ڈینڈرائمر – ٹیسگلیٹازر کنجوگیٹ مائیکروگلیہ کی فینوٹائپ شفٹ کی حوصلہ افزائی کرتا ہے اور ایمیلائڈ فیگوسائٹوسس کو بڑھاتا ہے† حصہ 2

وٹرو بائیولوجیکل اسسیس میں

سیل کلچر۔ BV2 مورین مائکروگلیئل سیل لائن مشی گن سیل کلچر کی سہولت کے چلڈرن ہسپتال سے حاصل کی گئی تھی۔

حالیہ برسوں میں، سائنسدانوں نے محسوس کیا ہے کہ سیل کلچر کا انسانی یادداشت سے گہرا تعلق ہے۔ مطالعے سے معلوم ہوا ہے کہ سیل کلچر کے مطالعہ کے ذریعے یادداشت اور سیکھنے کے عمل میں مالیکیولر میکانزم کو دریافت کیا جا سکتا ہے، جس سے انسانی علمی صلاحیت اور یادداشت میں بہتری آتی ہے۔

سیل کلچر سے مراد حیاتیاتی خلیوں کو کلچر میڈیم میں رکھنے کا عمل ہے جس میں وٹرو حالات میں بڑھنے اور دوبارہ پیدا کرنے کے لیے ضروری غذائی اجزاء ہوتے ہیں۔ خلیے زندگی کی بنیادی اکائیاں ہیں، اور سیل کلچر سائنسدانوں کو سیل کے رویے اور زندگی کی سرگرمیوں کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک پلیٹ فارم مہیا کرتا ہے۔ خلیات کے مطالعہ کے ذریعے، سائنسدانوں نے نیوران کی ترقی اور Synaptic کنکشن کے بارے میں بہت سی معلومات دریافت کی ہیں. یہ نتائج نہ صرف انسانوں کو بہتر طور پر سمجھنے میں مدد کرسکتے ہیں کہ دماغ کیسے کام کرتا ہے بلکہ نئے علاج اور ادویات تیار کرنے میں بھی مدد کرتا ہے۔

حالیہ برسوں میں ہونے والی تحقیق سے معلوم ہوا ہے کہ سیل کلچر کا انسانی یادداشت سے بھی گہرا تعلق ہے۔ سائنسدانوں نے محسوس کیا ہے کہ انسانی یادداشت کی تشکیل اور بحالی کے لیے بہت زیادہ مالیکیولر ریگولیشن اور سگنل کی ترسیل کی ضرورت ہوتی ہے۔ یہ سگنل ڈیلیوری اور ریگولیشن میکانزم سیل کلچر میں میکانزم کے ساتھ بہت سی مماثلت رکھتے ہیں۔ سیل کلچر میں سگنل ڈیلیوری اور ریگولیشن میکانزم کا مطالعہ کرکے، سائنسدان انسانی یادداشت اور سیکھنے کے طریقہ کار کو بہتر طریقے سے سمجھ سکتے ہیں۔

اس کے علاوہ، کچھ مطالعات نے یہ بھی دکھایا ہے کہ سیل کلچر بعض طریقوں سے انسانی یادداشت اور سیکھنے کی صلاحیت کو بڑھا سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، "برقی محرک" نامی طریقہ استعمال کرتے ہوئے، خلیات کی سرگرمی اور نیوران کے درمیان تعلق کو متحرک کیا جا سکتا ہے، اس طرح انسانی علمی صلاحیت اور سیکھنے کے اثرات کو بہتر بنایا جا سکتا ہے۔ اگرچہ یہ طریقہ ابھی بھی لیبارٹری تحقیق کے مرحلے میں ہے، لیکن مستقبل میں اس کے علمی تربیت کا ایک نیا طریقہ بننے کی امید ہے۔

خلاصہ یہ کہ سیل کلچر اور انسانی یادداشت کے درمیان گہرا تعلق ہے۔ خلیات کے مطالعہ کے ذریعے، ہم انسانی علمی طریقہ کار اور یادداشت کے طریقہ کار کو بہتر طور پر سمجھ سکتے ہیں اور علاج کے نئے طریقوں اور علمی تربیت کے طریقوں کو تیار کرنے میں بھی مدد کر سکتے ہیں۔ آئیے ہم مستقبل میں بنی نوع انسان کے لیے سیل کلچر ٹیکنالوجی کے تعاون کے منتظر ہیں! یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے، اور Cistanche میں یادداشت کو نمایاں طور پر بہتر بنایا جا سکتا ہے کیونکہ Cistanche میں اینٹی آکسیڈنٹ، اینٹی سوزش اور عمر بڑھنے کے اثرات ہوتے ہیں، جو دماغ میں آکسیڈیشن اور سوزش کے رد عمل کو کم کرنے میں مدد کر سکتے ہیں، اس طرح دماغی صحت کی حفاظت کرتے ہیں۔ اعصابی نظام. اس کے علاوہ، Cistanche اعصابی خلیوں کی نشوونما اور مرمت کو بھی فروغ دے سکتا ہے، اس طرح عصبی نیٹ ورکس کے رابطے اور کام کو بڑھاتا ہے۔ یہ اثرات یادداشت، سیکھنے کی صلاحیت، اور سوچنے کی رفتار کو بہتر بنانے میں مدد کر سکتے ہیں، اور ادراک کی خرابی اور نیوروڈیجینریٹو بیماریوں کی موجودگی کو بھی روک سکتے ہیں۔

