وٹرو میں بوائین اوکیٹس پر یورولیتھن اے کا بڑھاپا مخالف اثر

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

خلاصہ:آکسیڈیٹیو تناؤ اور مائٹوکونڈریل dysfunction عمر سے متعلق oocyte کے معیار کی کمی کے ساتھ وابستہ ہیں اور ان کی روک تھام کے لئے حکمت عملی فی الحال تلاش کی جارہی ہے۔ Urolithin A (UA) ایک قدرتی میٹابولائٹ ہے جس میں پرو اپوپٹوٹک اور اینٹی آکسیڈینٹ اثرات ہیں، جو مختلف عمر کے خلیوں میں غیر فعال مائٹوکونڈریا کے جمع ہونے کو روکنے کی صلاحیت رکھتے ہیں۔ UA کا کبھی بھی بوائین oocytes میں تجربہ نہیں کیا گیا۔ ہمارا مقصد تولیدی قابلیت سے متعلق اہم جینوں کے cumulus-oocyte-complexes (COCs) اور granulosa خلیات (GCs) کے اظہار کی نشوونما کی صلاحیت پر UA کے اثر کا مطالعہ کرنا تھا۔ جوہری پختگی کی ترقی، مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت (MMP)، اور جسمانی طور پر بالغ (22 h) اور وٹرو عمر کے oocytes (IVM کے 30 h) کی ترقی کی قابلیت پری پیوبرٹل اور بالغ خواتین سے حاصل کی گئی ہے، یا تو UA کے ساتھ ضمیمہ ہے یا نہیں اس کا اندازہ لگایا گیا ہے۔ مزید برآں، کئی جینز (NFE2L2، NQO1، اور mt-DN5) کے mRNA کی مقدار اور mt-ND5 DNA کاپیوں کی تعداد کو قبل از کم عمری اور بالغ خواتین سے مہذب GCs میں مقدار میں طے کیا گیا، یا تو UA کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا یا نہیں۔ ہمارے مطالعے نے جوہری پختگی کی ترقی، MMP، ترقیاتی قابلیت، اور جین کے اظہار کی سطح پر آوسیٹ عمر بڑھنے کے نقصان دہ اثر کی تصدیق کی ہے۔ وٹرو میچوریشن کے دوران UA کا علاج بڑھایا گیا (p<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

مطلوبہ الفاظ:oocyte عمر بڑھنے Urolithin A؛ معاون تولیدی ٹیکنالوجیز

1. تعارف

خواتین کی تولیدی صلاحیت کا زوال عمر بڑھنے سے بری طرح متاثر ہونے والے پہلے جسمانی افعال میں سے ایک ہے اور اس طرح اسے دنیا بھر میں صحت کا ایک ابھرتا ہوا مسئلہ سمجھا جاتا ہے [1,2]۔ متعدد پیتھولوجیکل مسائل کے علاوہ، خواتین کی زرخیزی میں عمر سے وابستہ کمی بڑی حد تک oocytes کے ڈمبگرنتی ذخیرے میں کمی سے منسوب ہے [1,3-5]ان کے معیار کے وقت پر منحصر بگاڑ [2]۔ یہ بگاڑ کا عمل بیضہ دانی سے پہلے عمر رسیدہ ڈمبگرنتی مائکرو ماحولیات میں oocytes کی نمائش کی وجہ سے ہوسکتا ہے۔ اس کے علاوہ، مادہ گیمیٹ اکثر بیضوی عمر کے بعد کی عمر کا نشانہ بنتی ہے جب فرٹلائجیشن کا عمل بہترین مدت کے اندر نہیں ہوتا ہے، اور غیر فرٹیلائزڈ آوسیٹ بیضہ نالی میں رہتا ہے یا لمبے عرصے تک انسیمینیشن سے پہلے میں رہتا ہے [6] کی خرابی oocyte کوالٹی ایک اہم عنصر ہے جو معاون تولیدی ٹیکنالوجیز (ART) کی ناکامی سے منسلک ہے کیونکہ اس کا معیار فرٹلائجیشن [7,8] کے بعد جنین کی نشوونما کی صلاحیت کا بنیادی عامل ہے۔ بیضہ دانی کی مطابقت پذیری اور عمر رسیدہ oocytes اکثر گھوڑی، مویشیوں اور بھیڑوں میں مصنوعی حمل اور جنین کی پیداوار کے پروگراموں کی کامیابی کو نقصان پہنچاتے ہیں جس سے اہم معاشی نقصانات ہوتے ہیں[1,9,10]۔ لہٰذا، انسانوں سمیت متعدد انواع میں زرخیزی کو بچانے کے لیے بہتر علاج کے طریقوں کو ڈیزائن کرنے کے لیے، اور مویشیوں میں جینیاتی بہتری کے لیے ایک آلے کے طور پر، oocyte کی عمر بڑھنے کے بنیادی میکانزم کا مطالعہ کرنا بنیادی اہمیت کا حامل ہے۔cistanche wirkungخاص طور پر توجہ دی جانی چاہیے کہ قبل از پیدائش کے مویشیوں سے oocytes کی نشوونما کی صلاحیت کو بہتر بنایا جائے، جو اکثر جینیاتی فائدہ کو تیز کرنے اور نسل کے وقفوں کو کم کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔

عمر رسیدہ oocytes میں نشوونما کی صلاحیت کی خرابی کی ایک بڑی وجہ آکسیڈیٹیو تناؤ میں اضافہ ہے، جو mitochondrial dysfunction، DNA کو پہنچنے والے نقصان، اور spindle formation کی خرابیوں کا باعث بنتا ہے، جو oocyte کے معیار کو متاثر کرتا ہے [1]۔ یہ بات اچھی طرح سے قائم ہے کہ آزاد ریڈیکلز کی بڑھتی ہوئی پیداوار کئی دائمی بیماریوں اور تولیدی حیاتیات میں سیلولر عمر بڑھنے کا ایک سبب ہے، جس کے نتیجے میں زرخیزی کے خراب نتائج ہوتے ہیں [12]۔ ڈمبگرنتی مائکرو ماحولیات، جس میں oocytes اور granulosa خلیات (GCs) شامل ہیں، ایک اینٹی آکسیڈینٹ دفاعی طریقہ کار فراہم کرتا ہے جو آکسیڈیٹیو حالات کو منظم کرنے اور آکسیڈینٹ/اینٹی آکسیڈینٹ توازن کو برقرار رکھنے کے قابل ہوتا ہے [13]۔ تاہم، عمر بڑھنے کے عمل کے دوران، رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کو بے اثر کرنے کے لیے اینٹی آکسیڈینٹ دفاع کی کارکردگی کو کم کیا جاتا ہے، اس طرح آکسیڈیٹیو تناؤ کی سطح میں اضافہ ہوتا ہے۔ نیوکلیئر فیکٹر-E2-متعلقہ فیکٹر2(Nrf2 یا NFE2L2)، جسے Nrf2/Kelch-like ECH- وابستہ پروٹین 1 (Keap1) پاتھ وے کے نام سے بھی جانا جاتا ہے، ایک غالب ردعمل جھرن ہے جو آکسیڈیٹیو تناؤ سے فعال ہوتا ہے[14]۔ یہ راستہ ایک سیلولر دفاعی طریقہ کار ہے جسے خلیوں نے آکسیڈیٹیو تناؤ کے مضر اثرات سے نمٹنے کے لیے تیار کیا ہے۔ عام حالات میں، Nrf2 منفی طور پر Keap1 کے ذریعے ریگولیٹ ہوتا ہے، جو cytoplasm میں ہوتا ہے، اور نچلی سطح پر برقرار رہتا ہے۔ جب آکسیڈنٹس کے سامنے آتا ہے، تو Nrf2 Keapl سے الگ ہوجاتا ہے، جس سے اس کے مرکزے میں نقل مکانی ہوتی ہے جہاں یہ مخصوص DNA ترتیب سے منسلک ہوتا ہے۔ اینٹی آکسیڈینٹ رسپانس عناصر (ARE) نامی یہ ترتیبیں، سائٹو پروٹیکٹیو جینز کی نقلی ایکٹیویشن کا باعث بنتی ہیں، جیسے NAD(P)H:quinone-oxidoreductase-1 (NQO1)، heme oxygenase-1 (HMOX1) ، اور گلوٹامیٹ-سسٹین لیگیس کیٹلیٹک سبونائٹ (GCLC)[15,16]۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ Nrf2-کیپل سگنلنگ پاتھ وے کو چالو کرنے سے انسانی GCs اور ماؤس اووری میں اینٹی آکسیڈینٹ کی سطح کو بلند کرکے آکسیڈیٹیو تناؤ کو پہنچنے والے نقصان کو کم کرتا ہے[17,18]۔ تاہم، زنانہ گیمیٹ عمر بڑھنے کے عمل میں اس کا کردار مضحکہ خیز رہتا ہے، حالانکہ یہ واضح طور پر قائم ہے کہ مائٹوکونڈریا اس عمل کے دوران ROS کے لیے اہم پروڈکشن سائٹ ہے [9,10]۔

