Codonopsis Pilosula Extract Melanocytes کو H2O کے خلاف تحفظ فراہم کرتا ہے

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

خلاصہ:حال ہی میں، جیسا کہ جلد میں میلانین کے بڑھاپے کے خلاف کردار اور میلانین کی پیداوار کی روک تھام کی نشاندہی کی گئی ہے، جلد کے ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے کے قابل مواد کی ترقی توجہ مبذول کر رہی ہے۔ اس مطالعے میں، ہم نے کوڈونوپسس پائلوسولا ایکسٹریکٹ (سی پی ای) کے اینٹی میلانوجینک اثر کی مزید تفتیش کی اور، آکسیڈیٹیو تناؤ کے تحت، میلان میں سائٹو پروٹیکٹو اثر - ایک میلانوسائٹس H2O2 کے سامنے آئے۔ سب سے پہلے، سی پی ای کے علاج نے میلانجینیسیس سے وابستہ پروٹینوں کو روک کر میلانین کی پیداوار کو نمایاں طور پر کم کیا، بشمول مائیکرو فیتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن فیکٹر (MITF)، ٹائروسینیز، اور ٹائروسینیز سے متعلقہ پروٹین 2 (TRP 2)، Melan میں MAPK/JNK کے فاسفوریلیشن کے نتیجے میں۔ - ایک خلیات. اگلا، آکسیڈیٹیو تناؤ سے متاثرہ جلد کی چوٹ اور اس کے مالیکیولر میکانزم پر سی پی ای کے حفاظتی اثرات کی چھان بین کرنے کے لیے، ہم نے میلانوسائٹس کو H2O2 میں بے نقاب کرکے آکسیڈیٹیو تناؤ پیدا کرنے کے بعد CPE کے اثر کا تعین کیا۔ CPE نے H2O2-سے خلیوں کو محفوظ کیا جس نے بیکس پرو اپوپٹوٹک پروٹین کو انکوڈنگ کرنے والے جین کے اظہار کو کم کرکے سائٹوٹوکسیٹی کی حوصلہ افزائی کی، جب کہ اس نے B-cell لیمفوما (Bcl2) فیملی اور MITF کو انکوڈنگ کرنے والے جینوں کی حوصلہ افزائی کی، جو ایک ٹرانسکرپشن ریگولیٹر ہے۔ جو میلانوسائٹ تفریق کو فروغ دیتا ہے۔ مزید برآں، ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ CPE نے آٹوفجی سے متعلق پروٹین جیسے کہ بیکلن-1 اور لائٹ چین 3 (LC3)Ⅱ کی پیداوار میں اضافہ کیا ہے۔ یہ کافی حد تک 3-میتھائل ایڈنائن (ایم اے، ایک آٹوفیجی روکنے والا) پریٹریٹمنٹ کے ذریعے الٹ گیا۔ اجتماعی طور پر، ہمارے نتائج یہ ظاہر کرتے ہیں کہ سی پی ای کا علاج نہ صرف نارمل میلانوسائٹس میں اینٹی میلانوجینک اثر ظاہر کرتا ہے بلکہ آٹوفجی اور ایم آئی ٹی ایف اظہار کو شامل کرکے آکسیڈیٹیو تناؤ کا نشانہ بننے والے میلانوسائٹس میں سائٹو پروٹیکٹو اثر بھی ظاہر کرتا ہے۔عضو تناسل کا سائز،لہذا، ہم سمجھتے ہیں کہ CPE میلانوسائٹس میں سیل کی دیکھ بھال کے لیے ایک طاقتور امیدوار ہے۔

مطلوبہ الفاظ:Codonopsis pilosula؛ میلان ایک خلیات؛ melanogenesis؛ آٹوفجی اوکسیڈیٹیو تناؤ

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

1. تعارف

انسانی جلد انسانی جسم کا سب سے بڑا عضو ہے اور جسم کو ماحولیاتی زہریلے مادوں، الرجین اور آکسیڈیٹیو تناؤ سے بچاتی ہے۔ میلانین، جو بنیادی طور پر میلانوسائٹس کے ذریعہ تیار کیا جاتا ہے، جلد کی بیماریوں کو روکنے میں اہم کردار ادا کرنے کے لیے جانا جاتا ہے اور انسانی جسم کے مختلف ٹشوز میں موجود ہوتا ہے [1,2]۔ تاہم، تناؤ، الٹرا وائلٹ (UV) تابکاری، اور عمر بڑھنے کی وجہ سے ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کی ضرورت سے زیادہ پیداوار اور جمع ہونے کے نتیجے میں جلد کے بہت سے عوارض، جیسے ہائپر پیگمنٹیشن، میلاسما، اور آخر کار میلانوسائٹس کا انحطاط ہوتا ہے۔ melanogenesis کے علاج سے متعلق متعدد مطالعات نے مائکروفتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن فیکٹر (MITF) اور ٹائروسینیز سرگرمی [3-5] کے اظہار کو منظم کرنے پر توجہ مرکوز کی ہے۔ مزید برآں، حالیہ مطالعات سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ جلد کے میلانوجینیسیس کئی میلانوجینک سگنلنگ راستوں کے ذریعے ثالثی کی جاتی ہے، بشمول مائٹوجن ایکٹیویٹڈ پروٹین کناز (MAPK) سگنلنگ، پروٹین کناز A(PKA)، اور سائکلک اڈینوسین مونو فاسفیٹ (cAMP) ثالثی راستہ [6]۔

