساخت، رنگت اور ریگولیشن سے نہیں ہے۔ اور جینیاتی عوامل [5] میں بنیادی طور پر تین قسمیں شامل ہیں: فلیوونائڈز، کیروٹین اور بیٹین، سب سے زیادہ وسیع رنگ کی حد [7] Paeonia Lactiflora Pal کی تین اقسام کے طور پر۔

یہ سفید کے طور پر ظاہر ہوتا ہے، اور رنگ کا بنیادی رنگ سرخ رنگ پر مشتمل ہوتا ہے اور خوبصورت قابلیت پھولوں کو جامنی رنگ کے سرخ بناتی ہے [8]۔ پھولوں کا رنگ بہت سے سجاوٹی پودوں کی ایک اہم خصوصیت ہے، اور یہ گلابی کیڑوں کو اپنی طرف متوجہ کرنے والا کلیدی عنصر بھی ہے [9]۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ یہ کیڑوں کے دوروں کی سب سے زیادہ تعدد گہری جامنی رنگ کا سیستانچ پلانٹ ہے [10]۔ ٹیوب پھول cistanosaurus پھولوں میں cistanoids کے مصنوعی جینیاتی تحقیق پر حیاتیاتی تحقیق کے لیے، یہ ٹیوب پھول کورڈن رنگنے کے کنٹرول کے طریقہ کار کو واضح کرنے کے لیے موزوں ہے، جینیاتی انجینئرنگ ٹیکنالوجی کے رنگ کو بہتر بنانے کے لیے نظریاتی بنیاد فراہم کرتا ہے، اس کے بھرپور رنگوں کو فروغ دیتا ہے، دیکھنے میں اضافہ کرتا ہے۔ ایپلی کیشنز کے دائرہ کار کو بڑھانا۔

کا بایوسنتھیٹک راستہflavonoidsکے ساتھ شروع ہوتا ہےphenylpropanoid راستہ. فینی لالینین سب سے پہلے فینیلیلینین امونیالیس (PAL) کے عمل کے تحت cinnamic acid میں تبدیل ہوتا ہے، اور cinnamic acid 4- cinnamic acid کے ذریعے ہائیڈرو آکسیلیٹ ہوتا ہے۔ انزائم (سنامیک ایسڈ-4-ہائیڈروکسیلیس، C4H) اور 4-کوماریٹ کوینزائم اے لیگیس (4-کوماریٹ کوینزائم اے لیگیس، 4CL) 4-coumaroyl-CoA پیدا کرنے کے رد عمل کو متحرک کرتے ہیں۔ [11]۔ 4- coumaroyl-CoA کا ایک مالیکیول اور malonyl-CoA کے تین مالیکیول کو چلکون سنتھیس (CHS) کے ذریعے اتپریرک کیا جاتا ہے تاکہ نارینجنن چالکون پیدا ہو، جس میںflavonoid مرکبات.chalcone isomerase، flavanone-3-hydroxylase، dihydroflavonol 4-reductase، وغیرہ کا بنیادی ڈھانچہ مختلف قسم کے flavonoids جیسے isoflavones، flavonols، anthocyanins وغیرہ پیدا کرتا ہے۔ [12]۔ flavonoid biosynthetic پاتھ وے میں کلیدی انزائم کے طور پر، CHS پودوں میں flavonoids کے مواد کو منظم کرتا ہے اور پودوں کے پھولوں کے رنگ کو منظم کرنے میں بھی اہم کردار ادا کرتا ہے [13]۔ مثال کے طور پر، Gentiana scabra Bunge CHS کے بعد نقلی جین کی خاموشی اینتھوسیاننز کے بایو سنتھیسز کو روک سکتی ہے اور کرولا لوبوں کی مخصوص سفیدی کا سبب بن سکتی ہے [14]۔ ایکٹینیڈیا ایرینتھا بینتھ کا CHS جین خاموش ہونا۔ CHS پنکھڑیوں میں اینتھوسیانین مواد کو کم کرتا ہے اور سرخ پنکھڑیوں کا رنگ ہلکا ہونے کا سبب بنتا ہے [15]۔ لہٰذا، اس تحقیق میں، Cistanche deserticola پھولوں سے ایک CtCHS جین کا کلون کیا گیا، اور CtCHS کے فنکشن کو دریافت کرنے کے لیے اس پر بائیو انفارمیٹکس تجزیہ، پروکاریوٹک ایکسپریشن اور پیوریفیکیشن، انزائم ایکٹیویٹی کا تجزیہ، ذیلی سیلولر لوکلائزیشن کا تجزیہ اور اظہار کا تجزیہ کیا گیا۔ پروٹین اور CtCHS جین کے اظہار کا نمونہ ابتدائی طور پر CtCHS اور Cistanche deserticola پھولوں کے رنگ کے درمیان تعلق کو دریافت کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، جس نے Cistanche deserticola پھول کے رنگ کے ریگولیٹری میکانزم کے مطالعہ کی بنیاد رکھی تھی۔

