حصہ Ⅰ: Streptozotocin-Nicotinamide-حوصلہ افزائی ذیابیطس چوہوں میں مردانہ تولیدی فنکشن پر Cistanche Tubulosa کے عرق کا اثر

رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com

Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He and Shu-Chun Cheng

خلاصہ:ذیابیطس ایک دائمی عارضہ ہے جس کی خصوصیت ہائپرگلیسیمیا کی وجہ سے ہوتی ہے جس کی وجہ انسولین کی سطح میں کمی ہوتی ہے یا اسے مؤثر طریقے سے استعمال کرنے میں بافتوں کی ناکامی ہوتی ہے۔ بانجھ پن کو ذیابیطس کے ایک بڑے نتیجے کے طور پر جانا جاتا ہے اور یہ مردانہ تولیدی نظام کو متاثر کرتا ہے جس سے نطفہ کی خرابی اور گوناڈل کی خرابی ہوتی ہے۔Cistanche tubulosaایک طفیلی پودا ہے جو یادداشت، قوت مدافعت اور جنسی صلاحیت کو بہتر بنانے، نامردی کو کم کرنے اور قبض کو کم کرنے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ یہ مطالعہ echinacoside (ECH) کے سوزش اور حفاظتی اثرات کی تحقیقات پر مرکوز تھا۔Cistanche tubulosa اقتباس(CTE) ذیابیطس کے چوہوں کے مردانہ تولیدی نظام پر۔ سی ٹی ای کے اینٹی آکسیڈینٹ، سوزش اور حفاظتی اثرات کا اندازہ وٹرو اور ویوو دونوں طریقوں سے کیا گیا۔ ان وٹرو نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ECH نے ری ایکٹو آکسیجن اسپیسز (ROS) کی پیداوار کو روکا اور سٹار، CYP11A1، CYP17A1، اور HSD17p3 پروٹین ایکسپریشن کو بہتر کیا۔ ان ویوو تجزیہ سی ٹی ای میں ایچناکوسائیڈ (ای سی ایچ) (80، 160، اور 320 ملی گرام/کلوگرام) کی تین خوراکوں کے ساتھ کیا گیا تھا۔ مجموعی طور پر، 0.571 mg/kg rosiglitazone (RSG) کو مثبت کنٹرول کے طور پر دیا گیا تھا۔ ذیابیطس اسٹریپٹوزٹوسن (STZ) (65 ملی گرام/کلوگرام) اور نیکوٹینامائڈ (230 ملی گرام/کلوگرام) زیادہ چکنائی والی خوراک (45 فیصد) کے ساتھ مل کر پیدا ہوئی تھی۔ ان ویوو اسٹڈیز نے اس بات کی تصدیق کی کہ ECH نے خون میں شکر کی سطح، انسولین مزاحمت، لیپٹین مزاحمت، اور لپڈ پیرو آکسیڈیشن کو بہتر کیا۔ یہ kisspeptin 1 (KiSS1)، G پروٹین-کپلڈ ریسیپٹر GPR 54، سائٹوکائن سگنلنگ 3 (SOCS-3) کو دبانے والا، اور sirtuin 1 (SIRT1) میسنجر رائبونیوکلک ایسڈ (mRNA) کے اظہار کو ہائپوتھیلمس میں بحال کر سکتا ہے اور جنسی تعلقات کو بحال کر سکتا ہے۔ ہارمون کی سطح. اس طرح، اس مطالعہ نے CTE کے اینٹی آکسیڈینٹ، اینٹی سوزش، اور سٹیرایڈوجنیسیس اثرات کی تصدیق کی۔

مطلوبہ الفاظ:ذیابیطس؛ بانجھ پن؛Cistanche tubulosa extract (CTE); echinacoside (ECH)؛ سوزش کی سرگرمی؛ اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی؛ steroidogenesis اثرات

ذیابیطس کا علاج:Cistanche tubulosa اقتباس(CTE)

