Cistanche Tubulosa سے Chalcone Synthase کی کلوننگ، فنکشنل شناخت اور اظہار کا تجزیہ

خلاصہ: مقصد Guanhuaroucongrong سے چالکون سنتھیس کے فنکشن کا مطالعہ کرنا (Cistanche tubulosa) اور سفید، سرخ اور جامنی رنگ کے پھولوں میں CTCHS جین کا اظہار پیٹرن۔

طریقے CtCHS جین کو RT-PCR کے ذریعے کلون کیا گیا اور بائیو انفارمیٹکس کا تجزیہ کیا گیا۔ پی ای ٹی-28a-CtCHS پلاسمڈ کو آئی پی ٹی جی کے ذریعہ پروٹین ایکسپریشن دلانے کے لیے ایسچریچیا کولی میں منتقل کیا گیا تھا۔ CtCHS ریکومبیننٹ پروٹین کو سبسٹریٹس p-coumaroyl CoA اور malonyl CoA کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا، اور HPLC اور MS کے ذریعہ مصنوعات کا پتہ چلا تھا۔ pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS پلازمڈ کو Arabidopsis thaliana کے پروٹوپلاسٹ میں منتقل کیا گیا تاکہ CtCHS پروٹین کے ذیلی خلوی لوکلائزیشن کا مشاہدہ کیا جا سکے۔ کے پھولوں میں CtCHSgene کا اظہار پیٹرنC. tubulosaتین رنگوں کے ساتھ qRT-PCR کے ذریعے پتہ چلا۔

نتائج CtCHS جین کا کلون کیا گیا تھا۔ اوپن ریڈنگ فریم (ORF) کی لمبائی 1173 bp تھی، جس میں 390 امینو ایسڈز کو انکوڈنگ کیا گیا تھا، اور پروٹین کا سالماتی وزن 42 8000 تھا۔CtCHS میں اتپریرک باقیات Cys164, His303, Asn336 شامل تھے، جو چالکون سنتھیس میں محفوظ تھے۔ CtCHSprotein E. coli میں ظاہر کیا گیا تھا اور دوبارہ پیدا ہونے والے پروٹین کو حاصل کرنے کے لیے پاک کیا گیا تھا۔ سی ٹی سی ایچ ایس پروٹین پی-کومارول CoA اور میلونیل CoA کو نارنجینن چالکون پیدا کرنے کے لیے متحرک کر سکتا ہے۔ سی ٹی سی ایچ ایس پروٹین بنیادی طور پر سائٹوپلازم میں مقامی تھا۔ سی ٹی سی ایچ ایس جین جامنی اور سرخ پھولوں میں بہت زیادہ ظاہر ہوتا ہے، اور متعلقہ اظہار کی سطح بالترتیب سفید پھولوں کے مقابلے میں 8.44 اور 3.21 گنا زیادہ تھی۔

نتیجہ ایک CtCHS جین کے پھول سے کلون کیا گیا تھا۔C. tubulosaاور پروٹین کا اظہار کیا گیا تھا۔ CtCHSprotein میں chalcone synthase فنکشن ہوتا ہے، اور CtCHS جین کا اظہار گہرے پھولوں میں زیادہ ہوتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ CtCHSgene C. tubulosa کے پھولوں کے رنگ کو منظم کر سکتا ہے، جو اس پر مزید تحقیق کی بنیاد رکھتا ہے۔C. tubulosa کے پھولوں کے رنگ کا ریگولیشن میکانزم.