Cistanche بڑھاپے کو روک سکتا ہے۔

اس کے برعکس، مائٹوکونڈریا کئی اہم سیلولر افعال میں شامل ہیں اور oocyte کی پختگی اور اس کے نتیجے میں جنین کی نشوونما کے دوران درکار توانائی کی پیداوار کی طلب کو پورا کرنے کے لیے بنیادی حیثیت رکھتے ہیں [19]۔ قابل مائٹوکونڈریل سرگرمی مائٹوکونڈریل ڈی این اے (mt-DNA) اور اے ٹی پی جنریشن [20]، اعلیٰ مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل [21]، اور مائٹوکونڈریا کے معیار اور مقدار کو مائٹوفیجی [22] کے ذریعے برقرار رکھنے کے ساتھ بہت زیادہ وابستہ ہے۔ مزید برآں، مائٹوکونڈریل سرگرمی کو براہ راست جنین کی عملداری اور بہتر زرخیزی کے نتائج کے ساتھ منسلک کرنے کا مشورہ دیا گیا ہے [23]۔ بڑھتے ہوئے شواہد اس بات کی تائید کرتے ہیں کہ عمر سے متعلق مائٹوکونڈریل تبدیلیاں ڈمبگرنتی بڑھاپے کی طرف لے جاتی ہیں اور اس کے نتیجے میں جنین کی عملداری اور امپلانٹیشن کی صلاحیت میں کمی واقع ہوتی ہے۔ ان تبدیلیوں میں mt-DNA کاپی نمبر میں کمی، ATP جنریشن میں کمی [20]، mitochondrial gene expression [24,mt-DNA نقصان [25]، اور مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت میں کمی [26] شامل ہیں۔

مائٹوکونڈریا کے اہداف کے علاج کے طریقوں نے مائٹوکونڈریل فنکشن کو بڑھانے میں ان کی بڑی صلاحیت کی وجہ سے عمر بڑھنے سے وابستہ متعدد پیتھالوجیز میں بہت زیادہ دلچسپی پیدا کی [27]۔ اس فریم ورک کے اندر، Urolithin A (UA) - ایک قدرتی میٹابولائٹ جو انار جیسے کھانے کے کھانے کے بعد حاصل کیا جاتا ہے اور اس کے بعد گٹ مائکرو بایوٹا کے ذریعے اس کی تبدیلی ہوتی ہے - کو عمر کے ساتھ غیر فعال مائٹوکونڈریا کے جمع ہونے سے روکنے کے لیے دکھایا گیا ہے، مائٹو فیجی کی حوصلہ افزائی کرتا ہے اور اس کے ساتھ ساتھ مائٹوکونڈریا کو بھی برقرار رکھتا ہے۔ بایوجنسیس اور سانس کی صلاحیت [28,29]۔ UA کو بعض کینسروں، جیسے کولوریکٹل اور پروسٹیٹ کینسر[30,31] کو روکنے کے لیے ایک امید افزا علاج معالجے کے طور پر استعمال کیا گیا ہے۔ مزید برآں، UA میں سوزش مخالف [32]، اینٹی موٹاپا [33]، اینٹی آکسیڈینٹ [34] اور عمر بڑھانے کی خصوصیات بھی ہیں [35]۔ھٹی bioflavonoidsایک حالیہ مطالعہ نے Nrf2-کیپل پاتھ وے کو ان کی اینٹی آکسیڈینٹ کی صلاحیت کو بڑھانے کے لیے سنسنی خیز انسانی جلد کے فائبرو بلاسٹس پر UA کی تکمیل کے اثرات کو اجاگر کیا ہے۔ Nrf2-کیپل پاتھ وے کی یہ ایکٹیویشن مؤثر طریقے سے ROS کی سطح کو کم کرتی ہے، Nrf2 ڈاؤن اسٹریم ARE-رسپانس جینز (SOD، NQO1، GCLC، اور HMOX1) کے اظہار کو اپ گریجولیشن کے ذریعے، ایک امید افزا اینٹی ایجنگ اثر کی نشاندہی کرتا ہے [ 35]۔

ڈمبگرنتی عمر بڑھنے میں تاخیر کے مقصد کے ساتھ کئی مطالعات انجام دی گئی ہیں، جس کے نتیجے میں oocyte کے معیار اور زرخیزی کے نتائج میں بہتری آتی ہے۔ ڈمبگرنتی عمر بڑھنے کے عمل میں آکسیڈیٹیو تناؤ کی شراکت کے ساتھ ساتھ مائٹوکونڈریل dysfunction کی وجہ سے، اینٹی آکسیڈینٹس کے ساتھ ضمیمہ ایک امید افزا علاج کے طور پر ظاہر ہوا ہے [36,37]۔ تاہم، یہ معلوم نہیں ہے کہ آیا Urolithin A کا ضمیمہ ڈمبگرنتی عمر کے دوران ہونے والے نقصان کو بحال کر سکتا ہے جو بانجھ پن کے مسائل کو روکنے میں معاون ہے۔ لہذا، اس مطالعے کا مقصد یہ تھا: (1) یہ ظاہر کرنا کہ عمر بڑھنے سے کمولس-آوسیٹ کمپلیکس (COC) کی نشوونما کی صلاحیت اور GCs کے Nrf2 سگنلنگ پاتھ وے میں شامل اہم جینوں کے اظہار کو تبدیل کیا جا سکتا ہے۔ خواتین کی زرخیزی جو عمر رسیدہ COCs اور GCs میں بڑھاپے کے خلاف اثر کا مظاہرہ کرتی ہے۔ اور (3) Nrf2 سگنلنگ پاتھ وے میں شامل جینوں کے اظہار کی سطح کے ساتھ ساتھ oocyte کے معیار پر UA اثر کا جائزہ لینا۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 تجرباتی نمونہ