1. تعارف

ذیابیطس mellitus (DM) ایک ایسی حالت ہے جس میں خون میں گلوکوز کی سطح بڑھ جاتی ہے جس کی وجہ لبلبہ کی کافی انسولین پیدا کرنے میں ناکامی، یا جسم کے مؤثر طریقے سے استعمال کرنے میں ناکامی کی وجہ سے ہوتی ہے۔ ڈبلیو ایچ او کے مطابق ذیابیطس کے شکار افراد کی تعداد 1980 میں 108 ملین سے بڑھ کر 2014 میں 422 ملین ہو گئی [1]۔ چار اہم قسمیں ہیں: پری ذیابیطس (ذیابیطس سے پہلے کا مرحلہ)، ٹائپ 1 (جہاں لبلبہ انسولین پیدا کرنے میں ناکام رہتا ہے)، ٹائپ 2 (جسم انسولین استعمال کرنے میں ناکام رہتا ہے)، اور حمل ذیابیطس (جو کہ حمل کے دوران ہوتا ہے)۔ آکسیڈیٹیو تناؤ ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) اور اینٹی آکسیڈنٹ [2] کی پیداوار کے درمیان عدم توازن کی وجہ سے ہوتا ہے جو بالآخر ذیابیطس کی حالت کا باعث بنتا ہے۔ ذیابیطس کی پیچیدگیوں میں گردے کا خراب ہونا، اعصابی نقصان، اندھا پن، فالج، دل کا دورہ، جنین کی موت اور بانجھ پن شامل ہیں۔ [1]۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ مرد ذیابیطس کے مریضوں میں سپرم نیوکلی، ڈی آکسیریبونیوکلک ایسڈ (DNA) اور مائٹوکونڈریا کو نمایاں طور پر نقصان پہنچایا گیا تھا [3]۔ سپرم کی نقل و حمل کے دوران آکسیڈیٹیو تناؤ مردانہ تولیدی نظام کے عمل کو بدل دے گا [4,5]۔

نطفہ پیدا کرنے کے عمل کو ہائپوتھیلمس-پٹیوٹری-گوناڈل (HPG) محور کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے۔ ہائپوتھیلمس کے ذریعہ تیار کردہ گوناڈوٹروپین جاری کرنے والا ہارمون (GnRH) luteinizing ہارمون (LH) اور follicle-stimulating hormone (FSH) کی پیداوار کو متحرک کرتا ہے۔ Leydig خلیات سیمینیفرس ٹیوبول سے ملحق پائے جاتے ہیں اور LH کے کنٹرول میں ٹیسٹوسٹیرون پیدا کرتے ہیں۔ FSH اینٹیجن بائنڈنگ پروٹین (ABP) کی پیداوار کو متحرک کرتا ہے جو مردانہ ہارمون کو منتقل کرنے میں مدد کرتا ہے۔ اس طرح، بانجھ پن اور دیگر مسائل بنیادی طور پر HPG محور میں ہونے والے خلل کی وجہ سے پیدا ہوتے ہیں۔ اسٹریپٹوزوٹوسن نیکوٹینامائڈ کے امتزاج کا استعمال تجرباتی چوہوں میں ذیابیطس کو جنم دیتا ہے۔ Streptozotocin ایک کیمیائی مرکب ہے جو لبلبہ میں انسولین پیدا کرنے والے p خلیات کے لیے زہریلا ہے اور نیکوٹینامائڈ پانی میں حل ہونے والا وٹامن ہے جو p خلیات کو مکمل نقصان سے بچاتا ہے [6]۔

Cistanche tubulosa ایک صحرائی پودوں کی نسل ہے جسے "Rou Cong-Rong" [7] کے نام سے بھی جانا جاتا ہے۔ یہ ایک غیر کلوروفیلک پرجیوی پودا ہے جو بنیادی طور پر کیلوٹروپیس پروکیرا کے درخت کی جڑ پر اگتا ہے اور گانسو، چنگھائی، سنکیانگ، منگولیا، ایران اور ہندوستان کی بنجر زمین میں وسیع پیمانے پر تقسیم ہوتا ہے۔ Cistanche tubulosa کا عام نام "Desert Hyacinth" ہے۔ اسے چینی روایتی ادویات میں بڑے پیمانے پر قبول کیا جاتا ہے اور اسے "صحرا کا Ginseng" کا نام دیا گیا ہے۔ یہ وسیع پیمانے پر دواؤں کے میدان میں موربڈ لیکوریا، بہت زیادہ میٹروریا، دائمی گردوں کی بیماریوں، قبض، نامردی اور بانجھ پن کے علاج کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ کے کیمیائی اجزاءCistanche tubulosaغیر اتار چڑھاؤ والے phenylethanoid glycosides (PHGs)، iridoids، lignans، volatile oils، alditols، oligosaccharides، اور polysaccharides [8] پر مشتمل ہوتے ہیں۔ مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ اس جڑی بوٹی سے echinacoside ROS کی سطح کو ریگولیٹ کرکے خراب شدہ فائبروبلاسٹ کی حفاظت کرتا ہے [9]۔ یہ مرکب اینٹی آکسیڈینٹ، vasorelaxation، اور اینٹی سوزش سرگرمیاں پیدا کرتا ہے جو کہ نیورو پروٹیکشن اور آسٹیوپوروسس کی روک تھام کے ساتھ ہے [10,11]۔

اس تحقیق کا مقصد تحقیق کرنا تھا۔Cistanche tubulosa نچوڑ کا اثراسٹریپٹوزوٹوسن-نیکوٹینامائڈ-حوصلہ افزائی ذیابیطس چوہے کی تولیدی خرابی پر ECH پر مشتمل ہے۔

Cistanche tubulosa

2. مواد اور طریقہ

2.1۔مواد

ECH اور CTE کو Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan) سے خریدا گیا تھا۔ ایڈوانسڈ گلائکیشن اینڈ پروڈکٹس (AGEs) بائیو ویژن (سان فرانسسکو، CA، USA) سے خریدے گئے تھے۔ LC-540 اور TM3 سیل لائنیں فوڈ انڈسٹری ریسرچ اینڈ ڈیولپمنٹ انسٹی ٹیوٹ (سنچو، تائیوان) سے خریدی گئیں۔ پانچ ہفتے پرانے Sprague-Dawley (SD) نر چوہے نیشنل لیبارٹری اینیمل سینٹر (تائی پے، تائیوان) سے خریدے گئے تھے۔ Feed Lab Diet® PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan) سے خریدا گیا تھا۔ 2،2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) سگما (St. Louis, MO, USA) سے حاصل کیا گیا تھا۔ میتھانول اور 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) بھی سگما سے خریدے گئے تھے۔ Dulbecco کے ترمیم شدہ Eagle medium/F12 اور trypsin-EDTA GIBCO (نیویارک، NY، USA) سے حاصل کیے گئے تھے۔ 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), ڈائمتھائل سلفوکسائڈ (DMSO)، اور nitroblue tetrazolium (NBT) سگما سے خریدے گئے تھے۔ گلوکوز انزیمیٹک کٹس Kyokutoseiyaku، ٹوکیو، جاپان سے حاصل کی گئیں۔ انسولین ELISA کٹس Mercodia AB Inc.، Sylveniusgatan 8A (Uppsala، سویڈن) سے خریدی گئیں۔ T-PER ٹشو پروٹین ایکسٹریکشن ریجنٹ تھرمو سائنٹیفک (شکاگو، IL، USA) سے حاصل کیا گیا تھا۔ اینٹی ہیومن/ماؤس/چوہا نیوکلیئر فیکٹر کپا B NF-kB پولی کلونل اینٹی باڈیز سانتا کروز بائیو ٹیکنالوجی، سانتا کروز، CA، USA سے خریدی گئیں۔ اینٹی ماؤس/چوہا ریسیپٹر برائے ایڈوانسڈ گلائیکیشن اینڈ پروڈکٹس (RAGE) پولی کلونل اینٹی باڈیز، اینٹی ہیومن/ماؤس/ریٹ اسٹار پولی کلونل اینٹی باڈیز، اور اینٹی ہیومن/ماؤس/چوہا سائٹوکوم پی450 17A1 مونوکلونل اینٹی باڈیز جین ٹیکس سے خریدی گئی تھیں۔ (Irvine, CA, USA)۔ اینٹی ہیومن/ماؤس/چوہا CYP11A1 پولی کلونل اینٹی باڈیز سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی (بیورلی، PA، USA) سے حاصل کی گئیں۔ ایزی بلیو ریجنٹ انویٹروجن، تھرمو فشر سائنٹیفک (کارلسباد، CA، USA) سے خریدا گیا تھا۔ Agarose اور DNA مارکر 100 bp پرومیگا، کارپوریشن (میڈیسن، WI، USA) سے حاصل کیے گئے تھے۔ RNeasy Lipid Tissue Mini Kit QIAGEN، Hilden، جرمنی سے خریدی گئی تھی۔

2.2.طریقے۔

2.2.1 وٹرو تجزیہ میں

LC{{0}} اور TM3 سیل کلچر: LC-540 سیل لائنوں کو Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) میڈیم میں 37 OC پر سوڈیم بائکاربونیٹ (1.5 g/L)، L کے ساتھ مکمل کیا گیا تھا۔ -گلوٹامین (2 ایم ایم)، غیر ضروری امینو ایسڈ (0.1 ایم ایم)، سوڈیم پائروویٹ (10 ایم ایم)، اور فیٹل بووائن سیرم (ایف بی ایس) (10 فیصد) 5 میں فیصد CO2 انکیوبیٹر (CO2 انکیوبیٹر، نیپکو 5410، تائیوان)۔ TM3 سیل لائن کو Dulbecco/s modified Eagle میڈیم (DMEM) میں گلوکوز (4.5 g/L)، سوڈیم پائروویٹ (0.5 mM)، L-glutamine (2.5 mM)، سوڈیم بائکاربونیٹ (1.2 g/L) کے ساتھ مکمل کیا گیا تھا۔ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES, 15 mM)، اور فیٹل کاف سیرم (FCS، 10 فیصد) یا ہارس سیرم (5 فیصد) 37 OC پر 5 میں فیصد CO2 انکیوبیٹر۔

Echinacoside (ECH) کے سیل وابستگی کا تعین: 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) ریجنٹ تھا سیل ویبلٹی پرکھ کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ سیل کی ارتکاز کو ایک 96-کنویں پلیٹ میں 2 x 105 سیل / ایم ایل میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ پھر، 20 卩L ECH (میڈیم کے 2 فیصد میں پتلا) شامل کیا گیا اور 5 فیصد CO2 انکیوبیٹر میں 37 OC پر 24 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ بعد میں، 100 卩L MTT ریجنٹ شامل کیا گیا اور تاریک حالات میں 4hat37 OC کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا۔ جاذبیت کی پیمائش 570 nm (ELISA ریڈر، Dynatech MR5000، Kloten، Switzerland) کی گئی۔

Restive CeH viabiHiy (فیصد)=[(570 nm پر اسامپل — خالی 570 nm پر)]/[(570 پر ایک کنٹرول — خالی پر 570)] x 100۔

Nitroblue Tetrazolium (NBT) کمی پرکھ اور 2،2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Assay: خلیات کی تعداد کو 1x 1{{10}}6 خلیات/mL میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ . اس کے بعد، 50 mg/mL ECH، resveratrol (RES)، اور اعلی درجے کی گلیکشن اینڈ پروڈکٹس (AGEs) (کنٹرول) کو 37OC پر 18 گھنٹے کے لیے شامل کیا گیا اور ہم آہنگ کیا گیا۔ اس کے بعد، 0.3 ملی لیٹر این بی ٹی محلول (0.1 ملی گرام/ ایم ایل این بی ٹی، 5 فیصد ایف بی ایس، اور 3 فیصد ڈائمتھائل سلفوکسائیڈ (ڈی ایم ایس او) 10 ملی لیٹر ڈی ایم ای ایم میں تحلیل کیا گیا) شامل کیا گیا اور 37 او سی پر 5 فیصد CO2 میں 1 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا۔ سینٹرفیوگریشن کے بعد (3 منٹ کے لیے 800 xg پر) سپرنٹنٹ کو ہٹا دیا گیا اور 200 卩L DMSO شامل کیا گیا اور الٹراسونک آسکیلیٹر (ڈیلٹا الٹراسونک کلینر D 200، کیلونگ، تائیوان) میں 5 منٹ تک ہلایا گیا۔ جذب 630 nm پر ماپا گیا۔ DPPH ریڈیکل پرکھ کے لیے، Trolox (95 فیصد الکحل میں) کو معیار کے طور پر لیا گیا تھا۔ پھر، 75 卩L 0.5 mM DPPH محلول کو 25 卩L نمونوں کے ساتھ ملایا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک تاریک جگہ پر رد عمل ظاہر کرنے کی اجازت دی گئی۔ مرکب کو ہلایا گیا اور جذب 517 nm پر ماپا گیا۔

Reactive Oxygen Species (ROS) مواد کا تجزیہ: سیل نمبر کو 2 x 105 سیلز/mL میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا 12-کنویں پلیٹ میں جس میں 2 فیصد FBS تھا۔ پھر، ECH، RES، اور AGEs کے 50 卩L/mL کو پلیٹ میں شامل کیا گیا اور 24 گھنٹے کے لیے 37 OC پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ 24 گھنٹے کے بعد، 2Z,7Z-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) کو شامل کیا گیا اور 37 OC پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ سینٹرفیوگریشن (400x g، 5 منٹ) کے بعد، سپرنٹنٹ کو ہٹا دیا گیا اور خلیات کو دو بار فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) سے دھویا گیا۔ PBS کے 1 ملی لیٹر میں خلیوں کو معطل کرنے کے بعد اور ROS کی سطحوں کا تعین فلو سائٹو میٹر (فلو سائٹو میٹر، بیکٹن ڈکنسن، CA، USA) کے ذریعے کیا گیا۔

پروٹین کی شناخت اور مقداری تجزیہ: پروٹین کو پروٹین ایکسٹریکشن ریجنٹ (T-PER) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا۔ سیل کی کثافت کو ایک 12-کنویں پلیٹ میں 2 x 105 خلیات/ملی لیٹر میں ایڈجسٹ کیا گیا تھا اور ECH، RES کے 50 卩L/mL، اور اعلی درجے کی گلیکشن اینڈ پروڈکٹ (RAGE) مخالف کے لیے ایک رسیپٹر، اور AGEs کو شامل کیا گیا تھا اور 24 گھنٹے کے لیے 5 فیصد CO2 انکیوبیٹر میں 37 OC پر سینکا۔ اس کے بعد، 400 卩L T-PER کو شامل کیا گیا، خلیات کو ختم کیا گیا، اور 125،000xg پر 20 منٹ (4 OC) پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو مزید تجزیہ کے لیے -80 OC (-80 OC فریزر، نیوائر، پلائی ماؤتھ، MN، USA) میں جمع اور ذخیرہ کیا گیا تھا۔ Bicinchonic acid (BCA) کٹ پروٹین کی مقدار کے لیے استعمال کی گئی تھی۔ پھر، 10 卩L معیاری سیل محلول اور 200 RL BCA ریجنٹ کو کنویں کی پلیٹوں میں شامل کیا گیا اور 37 O Cin پر 5 فیصد CO2 انکیوبیٹر میں 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ جذب 562 nm پر ماپا گیا۔ پروٹین کی شناخت کا تجزیہ سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ (SDS) -پولیاکریلامائڈ جیل (SDS-PAGE) الیکٹروفورسس کے ذریعہ کیا گیا تھا۔ پروٹین لوڈنگ بفر میں پروٹین لیسیٹ شامل کرکے نمونے تیار کیے گئے تھے اور مخصوص پروٹین کا پتہ لگانے کے لیے ویسٹرن بلاٹ تجزیہ کیا گیا تھا۔

2.2.2.Vivo تجزیہ میں

اینیمل ماڈل ڈیزائن: ساٹھ {{0}}ہفتہ پرانے نر Sprague-Dawley (SD) چوہے نیشنل لیبارٹری اینیمل سینٹر (تائی پے، تائیوان) سے خریدے گئے۔ ہر چوہے کو انفرادی طور پر جراثیم کش سٹینلیس سٹیل کے پنجروں میں کنٹرول شدہ درجہ حرارت (23 土 1 ڈگری) اور نمی (40-60 فیصد) میں 12 گھنٹے روشنی/12 گھنٹے تاریک سائیکل کے ساتھ رکھا گیا تھا۔ خوراک اور پانی کی اشد ضرورت فراہم کی گئی۔ ہر چوہے کو پہلے ہفتے میں پالا گیا تھا اور اسے لیبارٹری میں چوہا کی خوراک 5001 دی گئی تھی۔ تمام طریقہ کار نیشنل تائیوان اوشین یونیورسٹی، تائیوان کی ادارہ جاتی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی (IACUC منظوری نمبر 101026) کے معیار پر عمل پیرا ہیں۔ پالنے کے بعد، چوہوں کو دو گروپوں میں تقسیم کیا گیا: کنٹرول گروپ (Con) جسے لیب ڈائیٹ 5001 کے ساتھ کھلایا گیا تھا، اور ذیابیطس کا گروپ جسے پورے تجربے کے لیے زیادہ چکنائی والی خوراک (HFD، 40 فیصد) کھلائی گئی تھی۔ 4 ہفتوں تک HFD کے ساتھ کھانا کھلانے کے بعد، ذیابیطس کے گروپ کے چوہوں کو ذیابیطس mellitus (DM) دلانے کے لیے streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) لگایا گیا۔ STZ انجیکشن لگانے کے 15 منٹ کے اندر، نیکوٹینامائڈ (230 ملی گرام/کلوگرام جسمانی وزن) کا انجکشن لگایا گیا۔ انجیکشن کے ایک ہفتہ بعد، ذیابیطس میلیتس (DM) کی کامیاب شمولیت کا تعین کرنے کے لیے زبانی گلوکوز رواداری ٹیسٹ (OGTT) کیا گیا۔ اس کے بعد، جانوروں کو چھ گروپوں میں تقسیم کیا گیا: کنٹرول (لیب ڈائیٹ 5001 کے ساتھ کھلایا گیا)؛ ڈی ایم گروپ (ڈی ایم پلس 45 فیصد HFD)؛ ڈی ایم آر گروپ (ڈی ایم پلس روزگلیٹازون: 0.571 ملی گرام/کلوگرام بی ڈبلیو) کے علاوہ 45 فیصد HFD؛ DME1 گروپ (DM پلس CTE: 80 mg/kg BW) علاوہ 45 فیصد HFD؛ DME2 گروپ (DM پلس CTE: 160 mg/kg BW) علاوہ 45 فیصد HFD؛ اور DME4 گروپ (DM پلس CTE: 320 mg/kg BW) علاوہ 45 فیصد HFD۔ Rosiglitazone (RSG) کو مثبت کنٹرول کے طور پر لیا گیا تھا۔ CTE کی تین خوراکیں (80، 160، اور 320 mg/kg) تائیوان فوڈ اینڈ ڈرگ ایڈمنسٹریشن (TFDA) ہیلتھ فوڈ فنکشنل ایویلیویشن گائیڈ لائنز کی سفارش کے مطابق استعمال کی گئیں۔ تجربے کے اختتام تک علاج دیے گئے۔ تمام تجرباتی چوہوں کو 6 ہفتوں کے بعد قربان کیا گیا۔ چوہوں سے جمع کیے گئے خون کو 3000 rpm پر 15 منٹ کے لیے 4 ڈگری پر سینٹرفیوج کیا گیا۔

cistanche tubulosa کے میاں موثر اجزاء

مندرجہ ذیل تجزیہ کے لیے سپرنٹنٹ کا معائنہ کیا گیا۔

کل گلوکوز، ٹرائگلیسرائیڈ، اور کولیسٹرول کا تعین: گلوکوز کا تعین گلوکوز انزیمیٹک کٹس کے ذریعے کیا گیا تھا۔ پھر، خون کے پلازما کے 20 نمونے ری ایجنٹس میں شامل کیے گئے اور 5 منٹ کے لیے 37 ڈگری پر رکھا گیا۔ کل ٹرائگلیسرائڈز اور کل کولیسٹرول کی حراستی کا تعین ٹرائگلیسرائیڈ اور کولیسٹرول انزیمیٹک کٹس کے ذریعے کیا گیا تھا۔ پھر، 10 ^L خون کا پلازما ری ایجنٹس میں شامل کیا گیا اور تجربہ کارخانہ دار کی ہدایت کے مطابق کیا گیا۔ جذب 510 nm پر ماپا گیا۔

پلازما کل گلوکوز/ٹرائگلیسرائڈ/کولیسٹرول (mg/dL)=(-ABlank)/(Astandard - ABlank) x 200۔

ایک نمونہ: خون کے نمونوں کا جذب، خالی: نمونے کے بغیر کٹس کی جاذبیت کی قدر، ایک معیاری: معیاری ری ایجنٹ کی جاذبیت کی قدر، 200: 200 ملی گرام/ڈی ایل کے ارتکاز پر معیاری ری ایجنٹس۔

انسولین، لیپٹین، اور ہومیوسٹیٹک ماڈل اسیسمنٹ-انسولین ریزسٹنس (HOMA-IR) کا تعین: انسولین کی سطح کا تعین انسولین ELISA کٹس کے ذریعے کیا گیا تھا۔ یہاں، 25 خون کے پلازما کو ری ایجنٹس میں شامل کیا گیا اور جذب کو 450 nm پر ماپا گیا۔ لیپٹین انزائم امیونومیٹرک پرکھ کٹ کا استعمال کرکے کل لیپٹین مواد کا تعین کیا گیا تھا۔ پھر، 100 پلازما کا تجزیہ کیا گیا اور ELISA ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے جاذبیت کو 450 nm پر ماپا گیا۔ پورا تجربہ کارخانہ دار کی ہدایت کے مطابق کیا گیا۔ HOMA-IR قدر کا تعین ہومیوسٹاسس ماڈل اسسمنٹ مساوات=فاسٹنگ پلازما انسولین کنسنٹریشن (mU/mL) x فاسٹنگ پلازما گلوکوز کنسنٹریشن (mmol/L)/22.5 سے کیا گیا تھا۔

پلازما لپڈ پیرو آکسیڈیشن: یہاں، {{0}.5 ملی لیٹر خون کے پلازما کو 1 ملی لیٹر ریجنٹ کے ساتھ ملایا گیا (15 فیصد، w/v ٹرائکلورواسیٹک ایسڈ میں 0.25 این ہائیڈروکلورک ایسڈز (HCl) ) اور 0.375 فیصد، w/v تھیوباربیٹورک ایسڈ 0.25 N HCl میں) اور اسے 15 منٹ کے لیے 100 ڈگری سینٹی گریڈ پر پانی کے غسل (واٹر باتھ، BUCHI461، زیورخ، سوئٹزرلینڈ) میں رکھا گیا۔ ٹھنڈا ہونے کے بعد، 1 ملی لیٹر n-butanol شامل کیا گیا، زور سے ہلایا گیا، اور 10 منٹ کے لیے 1500 xg پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو جمع کیا گیا تھا اور جاذبیت کو 532 nm [12] پر ماپا گیا تھا۔

Malondialdehyde (MDA) ارتکاز (nM/mL)=[(ASample at532 nm - Ablank at 532 nm)/ (532 nm پر اسٹینڈرڈ - 532 nm پر خالی)] x 5۔

پلازما ٹیسٹوسٹیرون اور Luteinizing ہارمون (LH) کی سطح کا تعین: ٹیسٹوسٹیرون ELISA کٹ خون کے پلازما میں ٹیسٹوسٹیرون کی سطح کی پیمائش کے لیے استعمال کی گئی تھی۔ LH حراستی کا تعین کرنے کے لئے RIA کٹ استعمال کی گئی تھی۔ پھر، 50 卩L پلازما شامل کیا گیا اور حسابات ہارمون LH-RP-3 (معیاری) کے ارتکاز پر مبنی تھے۔ مزید اقدامات کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق کیے گئے۔

ٹیومر نیکروسس فیکٹر (TNF)-a اور Interleukin-6 (IL-6) کا تعین: پکڑے ہوئے اینٹی باڈی کو کوٹنگ بفر میں 250 بار پتلا کیا گیا، اسے {{4} میں شامل کیا گیا۔ اچھی طرح سے پلیٹ (100 卩L/کنواں)، اور رات بھر کے لیے 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر رکھا۔ سپرنیٹنٹ کو خواہش کی گئی تھی اور اسے واشنگ بفر سے پانچ بار دھویا گیا تھا (1 بار پی بی ایس، 0.05 فیصد ٹوین 20)۔ انکیوبیشن (1 h) کے بعد 200 ^g asay diluent کے ساتھ، خلیات کو 5 بار واشنگ بفر کے ساتھ دھویا گیا اور 100 ^L TNF- ایک معیاری محلول یا ٹیسٹ کے نمونے ہر کنویں میں شامل کیے گئے اور 2 گھنٹے تک انکیوبیشن کی گئی۔ دھونے کے بعد، 100 RL IL-6 پائے جانے والے اینٹی باڈیز کو شامل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت میں 1 ہیٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ سپرنیٹنٹ کو 5 بار دھویا گیا تھا۔ اس کے بعد، 480 RL انزائم ایوڈن ہارسریڈش پیرو آکسیڈیس (HRP) کو شامل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ سپرناٹینٹ کو اسپائریٹ کیا گیا تھا اور اسے واشنگ بفر سے پانچ بار دھویا گیا تھا۔ اس کے بعد ، 100 RL سبسٹریٹ حل شامل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ کے لئے انکیوبیٹ کیا گیا۔ بعد میں، ہر کنویں میں 50 RL سٹاپ محلول (1M فاسفورک ایسڈ) شامل کیا گیا اور جذب کو 450 nm پر ناپا گیا۔

Cistanche Echinacoside کا فائدہ: اینٹی آکسیڈیشن

سپرم اور ٹیسٹس پیرامیٹرز کا تجزیہ

نطفہ کے نمونے جمع کرنا: نطفہ کے نمونوں کا مجموعہ اس طریقہ کے مطابق انجام دیا گیا تھا جو پہلے [13] میں رپورٹ کیا گیا تھا۔ سپرنیٹنٹ سے سپرم جمع کیے گئے اور مزید تجزیہ کے لیے استعمال کیے گئے۔

سپرم کی تعداد، سپرم کی حرکت پذیری، اور غیر معمولی نطفہ: سپرم کی تعداد کا حساب ہیموسیٹومیٹر اور ٹریپین بلیو محلول کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ اس کے بعد، 100 RL سپرم مائع کو ٹرپین نیلے محلول کے ساتھ ملایا گیا، اور سپرم کی تعداد، حرکت پذیری، اور غیر معمولی نطفہ کا حساب ہیمو سائیٹومیٹر اور مائکروسکوپ [14] کے ذریعے کیا گیا۔

نائٹرو بلیو ٹیٹرازولیئم این بی ٹی میں کمی اور سپرم اور ٹیسٹس کی لپڈ پیرو آکسیڈیشن: لیپڈ پیرو آکسیڈیشن اور این بی ٹی میں کمی کا تجزیہ پلازما تجزیہ کے اسی طریقہ کار کے مطابق کیا گیا۔

سپر آکسائیڈ ڈسمیوٹیز (SOD) اور Catalase سرگرمی کا تعین: RANSEL کٹ کا استعمال کرتے ہوئے Superoxide dismutase (SOD) سرگرمی کا تجزیہ کیا گیا۔ یہاں، {{0}}۔{6}} 1.7 ملی لیٹر ری ایکشن سلوشن (0.05 mM xanthine، 0.025 mM 2-({6}} 5 mL testicular homogenates) {9}}iodophenyl)- 3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloride (INT))۔ اختلاط کے بعد، 0.25 ملی لیٹر xanthine oxidase (80 U/L) شامل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 سیکنڈ تک کمرے کے درجہ حرارت پر رد عمل ظاہر کیا۔ جذب 505 nm پر ماپا گیا۔ ورشن ہوموجنیٹ کے پروٹین کی حراستی کا تعین Bio-Rad DC پروٹین پرکھ کٹ کے ذریعہ کیا گیا تھا اور اس کی مخصوص سرگرمی (U/mg پروٹین) کا حساب لگایا گیا تھا۔ کیٹالیس (سی اے ٹی) کی سرگرمی کا تعین پہلے بیان کردہ طریقہ [15] کے مطابق کیا گیا تھا۔

H&E (Hematoxylin اور Eosin) سٹیننگ

خصیوں کو 10 فیصد فارملین میں 24 گھنٹے تک بھگو کر 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر محفوظ کیا گیا۔ ٹشوز کو مائیکرو سائز میں کاٹ کر سلائیڈ سے جوڑ دیا گیا۔ درست کرنے کے بعد (95 فیصد میتھانول پلس 5 فیصد ایسٹک ایسڈ)، سلائیڈوں کو ہیماتوکسیلین میں 3 منٹ تک ڈبو دیا گیا، 5 منٹ تک بہتے پانی سے دھویا گیا، اور پھر انہیں 50 فیصد، 70 فیصد، اور 90 فیصد الکحل کے ساتھ ایک منٹ کے لیے بھگو دیا گیا۔ اس کے بعد، سلائیڈوں کو 10 سیکنڈ کے لیے eosin سے داغ دیا گیا اور 100 فیصد الکحل میں ایک منٹ تک بھگو دیا گیا جب تک کہ یہ ختم نہ ہو جائے۔ آخر میں، سلائیڈ کو ایک منٹ کے لیے زائلین میں بھگو دیا گیا۔ بعد میں، سلائیڈ کو ہوا سے خشک کر کے سیل کر دیا گیا۔ مورفولوجی کا مشاہدہ کرنے کے لیے داغ والی ٹیوب کو الٹی فیز کنٹراسٹ مائکروسکوپ (انورٹڈ فیز ڈیفرنس مائکروسکوپ، اولمپس سی کے-2، ٹوکیو، جاپان) میں رکھا گیا تھا۔

ہائپوتھیلمس کا تجزیہ

ماؤس KISS1، G-پروٹین کپلڈ ریسیپٹر (GPR) 54، سائٹوکائن سگنلنگ 3 (SOCS-3) کو دبانے والا، اور sirtuin 1 (SIRT1) جین کے سلسلے کی شناخت NCBI (نیشنل سینٹر فار بائیو ٹیکنالوجی انفارمیشن) جین ڈیٹا بیس سے کی گئی۔ اور ایک مخصوص پرائمر پرائمر 5 کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیا گیا تھا۔{8}} PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.) تجربے میں استعمال ہونے والے پرائمر ٹیبل 1 میں درج ہیں۔

Hypothalamus سے Ribonucleic acid (RNA) کا اخراج۔ RNeasy Lipid Tissue Mini Kit کا استعمال کرتے ہوئے دماغ کے hypothalamus سے RNA نکالا گیا۔ حاصل کردہ mRNAs کو مقداری طور پر ریورس ٹرانسکرپشن (RT) اور پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) سے ماپا گیا۔ RT تجزیہ سے حاصل کردہ تعریفی DNA بعد میں استعمال کے لیے -20 ڈگری پر محفوظ کیا گیا تھا۔ نکالے گئے ڈی این اے کو Taq پولیمریز کا استعمال کرتے ہوئے پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) تجزیہ کا نشانہ بنایا گیا۔ پھر، PCR پروڈکٹ کا 5~10 ^L لیا گیا اور 1.5 فیصد ایگر کولائیڈ پر الیکٹروفورسس کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ تصویر UVP BioDoc-It امیجنگ سسٹم میں لی گئی تھی۔ ریورس ٹرانسکرائب شدہ تکمیلی ڈی آکسیریبونیوکلک ایسڈ (cDNA) لیا گیا اور IQ SYBR گرین سپرمکس کٹ کا استعمال کرتے ہوئے PCR کیا گیا۔ بعد میں، iQTM 5 آپٹیکل سسٹم سافٹ ویئر کے ساتھ اس کا تجزیہ کیا گیا۔ پروٹین کو پروٹین نکالنے والے ری ایجنٹ (T-PER) کا استعمال کرکے نکالا گیا تھا۔ پھر، 20 ملی گرام ٹیسکولر ہوموجنیٹ کو 400 ^L T-PER میں شامل کیا گیا اور سینٹرفیوجڈ (ہائی سپیڈ سینٹری فیوج، ہیٹیچ سی آر-12، ٹٹلنگن، جرمنی) کے لیے 4 ڈگری (125,000 xg) پر 20 منٹ مندرجہ ذیل طریقہ وٹرو تجزیہ میں "پروٹین کی شناخت اور مقدار کا تجزیہ" جیسا تھا۔

2.3 شماریاتی تجزیہ

تجرباتی نتائج کو اوسط 土 معیاری انحراف (میان 土 SD) کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا اور اعداد و شمار کا شماریاتی مصنوعات اور خدمات کے حل (SPSS) 11 کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا تھا۔{1}} سافٹ ویئر، IBM, Armonk, New York, NY, USA۔ گروپوں کے درمیان اختلافات کا یک طرفہ تجزیہ (ANOVA) کے ذریعے تجزیہ کیا گیا۔ ڈنکن کے ٹیسٹ کے ذریعے p < 0.05="" کی="" قدر="" پر="" اہم="" سطح="" کے="" طور="" پر="" مختلف="" گروپوں="" کے="" متعدد="" موازنہوں="" کا="" تجزیہ="" کیا="">

اگلا حصہ Ⅱ جاری رکھا جائے گا۔