مطلوبہ الفاظ:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; چالکون سنتھیس؛ انزائم سرگرمی کا تجزیہ؛ subcellular لوکلائزیشن؛ اظہار تجزیہ

30% ایکیناکوسائیڈ اور 12% ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ قدرتی آرگینک سیسٹانچ ایکسٹریکٹ حاصل کرنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

Wecistanche کی معاون خدمت - چین میں سب سے بڑا cistanche برآمد کنندہ:

ای میل:wallence.suen@wecistanche.com

واٹس ایپ٪ 2ftel٪3a٪7b٪7b0٪7d٪7d

مزید تفصیلات کے لیے خریداری کریں:

https://www.xjcistanche.com٪2014-شاپ

حیاتیاتی مصنوعیflavonoids کا راستہphenylpropanoid راستے سے شروع ہوتا ہے۔فینی لیلینائنسب سے پہلے کے تحت cinnamic ایسڈ میں تبدیل کیا جاتا ہےفینیلیلینین امونیالیس کی کارروائی(PAL)، اور دار چینی تیزاب 4-سنامک ایسڈ سے ہائیڈرو آکسیلیٹ ہوتا ہے۔ انزائم (سنامیک ایسڈ-4-ہائیڈروکسیلیس، C4H) اور 4-coumaratecoenzyme A ligase (4-coumaratecoenzyme A ligase, 4CL) 4-coumaroyl-CoA [11] پیدا کرنے کے رد عمل کو متحرک کرتے ہیں۔ ] 4-coumaroyl-CoA کا ایک مالیکیول اور malonyl-CoA کے تین سالموں کو چالکون سنتھیس (CHS) کے ذریعے اتپریرک کر کے نارینجنن چالکون پیدا کیا جاتا ہے، جس میں flavonoid مرکبات ہوتے ہیں چالکون isomerase کا بنیادی ڈھانچہ، flavanone flavanone{12}, dihydroflavonol 4-reductase، وغیرہ مختلف قسم کے flavonoids پیدا کرتا ہے جیسے isoflavones، flavonols، anthocyanins، وغیرہ۔ [12]۔ flavonoid biosynthetic پاتھ وے میں کلیدی انزائم کے طور پر، CHS پودوں میں flavonoids کے مواد کو منظم کرتا ہے اور پودوں کے پھولوں کے رنگ کو منظم کرنے میں بھی اہم کردار ادا کرتا ہے [13]۔ مثال کے طور پر، Gentiana scabra Bunge CHS کے بعد نقلی جین کی خاموشی اینتھوسیاننز کے بایو سنتھیسز کو روک سکتی ہے اور کرولا لوبوں کی مخصوص سفیدی کا سبب بن سکتی ہے [14]۔ Actinidia erianthaBenth کے CHS جین کی خاموشی۔ CHS پنکھڑیوں میں اینتھوسیانین مواد کو کم کرتا ہے اور پنکھڑیوں کو سرخ بناتا ہے۔ پنکھڑیوں کا رنگ ہلکا ہو جاتا ہے[15]۔ لہذا، اس مطالعہ میں، Cistanche tubulosa کے پھولوں سے ایک CtCHS جین کا کلون کیا گیا، اور CtCHS کے فنکشن کو دریافت کرنے کے لیے اس پر بائیو انفارمیٹکس تجزیہ، پروکاریوٹک اظہار اور صاف کرنے، انزائم ایکٹیویٹی تجزیہ، ذیلی سیلولر لوکلائزیشن کا تجزیہ اور اظہار کا تجزیہ کیا گیا۔ پروٹین اور CtCHS جین کے اظہار پیٹرن کا استعمال ابتدائی طور پر CtCHS اور Cistanche tubulosa پھولوں کے رنگ کے درمیان تعلق کو دریافت کرنے کے لیے کیا گیا تھا، جس نے اس کے ریگولیٹری میکانزم کے مطالعہ کی بنیاد رکھی۔Cistanche tubulosa پھول کا رنگ.