یادداشت کو بڑھانے کے لیے سپلیمنٹس جاننے پر کلک کریں۔

BV2 خلیات Dulbecco کے Modified EaglesMedium (DMEM) میڈیا میں 10% ہیٹ ان ایکٹیویٹڈ فیٹلبووائن سیرم (HI FBS) اور 1% پینسلن/سٹریپٹومائسن (P/S) 37 ڈگری اور 5% CO2 کے ساتھ کلچر کیے گئے تھے۔

ایک بار جب خلیے کلچرنگ فلاسک میں سنگم پر پہنچ گئے، خلیات کو ایک نئے فلاسک میں منتقل کر دیا گیا0.05% ٹرپسن – ایتھیلینیڈیمین ٹیٹرا ایسٹک ایسڈ (EDTA)۔ تجربات کے لیے، BV2 خلیوں کو DMEM میں 5% HIFBS اور 1% P/S کے ساتھ سیڈ کیا گیا تھا۔ 24-48 گھنٹے بعد، خلیات کو 3 گھنٹے کے لیے LPS کے 100 ng ml−1 (300 EU ml−1) کے ساتھ متحرک کیا گیا تاکہ خلیوں کو بہت سے اعصابی امراض میں موجود نیورو انفلامیٹری ماحول کی تقلید کرنے کے لیے سوزش کے حامی (M1) فینوٹائپ میں داخل ہو سکے۔

اس کے بعد خلیوں کا LPS کے ساتھ مل کر علاج کیا گیا اور یا تو مفت ٹیسا یا ڈی-ٹیسا 48 ہاتھ کے لیے مختلف ارتکاز میں پھر سپرنٹنٹ اور خلیات کو پروسیسنگ کے لیے اکٹھا کیا گیا۔ سیلز کا کبھی بھی LPS (No LPS) کے ساتھ علاج نہیں کیا گیا اور ہر وقت صرف LPS کے ساتھ علاج کیے جانے والے سیل (صرف LPS) کنٹرول گروپ کے طور پر کام کرتے ہیں۔ مفت ٹیسا اور ڈی ٹیسا اسٹاک سلوشنز پولی (ایتھر سلفونز) 0.2 µm فلٹرز کا استعمال کرتے ہوئے جراثیم کشی کر رہے تھے۔

ڈی ٹیسا سیل میڈیا میں گھلنشیل تھا۔ ٹیسا کو 0.1% (v/v) سے کم حتمی ارتکاز پر dimethylsulfoxide (DMSO) کا استعمال کرکے حل کیا گیا تھا۔Cytotoxicity، نائٹرک آکسائیڈ پرکھ، اور TNF- ELISA۔ سائٹوٹوکسیٹی پرکھ کے لیے، سیلوں کا علاج کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے96-کنویں پلیٹ میں، اور پھر مفت ٹیسا اور ڈی-ٹیسا کی سائٹوٹوکسیٹی کا اندازہ MTT پرکھ کے ذریعے مینوفیکچرر کی ہدایات کے بعد کیا گیا۔

نائٹرک آکسائیڈ پرکھ کے لیے، خلیات کو اوپر بیان کیا گیا جیسا کہ 12-کنویں کی پلیٹوں میں بیان کیا گیا تھا، اور پھر علاج شدہ خلیوں سے سپرنٹینٹس کو اکٹھا کیا گیا تھا اور فوری طور پر گریسس ریجنٹ کے لیے مینوفیکچرر کے پروٹوکول پر عمل کرتے ہوئے نائٹرک آکسائیڈ کی سطح کو درست کر دیا گیا تھا۔

TNF- ELISA کے لیے، سیلوں کا علاج اوپر بیان کردہ 12-کنویں پلیٹوں میں کیا گیا، اور پھر علاج شدہ خلیوں سے سپرنٹینٹس کو اکٹھا کیا گیا اور مزید پروسیسنگ کے لیے تیار ہونے تک −80 ڈگری پر محفوظ کیا گیا۔