اس مطالعہ کو قومی ویٹرنری اتھارٹی (N ڈگری 08965DGAV) کی اینیمل کیئر کمیٹی نے یورپی یونین کے رہنما خطوط (نمبر{1}}/609/EEC) کے بعد منظور کیا تھا۔ oocyte کے معیار میں تبدیلی اور UA کے ممکنہ اینٹی ایجنگ اثر پر عمر بڑھنے کے اثر کی چھان بین کرنے کے لیے، prepubertal اور بالغ گایوں سے جمع کردہ COCs کا استعمال کرتے ہوئے ایک ماڈل وٹرو عمر رسیدہ (30 گھنٹہ پختگی) یا جسمانی پختگی (22 گھنٹے) میں جمع کرایا گیا۔ h) عمل کو لاگو کیا گیا تھا۔

2.1.1۔پچھلا پرکھ—خوراک جوابی مطالعہ

UA کی حراستی کا تعین کرنے کے لئے ایک پچھلا پرکھ جو بوائین COCs کی پختگی کے عمل کے دوران استعمال کیا جانا چاہئے چار سیشنوں میں خوراک کے جواب کے مطالعے کی بنیاد پر انجام دیا گیا تھا۔ چونکہ UA کا کبھی بھی بوائین oocytes میں تجربہ نہیں کیا گیا تھا، اس لیے پچھلی خوراکیں کامیابی کے ساتھ کچھ کینسروں کی روک تھام اور تخفیف کے لیے لگائی گئی تھیں اور مختلف سیل لائنوں میں UA کے عمر مخالف اثر کو ظاہر کرنے کے لیے استعمال کیے گئے تھے [28,39]۔ پری بلوبرٹل اور بالغ بالغ گایوں (n=978) سے حاصل کردہ COCs کا انتخاب کیا گیا اور پھر UA کی مختلف خوراکوں کو جانچنے کے لیے تصادفی طور پر پانچ گروپوں میں تقسیم کیا گیا: وٹرو میچوریشن کے دوران جسمانی طور پر کنٹرول، 1,10,25، اور 50 uM۔ پختگی کی مدت کے بعد، کروموسومل ترتیب اور پختگی کے مراحل کا تعین کرنے کے لیے کچھ oocytes (n=154) کو داغ دیا گیا تھا۔ بقیہ پختہ oocytes کو منجمد / پگھلے ہوئے منی کے ساتھ وٹرو انسیمینیشن میں جمع کرایا گیا تھا۔ مفروضہ زائگوٹس کو کلچر کیا گیا تھا، اور کلچر کے دن 2 اور دن 7 میں کلیویج اور بلاسٹوسسٹ کی شرح کا تعین کیا گیا تھا۔ حاصل کردہ نتائج کی بنیاد پر، یعنی نقصان دہ اثرات کی عدم موجودگی اور پختگی اور بلاسٹوسسٹ کی نشوونما کے فروغ، UA کے 1 uM کی حراستی کا انتخاب کیا گیا۔

2.1.2۔تجربہ1

اس تجربے میں، چھ سیشنوں میں کیا گیا، دونوں COCs پری بلوغت (مطلب عمر=9 ماہ، n=660) اور بالغ (مطلب عمر =39ماہ، n=674) گائے کو عمر رسیدہ اور جسمانی طور پر پختہ oocytes کے oocyte کے معیار اور ترقیاتی صلاحیت کے ساتھ ساتھ خواتین کی زرخیزی کو بچانے کے لیے UA اثر کا جائزہ لینے کے لیے جمع کیا گیا تھا۔ COCs کو تصادفی طور پر 8 گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: (1) پری پیوبرٹل گروپ کو کنٹرول کریں، پری پبرٹل بچھڑوں کے COCs جو 22h (n=148) کے لیے پختہ ہوئے؛ (2) UA prepubertal گروپ، درمیانے درجے میں بالغ ہونے والے پری پبرٹل بچھڑوں کے COCs 1 uM کے ساتھ ضمیمہ 22 گھنٹے کے لیے UA (n=155)؛ (3) 30 گھنٹے کی عمر کے پری بلوبرٹل گروپ، Oitro میچوریشن (n=149) کے 30 گھنٹے تک کی عمر کے پری بلوبرٹل بچھڑوں کے COCs؛ (4) 30 گھنٹے کی عمر کے UA پری پیوبرٹل گروپ، وٹرو میں 30 گھنٹے کے لیے عمر رسیدہ بچھڑوں کے COCs جو 1 uM UA(n=144) کے ساتھ ضمیمہ کرتے ہیں؛ (5) کنٹرول بالغ گروپ، بالغ گایوں کے COCs 22h کے لیے بالغ ہوئے (n=155 );(6) UA بالغ گروپ، درمیانے درجے میں پختہ بالغ گایوں کے COCs 22 گھنٹے (n=129) کے لیے 1 uM UA کے ساتھ ضمیمہ؛ (7) 30 گھنٹے کی عمر کے بالغ گروپ کو کنٹرول کریں، اس سے عمر کی بالغ گایوں کے COCs 30 h of in oitro maturation (n=148); اور (8) UA عمر کے 30 گھنٹے بالغ گروپ، بالغ گایوں کے COCs جن کی عمر 30 گھنٹہ کے لیے اوئٹرو میں ہوتی ہے جس میں 1 uM UA(n=138) کے ساتھ تکمیل ہوتی ہے۔cynomorium فوائدمتعلقہ ان وٹرو میچوریشن ادوار کے بعد، oocytes کو پگھلے ہوئے کیپسیٹیٹڈ بیل منی کے ساتھ انسیمینیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، جنین کی نشوونما کا اندازہ لگایا گیا، کلیویڈ اور پیدا ہونے والے جنین دونوں کی شرح کے ساتھ ساتھ ان کے معیار کا بھی جائزہ لیا گیا۔

