سلیپ ڈپریوشن ماڈل چوہوں میں سیکھنے کے ادراک اور Synaptic پلاسٹکٹی پر Cistanche کے Glyeosides کے اثرات

خلاصہ

مقصد:'یہ دریافت کرنا کہ آیاcistanche کے glycosidesکو بہتر بنا سکتے ہیں۔نیند کی کمی کا سیکھنا اور علمی فعلماڈل چوہوں کی طرف سےSynaptic پلاسٹکٹی کو منظم کرنا. طریقے: پچاس نر چوہوں کو تصادفی طور پر خالی کنٹرول گروپ (کنٹرول)، پلیٹ فارم کنٹرول گروپ (PC)، ماڈل گروپ (ماڈل) میں تقسیم کیا گیا تھا۔cistanche گروپ کے glycosides(GCs)، اور estazolam گروپ (Est)۔ چوہوں کی نیند سے محرومی کا ماڈل ایک ترمیم شدہ ملٹی پلیٹ فارم واٹر انوائرمنٹ طریقہ سے تیار کیا گیا تھا۔ چوہوں کا پتہ لگانے کے لیے مورس واٹر میز اور اوپن فیلڈ ٹیسٹ کا استعمال کیا گیا۔مقامی علمی فعل aجذباتی تبدیلیاں۔ میں تبدیلیوں کا مشاہدہ کرنے کے لیے نسل سٹیننگ کا استعمال کیا گیا تھا۔مورفولوجی اور عصبی خلیوں کی مقدارچوہوں کے ہپپوکیمپل سی اے ایل کے علاقے میں۔ ویسٹرن بلاٹ اور R'T - PCl کا استعمال Synaptophysin (SYN)، postsynaptic membrane dens substance 95 (PSD - 95)، اور دماغ سے ماخوذ نیوروٹروفک عنصر (BDNF) کے اظہار کی سطحوں کا پتہ لگانے کے لیے کیا گیا تھا۔ نتائج: مورس واٹر بھولبلییا کے نتائج نے ظاہر کیا کہ کنٹرول گروپ کے مقابلے میں،سیکھنے اور سنجیدگی کی صلاحیتماڈل گروپ میں چوہوں کی تعداد میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی۔<0. 05 ), and theچوہوں کی سیکھنے اور یادداشت کا کامGCs کے علاج کو بہتر بنایا گیا تھا (P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

نتیجہ: cistanche کے GlycosidesSynaptic سے متعلقہ مارکروں کے اظہار کو منظم کرکے Synaptic plasticity کو متاثر کر سکتا ہے، اس طرح نیند سے محروم ماڈل چوہوں کے سیکھنے اور علمی کام کو بہتر بناتا ہے۔

کلیدی الفاظcistanche کے glycosides؛ ہپپوکیمپس؛ نیند کی کمی؛ سیکھنے اور میموری؛ بے چینی Synaptic پلاسٹکٹی