1 مواد اور آلات

1.1 مواد

مئی 2018 میں یوٹیان کاؤنٹی، ہوٹن پریفیکچر، سنکیانگ سے Cistanche tuberosa کے پھول جمع کیے گئے۔ نمونے لینے کے دوران بے ترتیب اصول کی پیروی کی گئی، اور Cistanche tuberosa کے پھولوں کا انتخاب کیا گیا جن کی جسمانی حیثیت اور پودوں کی مستقل اونچائی تھی۔ پیکنگ یونیورسٹی سکول آف فارمیسی کے پروفیسر ٹو پینگفی کے ذریعہ Cistanche deserticola کی تین قسمیں سفید، سرخ اور جامنی کے تین پھولوں کے ساتھ لی گئیں اور ان کی شناخت Cistanche tubulosa (Schenk) Wight کے طور پر کی گئی۔ انہیں فوری طور پر مائع نائٹروجن میں منجمد کر دیا گیا، خشک برف پر ذخیرہ کیا گیا اور بیجنگ پہنچا دیا گیا۔ E. coli DH5 کیمیاوی طور پر قابل خلیات نانجنگ نووزان بائیو ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ سے خریدے گئے تھے، اور E. کولی BL21 (DE3) کیمیاوی طور پر قابل سیل سیل بیجنگ Quanshijin Biotechnology Co., Ltd. سے خریدے گئے تھے۔ pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP ویکٹر کو ووہان ٹرانسڈکشن بائیولوجی لیبارٹری کمپنی لمیٹڈ سے خریدا گیا تھا۔ Malonyl-CoA سگما کمپنی، 4-coumaroyl-CoA، naringenin سے خریدا گیا تھا۔ -چالکون کو شنگھائی یوآنی بائیوٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ سے خریدا گیا تھا، اور نارنگینن کو شنگھائی میک لین بائیو کیمیکل ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ سے خریدا گیا تھا۔

1.2 آلات

Nanodrop 2000C سپیکٹرو فوٹومیٹر (تھرمو فشر کمپنی، USA)؛ گریڈینٹ پی سی آر آلہ (ایپینڈورف کمپنی، جرمنی)؛ CFX 96 فلوروسینس مقداری PCR آلہ، UVP جیل امیجر، جیل الیکٹروفورسس آلہ، پروٹین الیکٹروفورسس آلہ (BioRad کمپنی، USA)؛ EnSpire

مائکروپلیٹ ریڈر (PerkinElmer کمپنی، USA)؛ مستقل درجہ حرارت انکیوبیٹر (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.)؛ DHZ-D بڑی صلاحیت والا فل ٹمپریچر آسکیلیٹر (تائیکانگ تجرباتی آلات کی فیکٹری)؛ THZ-82پانی کے غسل کے مستقل درجہ حرارت کا آسکیلیٹر (جیانگ سو کیکسی انسٹرومنٹ کمپنی لمیٹڈ)؛ AIRTECH الٹرا کلین ورک بینچ (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.)؛ ہائی پریشر بھاپ سٹرلائزر (TOMY کمپنی، جاپان)؛ ملی کیو خالص پانی کا آلہ (ملی پور، امریکہ)؛ LC-20ایک اعلی کارکردگی والا مائع فیز کرومیٹوگراف (Shimadzu Company, Japan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap ہائی ریزولوشن ماس اسپیکٹومیٹری (تھرمو فشر کمپنی، USA)؛ FV1200 لیزر کنفوکل مائکروسکوپ (اولمپس کمپنی، جاپان)۔

2 تجرباتی طریقے

2.1 آر این اے نکالنا اور سی ڈی این اے ترکیب۔ Cistanche deserticola پھولوں کو مائع نائٹروجن میں پیس دیا گیا اور پھر RNA نکالنے پرکھ کا نشانہ بنایا گیا۔

ٹوٹل آر این اے کو ایک کٹ (نورجن، کیٹ 17200) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا، نینو ڈراپ 2000C کے ذریعے RNA کی حراستی اور معیار کا پتہ لگایا گیا، اور 1.8 اور 2.1 کے درمیان A260/A280 تناسب والے RNA نمونے cDNA کی ریورس ٹرانسکرپشن ترکیب کے لیے منتخب کیے گئے۔ M-MLV ریورس ٹرانسکرپٹیس (پرومیگا، M170B) کوالیفائیڈ کل RNA کو cDNA میں ریورس ٹرانسکرائب کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ تجرباتی آپریشن ہدایات کے مطابق کیے گئے تھے۔

