FAIMS حصہ 1 کے ساتھ دماغ کے بافتوں کے ٹاپ-ڈاون پروٹومکس کو بڑھانا

خلاصہ

الزائمر اور پارکنسنز کی بیماری کی پروٹومک تحقیقات نے نیوروڈیجنریٹیو عوارض کے بارے میں قیمتی بصیرت فراہم کی ہے۔ اب تک، یہ تحقیقات بڑی حد تک نیچے تک پہنچنے تک محدود کر دی گئی ہیں، جس سے اس حد تک رکاوٹ بنی ہوئی ہے کہ کوئی پروٹین کی "برقرار" حالت کو نمایاں کر سکتا ہے۔

الزائمر کی بیماری ایک نیوروڈیجینریٹیو بیماری ہے جو کسی شخص کی یادداشت اور علمی صلاحیتوں پر ناقابل واپسی اثرات مرتب کرتی ہے۔ اگرچہ لوگ اس مرض کا مکمل علاج نہیں کر سکتے لیکن احتیاط سے علاج اور روک تھام کے ذریعے بیماری کے بڑھنے کی رفتار کو ہر ممکن حد تک کم کیا جا سکتا ہے اور مریض کی جسمانی اور ذہنی صحت کو برقرار رکھا جا سکتا ہے۔

یادداشت الزائمر کے مریضوں سے متاثر ہونے والے سب سے واضح پہلوؤں میں سے ایک ہے۔ وہ اکثر اہم معلومات کو بھول سکتے ہیں، جیسے کہ ان کا نام، اپنے پیاروں کے نام، اہم تاریخیں وغیرہ۔ اس کے علاوہ، کچھ جدید خود سیکھنے والے الفاظ، جیسے تجریدی تصورات اور مترادفات، کو بھی بھلا دیا جا سکتا ہے۔ تاہم، کچھ علمی تربیت اور علاج کے ساتھ، الزائمر کے مریض اب بھی کچھ پہلوؤں میں اپنی یادداشت کو برقرار رکھ سکتے ہیں۔

اگرچہ الزائمر کی بیماری منفی اثرات لا سکتی ہے، ہمیں اسے مثبت طور پر دیکھنا چاہیے۔ سب سے پہلے، بیماری کے بارے میں آگاہی اور سمجھ میں اضافہ کرکے، ہم اس کی روک تھام اور علاج بہتر طریقے سے کر سکتے ہیں۔ دوم، الزائمر کے مریضوں کی دیکھ بھال کرنے والے اور ان کے خاندان کے افراد یہ بھی سیکھ سکتے ہیں کہ ان کے ساتھ کس طرح مواصلت اور بات چیت کی جائے تاکہ مریضوں کو عزت نفس کو برقرار رکھنے اور زیادہ سے زیادہ خوشی سے زندگی گزارنے میں مدد مل سکے۔

عام طور پر، اگرچہ الزائمر کی بیماری یادداشت اور علمی صلاحیتوں پر ناقابل واپسی اثرات کا باعث بن سکتی ہے، ہمیں ایک پرامید رویہ برقرار رکھنا چاہیے اور علاج اور احتیاطی تدابیر کے ذریعے بیماری کے بڑھنے کی رفتار کو کم کرنے کی کوشش کرنی چاہیے۔ ایک ہی وقت میں، ہمیں ان لوگوں کو مزید مدد اور مدد فراہم کرنی چاہیے جو الزائمر کے مرض میں مبتلا مریضوں کی دیکھ بھال کرتے ہیں، اور مشترکہ طور پر ایک زیادہ گرمجوشی اور بات چیت کرنے والی کمیونٹی تشکیل دیں۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ ہمیں یادداشت کو بہتر بنانے کی ضرورت ہے۔ Cistanche یادداشت کو نمایاں طور پر بہتر بنا سکتا ہے کیونکہ یہ ایک روایتی چینی ادویاتی مواد ہے جس میں بہت سے منفرد اثرات ہیں، جن میں سے ایک یادداشت کو بہتر بنانا ہے۔ Cistanche کا اثر اس میں موجود مختلف فعال اجزاء سے آتا ہے، بشمول tannic acid، polysaccharides، flavonoid glycosides وغیرہ۔ یہ اجزاء دماغ کی صحت کو کئی طریقوں سے فروغ دے سکتے ہیں۔

یادداشت کو بہتر بنانے کے 10 طریقے جانیں پر کلک کریں۔

ٹاپ ڈاون پروٹومکس (ٹی ڈی پی) اس حد کو عبور کرتا ہے۔ تاہم، یہ عام طور پر نسبتاً چھوٹے سائز کے صرف انتہائی پرچر پروٹیوفارمز کا مشاہدہ کرنے تک محدود ہے۔

لہذا، نمونے کی پیچیدگی کو کم کرنے کے لیے عام طور پر فریکشن تکنیک کا استعمال کیا جاتا ہے۔ یہاں، ہم ٹی ڈی پی کے اندر ہائی فیلڈ اسیمیٹرک ویوفارم آئن موبلٹی اسپیکٹومیٹری (FAIMS) کے ذریعے گیس فیز فریکشن کی تحقیقات کرتے ہیں۔

الزائمر کی بیماری (AD) دماغی بافتوں سے اخذ کردہ ایک اعلی پیچیدگی کے نمونے کو استعمال کرتے ہوئے، ہم یہ بیان کرتے ہیں کہ کس طرح TDP میں FAIMS کا اضافہ پروٹوم کوریج کی گہرائی کو مضبوطی سے بہتر بنا سکتا ہے۔

مثال کے طور پر، بیرونی معاوضہ وولٹیج (CV) کے ساتھ FAIMS کا نفاذ −50، −40، اور −30 CV پر قدم رکھنے سے FAIMS کے بغیر کے مقابلے میں غیر فالتو پروٹیوفارمز، جینز، اور پروٹوم سیکوینس کوریج کی اوسط تعداد دگنی ہو سکتی ہے۔

ہم نے یہ بھی پایا کہ FAIMS ان کے سائز کی بنیاد پر پروٹیوفارمز اور ان کے چارج لفافوں کی ترسیل کو متاثر کر سکتا ہے۔ اہم بات یہ ہے کہ FAIMS نے برقرار amyloidbeta (A ) پروٹیوفارمز کی شناخت کو قابل بنایا، جس میں A 1-42 کے جمع ہونے کا خطرہ بھی شامل ہے جو AD سے مضبوطی سے جڑا ہوا ہے۔

خام ڈیٹا اور متعلقہ فائلوں کو ڈیٹا سیٹ شناخت کنندہ PXD023607 کے ساتھ MassIVE ڈیٹا ریپوزٹری کے ذریعے ProteomeXchange Consortium میں جمع کر دیا گیا ہے۔

تعارف

پچھلی 2 دہائیوں کے دوران، نیوروڈیجنریٹیو بیماریوں کے واقعات دنیا بھر میں دگنے سے بھی زیادہ ہو گئے ہیں، الزائمر کی بیماری (AD) سب سے زیادہ عام شکل کے طور پر ہے۔ 2-5 مضبوطی سے AD کے ساتھ وابستہ ہیں۔

لہٰذا، AD کی تفصیلی پروٹومیکچرائزیشن خاص اہمیت کی حامل رہی ہے۔ 6,7 ماس سپیکٹرو میٹری نے ان تحقیقات میں مرکزی کردار ادا کیا ہے، 8 بنیادی طور پر نیچے سے اوپر کے نقطہ نظر سے۔9-16

تاہم، نیچے سے اوپر کے تجزیوں کے لیے درکار پروٹیز ہاضمہ پروٹین کی مکمل حالت کو حاصل کرنے میں رکاوٹ بنتا ہے، جو کہ جینیاتی ایللیس، متبادل سپلائی، پروٹولیٹک پروسیسنگ، اور بعد از ترجمہ ترمیم (جسے "پروٹیوفارمز" کہا جاتا ہے) کی وجہ سے مختلف ہو سکتا ہے۔ 20

چونکہ ٹاپ-ڈاؤن پروٹومک (ٹی ڈی پی) نقطہ نظر برقرار حالت میں پروٹین کا تجزیہ کرتا ہے، اس لیے بعض پیتھالوجیز سے وابستہ پروٹیوفارمز کو پکڑنے کا امکان زیادہ ہوتا ہے اور یہ جین ٹائپ اور فینوٹائپ کے درمیان مضبوط، زیادہ براہ راست تعلق کی اجازت دیتا ہے۔20-22

مثال کے طور پر، TDP خاص طور پر تاؤ جیسے پروٹین سے اخذ کردہ endogenous proteolytic ٹکڑوں کو حاصل کرنے کے لیے موزوں ہے، جن کا تعلق الزائمر کے پیتھالوجی سے ہے۔ .27–30

تاہم، پیچیدہ نمونوں کے TDP کو نمونے کی پیچیدگی کو کم کرنے کے لیے عام طور پر آف لائن فریکشنیشن تکنیکوں کی ضرورت ہوتی ہے کیونکہ انسانی پروٹوم سائز اور کثرت کے کئی آرڈرز پر محیط ہوتا ہے، اور پروٹین عام طور پر ریورس فیز ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی (LC) کے ساتھ اچھی طرح حل نہیں ہوتے ہیں۔

اس آف لائن فریکشن کو جیل سے نکالے جانے والے مائع فریکشن انٹریپمنٹ الیکٹروفورسس، سائز کے اخراج کی کرومیٹوگرافی، آئن ایکسچینج کرومیٹوگرافی، یا وابستگی پیوریفیکیشن کے ساتھ مکمل کیا جا سکتا ہے۔

بدقسمتی سے، آف لائن فریکشنیشن عام طور پر سیمپل ہینڈلنگ کی توسیع کی ضرورت کے ذریعے پیداوار اور تھرو پٹ کو کم کرتی ہے۔ 36 گیس فیز آئن موبلٹی سیپریشن ایک پرکشش فریکشنیشن متبادل ہے جسے LC اور MS ڈائمینشنز کے درمیان اضافی نمونہ ہینڈلنگ اقدامات کی ضرورت کے بغیر متعارف کرایا جا سکتا ہے۔

ہائی فیلڈ غیر متناسب ویوفارم آئن موبلٹی سپیکٹرو میٹری (FAIMS) خاص طور پر اس کام کے لیے FAIMS Pro ڈیوائس کے حالیہ تعارف کے ساتھ موزوں ہے، جس کا ماڈیولر ڈیزائن کئی موجودہ آربیٹریپ آلات پر آئن موبلٹی کو آسانی سے شامل کرنے کی اجازت دیتا ہے۔

FAIMS، جسے ڈیفرینشل موبلٹی اسپیکٹومیٹری بھی کہا جاتا ہے، ایک کیریئر گیس میں آئنوں کو مختلف عوامل جیسے سائز، چارج، یا شیپ کے امتزاج کی بنیاد پر ایک غیر متناسب موج کے اعلی اور کم الیکٹرک فیلڈز کے ساتھ متعارف کرایا جاتا ہے۔ الیکٹروڈ، آئن کے راستے میں ایک انحراف DC معاوضہ وولٹیج (CV) کے اطلاق کے ذریعے متعارف کرایا جاتا ہے، 39 اس آئن کی منتخب ترسیل کی اجازت دیتا ہے۔

برقرار پروٹین کے تجزیہ کے لیے FAIMS کا اطلاق بڑی حد تک انفرادی پروٹین کے موافقت کرنے والوں یا پروٹینوں کے چھوٹے امتزاج تک محدود ہے؛ 40-45

تاہم، FAIMS کو حال ہی میں مائع نکالنے کی سطح کے تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے برقرار اور مقامی پروٹین کے تجزیہ پر لاگو کیا گیا ہے۔

−50 سے −20 CV کی سی وی رینج میں بیرونی قدموں کے ساتھ اسکیننگ نے ہمیں یہ تعین کرنے کی اجازت دی کہ FAIMS CV کی ماڈیولیشن بیلناکار FAIMS یونٹ کے ذریعے منتقل ہونے والے آئنوں کی خصوصیات کو کس طرح متاثر کرتی ہے، اور کس طرح اس تعلق کو سائز کی بنیاد پر پروٹیوفارمز کو نشانہ بنانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔

FAIMS-TDP بغیر FAIMS کے مقابلے میں ایک ہی CV پر دوگنی سے زیادہ پروٹیوفارم کی شناخت اور نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں سے متعلقہ پروٹیوفارمز کی گہرائی سے پوچھ گچھ کو قابل بناتا ہے، بشمول -، -، اور -synucleins، PARK7، tau splice isoforms، اور کئی برقرار A proteoforms۔

ایک ساتھ مل کر، یہ کام بیان کرتا ہے کہ ٹی ڈی پی میں ایف اے آئی ایم ایس کے ساتھ گیس فیز فریکشنیشن کے ذریعے پروٹیوفارمز اور پروٹوم کوریج کی زیادہ سے زیادہ شناخت کیسے حاصل کی جا سکتی ہے۔

طریقے

نمونہ کی تیاری

MFC کا نمونہ رش یونیورسٹی الزائمر ڈیزیز سنٹر سے موصول ہوا تھا۔ شرکاء کلینک پر مبنی بوڑھے افراد تھے جنہوں نے 1992 سے 2005 تک یادداشت کی شکایات اور/آرڈیمینشیا کے ساتھ اندراج کیا تھا۔

رش میموری کلینک میں ممکنہ ڈیمنشیا کے لیے ان کا جائزہ لیا گیا اور رش الزائمر ڈیزیز کور سینٹر کے کلینکل کور کے حصے کے طور پر دماغ کے عطیہ پر رضامندی ظاہر کی۔ اس مطالعہ کو رش یونیورسٹی میڈیکل سینٹر کے ادارہ جاتی جائزہ بورڈ نے منظور کیا تھا۔

موت کے بعد، قریبی رشتہ دار نے پوسٹ مارٹم کے لیے رضامندی فراہم کی۔ مریض کا مجموعی علمی تشخیصی زمرہ الزائمر ڈیمنشیا تھا جس میں علمی خرابی کی کوئی اور وجہ نہیں تھی، 51 جبکہ پوسٹ مارٹم کا وقفہ 230 منٹ تھا۔

نمونے سے نمٹنے کے تمام اقدامات BSL{{0}} احتیاطی تدابیر کے ساتھ انجام دیئے گئے تھے۔ −80 ڈگری پر ذخیرہ شدہ 33 ملی گرام MFC ٹشو کو 1.5 ملی لیٹر LoBind Eppendorf ٹیوبوں (Eppendorf, Cat# 022431081) میں 0.5 mL homogenization بفر کے اضافے کے ساتھ منتقل کیا گیا جس میں 8 M یوریا، 10 mMammonate mAbiBC) tris(2-carboxyethyl)فاسفائن (TCEP) pH7.5 پر۔

کمرے کے درجہ حرارت پر ہوموجنائزیشن بفر کے 0.5 ملی لیٹر کے اضافے سے پہلے ہینڈ ہیلڈ موٹر سے چلنے والی گولی پیسٹل (BioVortexer with SpiralPestle؛ Biospec 1083 اور 1017) کے لیے جسمانی خلل کے ذریعے ہوموجنائزیشن حاصل کی گئی۔

اس کے بعد سیلولر پروٹین کو نکالنے اور ان کو ختم کرنے کے لیے تھرمو مکسر کا استعمال کرتے ہوئے نمونے کو 1200 rpm پر 60 منٹ کے لیے 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ یوریا میں حل نہ ہونے والے مواد کی پیلیٹنگ 18،000 گرام پر 20 منٹ کے لیے 22 ڈگری پر سینٹرفیوگریشن کے ساتھ مکمل کی گئی تھی، اور اس کے نتیجے میں سپرنیٹنٹ کو پھر 3 ملی لیٹر واش بفر میں شامل کیا گیا تھا (WB؛ 8 M یوریا، 10 mM ABC، pH7 .5) بڑی MWspecies کو ہٹانے کے لیے 4 mL 100 kDa مالیکیولر ویٹ کٹ آف (MWCO) فلٹر کے اندر۔

22 ڈگری اور 5000 گرام پر سینٹرفیوگریشن کے 1 گھنٹہ کے بعد، ریٹینٹیٹ کا حجم 200 μL تھا اور فلٹریٹ کا حجم 3.8 ملی لیٹر تھا۔ چھوٹے مالیکیول آلودگیوں اور کم میگاواٹ پیپٹائڈس کو دور کرنے کے لیے 3.8 ملی لیٹر فلٹریٹ کو 3 کے ڈی اے ایم ڈبلیو سی او فلٹر میں منتقل کیا گیا۔

3 kDa MWCOfilter کو 22 ڈگری اور 7300g پر 1 گھنٹے کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا، جس سے 200 μL کا ریٹینٹیٹ والیوم ملتا ہے۔ 100 kDa MWCO فلٹر سے 200μL ریٹینٹیٹ کو WB کے ساتھ 4 ملی لیٹر تک پتلا کرکے اور اسی فلٹر کے ذریعے دوبارہ فلٹر کرکے دھویا گیا۔

اس فلو تھرو کو اسی 3 kDa MWCO فلٹر میں شامل کیا گیا جیسا کہ اوپر بتایا گیا ہے اور ایک بار پھر توجہ مرکوز کی گئی ہے۔

3 kDa MWCO فلٹر واش سے فائنل200 μL ریٹنٹیٹ کو 1.5 mL LoBindEppendorf ٹیوب میں منتقل کیا گیا۔ نمونے کو تیز کرنے کے لیے، 10% فارمک ایسڈ (FA) کا 10 μL شامل کیا گیا، جس کے نتیجے میں حتمی نمونے میں 0.5% FA ارتکاز ہوا۔

نمونے کو 18،000g پر 15 منٹ کے لیے سینٹرفیوج کیا گیا تاکہ بِی سینچونِک ایسڈ (BCA) پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین کی ارتکاز کی پیمائش کرنے سے پہلے تیز مواد کو ہٹایا جا سکے۔

بی سی اے پرکھ میں کسی بھی ممکنہ بفر کی شراکت کے لیے بوائین سیرم البومین کے معیارات 8 M یوریا، 10 mM ABC، اور0.5% FA میں تیار کیے گئے تھے۔ BCA پرکھ کے ذریعے پروٹین کا ارتکاز 1.1 mg/mL ہونے کا تعین کیا گیا تھا، جو ∼200 μL نمونے میں کل بازیافت شدہ پروٹین کے 0.22 mg کی حتمی پیداوار کے مطابق تھا۔ WB کے ساتھ 0.5 mg/mL تک پتلا کیا گیا جس میں 0.5% FA ہے اور LC-MS تجزیہ تک −80 ڈگری پر محفوظ ہے۔

ہمیں یہ نوٹ کرنا چاہیے کہ ہمارے ہوموجنائزیشن بفر کے اندر روایتی پروٹیز/فاسفیٹیس انہیبیٹر کاک ٹیل کا استعمال کرتے ہوئے ابتدائی تجربات (ڈیٹا غیر مطبوعہ) 3KMWCO فلٹر کے ذریعے متعدد کاک ٹیل اجزاء کو برقرار رکھنے کی وجہ سے BCAassay اور LC-MS کے گمراہ کن نتائج کا باعث بنے تھے۔

مزید برآں، عام طور پر استعمال ہونے والے فاسفیٹیز اور پروٹیز روکنے والے بہت سے کیمیائی طور پر TCEP جیسے کم کرنے والے ایجنٹوں سے مطابقت نہیں رکھتے۔ ان عدم مطابقتوں پر غور کرتے ہوئے، اور یہ کہ 10 ایم ایم ٹی سی ای پی کے ساتھ 8 ایم یوریا کی سختی سے منحرف ہونے والی شرائط سے زیادہ تر پروٹیز کو غیر فعال کرنے کی توقع کی جائے گی، ہم سمجھتے ہیں کہ ان حالات میں پروٹولیٹک انحطاط کو اب بھی کم کیا جائے گا۔

LC-MS/MS تجزیہ اور FAIMS کی ترتیبات

واٹرس نینو ایکوئٹی UPLC سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے نمونوں کا تجزیہ کیا گیا جس میں موبائل فیزز پر مشتمل ہے جس میں H2O (موبائل فیز A) میں {{0}}.2% FA اور ACN (موبائل فیز B) میں 0.2% FA ہے۔

دونوں ٹریپنگ پری کالم (100 μm id، 5 سینٹی میٹر کی لمبائی) اور تجزیاتی کالم (75 μm id، 50cm لمبائی) C2 پیکنگ میٹریل (5 اور 3 μm ٹریپ/تجزیاتی کے لیے بالترتیب، 300 Ås، ٹکنالوجی کا طریقہ) سے بھری ہوئی سلوریاں تھیں۔ . نمونے 5 μLloop میں لوڈ کیے گئے تھے، جو بھری ہوئی مواد کی رقم کے 2.5 ug کے مساوی تھے، اور 20 منٹ سے زیادہ 3 μL/min پر 5% b کے isocratic بہاؤ کے ساتھ ٹریپنگ کالم میں انجیکشن لگائے گئے تھے۔

علیحدگی 5–50% b میلان کے ساتھ 180 منٹ سے زیادہ 300 nL/min پر کی گئی۔ پروٹین کے MS/MS تجزیہ کے لیے، NanoACQUITY سسٹم کو تھرمو سائنٹیفک آربٹریپ فیوژن LumosTribrid ماس اسپیکٹرومیٹر سے جوڑا گیا تھا جو FAIMS Pro انٹرفیس سے لیس تھا۔

ماخذ کے پیرامیٹرز میں 2.2 kV کا الیکٹرو سپرے وولٹیج، 275 ڈگری کا ٹرانسفر کیپلیری درجہ حرارت، اور 60% کا آئن فنل ریڈیو فریکوئنسی طول و عرض شامل ہے۔ FAIMS کو معیاری ریزولوشن کے بغیر صارف کے زیر کنٹرول کیریئر گیس کے بہاؤ اور −5 kV (−33.3 kV/cm کے ڈسپریشن فیلڈ کے مساوی) کے ڈسپریشن وولٹیج پر سیٹ کیا گیا تھا جبکہ CV تجربے کے لحاظ سے مختلف ہوتا ہے (جسے "بیرونی سٹیپنگ کہا جاتا ہے) ")۔

فیوژن Lumos کو "انٹیکٹ پروٹین" ایپلیکیشن موڈ پر سیٹ کیا گیا تھا، جو اعلی توانائی والے C-trap dissociation (HCD) cellN2 پریشر کو 2 mTorr تک کم کرتا ہے، اور ڈیٹا کو مکمل پروفائل کے طور پر اکٹھا کیا گیا تھا۔ MS1 اور MS2 ڈیٹا 120k اور 60k کے ریزولوشن پر حاصل کیا گیا، 3 اور 2 کے مائیکرو اسکین، 500–2،000 m/z اور 400–2،000 m/z رینج میں، اور اس کے ساتھ AGC کے اہداف بالترتیب 5 × 106 اور 5 × 105 ہیں۔

ایم ایس 1 اور ایم ایس 2 کو بھی 400 ایم ایس کے زیادہ سے زیادہ انجیکشن ٹائم کے ساتھ حاصل کیا گیا تھا۔ ڈیٹا پر منحصر سیٹنگز میں سرفہرست 6 انتہائی شدید آئنوں کا انتخاب، چارج سٹیٹ سے کم آئنوں کا اخراج5+، غیر متعین چارج سٹیٹس کو شامل کرنا، اور 30 ​​سیکنڈ تک ایک مشاہدے کے بعد متحرک اخراج شامل ہے۔

MS2 کے لیے منتخب کردہ آئنوں کو ±1.5 m/z ونڈو پر الگ تھلگ کیا گیا اور تصادم کی توانائی کے ساتھ تصادم کی حوصلہ افزائی (CID) کے ذریعے ٹکڑے ٹکڑے کر دیا گیا۔ قابل تشریح پروٹین فریگمینٹیشن سپیکٹرا کے حصول کے لیے نارمل تصادم کی توانائی کے کم انحصار کی وجہ سے ہم نے HCD کے بجائے CID کا استعمال کیا، اس طرح ترتیب کی کوریج پر ہمارے پروٹیوفارم مشاہدات کی وسعت کو ترجیح دی گئی۔52

ہر FAIMS CV کے ڈیٹا سیٹس کو سہ رخی میں جمع کیا گیا تھا۔ تمام خام فائلوں کو بڑے پیمانے پر ڈیٹا ریپوزٹری میں جمع کر دیا گیا ہے اور ان تک رسائی MSV000086696 کے ذریعے، یا PXD023607 onProteomeXchange کے ذریعے حاصل کی جا سکتی ہے۔

For more information:1950477648nn@gmail.com