پھر نمونوں کو برف پر پگھلا دیا گیا اور TNF- ELISA کو مینوفیکچرر کے پروٹوکول پر عمل کرتے ہوئے چلایا گیا۔ ان مطالعات کے لیے، D-Tesa اور free Tesa دونوں کو اس وقت تک سونیکیٹڈ اور گھلنشیل کیا گیا جب تک کہ وہ دونوں مکمل طور پر حل نہ ہو جائیں۔ مفت ٹیسا کو حل کرنے کے لیے، اسے سب سے پہلے DMSO میں گھلنشیل کیا گیا تھا، جہاں DMSO کا حتمی ارتکاز تمام مفت ٹیسا نمونوں کے لیے 0.1%(v/v) سے کم تھا۔

چونکہ D-Tesa سیل کلچر میڈیا میں گھلنشیل تھا، اس لیے DMSO کو ان نمونوں میں شامل نہیں کیا گیا۔ ایلن وٹرو اسٹڈیز کے لیے، مفت ٹیسا اور ڈی ٹیسا دونوں گروپوں کے خلیوں پر مساوی مقدار میں مفت یا کنجوگیٹڈ دوائیاں لاگو کی گئیں۔

مقداری ریئل ٹائم PCR (qRT-PCR)۔ سیلوں کا علاج اوپر بیان کردہ 12-کنویں پلیٹوں میں کیا گیا تھا، اور سپرنٹنٹ کو جمع کرنے کے بعد، خلیات کو Invitrogen™ TRIzol™ Reagent (Fisher Scientific سے) میں جمع کیا گیا تھا اور RNA کو مینوفیکچرر کے پروٹوکول پر عمل کرتے ہوئے نکالا گیا تھا۔ نتیجے میں آر این اے کی حراستی اور پاکیزگی کا تجزیہ نانوڈروپ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔

ہر نمونے سے RNA کی مساوی مقدار کو اعلیٰ صلاحیت سی ڈی این اے ریورس ٹرانسکرپشن کٹ کے لیے کارخانہ دار کے پروٹوکول کی پیروی کرتے ہوئے سی ڈی این اے میں تبدیل کیا گیا تھا (تھرمو فشر سائنٹیفک کے اپلائیڈ بایو سسٹم سے)۔

نتیجہ خیز سی ڈی این اے کو FAST-SYBR گرین ری ایجنٹ کا استعمال کرتے ہوئے اور مینوفیکچرر کے پروٹوکول کی پیروی کرتے ہوئے qRT-PCR تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا۔ Ct قدروں کا حساب مشین کے ذریعے کیا گیا اور 2−ΔΔCtmethod کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔

ہر ایک مختلف مارکر کے لیے، ΔΔCt قدر کا حساب ہر نمونے کے لیے ΔCt سے No LPS گروپ کے لیے ΔCt کو گھٹا کر کیا گیا۔ ΔCt قدر ہر دیے گئے نمونے کے لیے GAPDH کے لیے Ct مائنس دلچسپی کے جین کے لیے Ct قدر تھی۔

ایک بار جب تمام گروپوں کے لیے 2−ΔΔCt کا حساب لگایا گیا، تو ان سب کو No LPS گروپ میں نارمل کر دیا گیا، اس طرح تمام مارکروں کے لیے No LPS گروپ کو متعلقہ اظہار کی سطح 10 دی گئی۔ -پی سی آر درج ذیل جدول میں دکھایا گیا ہے۔ تمام ترتیبیں 5′→3′ سے لکھی گئی ہیں۔

مزید برآں، تجارتی طور پر دستیاب پرائمر BIORAD سے iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087)، TLR4 (qmmuCID0023548)، CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670)، TGF- 1 (qmmuCID001})،{901}5017}، CS1 (qmmuced0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1 (qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD (6020ST 60mm) id0006404)، اور PPAR (qmmucid0018821)۔ Phagocytosis پرکھ۔

-amyloid کے مفت Tesa اور D-Tesa onphagocytosis کے اثرات کا تعین پہلے سے بتائے گئے طریقہ کو استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ 0.5% (v/v)) سے کم اور PBS میں 5 µg ml−1 تک پتلا۔

اوپر بیان کردہ علاج کی اسکیم کے ساتھ Tesa اور D-Tesaw کے ساتھ خلیوں کا علاج کرنے کے بعد، -amyloid محلول کو 2 گھنٹے تک خلیوں پر لاگو کیا گیا۔ اس کے بعد، خلیات کو ہانک کے بیلنسڈ سالٹ سلوشن کے ساتھ ڈیویلنٹ کیشنز (کیلشیم اور میگنیشیم) کے ساتھ تین بار دھویا گیا، ٹرپسن کا استعمال کرتے ہوئے کنویں سے ہٹا دیا گیا، اور FACS بفر (انویٹروجن سے) میں دوبارہ معطل کر دیا گیا۔