CISTANCHE کے اعلیٰ درجے کے گلائکوسائیڈز برائے فروخت

نیند کی خرابی (SD)ایک ہےنیند کی فعال خرابیبے خوابی، بار بار خواب، اور آسان بیداری جیسے پیچیدہ عوامل کی ایک سیریز کی وجہ سے۔ حالیہ برسوں میں SD کے واقعات میں بتدریج اضافہ ہوا ہے۔ متعلقہ مطالعات نے اطلاع دی ہے کہ ایس ڈی کا سبب بن سکتا ہے۔قلبی امراض, میٹابولک dysfunction, مدافعتی امراض، اور مرکزی اعصابی نظام کی تنزلی کی بیماریاں جیسے الزائمر کی بیماری [1]۔ SD ہپپوکیمپل نیوران کو آکسیڈیٹیو نقصان پہنچا سکتا ہے، علمی خرابی کا سبب بن سکتا ہے، اور موڈ میں تبدیلیاں پیدا کر سکتا ہے جیسے کہ بے چینی اور ڈپریشن [2]۔ Cistanche deserticola ایک قیمتی چینی ادویاتی مواد ہے جسے دوا اور خوراک کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اس میں گردے کو ٹونیفائی کرنے اور کیوئ کو بھرنے، آنتوں کو نم کرنے اور آنتوں کی حرکت کو فروغ دینے اور یانگ کو مضبوط بنانے کے اثرات ہیں۔ Cistanche deserticola کے اہم نچوڑ، cistanche کے glycosides (GCs) میں اینٹی آکسیڈینٹ، اینٹی اپوپٹوٹک، جگر کی حفاظت، اور نیورو پروٹیکٹو اثرات ہوتے ہیں [3]۔ ہماری پچھلی تحقیق سے پتا چلا ہے کہ جی سیز SAMP8 چوہوں کے سیکھنے اور علمی فعل کو بہتر بنا سکتے ہیں ایک اینٹی آکسیڈینٹ اور اینٹی اپوپٹوٹک کردار ادا کر کے [4]۔ متعلقہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ SD کی وجہ سے علمی dysfunction کا synaptic plasticity [5] سے گہرا تعلق ہے۔ تاہم، اس طریقہ کار کے بارے میں کچھ رپورٹس موجود ہیں جن کے ذریعے GCs Synaptic plasticity کو منظم کرتے ہیں اور سیکھنے اور یادداشت کی خرابی اور نیند کی کمی کی وجہ سے چوہوں میں علمی کمی کو بہتر بناتے ہیں۔ لہذا، اس مطالعے کا مقصد یہ دریافت کرنا ہے کہ آیا GCs Synaptic سے متعلقہ مارکروں کے اظہار کو منظم کرکے Synaptic plasticity کو متاثر کرتے ہیں، اس طرح نیند کی کمی کے ماڈل میں چوہوں کے سیکھنے اور علمی کام کو بہتر بناتے ہیں، اور علاج کے نئے آئیڈیاز فراہم کرتے ہیں اور سیکھنے کے علاج کے لیے منصوبہ بندی کرتے ہیں۔ GCs کے ساتھ نیند کی خرابی کی وجہ سے علمی خرابی۔

1 مواد اور طریقے

1. 1 تجرباتی جانور

6 سے 8 ہفتوں کی عمر کے نر چوہے، جن کا وزن 280 سے 300 گرام ہے، بیجنگ سیبیفو سے جانوروں کی پیداوار کے لائسنس کے ساتھ خریدا گیا تھا [SCXK (Beijing) 2019-0010]۔ تمام جانوروں کو باؤتو میڈیکل کالج کے جانوروں کے تجرباتی مرکز میں درج ذیل شرائط کے تحت رکھا گیا تھا: درجہ حرارت (24 ± 1) ڈگری، نمی 50% سے 55%، 12 گھنٹے روشنی اور 12 گھنٹے اندھیرا، اور کھانے اور پانی پر کوئی پابندی نہیں۔ اس تجربے کو اسکول کی اخلاقیات کمیٹی [Baoyi Lunshen 2022 No. (63)] نے منظور کیا تھا۔

1. 2 اہم ریجنٹس اور آلات

Cistanche deserticola کے کل glycosides Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd. (بیچ نمبر: KSM20220609011) سے خریدے گئے تھے۔ Estazolam گولیاں CSPC فارماسیوٹیکل گروپ Ouyi فارماسیوٹیکل (بیچ نمبر: 044220343) سے خریدی گئی تھیں۔ پروٹین لوڈنگ بفر (P1015)، RIPA lysis buffer (R0010)، chemiluminescent محلول (PE0010) وغیرہ سب بیجنگ سولیباؤ سے خریدے گئے تھے۔ پوسٹ سینیپٹک کثافت مادہ 95 (PSD-95) اینٹی باڈی (AB192757)، Synaptophysin (SYN) اینٹی باڈی (ab32127)، Abcam، USA سے خریدی گئی؛ دماغ سے حاصل کردہ نیوروٹروفک فیکٹر (BDNF) (48503-2)، -ایکٹین (52901)، SAB، USA سے خریدا گیا؛ بکری اینٹی خرگوش IgG سیکنڈری اینٹی باڈی (SA00001-20), Proteintech, USA سے خریدی گئی چوہا میلاٹونن (MT)، ELISA کٹ (MM-0657R1)، جیانگسو اینزائم امیونٹی انڈسٹری کمپنی، لمیٹڈ پیرافین سلائسر (لائیکا، جرمنی) سے خریدا گیا؛ آپٹیکل خوردبین (لائیکا، جرمنی)؛ مورس واٹر میز، اوپن فیلڈ ٹیسٹ باکس (شنگھائی زنروان)؛ عمودی الیکٹروفورسس آلہ