مزید برآں، اس تجربے میں، ہر گروپ سے COCs کو ان کے جوہری پختگی کے مرحلے کا جائزہ لینے کے لیے بازیافت کیا گیا تھا (کنٹرول پری پیوبرٹل گروپ، n=7؛ UA prepubertal گروپ، n =7؛ 30 h prepubertal گروپ کو کنٹرول کریں، n{ {3}}؛ UA عمر 30 h پری بلوغت گروپ، n=6؛ کنٹرول بالغ گروپ، n=16؛ UA بالغ گروپ، n=21؛ 30 گھنٹے کی عمر کا بالغ گروپ، n{ {9}}؛ UA عمر 30 h بالغ گروپ، n=18)۔ COCs کے مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل (MP) کا بھی جائزہ لیا گیا (کنٹرول پری پبرٹل گروپ، n=10؛ UA پری پیوبرٹل گروپ، n{ {13}}؛ 30 گھنٹے پری بلوغت کے گروپ کو کنٹرول کریں، n=9؛ UA عمر 30 h پری بلوبرٹل گروپ، n=9؛ کنٹرول بالغ گروپ، n=15؛ UA بالغ گروپ، n{ {19}}؛ 30 گھنٹے کی عمر کے بالغ گروپ کو کنٹرول کریں، n=10؛ UA عمر 30 گھنٹے بالغ گروپ، n=14)۔

2.1.3۔تجربہ2

چونکہ GCs follicular نمو اور oocyte کی نشوونما میں ایک ضروری کردار ادا کرتے ہیں، NFE2L2، NQO1، اور mt-ND5 کے اظہار پر عمر اور UA کے اثر کا مزید مطالعہ کرنے کے لیے پانچ سیشنز میں دوسرا تجربہ کیا گیا۔ mt-ND5 جین کی کاپیوں کی تعداد کا بھی جائزہ لیا گیا۔ GCs prepubertal (مطلب عمر=10 ماہ) اور بالغ گائے (مطلب عمر =62ماہ) کے بیضہ دانیوں سے حاصل ہونے والے follicular سیال کے سینٹرفیوگریشن کے بعد حاصل کیے گئے تھے۔ ان خلیات کو درج ذیل حالات میں کلچر کیا گیا تھا: (1) پری بلوبرٹل کنٹرول، پری بلوبرٹل بچھڑوں کے جی سی کی ثقافت؛ (2) پری بلوبرٹل UA، 1 uM UA کے ساتھ ضمیمہ شدہ پری بلوبرٹل بچھڑوں کے GCs کی ثقافت؛ (3) بالغوں کا کنٹرول، بالغ گایوں کے GCs کی ثقافت؛ اور (4) بالغ UA، بالغ گایوں کی GCs کی ثقافت 1 uM UA کے ساتھ ضمیمہ۔ ثقافت کے 5 ویں دن GCs کے سنگم کے بعد، انہیں مائع نائٹروجن میں منجمد کر دیا گیا، اور بعد میں DNA اور RNA کو نکالا گیا، جس سے NFE2L2، NQO1، اور mt-ND5 mRNA ٹرانسکرپٹس اور mt-ND5 کاپیوں کی تعداد کو بعد میں درست کرنے کی اجازت دی گئی۔