Cistanche بڑھاپے کو روک سکتا ہے۔

سیلولر آٹوفیجی سسٹم کو سیلولر خود ہضم عمل کے طور پر جانا جاتا ہے جو خراب شدہ پروٹینوں کو کم کرتا ہے یا سیل میں غیر فعال آرگنیلز کو الگ کر دیتا ہے اور پھر سیل ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے کے لیے انہیں لائسو سومز میں گل جاتا ہے [7,8]۔ حالیہ مطالعات نے آٹوفیجی کی نشاندہی کی ہے کہ میلانوسائٹس کے عام کام میں اور میلانین بنانے والے ٹرانسکرپشن عنصر MITF کے اظہار کو منظم کرنے میں ملوث ہے۔ لہٰذا، آٹوفیجی پیدا کرنے والے ایجنٹوں میں UV شعاعوں اور لپڈ آکسیڈیشن سے ہونے والے نقصان کو محدود کرنے اور میلانوسائٹس اور کیراٹینوسائٹس [9-11] میں ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھنے کی صلاحیت ہوتی ہے۔cistanche پاؤڈر،تاہم، قدرتی آٹوفیجی پیدا کرنے والی تیاریوں کے استعمال کے بارے میں بہت کم معلومات موجود ہیں جو آکسیڈیٹیو تناؤ سے میلانوسائٹس کی حفاظت کرتی ہیں۔

Codonopsis pilosula Codonopsis pilosula (Fr.) Nanny کی جڑ ہے، جس کا تعلق کیمپانولا خاندان سے ہے۔ یہ کوریا کے Gangwon-do کے پہاڑوں میں اگائی یا کاشت کی جاتی ہے اور چین کے شمالی اور مغربی علاقوں جیسے گوانکسی اور شانسی کے علاقوں میں بھی تقسیم کی جاتی ہے [12]۔ لوک طب میں، اسے سینکڑوں سالوں سے ginseng کے متبادل کے طور پر استعمال کیا جا رہا ہے، کیونکہ اس میں دواسازی کی ایک جیسی سرگرمیاں ہیں، جیسے کہ قوت مدافعت کو مضبوط بنانے، معدے کی بیماریوں کو کم کرنا، اور بلڈ پریشر کو کنٹرول کرنا، لیکن کم قیمت پر۔ Phytochemical تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ C. pilosula میں بڑی مقدار میں sucrose، polysaccharides، triterpenes، saponins، phytosterols، phenolic glycosides، alkaloids، اور polyacetylenes ہوتے ہیں [13]۔ ان میں سے، لوبیٹیولین، C. pilosula کا بڑا acetylene، NF-kB کو فعال کرنے کے لیے جانا جاتا ہے اور اس کا مدافعتی محرک اثر ہوتا ہے [14] اس کے علاوہ، C. pilosula اقتباس کے اثر پر حالیہ مطالعات کے مطابق، ایک ایتھنول ایکسٹریکٹ C. pilosula نمایاں طور پر اوولبومین کی وجہ سے ہونے والے الرجک رد عمل کو روکتا ہے، جب کہ پانی کا ایک عرق پلازما گلوکوز کی سطح کو کم کرتا ہے، اور بٹانول کا عرق فری ریڈیکل اسکیوینجنگ سرگرمی کو ظاہر کرتا ہے اور چوہے کے دماغ میں لپڈ پیرو آکسیڈیشن پر روکا اثر ظاہر کرتا ہے[15-17] .

اس سے پہلے، C.pildsula کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی استعمال شدہ نکالنے والے سالوینٹس کے لحاظ سے پولی فینول کے مواد میں فرق کی وجہ سے مختلف پائی گئی تھی [18]۔ اس طرح، ہم نے میکانکی سگنلنگ پاتھ ویز کے ذریعے عام حالات میں C. pilosula extract (CPE) کے میلانوجینک انحیبیٹری اثر کی تحقیقات کی، نیز میلان-a melanocytes میں H2O2-حوصلہ افزائی آکسیڈیٹیو تناؤ کے خلاف سائٹو پروٹیکٹیو اثر۔