2.2 CtCHS جین کی کلوننگ

ہمارے ریسرچ گروپ [16] کے Cistanche deserticola پھولوں کے ٹرانسکروم ڈیٹا کی بنیاد پر، مکمل اوپن ریڈنگ فریم کے ساتھ ایک CtCHS اسکرین کیا گیا، اور SnapGene سافٹ ویئر کو جین کی ترتیب (ٹیبل 1) کی بنیاد پر مخصوص پرائمر ڈیزائن کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ پی سی آر پروردن ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر Cistanche deserticola پھول cDNA کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ ایمپلیفیکیشن سسٹم 2×Phanta Max Buffer 25 μL، dNTP مکس (10 mmol/L) 1 μL، اپ اسٹریم اور ڈاؤن اسٹریم پرائمر (10 μmol/L) 2 μL ہر ایک، cDNA 2 μL، فانٹا میکس سپر فیڈیلیٹی

ڈی این اے پولیمریز 1 μL، ddH2O 17 μL۔ رد عمل کے حالات یہ تھے: 3 منٹ کے لیے 95 ڈگری پر پری ڈینیچریشن؛ 15 سیکنڈ کے لیے 95 ڈگری پر ڈینیچریشن کے 25 چکر، 15 سیکنڈ کے لیے 55 ڈگری پر اینیلنگ، اور 1 منٹ کے لیے 72 ڈگری پر توسیع؛ اور رد عمل کی توسیع 72 ڈگری پر 5 منٹ کے لیے۔ PCR پروڈکٹ کا پتہ 1% ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے پایا گیا تھا، اور ڈی این اے پیوریفیکیشن کٹ (نوویزان، کیٹ ڈی سی301-01) کو جیل کی بازیابی کے لیے استعمال کیا گیا تھا، اور پھر برآمد شدہ ڈی این اے کو تیز رفتار کلوننگ کٹ (نوویزان، کیٹ) کے ذریعے صاف کیا گیا تھا۔ C601-01)۔ ڈی این اے کا ٹکڑا pCE2 TA/Blunt-Zero ویکٹر کے ساتھ باندھا گیا، Escherichia coli DH5 قابل خلیات میں تبدیل ہو گیا، اور 37 ڈگری پر راتوں رات کلچر کرنے کے بعد، سنگل کلون کے تناؤ کو منتخب کر کے کمپنی کو ترتیب دینے کے لیے بھیجا گیا۔

جدول 1 پرائمر کی ترتیب

2.3 بایو انفارمیٹکس تجزیہ

پروٹین کی جسمانی اور کیمیائی خصوصیات کا تجزیہ کرنے کے لیے ProtParam آن لائن سافٹ ویئر استعمال کریں۔ پروٹین ہائیڈرو فیلیسیٹی/ہائیڈرو فوبیسٹی کا تجزیہ کرنے کے لیے پروٹ اسکیل آن لائن ٹول کا استعمال کریں۔ پروٹین کے ثانوی ڈھانچے کی پیشن گوئی کرنے کے لیے آن لائن ٹول SOPMA استعمال کریں۔ آن لائن تجزیہ سافٹ ویئر SWISS-MODEL کا استعمال کریں تاکہ پروٹین کی ترتیری ساخت کی پیشن گوئی کی جا سکے۔ آن لائن سافٹ ویئر کا استعمال کریں TMHMM پروٹین کے ٹرانس میمبرین ڈھانچے کی پیش گوئی کریں؛ CtCHS کی ہومولوجی کا موازنہ دوسری پرجاتیوں کے CHS امینو ایسڈ کی ترتیب سے کرنے کے لیے DNAMAN سافٹ ویئر استعمال کریں۔ پڑوسی جوائننگ (NJ) اور Poisson تصحیح کا استعمال کرتے ہوئے فائیلوجنیٹک درخت کی تعمیر کے لیے MEGA-X سافٹ ویئر کا استعمال کریں ارتقائی فاصلے کا حساب بوٹسٹریپ طریقہ سے کیا جاتا ہے، اور بوٹسٹریپ کی تکرار کی تعداد 1000 گنا ہے۔