(بیجنگ لیوئی کمپنی)؛ رنگین شیکر (بیجنگ لیوئی کمپنی)؛ پروٹین امیجنگ تجزیہ نظام (شنگھائی ٹینن ٹیکنالوجی)؛ فلوروسینس مقداری پی سی آر آلہ (ژیان تیان لونگ ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ)۔

1. 3 تجرباتی طریقے

1. 3. 1 جانوروں کی گروہ بندی اور منشیات کی انتظامیہ

50 نر چوہوں کو تصادفی طور پر خالی کنٹرول گروپ (کنٹرول گروپ)، پلیٹ فارم کنٹرول گروپ (پلیٹ فارم کنٹرول، پی سی گروپ)، ماڈل گروپ (ماڈل گروپ)، Cistanche deserticola گروپ کے کل glycosides (GCs گروپ) میں تقسیم کیا گیا تھا۔ ، 50 mg/kg)، اور estazola گروپ (Est گروپ، 0.54 mg/kg)، ہر گروپ میں 10 چوہوں کے ساتھ۔ کنٹرول گروپ اور پی سی گروپ کو گیویج کے ذریعہ 0.9٪ نمکین دیا گیا تھا۔ ماڈلنگ شروع ہونے کے بعد ہر دن صبح 7 بجے تمام گروپس کی جانچ کی جاتی تھی، اور گیجج 21 دن تک جاری رہا۔

1. 3. 2. نیند سے محروم جانوروں کے ماڈل کی تیاری

نیند سے محرومی کا ماڈل تبدیل شدہ ملٹی پلیٹ فارم واٹر انوائرمنٹ طریقہ [6] کا استعمال کرتے ہوئے قائم کیا گیا تھا۔ تجرباتی سامان 130 سینٹی میٹر × 50 سینٹی میٹر × 45 سینٹی میٹر آئتاکار پولیتھیلین رال واٹر ٹینک تھا۔ پانی کے ٹینک میں 5 سینٹی میٹر قطر اور 20 سینٹی میٹر اونچائی والا ایک چھوٹا سا پلیٹ فارم رکھا گیا تھا۔ پی سی گروپ کے پلیٹ فارم کا قطر 10 سینٹی میٹر اور اونچائی 20 سینٹی میٹر تھی۔ پانی کا ٹینک تقریباً 18 سینٹی میٹر کی گہرائی تک پانی سے بھرا ہوا تھا، اور پانی کا درجہ حرارت (20 ± 1) ڈگری پر برقرار رکھا گیا تھا۔ تجربہ شروع ہونے سے ایک ہفتہ پہلے، چوہوں کو ہر روز 60 منٹ کے لیے نیند کی کمی کے خانے میں رکھا جاتا تھا تاکہ وہ ماحول سے خود کو واقف کر سکیں۔ ماڈل قائم ہونے کے بعد، کنٹرول گروپ کے علاوہ، ہر گروپ کے چوہوں کو روزانہ صبح 8 بجے سے رات 8 بجے تک چھوٹے پلیٹ فارم پر لگاتار 21 دن تک نیند کی کمی کے لیے رکھا گیا۔ تمام چوہوں کو آزادانہ طور پر کھانے پینے اور پلیٹ فارم پر آزادانہ نقل و حرکت کرنے کی اجازت تھی، ہر روز 12 گھنٹے روشنی اور اندھیرے کی تبدیلی کے ساتھ۔

1.3.3 مورس واٹر میز کا تجربہ

مورس کے پانی کی بھولبلییا کو 4 علاقوں میں تقسیم کیا گیا تھا، پانی سے بھرا ہوا تھا، اور پلیٹ فارم کو چوتھے کواڈرینٹ میں رکھا گیا تھا۔ پانی کی سطح پلیٹ فارم سے تقریباً 2 سینٹی میٹر اوپر تھی۔ فوڈ گریڈ خوردنی میلانین پانی میں شامل کیا گیا، اور پانی کا درجہ حرارت (25 ± 1) ڈگری پر برقرار رکھا گیا۔ (1) پوزیشننگ نیویگیشن تجربہ: ہر علاقے کا مرکز منتخب کیا گیا اور چوہوں کو آہستہ سے پانی میں رکھا گیا۔ انہیں آزادانہ طور پر دریافت کرنے کی اجازت تھی۔ چوہوں کو 60 سیکنڈ کے اندر ہدف کا پلیٹ فارم تلاش کرنے میں لگنے والا وقت ریکارڈ کیا گیا۔ جن چوہوں کو پلیٹ فارم نہیں ملا انہیں پلیٹ فارم تک پہنچایا گیا اور وہ 20 سیکنڈ تک ٹھہرے رہے۔ تربیت 5 دن تک جاری رہی۔ (2) مقامی ایکسپلوریشن ٹیسٹ: چھٹے دن، پلیٹ فارم کو ہٹا دیا گیا اور چوہوں کو پانی میں دوسرے کواڈرینٹ کے بیچ سے دیوار کے ساتھ رکھا گیا۔ چوہوں کے پلیٹ فارم سے 120 سیکنڈ کے اندر گزرنے کی تعداد اور چوتھے کواڈرینٹ میں رہنے کا وقت ریکارڈ کیا گیا۔

1.3 4 اوپن فیلڈ تجربہ

ایک 100 سینٹی میٹر × 100 سینٹی میٹر × 50 سینٹی میٹر تجرباتی باکس استعمال کیا گیا تھا، اور باکس کے نچلے حصے کو 9 گرڈز میں تقسیم کیا گیا تھا۔ چوہوں کے ہر گروپ کو 60 منٹ تک اندرونی ماحول کے مطابق ڈھالنے کے لیے پہلے سے کھلے میدان کے تجرباتی کمرے میں رکھا گیا تھا۔ تجربے کے آغاز میں، ٹیسٹ چوہوں کو کھلے میدان کے تجرباتی خانے کے مقررہ کونوں میں باری باری رکھا گیا، اور 5 منٹ کے اندر چوہوں کے کھڑے ہونے کے اوقات، حرکت کا فاصلہ، اور جامد وقت کو رویے کے تجزیہ سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے ریکارڈ کیا گیا۔ . تجربے کے دوران ماحول کو پرسکون رکھنے کی ضرورت تھی، اور تجرباتی ڈیوائس کو دو تجربات کے درمیان بالترتیب صاف پانی اور الکحل سے صاف کیا گیا تھا تاکہ پچھلے چوہے کی بدبو سے بچا جا سکے جو اگلے چوہے کے رویے کے فیصلے کو متاثر کرے۔

1. 3. 5 انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA)

چوہوں میں سیرم ایم ٹی کی سطح کا پتہ لگانا چوہوں کو انٹرا پیریٹونیل انجیکشن کے ذریعے بے ہوشی کی گئی تھی، اور پیٹ کی شہ رگ سے 5 ملی لیٹر خون جمع کیا گیا تھا۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ انتظار کرنے کے بعد، خون کو سیرم حاصل کرنے کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ ہر کنویں میں 40 μL نمونہ ملاوٹ شامل کیا گیا تھا، اور پھر ٹیسٹ کیے جانے والے نمونے کا 10 μL شامل کیا گیا تھا۔ سیلنگ فلم کے ساتھ سیل کرنے کے بعد، 37 ڈگری پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔ 5 بار دھوئیں، 50 μL انزائم لیبلنگ سلوشن شامل کریں، اور سیلنگ فلم کے ساتھ سیل کرنے کے بعد 37 ڈگری پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔ 5 بار دھوئیں، پھر رنگ تیار کرنے والے محلول اور رد عمل کو روکنے کا حل شامل کریں۔ ہر کنویں کی OD ویلیو 450 nm کی طول موج پر انزائم لیبلنگ کے آلے سے ماپا گیا۔

１۔ ３۔ ６ نسل کا داغ

ہر گروپ سے تین چوہوں کو لیا گیا تھا، اور دماغ کے ٹشو کو سر کاٹ کر ہٹا دیا گیا تھا۔ دماغی بافتوں کو 4% پولیمتھائل میتھ کرائیلیٹ محلول کے ساتھ فکس کیا گیا تھا، اور ٹشو کو پانی کی کمی، موم کے محلول میں ڈبو کر سرایت کی گئی تھی، اور ٹشو کو روایتی طریقوں سے کاٹ دیا گیا تھا۔ سلائسوں کو 5 μm کی موٹائی کے ساتھ رکھا گیا تھا، PBS کے ساتھ دھویا گیا تھا، 0 سے داغ دیا گیا تھا۔ 0 کے لیے 1% ٹولیوڈین بلیو۔ 5 h، 95% الکحل کے ساتھ فرق، 100% الکحل سے پانی کی کمی، زائلین کے ساتھ شفاف، اور غیر جانبدار گم کے ساتھ مہر بند۔ چوہے کے ہپپوکیمپس کے CA1 خطے میں مورفولوجی اور نیوران کی تعداد میں تبدیلیوں کو ایک خوردبین کے نیچے دیکھا گیا اور تصاویر اکٹھی کی گئیں۔

１۔ ３۔ 7 مغربی دھبے کا تجربہ

ہر گروپ سے چار چوہوں کا انتخاب کیا گیا تھا، اور ہپپوکیمپس کو سر کاٹ کر الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ ہپپوکیمپس ٹشو کو برف کے غسل کے ماحول میں RIP A lysis بفر کے ساتھ ملایا گیا اور سپرنٹنٹ کو حاصل کرنے کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا۔ پروٹین کی حراستی کا پتہ BCA طریقہ سے لگایا گیا تھا۔ الیکٹروفورسس کے لئے پروٹین لوڈنگ بفر کے ساتھ 20 ug پروٹین شامل کیا گیا تھا۔ پروٹین الیکٹروفورسس مکمل ہونے کے بعد، جھلی کو 300 ایم اے مستقل بہاؤ پر منتقل کیا گیا، 5% سکم دودھ پاؤڈر کے ساتھ بلاک کر دیا گیا، پرائمری اینٹی باڈی کو راتوں رات 4 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا، اور سیکنڈری اینٹی باڈی کو کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ رنگوں کی نشوونما کے حل کے استعمال کے بعد، کیمیلومینیسینس امیجنگ تجزیہ کا نظام پروٹین بینڈوں کے شماریاتی تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا۔

1. 3. 8 RT-PCR تجربہ

ہپپوکیمپس ٹشو ہوموجنیٹ تیار کرنے کے لئے ہر گروپ سے تین چوہوں کا انتخاب کیا گیا تھا۔ ٹشو فلو میں کل RNA کو Trizol طریقہ سے نکالا گیا تھا اور ارتکاز کی پیمائش کی گئی تھی۔ ایک روزہ رکھنے والی سی ڈی این اے ترکیب کٹ کو ریورس ٹرانسکرپشن کے لئے استعمال کیا گیا تھا، اور فلوروسینس مقداری امپلیفیکیشن رد عمل کا استعمال فلوروسینس مقداری کٹ کا استعمال کرتے ہوئے Synaptic سے متعلق پروٹین mRNA کے رشتہ دار اظہار کی سطح کا پتہ لگانے کے لئے کیا گیا تھا۔ 2-ΔΔCt کا استعمال کرتے ہوئے نتائج کا تجزیہ کیا گیا، اور پرائمر کی ترتیب جدول 1 میں دکھائی گئی ہے۔

1.4 شماریاتی طریقے

اعداد و شمار کے نتائج جو عام تقسیم کے مطابق تھے ان کا اظہار اوسط ± معیاری انحراف (x ± s) کے طور پر کیا گیا تھا، اور گراف پیڈ پرزم 9.5 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی تجزیہ کیا گیا تھا۔ متعدد نمونوں کے درمیان موازنہ کے لیے تغیر کا واحد عنصر کا تجزیہ استعمال کیا گیا، اور P < 0.05 نے اشارہ کیا کہ فرق شماریاتی لحاظ سے اہم تھا۔