2. مواد اور طریقہ

2.1۔ریجنٹس

RPMI 1640 اور فیٹل بووائن سیرم (FBS) ویلجین (ڈیگو، کوریا) سے خریدے گئے تھے۔cistanche سالسا اقتباسPenicillin-streptomycin GibcoBRL (Eggenstein، Germany) سے خریدی گئی تھی۔ Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) TOCRIS (برسٹل، UK) سے خریدا گیا تھا۔ ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ (HaO2)،3-(4,5-dimethylthiazol{{7} }yl)-2،5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)، 4'،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)، اور 3-MA سگما سے خریدے گئے تھے۔ -الڈرچ (سینٹ لوئس، ایم او، امریکہ)۔ باقی تمام کیمیکلز اور ری ایجنٹس تجزیاتی گریڈ کے تھے۔

2.2. Codonopsis Pilosula Extract کی تیاری

C.pilosula root (CP) کو آسانی سے کاٹا گیا تھا، اور CP کے 100 گرام کو 1 Lof 50 فیصد ایتھنول (w/v) میں ڈبو دیا گیا تھا۔ پھر، اسے 30 ڈگری پر الٹراسونک لہروں کا استعمال کرتے ہوئے تین بار نکالا گیا۔ سپرناٹینٹ کو جمع کرنے کے لیے ہر ایک نچوڑ کو سینٹرفیوگ کرنے کے بعد، سی پیلوسولا ایکسٹریکٹ (سی پی ای) تیار کرنے کے لیے سپرناٹینٹ کو مرتکز اور منجمد خشک کر دیا گیا۔

2.3۔ CPE کی سیل کلچر اور اسٹاک کی تیاری

melanocyte Melan-a خلیات RPMI 1640 میں 10 فیصد FBS، پینسلن (100 U/mL)، streptomycin (100 U/mL)، اور 200 nM فوربول 12-میریسٹیٹ 13- کے ساتھ بڑھے اور برقرار رکھے گئے۔ ایسیٹیٹ (TPA) اور 5 فیصد CO2 انکیوبیٹر میں 37 ڈگری پر برقرار رکھا جاتا ہے۔ چھ کنویں پلیٹ میں 3×105 سیلز فی کنواں کلچر کرنے کے بعد، میلان اے سیلز کو انکیوبیٹر میں 48 گھنٹے تک رکھا گیا جب تک کہ میڈیم کا رنگ سیاہ نہ ہو جائے۔ CPE کے سٹاک سلوشنز (100mg/mL) جراثیم سے پاک پانی میں تحلیل ہو کر-20 ڈگری پر محفوظ کیے گئے تھے۔

2.4 سیل کی قابل عملیت کی پیمائش

میلان-اے سیلز میں سی پی ای کی سیل کی قابل عملیت کا تعین MT رنگین میٹرک پرکھ اور فلو سائٹومیٹری کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ خلیوں کو اس وقت تک برقرار رکھا گیا جب تک کہ وہ 96-کنویں پلیٹوں میں 80 فیصد سنگم تک نہ پہنچ جائیں اور پھر CPE اور/یا 0.5 mMH2O2 کے ساتھ 24 گھنٹے تک علاج کیا جائے۔ 10 μL MTT محلول （5 mg/mL） کے ساتھ ایک سیل میڈیم شامل کیا گیا، اور خلیات کو اضافی 4 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا۔ خلیوں کے انکیوبیشن کے بعد، ناقابل حل فارمازان کرسٹل ڈائمتھائل سلفوکسائیڈ کے 100 یو ایل میں تحلیل ہو گئے۔ 540 nm پر جذب کو مائکروپلیٹ ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے سپیکٹرو فوٹومیٹری کے ذریعہ ماپا گیا۔ مردہ خلیوں کا تعین کارخانہ دار کے پروٹوکول کے مطابق PI/Annexin V سیل موت کا پتہ لگانے والی کٹ (EMD ملی پور کارپوریشن، بلریکا، MA، USA) کے ساتھ کیا گیا تھا۔ مختصرا،، خلیات کو دھویا گیا اور 15 منٹ تک RT پر اندھیرے میں FITC-Annexin V اور PI پر مشتمل تھا۔ اس کے بعد، مردہ خلیوں کا MuselM سیل تجزیہ کار کے ذریعہ تجزیہ کیا گیا۔

2.5. وٹرو میلانین تخمینہ میں

تقریباً 2×105 سیل/کنویں چھ کنویں پلیٹ میں اگائے گئے تھے۔ CPE اور/یا 0.5 mM H-Op کے ساتھ علاج کے بعد جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [19]، PBS سے دھوئے گئے خلیات کی کٹائی کی گئی، 1× PBS میں لیس کیا گیا جس میں 1 فیصد Triton X-100 تھا، اور 13 پر 4 ڈگری پر سینٹرفیوج کیا گیا، 15 منٹ کے لیے 000 rpm۔ سیلولر میلانین مواد کو 1 N NaOH کا استعمال کرتے ہوئے حل کیا گیا تھا۔ ایک ELISA پلیٹ ریڈر کو 405 nm پر جاذبیت کی پیمائش کرکے میلانین کی مقدار درست کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ڈیٹا تین تجربات سے حاصل کیا گیا تھا، اور میلانین کے مواد کا حساب لگایا گیا تھا اور اسے کنٹرول سیلز کے مقابلے فولڈ تبدیلی کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔ 2.6.پروٹین آئسولیشن اور ویسٹرن بلاٹ پرکھ

پروٹین کے نمونے نکالے گئے جیسا کہ ہمارے پچھلے کام میں بیان کیا گیا ہے [20]۔ پھر، BCA پروٹین پرکھ کٹ (تھرمو سائنٹیفک، والتھم، ایم اے، USA) کا استعمال کرتے ہوئے سیل لیسیٹ کی پروٹین کی حراستی کی پیمائش کی گئی۔ ڈینیچرڈ سیل لیسیٹ کی مساوی مقدار (30 ugs سیل lysate فی نمونہ) کو 10 فیصد سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ-پولیاکریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس (SDS-PAGE) سے الگ کیا گیا اور نائٹروسیلوز جھلی میں منتقل کیا گیا۔ اس جھلی کو پی بی ایس میں 5 فیصد سکم دودھ پاؤڈر میں پتلا شدہ بنیادی اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا جس میں 0.05 فیصد ٹوین 20 (PBST) راتوں رات 4 ڈگری پر ہوتا ہے۔

پرائمری اینٹی باڈی انکیوبیشن کے بعد، جھلیوں کو HRP-conjugated سیکنڈری اینٹی باڈی میں دھویا گیا اور PBST میں 5 فیصد سکم دودھ میں کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ تک گھلایا گیا۔ پروٹین کے اظہار کا تجزیہ بہتر کیمیلومینیسینس (ای سی ایل) کا پتہ لگانے کے نظام (AI680، GE ہیلتھ کیئر، اپسالا، سویڈن) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔

2.7. DCFH-DA سٹیننگ کے ذریعے انٹرا سیلولر ROS کا تخمینہ

Hoo-treated Melan-a خلیوں میں سیلولر ROS کی سطح کا اندازہ DCFH-DA فلوروسینس مائکروسکوپی طریقہ [21] سے لگایا گیا تھا۔ انٹرا سیلولر DCF فلوروسینس کی سطحیں تیار کردہ انٹرا سیلولر ROS کے متناسب ہیں۔ سب سے پہلے، 2 × 105 خلیات/ اچھی طرح سے CPE اور/یا H-O2 کے انفرادی ارتکاز کے ساتھ 24 گھنٹے کے لیے علاج کیا گیا، پھر DCFH2- DA رد عمل کے اختتام سے 2 گھنٹے پہلے شامل کیا گیا۔ تین یا زیادہ آزاد تجربوں سے ڈیٹا اکٹھا کیا گیا۔ 2.8 شماریاتی پروسیسنگ

تمام تجرباتی نتائج کو تین حیاتیاتی نقلوں کے ذرائع ± معیاری انحراف (SDs) کے طور پر پیش کیا گیا ہے۔cistanche تنامتعدد اوسط اقدار کے درمیان شماریاتی اہمیت کا اندازہ تغیرات کے یک طرفہ تجزیہ (ANOVA) سے کیا گیا، اس کے بعد ڈنکن کا متعدد موازنہ ٹیسٹ، SPSS 18 کا استعمال کرتے ہوئے۔{3}}(SPSS Inc., Chicago, IL, USA), جیسا کہ افسانوں میں بتایا گیا ہے۔ ایک پی ویلیو<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

3. نتائج

3.1.CPE کے ذریعے میلانوسائٹس میں میلانوجینیسیس کی کمی

میلانوسائٹس بیرونی محرکات جیسے UV شعاع ریزی کے جواب میں میلانین کی ترکیب کرتے ہیں۔ اہم عوامل جیسے کہ a-melanocyte-stimulating hormone (-MSH)، اسٹیم سیل فیکٹر (SCF)، اور اینڈوتھیلین-1(ET-1) میلانوسائٹس سے خارج ہوتے ہیں اور MITF کے اظہار کو بڑھاتے ہیں جس سے میلانوجینیسیس کو فروغ ملتا ہے۔ [22,23]۔ سب سے پہلے، ہم نے جانچا کہ آیا سی پی ای کے علاج نے میلانین کی پیداوار اور میلانوجینیسیس سے متعلق پروٹین کو روکا ہے۔

منفی کنٹرول کے مقابلے میں 100,200 اور 300 ug/mL پر CPE علاج نے میلانین کی پیداوار کو نمایاں طور پر کم کیا۔ خاص طور پر، CPE کے 300 ug/mL کے ساتھ علاج کے نتیجے میں arbutin کے علاج (شکل 1A, B) کی طرح کمی آئی۔ اس کے علاوہ، ہم نے میلانوجینیسیس پروٹین ٹائروسینیز، TRP-1، TRP{{6} کی چھان بین کی۔ }}، اور MITF بذریعہ ویسٹرن بلاٹنگ۔cistanche tubulosa فوائد اور ضمنی اثرات300 ug/mL کے ارتکاز پر CPE کے ساتھ علاج نے MITF، TRP-2، اور ٹائروسینیز پروٹین (شکل 1C) کی سطح میں نمایاں کمی کی۔ جیسا کہ اس بات کی تصدیق ہوئی کہ سی پی ای ایم آئی ٹی ایف سے متعلق پروٹین کے اظہار کو روکتا ہے، میلانین کی تشکیل کو روکتا ہے، ہم نے مزید جانچ کی کہ آیا سی پی ای نے ایم اے پی کے سگنلنگ پاتھ وے کو متاثر کیا۔ سی پی ای نے خوراک پر منحصر انداز میں MAPK فاسفوریلیشن میں اضافہ کیا، خاص طور پر JNK فاسفوریلیشن (شکل 1D) کی حوصلہ افزائی کی۔ یہ نتائج تجویز کرتے ہیں کہ CPE کے ذریعہ میلانوجینیسیس کی روک تھام کا نتیجہ JNK/MAPK فاسفوریلیشن کی شمولیت سے MITF اور ٹائروسینیز اظہار کی کمی سے ہوتا ہے۔

3.2.H2O پر CPE کا اثر2-میلانوسائٹس میں سیل کی موت کی حوصلہ افزائی

جلد کے خلیے، جیسے کہ کیراٹینوسائٹس اور میلانوسائٹس، ROS، جیسے کہ ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ (HzOz) اور سپر آکسائیڈ ایون کے لیے حساس طور پر رد عمل ظاہر کرتے ہیں، تاکہ معمول کی حیثیت برقرار رہے۔ تاہم، ضرورت سے زیادہ سیلولر ROS کی وجہ سے آکسیڈینٹ-اینٹی آکسیڈینٹ کی حیثیت میں عدم توازن خراب پروٹین یا آرگنیلز کے جمع ہونے کا باعث بن سکتا ہے، جو بالآخر اپوپٹوٹک سیل کی موت کا باعث بنتا ہے [24,25]۔ حال ہی میں، یہ اطلاع دی گئی ہے کہ میلانین جلد کے بیرونی ماحول پر منحصر میلانین کی تشکیل کو تحریک دے کر جلد کی عمر بڑھنے کو فروغ دیتا ہے، نیز انٹرا سیلولر میلانین مواد کو برقرار رکھنے سے جلد کی صحت برقرار رہتی ہے [26]۔ اس طرح، ہم نے H2O2 علاج کے ذریعے آکسیڈیٹیو تناؤ کا شکار خلیوں پر CPE نچوڑ کے اثر کی تحقیقات کی۔ HzO2-علاج شدہ خلیات نے علاج نہ کیے جانے والے خلیوں کے مقابلے میں 32.8 فیصد سیل کی عملداری میں کمی ظاہر کی۔ تاہم، CPE علاج نے H-O2 علاج کے تحت ارتکاز پر منحصر انداز میں سیل کی عملداری کی روک تھام کو کم کیا۔ خاص طور پر، 300 ug/mL پر CPE نے سیل کی قابل عملیت کو 91.9 فیصد (شکل 2A) پر بحال کیا۔ اس کے علاوہ، CPE-اور/یا H2O{18}}علاج شدہ خلیوں کی اپوپٹوٹک موت کا پتہ Annexin V- کے ساتھ دوہرا داغ لگا کر پایا گیا۔ FITC/PI، اس کے بعد بہاؤ سائٹومیٹرک تجزیہ۔ H2O2 کے علاج کے بعد، اپوپٹوٹک خلیوں کا فیصد بڑھ کر 34.5 فیصد ہو گیا، جبکہ علاج نہ کیے جانے والے خلیوں میں یہ 14.8 فیصد تھا۔ تاہم، CPE علاج نے واضح طور پر H2O2-کی حوصلہ افزائی اپوپٹوٹک موت کو روک دیا، جس میں Annexin V-stained خلیات کا فیصد 22.2 فیصد ہے (شکل 2B)۔ جیسا کہ یہ آر او ایس کے مواد کی طرح کا نمونہ دکھاتا ہے، یہ نتائج ظاہر کرتے ہیں کہ CPE H2O2-حوصلہ افزائی ROS (شکل 2C) کے خلاف حفاظت کے ذریعے سیل کی موت کو روک کر سیل کی عملداری کو برقرار رکھتا ہے۔