2.2 Oocyte کلیکشن اور ان وٹرو میچوریشن

بالغ اور قبل از بلوغت کی گایوں کے بیضہ دانی (پچھلے پرکھ، n {{0}} اور exp. 1, n=1334) کو مقامی مذبح خانے میں جمع کیا گیا تھا، اور 35-37 ڈگری پر رکھا گیا تھا۔ ایک فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) 0.15 فیصد بوائین سیرم البومین (w/v, BSA) کے ساتھ 0.05 mg mL-l کنامیسن کے ساتھ ضمیمہ۔ لیبارٹری میں، 2-8 ملی میٹر قطر کے ڈمبگرنتی follicles کو ایک 19-گیج کی سوئی سے اسپیریٹ کیا گیا تھا۔ صرف COCs کو کم سے کم تین پرتوں کے ساتھ کمپیکٹ کمولس خلیوں اور ایک یکساں اوپلاسم کو دھویا گیا تھا اور تجرباتی ڈیزائن کے مطابق پختگی کے لیے منتخب کیا گیا تھا۔صحرائی آبشارمیچوریشن ایک انکیوبیٹر میں 38.8 ڈگری، 5 فیصد CO2 پر مرطوب ہوا میں 22 یا 30 گھنٹے کے لیے ٹشو کلچر میڈیم 199 (TCM) پر مشتمل میچوریشن میڈیم میں 10 فیصد فیٹل بووائن سیرم، 0.2mM سوڈیم کے ساتھ مکمل کیا گیا۔ پائروویٹ، ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر کا 10 ng mL-l، اور gentamicin کا ​​10 μL mL-l【40】۔

2.3. گرانولوسا سیلز کا مجموعہ اور ثقافت

گرینولوسا سیلز 200x g[41] پر 10 منٹ کے لیے سینٹرفیوگریشن کے بعد بازیافت شدہ فولیکولر سیال سے حاصل کیے گئے تھے۔ گولی کو 1 ملی لیٹر کلچر میڈیم (TCM199 پلس 10 فیصد سیرم) میں 5 منٹ کے لیے ایک اور سینٹرفیوگریشن کرنے کے لیے معطل کر دیا گیا تھا۔ نئی گولی کو کلچر میڈیم کے 1 ملی لیٹر میں یا تو 1 uM UA کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا تھا یا تجرباتی ڈیزائن کے مطابق نہیں اور خلیوں کو الگ کرنے کے لیے کم از کم 30 بار 19G-سوئی سے منسلک سرنج کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا تھا۔ GC کے قابل عمل ہونے کی تشخیص کے بعد (ٹرپین بلیو ڈائی، 0.4 فیصد w/v)، سیلز کو 2×105 قابل عمل سیلز mL-1 کے ارتکاز پر بیج کیا گیا اور 38.8 ڈگری، 5 فیصد CO2 پر پانچ دنوں کے لیے مرطوب میں بنایا گیا۔ سنگم تک ماحول. ہر 48 گھنٹے پر، کلچر میڈیم کو ڈسچارج کیا جاتا تھا اور ایک نئے کے ساتھ تازہ کیا جاتا تھا۔ ڈی این اے اور آر این اے نکالنے کے لیے، جی سی کو 10 منٹ کے لیے 200x جی پر سینٹرفیوگریشن کے ذریعے اکٹھا کیا گیا اور دھویا گیا۔ سیل کے چھرے PBS کے 1 mL میں دوبارہ معطل کیے گئے، فوری طور پر مائع نائٹروجن میں منجمد ہو گئے، اور -80 ڈگری پر محفوظ کر لیے گئے۔

2.4 Oocyte جوہری پختگی

وٹرو کی پختگی کے 22 گھنٹے یا 30 گھنٹے کی مدت کے بعد جوہری پختگی کے مراحل کا اندازہ کیا گیا۔flavonoid نکالنے کا طریقہ pdfڈینیوڈڈ آوسیٹس کو ایسٹک ایسڈ/ایتھنول (1:3، v/v) محلول میں طے کیا گیا تھا، اور 48 گھنٹے کے لیے 4 ڈگری پر برقرار رکھا گیا تھا۔ اس کے بعد oocytes کو 1 فیصد aceto-lacmoid محلول کے ساتھ داغ دیا گیا، ایک Neubauer چیمبر میں نصب کیا گیا، اور ایک مرحلے کے برعکس مائکروسکوپ (Olympus BX41) کے تحت مشاہدہ کیا گیا۔ Oocytes کو مندرجہ ذیل درجہ بندی کیا گیا تھا: Germinal Vesicle (GV)، Condensing Chromo-somes I (CCI)، Condensing Chromosomes II (CCII)، Diakinesis، Anaphase-I/Telophase-I (AI/TI)، اور MII (Metaphase-II) . صرف نظر آنے والے کرومیٹن داغ والے oocytes کو مدنظر رکھا گیا تھا [42]۔