نمونے برف پر محفوظ کیے گئے تھے، اور فوری طور پر سونی سیل سارٹر SH800 فلو سائٹو میٹری مشین پر چلائے گئے، اور متعلقہ سافٹ ویئر کے ساتھ ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔

گیٹ کو سیلز کا استعمال کرتے ہوئے سیٹ کیا گیا تھا جن کا فلوروسینٹ -amyloid کے ساتھ علاج نہیں کیا گیا تھا، اور دکھائے گئے نتائج ہر گروپ کے سیلز کا فیصد ہیں جنہوں نے بیک گراؤنڈ فلوروسینس کے اوپر فلوروسینس کی نمائش کی۔

ہر گروپ کے لیے ہائی لائٹ™ 488- کا لیبل لگا ہوا فلوروسینٹ شدت (MFA) بھی رپورٹ کیا گیا تھا۔ یہ پرکھ ڈپلیکیٹ میں کی گئی تھی۔ دکھایا گیا تمام ڈیٹا تین الگ الگ تجربات کا نتیجہ ہے، ہر ایک کو سہ رخی میں انجام دیا گیا ہے جب تک کہ دوسری صورت میں نوٹ نہ کیا جائے۔ گراف پیڈ پرزم 5 اور مائیکروسافٹ ایکسل کو اعداد و شمار کی کارکردگی کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔

بونفیرونی کوریکشن کے ساتھ دو دم والے، جوڑے والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کیے گئے۔ گربس کا ٹیسٹ آؤٹ لیرز کا تعین کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ ونڈوز کے لیے گراف پیڈ پرزم 5 کو ڈیٹا پلاٹ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا (سان ڈیاگو، سی اے)۔ دکھایا گیا ڈیٹا اوسط + SEM ہے۔

نتائج اور بحث

ڈی ٹیسا کی ترکیب اور خصوصیات

دماغ میں فعال مائکروگلیئل سیلز کو ٹارگٹڈ، انٹرا سیلولر ڈیلیوری کی اجازت دینے کے لیے، ٹیسا کو G4-PAMAM-OH کی سطح پر دوا اور ڈینڈریمر لنکر کے درمیان کلیو ایبل ایسٹر بانڈز کے ساتھ ہم آہنگی سے جوڑ دیا گیا تھا (تصویر 1)۔

پہلے مرحلے میں، Tesa (1) کو tetramethylene glycol azide (TEG-azide) (2) کے ساتھ رد عمل میں Tesa-TEG-azide (3) پیدا کیا گیا، جس کا دوائی اور لنکر (تصویر 1A) کے درمیان ایسٹر کا تعلق ہے۔

کمپاؤنڈ (3) کے HPLC نے 99% (تصویر S1B†) سے زیادہ پاکیزگی کے ساتھ 13.4 منٹ کا برقرار رکھنے کا وقت دکھایا۔ (3) کے بڑے پیمانے پر سپیکٹرم نے ایک چوٹی 610.13 [M + 1]+ ظاہر کی جو Tesa-TEG-azide مالیکیولر وزن سے مطابقت رکھتی ہے جو مصنوعات کی تشکیل کی مزید تصدیق کرتی ہے (تصویر S2†)۔ علیحدہ طور پر، G4-PAMAM-OH ڈینڈریمر (4) کو ڈی-YNE (5) (تصویر 1B) پیدا کرنے کے لیے ایک ایسٹریفیکیشن ری ایکشن کا استعمال کرتے ہوئے 5-ہیکسائنوک ایسڈ کے ساتھ رد عمل ظاہر کیا گیا۔

آخر میں، Tesa-TEG-azide (3) اورD-YNE (5) کو انتہائی موثر copper-catalyzedazide-alkyne cycloaddition (CuAAC) کلک ری ایکشن کے ذریعے ڈی-ٹیسا (6) (تصویر 1B) پیدا کرنے کے لیے رد عمل ظاہر کیا گیا۔ 48 The 1H NMR تمام انٹرمیڈیٹس اور حتمی مصنوعات کی کامیاب ترکیب کی تصدیق کی؛ ڈی ٹیسا (6) ڈینڈریمر اور ڈرگ لنکر پروٹون کی خصوصیت کی چوٹیوں پر مشتمل ہے جو ڈی ٹیسا (تصویر 2A) کی کامیاب ترکیب کا مظاہرہ کرتے ہیں۔