3.3.HzO پر CPE کا اثر2-میلانوسائٹس میں سیل کی موت کی حوصلہ افزائی

جیسا کہ پہلے تصدیق کی گئی ہے، CPE HzO2 کے علاج کے بعد apoptosis میں اضافے کو روک کر سیل کی قابل عملیت کو برقرار رکھتا ہے۔ اس طرح، ہم نے اگلی بار سیل کی موت میں شامل پروٹینوں اور MITF پروٹین کے اظہار پر CPE کے اثر کی تحقیقات کی، جو H2O2 کی موجودگی میں میلانین کی پیداوار کو منظم کرتا ہے۔ جیسا کہ شکل 3 میں دکھایا گیا ہے، H2O2 کے ساتھ علاج کیے گئے خلیوں میں، MITF اظہار قدرے کم ہو گیا تھا، دوسری طرف، CPE کے ساتھ علاج کیے جانے والے خلیوں میں، اور MITF اظہار تقریباً ویسا ہی تھا جیسا کہ علاج نہ کیے جانے والے خلیوں میں ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، H2O2 نے apoptosis-inducing Bax پروٹین [27,28] کے اظہار میں اضافہ کیا لیکن CPE سے علاج شدہ خلیوں میں ارتکاز پر منحصر انداز میں Bax اظہار کو کم کیا۔ اس کے برعکس، H202 نے Bcl2 پروٹین کے اظہار کو کم کیا، جو سیل کی بقا کو فروغ دیتا ہے [28,29]، لیکن Bel2 کے اظہار میں CPE علاج کے ذریعے ارتکاز پر منحصر انداز میں اضافہ ہوا۔ جب ہم نے Bax/Bcl2 تناسب کا تعین کرنے کے لیے ان دو پروٹینوں کے اظہار کا حساب لگایا تو ایک ہی رجحان دیکھا گیا۔ لہذا، H2O2-حوصلہ افزائی آکسیڈیٹیو تناؤ کے تحت، MITF کے اظہار کو سیل کی موت کی شمولیت سے کم کیا گیا، جبکہ CPE نے ایک مضبوط حفاظتی اثر کا مظاہرہ کیا، H2Oz کی حوصلہ افزائی سیل کی موت کو روکا اور MITF کے اظہار کو برقرار رکھا۔

3.4 آکسیڈیٹیو تناؤ سے متاثرہ میلانوسائٹس میں آٹوفیجی ایکٹیویشن پر سی پی ای کا اثر

حالیہ مطالعات سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ آٹوفیجی اور اس کا ریگولیٹر انسانی خلیات میں ROS کی حوصلہ افزائی آکسیڈیٹیو تناؤ کے خلاف اینٹی آکسیڈیٹیو ردعمل میں اہم کردار ادا کرتا ہے [26,30]۔ فینگ وغیرہ۔[31] ظاہر ہوا کہ Apocymum venetum leaf extract زخمی نیورونز کو H2O2-حوصلہ افزائی شدہ اپوپٹوسس سے بچاتا ہے جس سے آٹوفجی کی ROS حوصلہ افزائی ایکٹیویشن کم ہوتی ہے۔ چونکہ آٹوفیجی اور اینٹی میلانوجینیسیس کی ماڈیولیشن کے درمیان تعلق قائم ہو چکا ہے، میلان اے سیلز میں H-Oz-حوصلہ افزائی آکسیڈیٹیو تناؤ کے خلاف CPE کے حفاظتی اثر میں آٹوفیجی کے کردار کی تحقیقات کی گئیں۔ LC3 کی سطح، ایک آٹوفاگوسم پروٹین، آٹوفجی کے اشارے کے طور پر استعمال ہوتی تھی۔ ویسٹرن بلٹ ڈیٹا نے اشارہ کیا کہ CPE نے پرو آٹوفیجک LC3-Ⅱ اور بیکلن پروٹین کے اظہار کو نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ کیا، جن کا اظہار H2O2 علاج سے کم ہوا تھا۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ سی پی ای کا آٹوفیجی ایکٹیویشن آرڈر انٹرا سیلولر آکسیڈیٹیو اسٹریس (شکل 4A) کے ذریعے سائٹو پروٹیکٹو اثر ہوتا ہے۔ اس کے بعد، HzOz سے علاج شدہ میلان-اے سیلز میں سائٹو پروٹیکٹو اثر اور سی پی ای کے آٹوفیجی کے درمیان انٹرا ریلیشن شپ کا مزید تجزیہ ایک طاقتور آٹوفیجک انحیبیٹر،3-MA کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ پچھلے اعداد و شمار کے مقابلے میں، سیلز کو 3-MA اور CPE کے ساتھ پہلے سے علاج کیا گیا اور H2O2 کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی LC3-II اظہار کی سطحوں میں کمی ہوئی (شکل 4B)۔ مجموعی طور پر، ان اعداد و شمار سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ آٹوفیجی کو روکنا HzO2-علاج شدہ خلیوں میں CPE کی سائٹو پروٹیکٹو افادیت کو منفی طور پر متاثر کرتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ CPE کے سائٹو پروٹیکٹیو اثرات کے لیے آٹوفیجی ضروری ہے۔

4. بحث

ہم نے پہلے زیادہ سے زیادہ نکالنے کا طریقہ قائم کیا جس کے نتیجے میں سب سے زیادہ اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کے ساتھ ساتھ پولیفینول مواد [18]۔ اس مطالعے میں، ہم نے اعلیٰ پیداوار والے الٹراسونک نکالنے کا طریقہ استعمال کیا اور پایا کہ یہ عرق آکسیڈیٹیو تناؤ کے حالات میں آٹوفیجی کو چالو کرکے، نیز میلان-اے کے خلیات میں میلانوجینیسیس کو روک کر سائٹو پروٹیکٹو اثر کو ظاہر کرتا ہے۔

سب سے پہلے، ہم نے CPE کے اینٹی میلانوجینک اثر کی مزید چھان بین کی۔ CPE ڈاؤن ریگولیٹڈ میلانوجینیسیس میلانوجینیسیس سے متعلق جینوں کے اظہار کو کم کرکے، جیسے MITF، ٹائروسینیز، اور TRP-2۔ متعدد مطالعات نے یہ ثابت کیا ہے کہ انزائم اظہار سے متعلق میلانوجینیسیس کے بائیو سنتھیٹک میکانزم مختلف سگنلنگ راستوں سے ثالثی کرتے ہیں، بشمول مائٹوجن ایکٹیویٹڈ پروٹین کناز (MAPK)، پروٹین کناز A (PKA)، اور PI3K/Akt [32]۔ ان میں سے، ایم اے پی کے سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کرنے نے ایم آئی ٹی ایف کو پروٹین استحکام کی سطح کے ساتھ ساتھ انسانی بنیادی میلانوسائٹس [33,34] میں نقل کی سطح کو دبایا۔ MAPK کا فاسفوریلیشن اور ایکسٹرا سیلولر ریسپانسیو کناز (ERK)، c-Jun N-terminal kinase (JNK)، اور p38 کے سگنلنگ جھرن میلانین کی پیداوار کو بھی منظم کرتے ہیں۔ ان میں سے، JNK ایکٹیویٹر CREB- ریگولیٹڈ ٹرانسکرپشن کوایکٹیویٹر 3 (CRTC3) پر منحصر MITF اظہار [35,36] کے فاسفو-انیبیشن کے ذریعے میلانوجینیسیس کو دباتا ہے۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ MAPK کا فاسفوریلیشن، خاص طور پر JNK، کنٹرول سیلز کے مقابلے CPE علاج کے بعد مؤثر طریقے سے بڑھتا ہے۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ میلان-اے میلانوسائٹس میں سی پی ای کی حوصلہ افزائی شدہ ڈیپگمنٹیشن MITF/JNK-ریگولیٹڈ سگنلنگ پاتھ ویز کے ذریعے ہو سکتی ہے۔

میلانوسائٹس میلانین پگمنٹ تیار کرتے ہیں اور اسے کیراٹینوسائٹس میں منتقل کرتے ہیں، جہاں روغن جلد کو آکسیڈیٹیو ماحولیاتی دباؤ جیسے فضائی آلودگی، کیمیائی مصنوعات، اور یووی نقصان [37-39] سے بچانے میں مدد کرتا ہے۔ MITF کلیدی جینوں کے لیے ذمہ دار بڑے ٹرانسکرپشن ریگولیٹرز میں سے ایک ہے جو میلانوسائٹ کی نشوونما اور تفریق کو فروغ دینے کے ساتھ ساتھ میلانوجینیسیس کو بھی منظم کرتا ہے۔ مزید برآں، MITF بعض جینوں کے اظہار کو منظم کرتا ہے جو سیل ہومیوسٹاسس کو برقرار رکھتے ہیں، بشمول وہ جو پھیلاؤ میں شامل پروٹین کو انکوڈنگ کرتے ہیں (جیسے، CDK2) اور apoptosis (جیسے، Bcl2)[40-42]۔ Stein-Grimson et al. اس سے پتہ چلتا ہے کہ MITF ان سیل اقسام کی نشوونما میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔

سی پی ای جڑی بوٹیوں کی دوائیوں سے مشتق ہے جو معدے اور الرجی کی بیماریوں کے علاج کے لیے استعمال ہوتی ہے کیونکہ اس کے اینٹی ایجنگ اور اینٹی الرجک اثرات[15,44]۔ تاہم، آیا سی پی ای میلانوسائٹس کو آکسیڈیٹیو تناؤ سے بچا سکتا ہے یا نہیں یہ نامعلوم ہے۔ آکسیڈیٹیو تناؤ کے جواب میں میلانوسائٹ کی بقا پر سی پی ای کے اثر کا اندازہ لگانے کے لیے، ہم نے پہلے H-O2 کے سامنے آنے والے میلانوسائٹس میں سیل کی موت کا مشاہدہ کیا۔ 24 گھنٹے کے لیے 0.5 mM H-O2 کے ساتھ علاج کے بعد، علاج نہ کیے جانے والے خلیوں کے مقابلے میں خلیے کی عملداری میں کمی واقع ہوئی۔ تاہم، ROS مواد کو کم کرکے CPE سے علاج شدہ خلیات کی عملداری کو بحال کیا گیا تھا۔ پھر Bax/Bcl2 تناسب اور MITF اظہار بڑھایا گیا، H2O2-علاج شدہ خلیوں کے برعکس۔

آٹوفیجی انٹرا سیلولر انحطاط کا ایک بڑا نظام ہے جس کے ذریعہ لائسوزوم کے نقصان کے نتیجے میں ان کی تنزلی ہوتی ہے۔ Mizushima et al. [45] نے یہ ظاہر کیا کہ بھوک، سوزش، یا آکسیڈیٹیو تناؤ کے حالات میں، آٹوفیجک عمل خلیات میں تباہ شدہ پروٹین اور آرگنیلز کے انحطاط کو کنٹرول کر سکتا ہے، تاکہ سیلولر تزئین و آرائش اور ہومیوسٹاسس حاصل کیا جا سکے۔ مائیکرو ٹیوبول سے وابستہ پروٹین 1 لائٹ چین 3 (LC3) اور بیکلن-1 ممالیہ کی آٹوفیجی میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ LC3 دو شکلوں میں موجود ہے، یعنی ایک سائٹوسولک شکل (LC3 I) اور ایک لپڈ فاسفیٹائیڈیلتھانولامین کنجوگیٹڈ فارم (LC3 III) جو بڑھتے ہوئے آٹوفاگوسم[46,47]Zhang et al کی اندرونی اور بیرونی دونوں جھلیوں میں داخل کی جاتی ہے۔ 48] LC3Ito LC3II کی تبدیلی کو بائیو کیمیکل مارکر کے طور پر استعمال کیا تاکہ میلانوسائٹس میں آٹوفجی کی کیفیت کا تجزیہ کیا جا سکے۔ مزید تحقیق نے اشارہ کیا کہ LC3 حتمی آٹوفاگوسم تشکیل کا ایک نشان ہے، جب کہ بیکلن-ایل آٹوفاگوسم تشکیل کے ابتدائی مرحلے میں شامل ہے، آٹوفجی کو چالو کرتا ہے [49]۔ تشکیلاتی آٹوفیجک سرگرمی میلانوسائٹس میں آکسیڈیٹیو نقصان کو روکنے میں کلیدی کردار ادا کرتی ہے، لیکن آکسیڈیٹیو تناؤ کے تحت میلانوسائٹس میں آٹوفیجی کو منظم کرنے والے مالیکیولر میکانزم پر کچھ مطالعات ہوئے ہیں۔

اس کے نتیجے میں ، ہم نے آکسیڈیٹیو تناؤ کا نشانہ بننے والے میلانوسائٹس میں سیل کی بقا کے لئے سی پی ای ثالثی آٹوفجی کے مضمرات کی تحقیقات کی۔ ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ، CPE علاج کے بعد، آٹوفجی کو بیکلن-1 کے بڑھتے ہوئے اظہار اور LC3Ito LC3 II کی حوصلہ افزائی کے ذریعے فعال کیا گیا تھا۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ سی پی ای آکسیڈیٹیو تناؤ کا شکار میلانوسائٹس میں آٹوفیجی ایکٹیویشن کے ذریعے سائٹو پروٹیکٹو اثر ڈالتا ہے۔

آخر میں، موجودہ مطالعہ نے یہ ظاہر کیا کہ CPE علاج نہ صرف عام میلانوسائٹس میں MITF/JNK پاتھ وے کے ذریعے ایک اینٹی میلانوجینک اثر رکھتا ہے بلکہ HzOg-حوصلہ افزائی آکسیڈیٹیو تناؤ کے تحت، سیل کی بقا کو برقرار رکھتا ہے اور MITF کے ذریعے سائٹو پروٹیکشن کا استعمال کرتا ہے، جس کے نتیجے میں پائیدار سرگرمی ہوتی ہے۔ میلان ایک خلیات میں آٹوفجی کا۔

یہ مضمون کاسمیٹکس 2021، 8، 67 سے لیا گیا ہے۔ https://doi.org/10.3390/cosmetics8030067 https://www.mdpi.com/journal/cosmetics