2.5 مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت کا اندازہ

مائٹوکونڈریل میمبرین پوٹینشل (ایم پی) کی پیمائش کرنے کے لیے، جو مائٹوکونڈریل سرگرمی کا ایک اشارہ ہے، مائٹوکونڈریا کو 5، 6، 6'-ٹیٹراکلورو-1، 1'، 3، 3'ٹیٹرایتھیلبینزیمائڈازول کاربوسائنائن آئوڈائڈ (JC{{8}) سے داغ دیا گیا تھا۔ ، انویٹروجن، والتھم، ایم اے، یو ایس اے)۔ اندھیرے میں مرطوب ہوا میں 30 منٹ تک 38.8 ڈگری پر اور 5 فیصد CO2 کے لیے ڈینیوڈڈ oocytes کو 5 ug mL-l JC-1 [37] کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ Oocytes کو PBS میں دو بار دھویا گیا اور فوری طور پر پہلے سے گرم سلائیڈ گلاس میں منتقل کیا گیا اور بلیو فلوروسینس فلٹر (BP 470-490 مقصد UPlanFI 20×/0.50) کا استعمال کرتے ہوئے فلوروسینس مائکروسکوپ (Olympus BX51) کے تحت مشاہدہ کیا گیا۔ مائٹوکونڈریل جھلی کی صلاحیت کو پھر امیج] سافٹ ویئر (نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ، بیتیسڈا، MD، USA) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا سرخ/سبز فلوروسینس کے تناسب کے طور پر شمار کیا گیا۔ 2.6 وٹرو فرٹیلائزیشن اور ایمبریو کلچر میں

ان وٹرو فرٹلائجیشن ایک ہولسٹین-فریزین بیل کے منجمد پگھلے ہوئے نطفہ کے ساتھ انجام دی گئی تھی، اس سے قبل پرکول گریڈینٹ (45 اور 90) طریقہ استعمال کرتے ہوئے 2 x 10 ڈگری اسپرمیٹوزا mL-4.COCs اور نطفہ 20 گھنٹے کے لیے 38.8 ڈگری اور مرطوب ہوا میں 5 فیصد CO2 پر اکٹھے ہوئے تھے۔ اس کے بعد مفروضہ زائگوٹس کو مصنوعی بیضوی سیال (SOF) میڈیم کی بوندوں میں منتقل کیا گیا جو BME اور MEM امینو ایسڈز، گلوٹامین، گلوٹاتھیون، اور BSA [40] کے ساتھ اضافی ہیں۔ حمل کے 48 گھنٹے کے بعد، کلیویج کی شرح (کلیواڈ ایمبریوز فی کل انسیمینیٹڈ آوسیٹس) کو منظور کیا گیا، اور کلیویڈ ایمبریوز کو SOF میں BSA اور فیٹل بوائین سیرم (FBS) کے 10 فیصد کے ساتھ برقرار رکھا گیا۔ جنین کو 12 دن [41,43] کے لیے کلچر کیا گیا تاکہ بلاسٹوسسٹ کی نشوونما کی شرح کا اندازہ کیا جا سکے (7،9 اور 12 دن؛ D7 ایمبریو فی کلییوڈ ایمبریو) اور ہیچڈ ایمبریو ریٹ (ہیچڈ ایمبریو فی D7 ایمبریو) اور ان کے معیار [43]۔ دن 7 جنین کو گریڈ 1 (اچھے معیار)، 2 (منصفانہ معیار)، اور گریڈ 3 (خراب معیار) کے طور پر درجہ بندی کیا گیا تھا[4]۔

2.7.DNA اور RNA نکالنا اور مقدار درست کرنا

مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق بالترتیب ہائی پیور پی سی آر ٹیمپلیٹ پریپریشن کٹ (روچے، باسل، سوئٹزرلینڈ) اور پیور لنک ٹی ایم آر این اے منی کٹ (انویٹروجن ٹی ایم، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) کا استعمال کرتے ہوئے کل ڈی این اے اور آر این اے کو جی سی سے الگ تھلگ کیا گیا۔ ان پروٹوکولز میں اسپن کالموں کا استعمال شامل تھا جو اعلیٰ معیار کے کل DNA اور RNA اور DNase کو RNA سے جینومک DNA کو ہٹانے کے علاج کے طور پر الگ تھلگ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا[40]۔ نکالنے کے بعد، نمونے -80 ڈگری پر محفوظ کیے گئے تھے۔ DNA اور RNA کے ارتکاز اور معیار کا تعین NanoDropTM One/OneC سپیکٹرو فوٹومیٹر (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA) کے ذریعے کیا گیا تھا۔

2.7.1 تکمیلی ڈی این اے ترکیب

RNA الگ تھلگوں سے تکمیلی DNA (cDNA) کی ترکیب Xpert cDNA Synthesis Mastermix kit (GRiSP، Porto، پرتگال کا استعمال کرتے ہوئے، مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق کی گئی تھی۔ RNA کو ہر نمونے سے 500 ng نکالے گئے RNA کا استعمال کرتے ہوئے cDNA کی ترکیب کو انجام دینے کے لیے ریورس ٹرانسکرائب کیا گیا تھا، جسے تھرمو سائکلر (T100 تھرمل سائیکلر، بائیو ریڈ، ہرکیولس، CA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔ نتیجے میں آنے والے cDNAs کو مزید جانچ کے لیے استعمال ہونے تک -20 ڈگری پر ذخیرہ کیا گیا تھا۔ 2.7.2.Primer Design