حتمی D-Tesa conjugate کے NMR نے انکشاف کیا کہ ٹیسا کے اوسطاً دس مالیکیول ہر ڈینڈرائمر کے ساتھ منسلک تھے۔ HPLC نے کامیاب covalent conjugation کی تصدیق کی، کیونکہ D-Tesa نے D-YNE اور TesaTEG-azide (تصویر 2B اور S1†) دونوں سے تبدیلی کی نمائش کی۔

ٹیسا میں پانی میں حل پذیری ناقص ہے، جس کا تخمینہ 0.0035 mg mL−1.49 ہے Tesa onhydroxyl dendrimer کے جوڑ نے اس تخمینے سے اس کی پانی میں حل پذیری کو کئی درجے بہتر کیا۔ D-Tesa 22 mg mL−1 پر پانی کے اندر حل پذیری تھی، اور چونکہ Tesa D-Tesa کے ∼19% پر مشتمل ہے، 4.2 mg ml−1 Tesa کے مساوی حل کیا گیا تھا (تصویر 3A)۔

ڈینڈرائمر کی طرف سے فراہم کی جانے والی گھلنشیلیت میں آسانی پیدا ہوتی ہے اور ممکنہ طور پر زہریلے مادوں کی ضرورت کو دور کرتی ہے۔ علاج کے اثر کو حاصل کرنے کے لیے خوراک کی ضرورت ہے۔ 18–28 آخر میں، D-Tesa کا اوسط سائز 7.75 ± 0.29 nm (تصویر S3†) تھا، اور ایک زیٹا پوٹینشل آف 2۔{11}} ± 0.38 mV (بالترتیب N=5 اور N=3 پیمائش)۔

منشیات کی رہائی

ہم نے D-Tesa کو intracellularly the low pH اور ہائی ایسٹیریز ارتکاز والے ماحول کے اندر فعال مائیکروگلیہ کے inendosomes/lysosomes کو جاری کرنے کے لیے ڈیزائن کیا ہے۔ ہم نے پہلے اطلاع دی ہے کہ PAMAM dendrimers بنیادی طور پر خلیات میں سیال فیز اینڈوسیٹوسس کے ذریعے داخل ہوتے ہیں، اور vesicles جن میں conjugates ہوتے ہیں وہ lysosomes میں تبدیل ہو جاتے ہیں۔

ہم نے ڈی ٹیسا کو سوڈیم سائٹریٹ بفر (پی ایچ 5.5) میں 37 ڈگری پر ایسٹریسیس کی موجودگی میں لیزوزوم کی حالتوں کی نقل کرنے کے لیے انکیوبیٹ کیا، جیسا کہ پہلے کیا گیا تھا۔ بفر، پی ایچ 7.4)۔

پلازما کے حالات میں، صرف 1.5% ٹیسا 48 گھنٹوں کے بعد جاری ہوتا ہے، اور 20% سے بھی کم ٹیسا 25 دن تک جاری ہوتا ہے جو کہ کنجوگیٹ کے پلازما کے استحکام کی تجویز کرتا ہے (تصویر 3B)۔

لائسوسومال کنڈیشنز کے تحت، ڈی ٹیسا سے تقریباً 60% ٹیسا پہلے 48 گھنٹوں کے اندر جاری ہو جاتی ہے، اور 19 دنوں کے اندر، تقریباً 100% ٹیسا جاری ہو جاتی ہے۔ یہ نتائج ظاہر کرتے ہیں کہ D-Tesa جسمانی لحاظ سے متعلقہ، لائسوسومال کنڈیشنز کے تحت پہلے دو ہفتوں کے لیے مفت دوا کی مستقل، متحرک رہائی فراہم کرتا ہے۔

مزید برآں، پہلے 48 گھنٹوں کے دوران مصنوعی پلازما حالات (pH 7.4 گروپ) میں ٹیسا کی کم از کم رہائی اہم ہے، کیونکہ یہ گردے کی منظوری سے پہلے کا عام G4-PAMAM-OH گردش کا وقت ہے، اس لیے ممکنہ طور پر ٹیسا کا اجراء مائیکروگلیہ تک پہنچنے سے پہلے کنجوگیٹس۔24

D-Tesa نے M1 مارکر کے اظہار کو کم کیا اور M2 مارکر میں اضافہ کیا۔

D-Tesa کی M1 سے M2 فینوٹائپ شفٹ کرنے کی صلاحیت کا جائزہ لینے کے لیے، ہم نے D-Tesa کی M1 اور M2 مارکر کے اظہار کو وٹرو میں مورائن مائکروگلیئل سیل لائن (BV2) کا استعمال کرتے ہوئے تبدیل کرنے کی صلاحیت کا جائزہ لیا۔