1 مواد اور آلات

1.1 مواد

مئی 2018 میں یوٹیان کاؤنٹی، ہوٹن پریفیکچر، سنکیانگ سے Cistanche tubulosa کے پھول جمع کیے گئے تھے۔ نمونے لینے کے دوران بے ترتیب اصول کی پیروی کی گئی، اور Cistanche tubulosa کے پھولوں کا انتخاب کیا گیا جن کی جسمانی حیثیت اور پودوں کی مستقل اونچائی تھی۔ پیکنگ یونیورسٹی اسکول آف فارمیسی کے پروفیسر ٹو پینگفی کے ذریعہ Cistanche tubulosa کے تین قسم کے سفید، سرخ اور جامنی رنگ کے تین پھولوں کے ساتھ لیے گئے اور ان کی شناخت Cistanche tubulosa (Schenk) Wight کے طور پر کی گئی۔ انہیں فوری طور پر مائع نائٹروجن میں منجمد کر دیا گیا اور پھر خشک برف کے ذخیرے میں بیجنگ پہنچا دیا گیا۔ E. coli DH5 کیمیاوی طور پر قابل خلیات نانجنگ نووزان بائیو ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ سے خریدے گئے تھے، اور E. کولی BL21 (DE3) کیمیاوی طور پر قابل سیل سیل بیجنگ Quanshijin Biotechnology Co., Ltd. سے خریدے گئے تھے۔ pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP ویکٹر کو ووہان ٹرانسڈکشن بائیولوجی لیبارٹری کمپنی لمیٹڈ سے خریدا گیا تھا۔ Malonyl-CoA سگما کمپنی، 4-coumaroyl-CoA، naringenin سے خریدا گیا تھا۔ -چالکون کو شنگھائی یوآنی بائیوٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ سے خریدا گیا تھا، اور نارنگینن کو شنگھائی میک لین بائیو کیمیکل ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ سے خریدا گیا تھا۔

1.2 آلات

Nanodrop 2000C سپیکٹرو فوٹومیٹر (تھرمو فشر کمپنی، USA)؛ گریڈینٹ پی سی آر آلہ (ایپینڈورف کمپنی، جرمنی)؛ CFX 96 فلوروسینس مقداری PCR آلہ، UVP جیل امیجر، جیل الیکٹروفورسس آلہ، پروٹین الیکٹروفورسس آلہ (BioRad کمپنی، USA)؛ EnSpire

مائکروپلیٹ ریڈر (PerkinElmer کمپنی، USA)؛ مستقل درجہ حرارت انکیوبیٹر (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.)؛ DHZ-D بڑی صلاحیت والا فل ٹمپریچر آسکیلیٹر (تائیکانگ تجرباتی آلات کی فیکٹری)؛ THZ-82پانی کے غسل کے مستقل درجہ حرارت کا آسکیلیٹر (جیانگ سو کیکسی انسٹرومنٹ کمپنی لمیٹڈ)؛ AIRTECH الٹرا کلین ورک بینچ (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.)؛ ہائی پریشر بھاپ سٹرلائزر (TOMY کمپنی، جاپان)؛ ملی کیو خالص پانی کا آلہ (ملی پور، امریکہ)؛ LC-20ایک اعلی کارکردگی والا مائع فیز کرومیٹوگراف (Shimadzu Company, Japan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap ہائی ریزولوشن ماس اسپیکٹومیٹری (تھرمو فشر کمپنی، USA)؛ FV1200 لیزر کنفوکل مائکروسکوپ (اولمپس کمپنی، جاپان)۔

2 تجرباتی طریقے

2.1 آر این اے نکالنا اور سی ڈی این اے ترکیب۔

Cistanche tubulosa کے پھولوں کو مائع نائٹروجن میں پیس دیا گیا اور پھر RNA نکالنے کے پرکھ کا نشانہ بنایا گیا۔

کل آر این اے کو ایک کٹ (نورجن، کیٹ 17200) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا، RNA کی حراستی اور معیار کا پتہ NanoDrop 2000C کے ذریعے کیا گیا تھا، اور RNA کے نمونے 1.8 اور 2.1 کے درمیان A260/A280 تناسب کے ساتھ cDNA کی ترکیب کے لیے ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے منتخب کیے گئے تھے۔ M-MLV ریورس ٹرانسکرپٹیس (پرومیگا، M170B) کوالیفائیڈ کل RNA کو cDNA میں ریورس ٹرانسکرائب کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ تجرباتی آپریشن ہدایات کے مطابق کیے گئے تھے۔

2.2 CtCHS جین کی کلوننگ

ہمارے ریسرچ گروپ [16] کے Cistanche tubulosa پھول ٹرانسکروم ڈیٹا کی بنیاد پر، ایک مکمل اوپن ریڈنگ فریم والا CtCHS اسکرین کیا گیا، اور SnapGene سافٹ ویئر کو جین کی ترتیب (ٹیبل 1) کی بنیاد پر مخصوص پرائمر ڈیزائن کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ پی سی آر پروردن کو ایک ٹیمپلیٹ کے بطور Cistanche tubulosa پھول cDNA کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ ایمپلیفیکیشن سسٹم 2×Phanta Max Buffer 25 μL، dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL، upstream اور downstream پرائمر (10 μmol/L) 2 μL ہر ایک، cDNA 2 μL، Phanta Max Super- Fidelity DNA Polymerase 1 μL، ddH2O 17 μL۔ رد عمل کے حالات یہ تھے: 3 منٹ کے لیے 95 ڈگری پر پری ڈینیچریشن؛ 15 سیکنڈ کے لیے 95 ڈگری پر ڈینیچریشن کے 25 چکر، 15 سیکنڈ کے لیے 55 ڈگری پر اینیلنگ، اور 1 منٹ کے لیے 72 ڈگری پر توسیع؛ 5 منٹ کے لیے 72 ڈگری پر ردعمل کی توسیع۔ پی سی آر پروڈکٹ کا پتہ 1% ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعہ پایا گیا تھا، اور ڈی این اے پیوریفیکیشن کٹ (نوویزان، کیٹ ڈی سی301-01) کو جیل کی بحالی کے لیے استعمال کیا گیا تھا، اور پھر برآمد شدہ ڈی این اے کو تیز رفتار کلوننگ کٹ (نوویزان، کیٹ) کے ذریعے صاف کیا گیا تھا۔ C601-01)۔ ڈی این اے کا ٹکڑا pCE2TA/Blunt-Zero ویکٹر کے ساتھ بندھا ہوا تھا، Escherichia coli DH5 قابل خلیات میں تبدیل ہوا، اور 37 ڈگری پر رات بھر کلچر کرنے کے بعد، سنگل کلون کے تناؤ کو منتخب کیا گیا اور کمپنی کو ترتیب کے لیے بھیجا گیا۔

جدول 1 پرائمر کی ترتیب

2.3 بایو انفارمیٹکس تجزیہ

پروٹین کی جسمانی اور کیمیائی خصوصیات کا تجزیہ کرنے کے لیے ProtParam آن لائن سافٹ ویئر استعمال کریں۔ پروٹین ہائیڈرو فیلیسیٹی/ہائیڈرو فوبیسٹی کا تجزیہ کرنے کے لیے پروٹ اسکیل آن لائن ٹول کا استعمال کریں۔ پروٹین کے ثانوی ڈھانچے کی پیشن گوئی کرنے کے لیے آن لائن ٹول SOPMA استعمال کریں۔ آن لائن تجزیہ سافٹ ویئر SWISS-MODEL کا استعمال کریں تاکہ پروٹین کی ترتیری ساخت کی پیشن گوئی کی جا سکے۔ آن لائن سافٹ ویئر کا استعمال کریں TMHMM پروٹین کے ٹرانس میمبرین ڈھانچے کی پیش گوئی کریں؛ CtCHS کی ہومولوجی کا موازنہ دوسری پرجاتیوں کے CHS امینو ایسڈ کی ترتیب سے کرنے کے لیے DNAMAN سافٹ ویئر استعمال کریں۔ پڑوسی جوائننگ (NJ) اور Poisson تصحیح کا استعمال کرتے ہوئے فائیلوجنیٹک درخت کی تعمیر کے لیے MEGA-X سافٹ ویئر کا استعمال کریں ارتقائی فاصلے کا حساب بوٹسٹریپ طریقہ سے کیا جاتا ہے، اور بوٹسٹریپ کی تکرار کی تعداد 1000 گنا ہے۔