مزید پتہ لگانے کے لیے UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS کا استعمال کیا گیا۔ مائع مرحلے کے حالات واٹر ایکویٹی UPLC BEH شیلڈ RP18 کالم (100 ملی میٹر × 3۔{31}} ملی میٹر، 1.7 μm)، کالم کا درجہ حرارت 40 ڈگری، نارنگینن تھے۔ ، چالکون اور نارنگینن۔ کنٹرول مادہ کی لوڈنگ والیوم 4 μL ہے، اور انزائم ری ایکشن پروڈکٹ کی لوڈنگ والیوم 7 μL ہے۔ پانی (A)-acetonitrile (B) کو موبائل مرحلے کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ اخراج کا میلان ہے: 0 سے 5 منٹ، 30% B؛ 5 سے 15 منٹ۔ ، 30% ~ 60% B؛ 15~20 منٹ، 60%~100% B؛ 20~25 منٹ، 100% B؛ 25~31 منٹ، 100%~30% B۔ حجمی بہاؤ کی شرح 0.3 ملی لیٹر/منٹ ہے۔ ماس سپیکٹرو میٹری حالات الیکٹرو سپرے آئن سورس، کیریئر گیس کے طور پر نائٹروجن، میان گیس پریشر 3.5 MPa، معاون گیس پریشر 1.0 MPa، سپرے پریشر 3500 V، کیپلیری درجہ حرارت 350 ڈگری، معاون گیس حرارتی درجہ حرارت 200 ڈگری، مثبت اور منفی آئن موڈ ہیں۔ آئن رینج m/z ہے 100-1500، مکمل MS ریزولوشن 35 000 ہے، dd-MS2 ریزولوشن ہے 17 500، (N)

CE/stepped nce 35, 60 پر سیٹ ہے۔

2.6 CTCHS پروٹین کا ذیلی سیلولر لوکلائزیشن

CtCHS ترتیب اور ہموار کلوننگ کے اصول کی بنیاد پر، انزائم کٹنگ سائٹس Kpn Ⅰ اور BamH Ⅰ کے ساتھ پرائمر ڈیزائن کیے گئے تھے، اور متعلقہ ہدف کے ٹکڑوں کو PCR کے ذریعے بڑھا دیا گیا تھا۔ pCAMBIA1300-35S-GFP پلازمیڈ کو پابندی والے اینڈونکلیز Kpn Ⅰ اور BamH Ⅰ کے ساتھ ہضم کیا گیا تھا، اور ہدف کے ٹکڑے اور ویکٹر کو بغیر کسی رکاوٹ کے کلوننگ کٹ (نوویزان، کیٹ سی115-01) کے ذریعے جوڑا گیا تھا، اور پھر منتقل کیا گیا تھا۔ E. کولی DH5 قابل خلیوں میں۔ ترتیب دینے کے لیے سنگل کلون اسٹرینز کا انتخاب کریں، اور صحیح تناؤ سے پلازمیڈ نکالیں۔ pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS اور pCAMBIA 1300-35S-GFP پلازمیڈ PEG4000 کا استعمال کرتے ہوئے Arabidopsis thaliana پروٹوپلاسٹ میں تبدیل ہو گئے تھے، اور 8 سے 10 گھنٹے تک کم روشنی میں کلچر کیے گئے تھے۔ سی ٹی سی ایچ ایس پروٹین کے ذیلی سیلولر لوکلائزیشن کو لیزر کنفوکل مائکروسکوپ کے تحت دیکھا گیا۔

2.7 CTCHS اظہار پیٹرن کا تجزیہ

CtCHS ترتیب کی بنیاد پر، DNAMAN کو اصل وقت میں فلوروسینس مقداری پرائمر ڈیزائن کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، جس میں F-box اندرونی حوالہ جین کے طور پر تھا۔ پرائمر کے سلسلے ٹیبل 1 میں دکھائے گئے ہیں۔ مختلف رنگوں کے Cistanche deserticola پھولوں میں CtCHS کے متعلقہ اظہار کا پتہ ریئل ٹائم فلوروسینس مقداری PCR کے ذریعے کیا گیا۔ SYBR گرین فلوروسینٹ ڈائی کے طریقہ کار سے پیمائش کرنے کے لیے TransStart Green qPCR SuperMix (Full Gold, AQ101-02) کا استعمال کریں: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL، upstream اور downstream پرائمر (10

μmol/L) {{0}}.2 μL ہر ایک، cDNA ٹیمپلیٹ 0.5 μL، نیوکلیوٹائڈیز سے پاک پانی 4.1 μL، رد عمل کے لیے دو قدمی طریقہ استعمال کیا گیا تھا، اور رد عمل کا طریقہ کار طریقہ پر مبنی تھا۔ ڈونگ Xianjuan et al. [18]۔ ہر نمونے میں 3 حیاتیاتی نقلیں تھیں، اور تجربہ تین بار دہرایا گیا۔ ایکسل ٹو 2 کا استعمال کرتے ہوئے تجرباتی ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔

CtCHS کے متعلقہ اظہار کا حساب −ΔΔCt طریقہ استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، اور گراف پیڈ پرزم 8 کو اہمیت کا تجزیہ کرنے اور ہسٹوگرامس بنانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