BV2 خلیات مورائن مائکروگلیئل سیلز کو لافانی بنا کر تخلیق کیے گئے تھے اور مائکروگلیئل انفلامیٹری ردعمل کا مطالعہ کرنے کے لیے پرائمری مائکروگلیہ سیلز کے لیے ایک مناسب متبادل دکھایا گیا تھا۔ ng ml−1 (300 endotoxinunits (EU) per ml) LPS 3 گھنٹے کے لیے۔

پھر، ہم نے ایل پی ایس کے ساتھ سیلز کا علاج کیا اور 48 گھنٹے تک مفت ٹیسا یا ڈی ٹیسا، اور پھر نمونے اکٹھے کئے۔ ہم نے مساوی ادویات کی بنیاد پر 1.5، 15، اور 150 µM فری ٹیسا یا ڈی-ٹیسا کی تعداد میں خلیوں کا علاج کیا۔

MTT پرکھ نے یہ ظاہر کیا کہ مفت Tesaor D-Tesa ان ارتکاز میں سائٹوٹوکسٹی (تصویر S4†) کا سبب نہیں بنتا ہے۔ Tesa andD-Tesa کی سب سے مؤثر خوراک کا تعین کرنے کے لیے Tesaand D-Tesa کے ساتھ ابتدائی خوراک تلاش کرنے کا مطالعہ کیا گیا۔

1.5 اور 15 µM مفت Tesa اور D-Tesadid کے ساتھ علاج نائٹرک آکسائیڈ یا TNF- کی رطوبت کو تبدیل نہیں کرتا، جیسا کہ بالترتیب Griess Reagent اور TNF- ELISA کے ذریعے طے کیا جاتا ہے (تصویر S5†)۔ ان نتائج کی بنیاد پر، ہم نے اپنے qRT-PCR اسسیس میں ان کم ارتکاز کا تجزیہ نہیں کیا۔

بہت سی نیوروڈیجینریٹو بیماریوں میں، پروینفلامیٹری کا ایک بڑا نیوروٹوکسک فعل، M1 مائیکروگلیہ ان کا رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (مثلاً نائٹرک آکسائیڈ) کا سراو ہے جو براہ راست نیورونز کو مار ڈالتا ہے۔

ہم نے اس اثر کو حاصل کرنے کے لیے D-Tesa کی صلاحیت کا جائزہ لیا۔ LPS محرک کے بعد، D-Tesa نے خفیہ نائٹرک آکسائیڈ اور inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA کی سطح 3 میں کمی کی۔{3}}fold (p < 0.0001) اور 2-fold (p {{) 7}}.011)، بالترتیب، صرف LPS (صرف LPS) (تصویر 4Aand B) کے ساتھ علاج کیے جانے والے خلیوں کے مقابلے میں۔

دوسری طرف، مفت ٹیسا نے خفیہ نائٹرک آکسائیڈ کو زیادہ اعتدال سے کم کیا (14-fold, p=0.004) اور iNOS mRNA اظہار (تصویر 4A اور B) میں نمایاں کمی نہیں کی۔ )۔

D-Tesa نائٹرک آکسائیڈ کے اخراج کو دبانے والے مفت Tesain سے کہیں زیادہ موثر تھا۔ اس کے بعد، اگر مائکروگلیا M1 یا M2 فینوٹائپ میں ہیں اس پر منحصر ہے، مائکروگلیہ یا تو iNOS یا Arginase 1 (Arg1) کو میٹابولائز کرنے کے لیے L-arginine کو اپنے M1 روگجنوں کو مارنے والے ردعمل کے لیے نائٹرک آکسائیڈ تیار کرنے کے لیے، orornithine اور Urea کو M2 کے لیے بالترتیب زخم بھرنے کے لیے اپ گریڈ کرتا ہے۔ 59

آئی این او ایس کی اس کی کمی کے ساتھ مطابقت رکھتے ہوئے، صرف ایل پی ایس کنٹرول کے مقابلے میں ڈی-ٹیسا نے Arg1 mRNA کی سطح 2- گنا (p=0.011) میں اضافہ کیا، جبکہ مفت ٹیسا نے اظہار میں نمایاں اضافہ نہیں کیا (p=0 .40) (تصویر 4C)۔

D-Tesa، اور ایک حد تک فری ٹیسا نے، مائکروگلیہ کو سائٹوٹوکسک نائٹروک آکسائیڈ جاری کرنے سے تبدیل کر کے زخم بھرنے کے لیے L-arginine کو میٹابولائز کرنے کے لیے تبدیل کر دیا، جس کے مضمرات کو کم کرنے اور ممکنہ طور پر الٹنے میں ہے، نیوروڈیجنریشن میں مائیکروگلیہ کی وجہ سے ہونے والی نیوروٹوکسیٹی، 1.5-7.

ڈی ٹیسا کے علاج کے ساتھ آئی این او ایس اور سیکریٹڈ نائٹرک آکسائیڈ کی سطح کو کم کرنا پچھلے کام سے ہے جس نے PPAR کے قدرتی ligand (15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2) میں iNOS اور نائٹرک آکسائیڈ کے اظہار اور رطوبت کو LPS میں علاج میں کمی کا مظاہرہ کیا۔ بنیادی مائیکروگلیا.60

IL-10، IL-4، اور TGF- 1 تمام سائٹوکائنز ہیں جو متبادل طور پر فعال M2 مائکروگلیہ کے ذریعے چھپتی ہیں جو دماغ میں ایک نیورو پروٹیکٹو، سوزش مخالف ماحول پیدا کر سکتی ہیں۔ 58,61,62 کی طرف اس اختتام پر، D-Tesa نے IL-105 کے اظہار میں اضافہ کیا۔{10}}fold (p=0.011) اور IL-4 8۔{14}}گنا (p { {15}}.013) صرف LPS کنٹرول (تصویر 4D اور E) کے مقابلے میں۔

مفت ٹیسا نے IL-10 یا IL-4 کی سطحوں میں نمایاں اضافہ نہیں کیا، حالانکہ اوسط 1 تھی۔{3}}گنا (p=0.066) اور 2۔{7} صرف ایل پی ایس کنٹرولز (تصویر 4D اور E) کے مقابلے میں ٹیسا سے علاج شدہ مائکروگلیہ کے لیے بالترتیب گنا (p=0.11) زیادہ۔ مزید برآں، D-Tesa نے TGF کے اظہار میں اضافہ کیا- 1 2۔{16}}fold (p=0.015) اور فری ٹیسا نے اظہار کو نمایاں طور پر تبدیل نہیں کیا (تصویر 4F)۔

اس طرح، D-Tesa مائکروگلیہ کے LPS علاج کے بعد سوزش والی سائٹوکائنز کے اخراج کو اکساتا ہے، جو نیوروٹوکسک، سوزش کے حامی ماحول کو نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں میں کم کر سکتا ہے۔5–7,10

M2- ذیلی قسم کے مارکر کا D-Tesa-حوصلہ افزائی اظہار

CD206، Ccl1، اور TLR8 بالترتیب M2a، M2b، اور M2c مائکروگلیہ ذیلی قسموں کے لیے مخصوص مارکر ہیں۔ 58 D-Tesa upregulated CD206 اظہار 4۔{10 }} فولڈ (p < 0.001)، Ccl1 3۔{14}} فولڈ (p < 0.005)، اور TLR8 5- گنا (p <0.01)، جبکہ فری ٹیسا نے اظہار میں نمایاں اضافہ نہیں کیا۔ ان تینوں میں سے کوئی بھی مارکر (تصویر 5A–C)۔

یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ D-Tesa سے علاج شدہ مائیکروگلیہ تینوں M2 ذیلی قسموں کے مارکر کی نمایاں اپ گریجشن کو ظاہر کرتا ہے، جو اس سمجھ سے متفق ہے کہ مائکروگلیہ فینوٹائپ پلاسٹک ہے نہ کہ بائنری۔63–65

M1/M2 کا نام اس پیچیدگی کو زیادہ آسان بناتا ہے کہ مائیکروگلیا ایکٹیویشن سٹیٹس کے سپیکٹرم میں موجود ہو سکتا ہے۔ اس تسلسل کے ساتھ، تین الگ الگ M2 فینوٹائپس (M2a، M2b، اور M2c) کی خصوصیت کی گئی ہے، اور D-Tesa ان میں سے ہر ایک کے ساتھ ہم آہنگ مارکروں کے اظہار کو اکساتا ہے۔ اسکیوینجر ریسیپٹرز، ٹشووں کی مرمت، اور سوزش مخالف کارروائیوں کے ذریعے پروٹین۔

M2b مائیکروگلیا M1 مائیکروگلیہ کی طرح ہیں جس میں وہ ایکسپریس IL-1, TNF-، اور IL-6; تاہم، M2b M1 مائیکروگلیا سے اس لحاظ سے الگ ہیں کہ وہ IL-10 کو اعلی سطح پر ظاہر کرتے ہیں اور iNOS اظہار کو کم کرتے ہیں۔ M2b میکروفیجز اور مائیکروگلیہ Th2 T-خلیات کو متحرک کرتے ہیں، جو کہ ایک سوزش آمیز ردعمل پیدا کرنے میں M2b کے تھیرولز میں سے ایک کا اشارہ ہے۔

M2cmicroglia زخموں کو ٹھیک کرنے، ٹشووں کو دوبارہ بنانے، آئرن سیکوسٹریشن، اور STAT3 ایکٹیویشن میں ملوث ہیں جو کہ پروانفلامیٹری سگنلنگ کو کم کرتا ہے۔ جو دونوں M2a مارکر ہیں۔ 58D-Tesa نے PPAR 2 کے اظہار میں اضافہ کیا۔{11}}fold (p=0.0036)اور STAT6 3۔{15}} فولڈ (p < 0.001)، جبکہ مفت ٹیسا نے STAT میں اضافہ کیا6 1۔{19}}گنا (p=0.011) بغیر PPAR اظہار (1{23}}گنا اضافہ، p=0.17) (تصویر 5D اور E)۔

STAT6 اور PPAR کے بڑھتے ہوئے اظہار کے نتیجے میں اینٹی سوزش جین کی پیداوار اور NF-κB سرگرمی کو روک کر سوزش کے حامی سگنلز کی روک تھام ہوتی ہے۔ چونکہ M2a مائیکروگلیہ کو IL-4 کے ساتھ مائیکروگلیہ کا علاج کر کے حوصلہ افزائی کی جا سکتی ہے، جو کہ STAT6 اور PPAR کے ذریعے سگنل دیتا ہے، اس لیے دو نیچے دھارے والے سگنلنگ پروٹینوں کی اپ گریجشن فیڈ فارورڈM2a پولرائزیشن کا نتیجہ بن سکتی ہے۔

ہمارے جائزوں میں، LPS ایکٹیویشن نے IL-6، TNF-، اور IL-1 کی سطحوں میں اضافہ کیا، اور D-Tesa کے ساتھ علاج نے ان سائٹوکائنز (تصویر S6A–D†) کے اظہار کو مزید بڑھا دیا، جس کا امکان ہے۔ D-Tesa M2b فینوٹائپ (تصویر 5B) کو دلانے کی وجہ سے۔

Free Tesain نے IL-6 کے اظہار میں اضافہ کیا اور TNF- اور IL-1 اظہار (تصویر S6A–D†) کو نمایاں طور پر تبدیل نہیں کیا۔ جبکہ یہ سائٹوکائنز M1 مائیکروگلیہ کے ذریعے خفیہ ہوتی ہیں، M2b مائیکروگلیہ ان سائٹوکائنز کو بھی ظاہر کرتی ہے۔ 58,61 CD86 M1 اورM2b مائیکروگلیہ دونوں کا مارکر ہے، اور D-Tesa علاج (تصویر S6E†) کے ساتھ بڑھایا جاتا ہے۔

مزید برآں، سائٹوکائن سگنلنگ (SOCS) کو دبانے والا انٹرا سیلولر پروٹینز کا ایک خاندان ہے جو مائیکروگلیہ کے فینوٹائپک پولرائزیشن کو کنٹرول کرتا ہے جس سے سائٹوکائنز کے ذریعے فعال ہونے والے متعدد سگنلنگ پاتھ ویز کو دبایا جاتا ہے۔ ثالثی NF-κB اور JAK2 سگنلنگ، اس طرح TNF- , IL-1، اور IL-6 کی مقدار کو کم کرتا ہے جو M1 مائکروگلیہ کے ذریعے LPS/TLR4 راستے سے جاری ہوتا ہے۔

D-Tesa صرف LPS کنٹرول (تصویر S6F†) کے مقابلے SOCS1 کے اظہار کو اپ گریڈ کرتا ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ IL-6، TNF- اور IL-1 میں اضافہ D-Tesac کے ذریعہ نمائش کی وجہ سے ہوسکتا ہے۔ M2b فینوٹائپ نہ کہ LPS/TLR4 کی افزائش کے ذریعے، M1-دلانے والا فینوٹائپ۔

مزید برآں، TLR4 کے ذریعے LPS سگنلز اور ضرورت سے زیادہ سیلولر ایکٹیویشن کو روکنے کے لیے، مائیکروگلیہ ایک منفی فیڈ بیک میکانزم رکھتا ہے جس کے تحت TLR4 ایکٹیویشن TLR4.70 کے اظہار میں کمی کا باعث بنتا ہے۔

مفت Tesa اور D-Tesa کے ساتھ علاج سے TLR4 کی سطح میں 3 کا اضافہ ہوا۔{3}}گنا (p < 0۔{8}}01) اور 3۔{7}}گنا (p <0.001)، بالترتیب (تصویر 5F)، تجویز کرتا ہے کہ Tesa اور D-Tesa نے عام LPS/TRL4 منفی تاثرات کے سگنلنگ راستے کو تبدیل کیا۔

For more information:1950477648nn@gmail.com