2.4 CTCHS پروکاریوٹک اظہار اور طہارت

CtCHS ترتیب کی بنیاد پر پابندی والی سائٹس BamHⅠ اور XhoⅠ کے ساتھ پرائمر ڈیزائن کریں، اور PCR متعلقہ ہدف کے ٹکڑوں کو بڑھاتا ہے۔ پی ای ٹی-28ایک ویکٹر اور ہدف کے ٹکڑے کو اینڈونکلیز بام ایچ آئی کا استعمال کرتے ہوئے ہضم کیا گیا تھا اور کلون شدہ تناؤ کو ترتیب دیا گیا ہے، اور پلاسمڈ کو صحیح ترتیب کے بعد نکالا جاتا ہے۔ ترتیب کے ذریعے تصدیق شدہ pET-28a-CtCHS پلاسمڈ کو Escherichia coli BL21 (DE3) قابل خلیات میں منتقل کیا گیا تھا۔ Ding Ning et al کے طریقہ کار کو دیکھیں۔ [17] isopropyl کے ساتھ

-D-thiogalactopyranoside (IPTG) کو کم درجہ حرارت پر پروٹین اظہار دلانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا اور اسے Ni2+ affinity chromatography کالم (Cytiva, Cat 17531901) کے ذریعے صاف کیا گیا تھا۔ پروٹین کو ایک الٹرا فلٹریشن ٹیوب (ملی پور، 30 000) میں سینٹرفیوگریشن کے ذریعے مرتکز کیا گیا تھا اور اسے صاف کیا گیا تھا۔ 20 mmol/L KPB بفر (pH 8.0، 1 mmol/LEDTA پر مشتمل) میں اسٹور کریں اور طویل مدتی اسٹوریج کے لیے −80 ڈگری ریفریجریٹر میں اسٹور کریں۔

2.5 CtCHS انزائم سرگرمی کا تجزیہ

CtCHS انزائم ری ایکشن سسٹم: 100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-coumaroyl-CoA 2 μL، CtCHS ریکومبیننٹ پروٹین 20 μL، میں 12 گھنٹے تک 37 ڈگری پر پانی کے غسل میں رد عمل ظاہر کرنے کے بعد، مرکب کو 800 μL ایتھائل ایسیٹیٹ کے ساتھ تین بار نکالا گیا، نائٹروجن کے بہاؤ سے خشک کیا گیا، اور پھر 100 μL میتھانول میں تحلیل کر دیا گیا۔ پروڈکٹ کا پتہ لگانے کے لیے ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی کا استعمال کریں۔ شرائط الٹیمیٹ LP-C18 کالم (250 ملی میٹر × 4.6 ملی میٹر، 5 μm)، کالم کا درجہ حرارت 30 ڈگری، نمونہ والیوم 10 μL، اور پانی (A) اور ایسٹونیٹرائل (B) بہاؤ کے طور پر ہیں۔ فیز، ایلیوشن گریڈینٹ: 0~10

منٹ، 30% B؛ 10~20 منٹ، 30%~60% B؛ 20~25 منٹ، 60%~70% B؛ 25~30 منٹ، 70%~80% B؛ 30~35 منٹ، 80%~100% B؛ 35-40 منٹ، 100% B؛ 40-46 منٹ، 100%-30% B. والیومیٹرک بہاؤ کی شرح 1 mL/min ہے اور پتہ لگانے کی طول موج 290 nm ہے۔

مزید پتہ لگانے کے لیے UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS کا استعمال کیا گیا۔ مائع مرحلے کی شرائط واٹر ایکویٹی UPLC BEH شیلڈ آر پی 18 کالم (100 ملی میٹر × 3۔{29}} ملی میٹر، 1.7 μm)، کالم کا درجہ حرارت 40 ڈگری، نارنگین- چالکون اور نارنگینن کنٹرول۔ مصنوعات کی لوڈنگ والیوم 4 μL ہے، اور انزائم ری ایکشن پروڈکٹ کی لوڈنگ والیوم 7 μL ہے۔ پانی (A)-acetonitrile (B) کو موبائل مرحلے کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ اخراج کا میلان ہے: 0 سے 5 منٹ، 30% B؛ 5 سے 15 منٹ، 30 %-60% B; 15-20 منٹ، 60%-100% B; 20-25 منٹ، 100% B؛ 25-31 منٹ، 100%-30% B. حجمی بہاؤ کی شرح 0.3 ملی لیٹر/منٹ ہے۔ ماس سپیکٹرو میٹری حالات الیکٹرو سپرے آئن سورس، کیریئر گیس کے طور پر نائٹروجن، میان گیس پریشر 3.5 MPa، معاون گیس پریشر 1.0 MPa، سپرے پریشر 3500 V، کیپلیری درجہ حرارت 350 ڈگری، معاون گیس حرارتی درجہ حرارت 200 ڈگری، مثبت اور منفی آئن موڈ ہیں۔ آئن رینج m/z ہے 100-1500، مکمل MS ریزولوشن ہے 35 000، dd-MS2 ریزولوشن ہے 17 500، (N)

CE/stepped nce 35, 60 پر سیٹ ہے۔

2.3 بایو انفارمیٹکس تجزیہ

پروٹین کی جسمانی اور کیمیائی خصوصیات کا تجزیہ کرنے کے لیے ProtParam آن لائن سافٹ ویئر استعمال کریں۔ پروٹین ہائیڈرو فیلیسیٹی/ہائیڈرو فوبیسٹی کا تجزیہ کرنے کے لیے پروٹ اسکیل آن لائن ٹول کا استعمال کریں۔ پروٹین کے ثانوی ڈھانچے کی پیشن گوئی کرنے کے لیے آن لائن ٹول SOPMA استعمال کریں۔ آن لائن تجزیہ سافٹ ویئر SWISS-MODEL کا استعمال کریں تاکہ پروٹین کی ترتیری ساخت کی پیشن گوئی کی جا سکے۔ آن لائن سافٹ ویئر کا استعمال کریں TMHMM پروٹین کے ٹرانس میمبرین ڈھانچے کی پیش گوئی کریں؛ CtCHS کی ہومولوجی کا موازنہ دوسری پرجاتیوں کے CHS امینو ایسڈ کی ترتیب سے کرنے کے لیے DNAMAN سافٹ ویئر استعمال کریں۔ پڑوسی جوائننگ (NJ) اور Poisson تصحیح کا استعمال کرتے ہوئے فائیلوجنیٹک درخت کی تعمیر کے لیے MEGA-X سافٹ ویئر کا استعمال کریں ارتقائی فاصلے کا حساب بوٹسٹریپ طریقہ سے کیا جاتا ہے، اور بوٹسٹریپ کی تکرار کی تعداد 1000 گنا ہے۔

2.4 CTCHS پروکاریوٹک اظہار اور طہارت

CtCHS ترتیب کی بنیاد پر پابندی والی سائٹس BamHⅠ اور XhoⅠ کے ساتھ پرائمر ڈیزائن کریں، اور PCR متعلقہ ہدف کے ٹکڑوں کو بڑھاتا ہے۔ پی ای ٹی-28ایک ویکٹر اور ہدف کے ٹکڑے کو اینڈونکلیز بام ایچ آئی کا استعمال کرتے ہوئے ہضم کیا گیا تھا اور کلون شدہ تناؤ کو ترتیب دیا گیا ہے، اور پلاسمڈ کو صحیح ترتیب کے بعد نکالا جاتا ہے۔ ترتیب کے ذریعے تصدیق شدہ pET-28a-CtCHS پلاسمڈ کو Escherichia coli BL21 (DE3) قابل خلیات میں منتقل کیا گیا تھا۔ Ding Ning et al کے طریقہ کار کو دیکھیں۔ [17] isopropyl کے ساتھ

-D-thiogalactopyranoside (IPTG) کو کم درجہ حرارت پر پروٹین اظہار دلانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا اور اسے Ni2+ affinity chromatography کالم (Cytiva, Cat 17531901) کے ذریعے صاف کیا گیا تھا۔ پروٹین کو ایک الٹرا فلٹریشن ٹیوب (ملی پور، 30 000) میں سینٹرفیوگریشن کے ذریعے مرتکز کیا گیا تھا اور اسے صاف کیا گیا تھا۔ 20 mmol/L KPB بفر (pH 8.0، 1 mmol/LEDTA پر مشتمل) میں اسٹور کریں اور طویل مدتی اسٹوریج کے لیے −80 ڈگری ریفریجریٹر میں اسٹور کریں۔

2.5 CtCHS انزائم سرگرمی کا تجزیہ

CtCHS انزائم ری ایکشن سسٹم: 100 mmol/L KPB (pH 7.5) 468 μL, 1 mmol/L malonyl-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-coumaroyl-CoA 2 μL، CtCHS ریکومبیننٹ پروٹین 20 μL، میں 12 گھنٹے تک 37 ڈگری پر پانی کے غسل میں رد عمل ظاہر کرنے کے بعد، مرکب کو 800 μL ایتھائل ایسیٹیٹ کے ساتھ تین بار نکالا گیا، نائٹروجن کے بہاؤ سے خشک کیا گیا، اور پھر 100 μL میتھانول میں تحلیل کر دیا گیا۔ پروڈکٹ کا پتہ لگانے کے لیے ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی کا استعمال کریں۔ شرائط الٹیمیٹ LP-C18 کالم (250 ملی میٹر × 4.6 ملی میٹر، 5 μm)، کالم کا درجہ حرارت 30 ڈگری، نمونہ والیوم 10 μL، اور پانی (A) اور ایسٹونیٹرائل (B) بہاؤ کے طور پر ہیں۔ فیز، ایلیوشن گریڈینٹ: 0~10

منٹ، 30% B؛ 10~20 منٹ، 30%~60% B؛ 20~25 منٹ، 60%~70% B؛ 25~30 منٹ، 70%~80% B؛ 30~35 منٹ، 80%~100% B؛ 35-40 منٹ، 100% B؛ 40-46 منٹ، 100%-30% B. والیومیٹرک بہاؤ کی شرح 1 mL/min ہے اور پتہ لگانے کی طول موج 290 nm ہے۔

مزید پتہ لگانے کے لیے UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS کا استعمال کیا گیا۔ مائع مرحلے کی شرائط واٹر ایکویٹی UPLC BEH شیلڈ آر پی 18 کالم (100 ملی میٹر × 3۔{29}} ملی میٹر، 1.7 μm)، کالم کا درجہ حرارت 40 ڈگری، نارنگین- چالکون اور نارنگینن کنٹرول۔ مصنوعات کی لوڈنگ والیوم 4 μL ہے، اور انزائم ری ایکشن پروڈکٹ کی لوڈنگ والیوم 7 μL ہے۔ پانی (A)-acetonitrile (B) کو موبائل مرحلے کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ اخراج کا میلان ہے: 0 سے 5 منٹ، 30% B؛ 5 سے 15 منٹ، 30 %-60% B; 15-20 منٹ، 60%-100% B; 20-25 منٹ، 100% B؛ 25-31 منٹ، 100%-30% B. حجمی بہاؤ کی شرح 0.3 ملی لیٹر/منٹ ہے۔ ماس سپیکٹرو میٹری حالات الیکٹرو سپرے آئن سورس، کیریئر گیس کے طور پر نائٹروجن، میان گیس پریشر 3.5 MPa، معاون گیس پریشر 1.0 MPa، سپرے پریشر 3500 V، کیپلیری درجہ حرارت 350 ڈگری، معاون گیس حرارتی درجہ حرارت 200 ڈگری، مثبت اور منفی آئن موڈ ہیں۔ آئن رینج m/z ہے 100-1500، مکمل MS ریزولوشن ہے 35 000، dd-MS2 ریزولوشن ہے 17 500، (N)

CE/stepped nce 35, 60 پر سیٹ ہے۔

2.6 CTCHS پروٹین کا ذیلی سیلولر لوکلائزیشن

CtCHS ترتیب اور ہموار کلوننگ کے اصول کی بنیاد پر، انزائم کٹنگ سائٹس Kpn Ⅰ اور BamH Ⅰ کے ساتھ پرائمر ڈیزائن کیے گئے تھے، اور متعلقہ ہدف کے ٹکڑوں کو PCR کے ذریعے بڑھا دیا گیا تھا۔ pCAMBIA1300-35S-GFP پلازمیڈ کو پابندی والے اینڈونکلیز Kpn Ⅰ اور BamH Ⅰ کے ساتھ ہضم کیا گیا تھا، اور ہدف کے ٹکڑے اور ویکٹر کو بغیر کسی رکاوٹ کے کلوننگ کٹ (نوویزان، کیٹ سی115-01) کے ذریعے جوڑا گیا تھا، اور پھر منتقل کیا گیا تھا۔ E. کولی DH5 قابل خلیوں میں۔ ترتیب دینے کے لیے سنگل کلون اسٹرینز کا انتخاب کریں، اور صحیح تناؤ سے پلازمیڈ نکالیں۔ pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS اور pCAMBIA 1300-35S-GFP پلازمیڈ PEG4000 کا استعمال کرتے ہوئے Arabidopsis thaliana پروٹوپلاسٹ میں تبدیل ہو گئے تھے، اور 8 سے 10 گھنٹے تک کم روشنی میں کلچر کیے گئے تھے۔ سی ٹی سی ایچ ایس پروٹین کے ذیلی سیلولر لوکلائزیشن کو لیزر کنفوکل مائکروسکوپ کے تحت دیکھا گیا۔

2.7 CTCHS اظہار پیٹرن کا تجزیہ

ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری پرائمر کو CtCHS ترتیب کی بنیاد پر DNAMAN کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیا گیا تھا، جس میں F-box اندرونی حوالہ جین کے طور پر تھا۔ پرائمر کے سلسلے ٹیبل 1 میں دکھائے گئے ہیں۔ مختلف رنگوں کے Cistanche tubulosa کے پھولوں میں CtCHS کے متعلقہ اظہار کا پتہ ریئل ٹائم فلوروسینٹ مقداری PCR سے ہوا۔ SYBRGreen فلوروسینٹ ڈائی طریقہ سے پیمائش کرنے کے لیے TransStart Green qPCR SuperMix (پورا گولڈ، AQ101-02) استعمال کریں۔ رد عمل کا نظام: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL، اپ اسٹریم اور ڈاون اسٹریم پرائمر (10 μmol/L) 0.2 μL ہر ایک، cDNA ٹیمپلیٹ 0.5 μL، 4.1 μL نیوکلیوٹیڈیز سے پاک پانی استعمال کیا گیا تھا۔ دو قدمی طریقہ استعمال کرتے ہوئے ردعمل کے لیے۔ رد عمل کا طریقہ کار ڈونگ Xianjuan et al کے طریقہ کار پر مبنی تھا۔ [18]۔ ہر نمونے میں 3 حیاتیاتی نقلیں تھیں، اور تجربہ تین بار دہرایا گیا۔ تجرباتی اعداد و شمار کا ایکسل کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا، CtCHS کے متعلقہ اظہار کا حساب 2−ΔΔCt طریقہ استعمال کرتے ہوئے کیا گیا، اور گراف پیڈ پرزم 8 کو اہمیت کا تجزیہ کرنے اور ہسٹوگرامس بنانے کے لیے استعمال کیا گیا۔