اس مطالعے کے لیے، ٹارگٹڈ (NFE2L2 اور NQO1) اور ایک اینڈوجینس کنٹرول جین (6-ایکٹین) کے لیے پرائمر نیشنل سینٹر فار بائیوٹیکنالوجی انفارمیشن (NCBI) کے پرائمر-BLAST سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیے گئے تھے (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/، تک رسائی 6 مارچ 2020)۔ ریفرنس جینز اور ٹارگٹ جینز کے لیے پرائمر کی ترتیب کو ٹیبل 1 میں دکھایا گیا ہے۔ مزید برآں، اس کام میں mt-ND5 جین استعمال کیا گیا تھا، اور mt-ND5 پرائمر کے بارے میں تفصیلات پچھلے مطالعے سے حاصل کی گئی تھیں [45]۔

2.7.3. مقداری ریورس ٹرانسکرپشن پولیمریز چین ری ایکشن

ایک QuantStudio 3 thermocycler (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA) میں ROX کے ساتھ Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X کا استعمال کرتے ہوئے ریئل ٹائم PCR تجزیے 25 ng uL-l کے ارتکاز میں cDNA کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے۔ ND5 جین کی mitochondrial DNA (mt-DNA) کاپی نمبر کا اندازہ qPCR کے ذریعے پہلے نکالے گئے DNA کے ذریعے کیا گیا تھا، اسی آلات کا استعمال کرتے ہوئے جیسا کہ جین کی مقدار درست کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ ہر ایک بہترین ردعمل کا مظاہرہ کیا گیا، جس میں ایکسپرٹ فاسٹ ایس وائی بی آر گرین ماسٹر مکس 2 ایکس ROX کے ساتھ، ہر ٹارگٹ جین کا پرائمر (فارورڈ اور ریورس)، نمونہ (cDNA/DNA)، اور RNase فری پانی کا مجموعی حجم 10 μL ہے۔ نمونوں کا ڈپلیکیٹ میں تجزیہ کیا گیا اور ٹیمپلیٹ کے بجائے پانی پر مشتمل ردعمل کو منفی کنٹرول کے طور پر شامل کیا گیا۔ نمونوں کو ایک ایمپلیفیکیشن پروٹوکول کا نشانہ بنایا گیا تھا جس میں ابتدائی سائیکل 95 ڈگری پر 2 منٹ کے ڈینیچریشن مرحلے پر مشتمل تھا، اس کے بعد 55 سیکنڈ کے لیے 95 ڈگری پر 40 ڈینیچریشن سائیکل، 60 ڈگری پر 30 سیکنڈ کے لیے 40 اینیلنگ سائیکل (منحصر پگھلنے والے درجہ حرارت پر) پرائمر سیکوینسز)، اور ایکسٹینشن کا مرحلہ 72 ڈگری پر 30 سیکنڈ کے لیے اور آخر میں، 10 منٹ کے لیے 72 ڈگری پر ایک فائنل ایکسٹینشن پیریڈ۔

جین کے اظہار کی مقدار کے لئے، متعلقہ مقدار کا طریقہ استعمال کیا گیا تھا۔ جین کے اظہار کی رشتہ دار مقدار کا یہ طریقہ مطالعہ کے تحت ہدف جینوں کے اظہار کی سطح کے ساتھ کیا گیا تھا، جو CT تقابلی طریقہ کے ذریعہ ہاؤس کیپنگ جینز کے ساتھ معمول بنائے گئے تھے۔ جیسا کہ RT-qPCR کی طرف سے بڑھاوا نقل میں انجام دیا گیا تھا، ہر جین کے لیے اوسط CT اقدار کا تعین کیا گیا تھا اور مندرجہ ذیل فارمولے کا استعمال کرتے ہوئے اظہار کی سطحوں کا حساب لگایا گیا تھا:

جہاں △Ct=Ct ہدف جین -Ct اینڈوجینس کنٹرول جین۔

کاپیوں کے mt-DNA نمبر کی مقدار کے تعین کے لیے، یونٹ ماس کے طریقہ کار کے خلاف معمول کے مطابق متعلقہ مقدار کا استعمال کیا گیا تھا۔ یہ طریقہ GCs کی CT اقدار کے ساتھ کیا گیا تھا جس کا علاج UA (ایک ٹیسٹ کے طور پر نام دیا گیا ہے) کے ساتھ کیا گیا تھا، جنہیں کنٹرول کے نمونوں کے ساتھ معمول بنایا گیا تھا (فی الحال کیلیبریٹر کے طور پر نامزد کیا گیا ہے)۔ جیسا کہ mt-ND5 کاپی نمبر کا اندازہ qPCR کے ذریعے کیا گیا تھا اور اسے ڈپلیکیٹ میں انجام دیا گیا تھا، ٹیسٹوں اور کیلیبریٹرز کے نمونوں کے لیے اوسط CT قدروں کا تعین کیا گیا اور درج ذیل فارمولے کا استعمال کرتے ہوئے تناسب کا حساب لگایا گیا:

جہاں △Ct=Ct calibrator-Ct ٹیسٹ اور E کارکردگی ہے۔

یہ مضمون اینیملز 2021، 11، 2048 سے لیا گیا ہے۔ https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals