اڈینو سے وابستہ وائرل ویکٹر کی تیاریوں میں ایکسٹرا وائرل ڈی این اے انسانی پلازمیسیٹائڈ ڈینڈریٹک خلیوں میں TLR9 پر منحصر پیدائشی مدافعتی ردعمل کو اکساتا ہے۔

اڈینو سے وابستہ وائرل (AAV) ویکٹر معطلی یا تو انسانوں سے ماخوذ HEK خلیات میں یا Spodoptera frugiperda (Sf9) کیڑوں کے خلیوں میں پیدا ہونے والے بقایا میزبان خلیوں کے اجزاء کے ساتھ ساتھ AAV پروٹین کیپ پر دکھائے جانے والے پرجاتیوں کی مخصوص پوسٹ ٹرانسلیشنل ترمیمات کے لحاظ سے مختلف ہیں۔ . یہاں ہم نے ویکٹر کی امیونوجینک خصوصیات پر ان اختلافات کے اثرات کا تجزیہ کیا۔ ہم نے مختلف مینوفیکچررز سے اخذ کردہ HEK سیل سے تیار کردہ اور Sf9 سیل سے تیار کردہ AAVCMV-eGFP ویکٹر کے ساتھ انسانی پلازمیسیٹائڈ ڈینڈریٹک خلیوں کو متحرک کیا۔ ہم نے پایا کہ AAV8-CMV-eGFP کے ساتھ ساتھ AAV2-CMV-eGFP ویکٹرز نے بہت سے مخصوص لیکن پروڈکشن پلیٹ فارم کے لیے مخصوص یا مینوفیکچرر کے لیے مخصوص سوزش والی سائٹوکائن ردعمل کی حوصلہ افزائی نہیں کی۔ ٹول نما رسیپٹر 9 سگنلنگ کو مسدود کر کے یا DNase کا استعمال کرتے ہوئے ویکٹر لاٹس میں ڈی این اے کو انزائمی طور پر کم کر کے ان کو کم یا ختم کیا جا سکتا ہے۔ DNase سے علاج شدہ AAV لاٹس اور DNA تجزیوں کے ذریعے کامیاب HEK سیل کی نقل و حمل نے یہ ظاہر کیا کہ DNase نے ویکٹر کی سالمیت کو متاثر نہیں کیا بلکہ اضافی وائرل DNA کو کم کیا۔ ہم یہ نتیجہ اخذ کرتے ہیں کہ HEK- اور Sf9- سیل سے ماخوذ AAV تیاریوں میں امیونوجینک ایکسٹرا وائرل DNA اجزاء شامل ہو سکتے ہیں جو بہت سے مخصوص اشتعال انگیز مدافعتی ردعمل کو متحرک کر سکتے ہیں۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ اضافی وائرل ڈی این اے کی نجاست کو دور کرنے کے لیے بہتر حکمت عملی AAV ویکٹر کی تیاریوں کی امیونوجینک خصوصیات کو کم کرنے میں مددگار ثابت ہو سکتی ہے۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

پچھلی دہائی نے بنیادی تحقیق اور کلینیکل ایپلی کیشنز 1–3 دونوں کے لیے نئے ریکومبیننٹ اڈینو ایسوسی ایٹڈ وائرس (AAV) پر مبنی حکمت عملیوں کی ترقی میں بہت زیادہ دلچسپی دیکھی ہے۔ اس کی بڑی وجہ اس حقیقت میں مضمر ہے کہ AAV ویکٹرز جین تھراپی کے میدان میں انتہائی ورسٹائل ٹولز رہے ہیں جس کی وجہ سے ٹشوز کو نشانہ بنانے کے لیے مؤثر طریقے سے اور محفوظ طریقے سے علاج کے جین فراہم کرنے کی ان کی صلاحیت ہے۔ تاہم، تفتیش کاروں کی ایک بڑھتی ہوئی تعداد آزادانہ طور پر ان نتائج کی اطلاع دیتی ہے جو پری کلینیکل اور کلینیکل اسٹڈیز5–8 میں AAV کی ترسیل کے بعد مقامی اور نظامی مدافعتی ردعمل کا مشورہ دیتے ہیں۔

AAV ویکٹرز کو پیدائشی مدافعتی پیٹرن کی شناخت کرنے والے ریسیپٹرز کو چالو کرتے دکھایا گیا ہے جیسے کہ ٹول نما رسیپٹر (TLR)2 اور TLR9 جس کے نتیجے میں سوزش والی سائٹوکائنز اور ٹائپ I انٹرفیرون (IFN)9,10 کی رہائی ہوتی ہے۔ AAV کے امیونوجینک اجزاء جو ان ردعمل کو متحرک کرسکتے ہیں ان میں کیپسڈ پروٹین اور ویکٹر جینوم 9,10 شامل ہیں۔ AAV درخواست کے بعد مدافعتی ردعمل بھی ویکٹر معطلی 5,11 میں موجود نجاستوں کی وجہ سے متحرک ہو سکتے ہیں۔ ان نجاستوں کو مطلوبہ پروڈکٹ کے علاوہ پیوریفائیڈ AAV ویکٹر سسپنشن میں موجود کسی بھی جزو کے طور پر بیان کیا گیا ہے اور یہ ویکٹر کی پیداواری عمل کے نتیجے میں ہوتا ہے۔ کلینیکل ریکومبیننٹ AAV ویکٹر پیدا کرنے کے دو بڑے طریقوں میں پلازمڈ DNA کی HEK خلیوں میں منتقلی اور Bacoluvirus13 کے ساتھ Spodoptera frugiperda (Sf9) کیڑے کے خلیوں کا انفیکشن شامل ہے۔ اس کے مطابق، AAV ویکٹر سسپنشنز میں موجود ممکنہ طور پر امیونوجینک نجاست میں اینڈوٹوکسین، سیل کلچر میڈیم اجزاء، ری ایجنٹس جو AAV پیوریفیکیشن کے لیے استعمال ہوتے ہیں، میزبان خلیات سے اخذ کردہ پروٹین اور DNA، اور بقایا بیکولووائرل DNA یا پلازمڈ DNA5 شامل ہو سکتے ہیں۔ اضافی عوامل جو AAV ویکٹر سسپنشنز کی مدافعتی صلاحیت کو متاثر کر سکتے ہیں وہ ہیں پوسٹ ٹرانسلیشنل ترمیم (PTMs) جو مختلف ویکٹر پروڈکشن پلیٹ فارمز کے ذریعے کیپسڈ پر نقش ہوتے ہیں۔ اہم بات یہ ہے کہ، HEK سیل سے ماخوذ اور Sf9 سیل سے ماخوذ AAV ویکٹر ان کے PTMs، ان کی بقایا میزبان سیل پروٹین کی ناپاکی11، اور ممکنہ طور پر ان کے DNA کی نجاست (HEK سیل DNA بمقابلہ Sf9 سیل DNA نیز بقایا DNA) کے لحاظ سے بہت مختلف ہیں۔ بمقابلہ بیکولووائرل ڈی این اے)14۔ Plasmacytoid dendritic خلیات (pCDs) ایک خصوصی پیدائشی مدافعتی خلیے ہیں جو وائرل انفیکشن 9,15 پر بڑی مقدار میں قسم I IFN اور پرو سوزش والی سائٹوکائنز کو چھپاتے ہیں اور AAV ویکٹر 9 کی حساسیت میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ اسی مناسبت سے، یہ تجزیہ کرنے کے لیے کہ آیا HEK سیل سے تیار کردہ اور Sf9- سیل سے تیار کردہ AAV ویکٹر کے درمیان فرق ان کی امیونوجینک خصوصیات میں فرق کا باعث بنتا ہے، ہم نے انسانی pDCs کو دو پیداواری نظاموں سے حاصل کردہ ایک ہی AAV ویکٹر کے مختلف لاٹوں کے ساتھ متحرک کیا۔ اور مختلف مینوفیکچررز. ہم نے پایا کہ ویکٹر لاٹس میں سے نصف نے مخصوص لاٹ مخصوص پرو سوزش مدافعتی ردعمل کا جائزہ لیا جو نہ تو ویکٹر پروڈکشن سسٹم سے متعلق تھے اور نہ ہی مینوفیکچرر سے۔ یہ جوابات TLR9 سگنلنگ کے ذریعہ ثالثی کیے گئے تھے اور DNase کے ساتھ ویکٹر لاٹ کے علاج کے لیے حساس تھے۔ علاج نہ کیے جانے والے اور DNase سے علاج شدہ AAV ویکٹر لاٹس اور AAV تیاریوں کے DNA تجزیوں کے ذریعہ کامیاب HEK سیل کی نقل و حمل نے تجویز کیا کہ DNase نے AAV پارٹیکل کی سالمیت کو متاثر نہیں کیا بلکہ غیر انکیپسلیٹڈ اضافی وائرل DNA کو نشانہ بنایا۔ اجتماعی طور پر، اس سے پتہ چلتا ہے کہ AAV ویکٹر کی تیاریوں میں غیر محفوظ شدہ اضافی وائرل DNA شامل ہوسکتا ہے جو انسانی pDCs میں AAV ویکٹر کی تیاریوں کی امیونوجینک خصوصیات کو متاثر کرسکتا ہے۔

cistanche tubulosa کے فوائد- مدافعتی نظام کو مضبوط کرنا

نتائج

AAV انسانی pDCs میں بہت سے مخصوص پیدائشی مدافعتی ردعمل کو اکساتا ہے۔

مطالعات نے ثابت کیا ہے کہ HEK سیل سے ماخوذ، اور Sf9 سیل سے ماخوذ، AAV ویکٹر ان کے PTMs اور وائرل سسپنشنز11 میں موجود نجاست کے لحاظ سے مختلف ہیں۔ ہم نے قیاس کیا کہ ان عوامل کے نتیجے میں HEK سیل- اور Sf9 سیل سے ماخوذ ویکٹر لاٹ کے درمیان امیونوجینک خصوصیات میں فرق ہو سکتا ہے۔ اس مفروضے کو جانچنے کے لیے، ہم نے کل آٹھ AAV سیرو ٹائپ 8 (AAV8) ویکٹر لاٹس کا تجزیہ کیا جس میں سائٹومیگالو وائرس پروموٹر (CMV) کی ایک جیسی DNA ترتیب اور بہتر گرین فلوروسینس پروٹین (eGFP) (AAV8- کے لیے ایک جیسی ٹرانسجن شامل ہیں۔ CMV-eGFP؛ پانچ HEK- اور تین Sf9 سیل سے ماخوذ لاٹس) اور چار AAV2-CMV-eGFP لاٹس (دو HEK- اور دو Sf9 سیل سے ماخوذ لاٹس) تین مختلف مینوفیکچررز [مینوفیکچرر A; Iowa یونیورسٹی (Iowa, USA) کی وائرل ویکٹر کور سہولت، صنعت کار B؛ Virovek (CA, USA) اور صنعت کار C; Vigene Biosciences (MD, USA)]۔ لاٹوں میں مماثلت کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے، مینوفیکچرر A اور مینوفیکچرر B (ٹیبل 1) کے سات AAV8 لاٹ ایک ہی اصل پلازمیڈ کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے گئے تھے۔ مزید برآں، AAV ویکٹر لاٹس کے ویکٹر جینوم (vg) کی ایک ڈراپلیٹ ڈیجیٹل PCR (ddPCR) رجسٹریشن دو مختلف اہداف کا استعمال کرتے ہوئے ایک ساتھ ساتھ پیمائش میں کی گئی: ایک CMV ترتیب کے اندر اور دوسرا eGFP ترتیب کے اندر۔ ویکٹر CMV ہدف کی مقدار کے ذریعے حاصل کردہ نتائج درج ذیل تجربات (ٹیبل 1) میں AAV ویکٹر لاٹ کے ٹائٹریشن کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ pDCs خصوصی وائرل سینسر ہیں جو AAV ویکٹر 9 سمیت وائرل انفیکشن15 پر بڑے پیمانے پر قسم I IFN تیار کرتے ہیں۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا HEK سیل سے تیار کردہ اور Sf9- سیل سے تیار کردہ AAV ویکٹر مدافعتی خلیوں میں پیدائشی مدافعتی ردعمل کو ظاہر کرنے کی صلاحیت میں مختلف ہیں، ہم نے اوپر درج AAV ویکٹر لاٹس کے ساتھ انسانی pDCs کو متحرک کیا۔ اس مقصد کے لیے، pDCs کو مقناطیسی ایکٹیویٹڈ سیل چھانٹی (MACS) کا استعمال کرتے ہوئے منفی انتخاب کے ذریعے انفرادی صحت مند انسانی عطیہ دہندگان کے پیریفرل بلڈ مونو نیوکلیئر سیل (PBMCs) سے پاک کیا گیا تھا۔ فلو سائٹومیٹری تجزیہ نے 90% سے زیادہ کے الگ تھلگ pDCs کی پاکیزگی کی تصدیق کی (تصویر S1)۔ ایک انفرادی عطیہ دہندہ کے دس، پی ڈی سی کو 18 گھنٹے کے لیے 1:1×106 vg/cell کے MOI پر AAV8 اور AAV2 ویکٹر لاٹ کے ساتھ سیڈ اور حوصلہ افزائی کی گئی۔ 1:106 vg/cell کا MOI 50 ul/well میں کل 12.500 سیلوں پر لاگو ہوتا ہے جو 2.5×1011 vg/ml کے ٹائٹر میں ترجمہ ہوتا ہے۔ ہم نے اس ٹائٹر کا استعمال کیا کیونکہ یہ انسانوں میں ریٹینل جین تھراپی اسٹڈیز (مثلاً 1 × 1012 vg/ ml16 یا 4 × 1011–1.3 × 1012 vg/ml17) اور غیر انسانی پریمیٹ (مثال کے طور پر 5 × 1011–5 × 1012 vg/ml6)۔ گاڑی کے ساتھ محرک نے کنٹرول کے طور پر کام کیا۔ AAV8 اور AAV2 ویکٹر لاٹ کے ساتھ انکیوبیشن کے نتیجے میں pDCs میں کوئی قابل شناخت ٹرانسجن اظہار نہیں ہوا۔ تاہم، آٹھ میں سے چار AAV8 لاٹ (لاٹ A-HEK-1، A-HEK-2، A-HEK-3، A-Sf9-1) اور دو چار AAV2 لاٹ (لاٹ B-Sf9-1, B-Sf9-2) محرک پی ڈی سی (تصویر 1a) میں رد عمل والے خلیوں کے پھیلاؤ کی حوصلہ افزائی کرتے ہیں۔ اس کے ساتھ سوزش کی حامی سائٹوکائنز (IP-10، MIP-1، اور TNF- ) اور ٹائپ I IFN (IFN-) کی رہائی تھی۔ اس کے برعکس، باقی AAV8 (Lats A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92} سے نہ تو سیل کے پھیلاؤ اور نہ ہی سائٹوکائن کی رہائی کی حوصلہ افزائی کی گئی تھی۔ }) اور AAV2 لاٹ (لاٹ C-HEK-1، C-HEK-2)۔ ان نتائج کی تصدیق تین سے چار آزاد تجربوں میں ہوئی جو ہر ایک انفرادی عطیہ دہندہ کے خلیات (تصویر 1a–c اور Table S1) کے ساتھ کیے گئے تھے۔ ان آزاد تجربوں میں سائٹوکائن کے ارتکاز میں بہت سے مخصوص فرقوں کا شماریاتی طور پر مختلف AAV ویکٹر لاٹس کے کم سے کم مربع ذرائع کا موازنہ کرکے ایک لکیری مخلوط اثر ماڈل اور پوسٹ ہاک ڈنیٹ کے ٹیسٹ (Q{101}}.6) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ گاڑی کا کنٹرول (ٹیبلز S2 اور S3)۔ اس نے "امیونوجینک" AAV ویکٹر لاٹس (AAV8 لاٹ A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf-1 کے درمیان سائٹوکائن کے ردعمل میں اعدادوشمار کے لحاظ سے اہم فرق کو ظاہر کیا۔ {114}}، یا AAV2 لاٹس B-Sf9-1, B-Sf9-2 بالترتیب) اور کنٹرول لیکن "غیر امیونوجینک" AAV ویکٹر لاٹس (AAV8 لاٹ A-Sf{{) کے درمیان کوئی خاص فرق نہیں 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 یا AAV2 لاٹ C-HEK-1, C-HEK-2 بالترتیب) اور کنٹرول (ٹیبل S3)۔ ملٹی پلیکس پرکھ میں شامل باقی ماپا سائٹوکائنز کا ارتکاز یا تو پرکھ کی حد سے نیچے تھا (یعنی، IL-1، IL-2، IL-4، IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN-) یا نہ ہی "امیونوجینک" اور نہ ہی "غیر امیونوجینک" ویکٹر لاٹ نے ان کے اجراء میں کوئی خاص اضافہ کیا (یعنی، IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (تصویر S2), تجویز AAV ثالثی سائٹوکائن ردعمل میں مخصوصیت کی ایک ڈگری۔ سائٹوکائن کے ردعمل کی تحقیقات کے لیے پہلے وقت پر، pDCs کو "امیونوجینک" AAV8 ویکٹر لاٹ A-HEK-1 سے متحرک کیا گیا تھا۔ ہم نے پی ڈی سی محرک کے بعد پہلے ہی 2 گھنٹے پر سپرنٹنٹ میں TNF- کی حراستی میں نمایاں اضافہ دیکھا۔ اس ردعمل کے پیٹرن کی تصدیق تین تجربات میں کی جا سکتی ہے، ہر ایک انفرادی عطیہ دہندہ کے خلیات (تصویر S3) کے ساتھ انجام دیا جاتا ہے۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا "نان امیونوجینک" AAV8 ویکٹر لاٹ کی زیادہ خوراک مدافعتی ردعمل کو متحرک کرنے کے قابل تھی، ہم نے تکنیکی طور پر زیادہ سے زیادہ قابل اطلاق MOI (1:4.61×106 vg) کے ساتھ pDCs کو متحرک کیا۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ اس بڑھے ہوئے ٹائٹر (تصویر S4) کے ساتھ محرک پر نہ تو رد عمل والے سیل پھیلاؤ اور نہ ہی سائٹوکائن کے ردعمل کا پتہ چلا۔ ہمارے مفروضے کے برعکس، یہ نتائج ظاہر کرتے ہیں کہ pDCs میں AAV کے لیے فطری مدافعتی ردعمل بہت مخصوص تھے اور کسی مخصوص پیداواری نظام یا صنعت کار/صاف کرنے کے طریقہ سے متعلق نہیں تھے۔

جدول 1۔ اس مطالعے میں استعمال کیے گئے AAV8 اور AAV2 وائرل ویکٹر کے مختلف لاٹ۔

شکل 1. انسانی pDCs میں AAV ویکٹر لاٹ مخصوص مدافعتی ردعمل کی شمولیت۔ انسانی pDCs کو مختلف لاٹ AAV8-CMV-eGFP اور AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1×106 vg) کے ساتھ 18 گھنٹے کے لیے متحرک کیا گیا (a) pDCs کی نمائندہ روشن فیلڈ امیجز کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی۔ وہیکل کنٹرول (اوپری امیج) یا امیونوجینک AAV ویکٹر لاٹ (نچلی تصویر)۔ اسکیل بار 100 μm ہے۔ (b) IP-10، MIP-1، TNF-، اور IFN- 2 کی سائٹوکائن ریلیز AAV8-متحرک pDCs کے ذریعے۔ (C) AAV2-متحرک pDCs کے ذریعہ سائٹوکائن کی رہائی۔ تین سے چار آزاد تجربوں میں سے ایک کے نمائندہ پلاٹ۔ چونکہ IFN- 2 پیمائش (b,c) اور TNF- پیمائش (c) میں کچھ قدریں پرکھ کی حد سے نیچے آگئی ہیں، اس لیے مستقل 1 کو تمام ماپا جانے والے IFN- 2 اور TNF- اقدار میں پیش کرنے کے لیے شامل کیا گیا تھا۔ نیم لوگاریتھمک پلاٹ میں۔ میڈین اور انٹرکوارٹائل رینجز دکھائے گئے ہیں۔ انفرادی ویکٹر لاٹ کے لیبل میں تینوں مینوفیکچررز کو حروف A، B، اور C سے ظاہر کیا جاتا ہے۔ HEK سیل سے ماخوذ اور Sf9- سیل سے اخذ کردہ ویکٹرز "HEK اور "Sf9" سے ظاہر ہوتے ہیں اور ایک ہی مینوفیکچرر اور اسی پروڈکشن سسٹم کے متعلقہ لاٹوں کو "1، 2، 3" نمبر دیا جاتا ہے۔ دائرہ: HEK سے ماخوذ ویکٹر لاٹ؛ مثلث: Sf9-ماخوذ ویکٹر لاٹ؛ سیاہ: مینوفیکچرر A سے ویکٹر لاٹ؛ اورینج: ویکٹر لاٹ مینوفیکچرر B سے؛ سبز: ویکٹر لاٹ مینوفیکچرر C سے۔

pDCs میں AAV محرک کا مدافعتی ردعمل capsid/VG تناسب میں فرق سے متاثر نہیں ہوتا ہے۔

طبی مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ AAV ویکٹر معطلی میں مکمل اور خالی ویکٹر ذرات کی تعداد میں فرق مدافعتی ردعمل کو متاثر کر سکتا ہے۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا تجزیہ شدہ ویکٹر لاٹس کے درمیان امیونوجینک خصوصیات میں فرق مکمل اور خالی ویکٹر ذرات کے تناسب میں فرق کی وجہ سے تھا، ہم نے AAV ٹائٹریشن ELISA کے ذریعے تمام AAV لاٹس میں ویکٹر کیپسڈ کے ٹائٹر کا تعین کیا اور کیپسڈ/VG کا حساب لگایا۔ تناسب دلچسپ بات یہ ہے کہ تمام AAV لاٹس (تصویر 2) کے درمیان capsid/vg تناسب میں بڑے فرق پائے گئے۔ AAV8-CMV-eGFP لاٹ A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} میں vg (2:1) سے تقریباً دو گنا زیادہ کیپسڈز پائے گئے۔ } اور AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; اور AAV8 لاٹ A-Sf9-1 میں چار گنا زیادہ (4:1)۔ باقی لاٹوں میں 1:1 کا تناسب دیکھا گیا۔ تاہم، AAV8 (P=0.27) میں اور نہ ہی AAV2 (P=0.37) میں "امیونوجینک" اور "نان امیونوجینک" AAV ویکٹر لاٹ کے capsid/vg تناسب کے درمیان کوئی خاص فرق نہیں پایا گیا۔ ویکٹر لاٹ (تصویر 2)۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ تجزیہ شدہ AAV ویکٹر لاٹ کی امیونوجینک خصوصیات میں فرق بھی مکمل اور خالی ویکٹر ذرات کے تناسب میں فرق سے متعلق نہیں تھا۔

cistanche سپلیمنٹ کے فوائد - مدافعتی نظام کو مضبوط کرنے کا طریقہ

TLR9 کے ذریعہ "امیونوجینک" AAV8 ویکٹر لاٹ کی پہچان۔

یہ دکھایا گیا ہے کہ مورین اور انسانی پی ڈی سی کے ذریعہ AAV کی فطری قوت مدافعت کی شناخت DNA سینسنگ TLR99 کے ذریعہ کی جاتی ہے۔ اسی مناسبت سے، ہم نے جائزہ لیا کہ آیا TLR9 بھی ہمارے "امیونوجینک" AAV8 ویکٹر لاٹس کی پہچان میں شامل تھا۔ اس مقصد کے لیے، pDCs کو TLR9 مخالف H154 (50 µM) کے ساتھ بیان اور کلچر کے مطابق ترتیب دیا گیا جس کے بعد "امیونوجینک" AAV8 ویکٹر لاٹ A-HEK-1, A-HEK-2، A کے ساتھ محرک کیا گیا۔ -HEK-3، اور A-Sf9-1 (MOI: 1:1×106 vg)۔ 18 گھنٹے کے بعد، سیل کے پھیلاؤ کا کوئی ثبوت نہیں دیکھا گیا (تصویر 3a) اور IP-10، MIP-1، TNF- اور IFN- کے اجراء میں نمایاں کمی کی پیمائش کی گئی۔ 3b)۔ اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ انسانی pDCs میں "امیونوجینک" AAV8 ویکٹر لاٹ کے لیے مدافعتی ردعمل TLR9 سگنلنگ کے ذریعے ثالثی کی جاتی ہے۔

شکل 2. مختلف AAV8-CMV-eGFP اور AAV2-CMV-eGFP ویکٹر لاٹ کے درمیان capsid/vg تناسب کا موازنہ۔ Te capsid/vg تناسب جاذب پیمائش (ELISA) اور ddPCR کے نتائج (a) آٹھ AAV8 ویکٹر لاٹس اور (b) چار AAV2 ویکٹر لاٹس سے اخذ ہوتے ہیں۔ ڈیشڈ لائنیں "امیونوجینک" کو "نان امیونوجینک" AAV ویکٹر لاٹ سے الگ کرتی ہیں۔ باریں نقل کے ذرائع اور معیاری انحراف کی نشاندہی کرتی ہیں۔ شماریاتی اہمیت کا تعین غیر جوڑا اسٹوڈنٹ ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔

شکل 3. pDCs کے ذریعہ "امیونوجینک" AAV8-CMV-eGFP ویکٹر لاٹ کی پہچان TLR9 پر منحصر ہے۔ انسانی pDCs کا علاج TLR9 مخالف H154 (50 μM) کے ساتھ کیا گیا جس کے بعد 18 گھنٹے کے لیے "امیونوجینک" AAV8 ویکٹر لاٹ (MOI: 1:1× 106 vg) کے ساتھ محرک ہوا۔ (a) "امیونوجینک" AAV ویکٹر لاٹس (اوپری امیج) یا "امیونوجینک" AAV ویکٹر لاٹس اور H154 (نچلی تصویر) کے ساتھ علاج شدہ پی ڈی سی کی نمائندہ روشن فیلڈ امیجز۔ اسکیل بار 100 μm ہے۔ (b) متحرک pDCs کے ذریعے IP-10، MIP-1، TNF-، اور IFN- 2 کی سائٹوکائن کی رہائی۔ چونکہ IFN- 2 پیمائشوں میں، کچھ قدریں پرکھ کی حد سے نیچے آگئی ہیں، اس لیے مستقل 1 کو تمام ماپا جانے والی IFN- 2 اقدار میں ایک نیم لوگارتھمک پلاٹ میں پیش کرنے کے لیے شامل کیا گیا تھا۔ دکھائے گئے ذرائع اور معیاری انحرافات۔ شماریاتی اہمیت کا تعین یک طرفہ ANOVA اور Holm-Sidak کے پوسٹ ہاک تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ P اقدار: 0.05 سے کم یا اس کے برابر: *؛ 0.01 سے کم یا اس کے برابر: **؛ 0.001 سے کم یا اس کے برابر: ***۔

DNase علاج "امیونوجینک" AAV8 اور AAV2 ویکٹر لاٹ کے مدافعتی ردعمل کو کم کرتا ہے۔

جب کہ "امیونوجینک" AAV8 ویکٹرز نے pDCs میں TLR9-انحصار مدافعتی ردعمل حاصل کیا، اس طرح کے کوئی ردعمل "غیر امیونوجینک" لاٹوں سے نہیں ملے۔ TLR9 DNA کے جواب میں چالو ہوتا ہے، خاص طور پر DNA جس میں غیر میتھلیٹیڈ CpG motifs9 ہوتا ہے۔ اہم بات یہ ہے کہ ہماری ڈی ڈی پی سی آر پیمائش نے اس بات کی تصدیق کی ہے کہ ایک ہی وائرل ڈی این اے اجزاء دونوں "امیونوجینک" اور "نان امیونوجینک" ویکٹر لاٹ میں موجود تھے۔ اجتماعی طور پر، اس نے تجویز کیا کہ وائرل سسپنشن میں انٹرا وائرل ڈی این اے کے بجائے پیک بند/مفت ڈی این اے "امیونوجینک" AAV ویکٹر لاٹ کے مشاہدہ شدہ مدافعتی ردعمل کا کارگر ایجنٹ ہو سکتا ہے۔ لہذا، اگر "امیونوجینک" AAV8 ویکٹر لاٹ کے وائرل معطلی میں بقایا مفت DNA موجود تھا، تو پیدائشی مدافعتی ردعمل کو DNase کے ذریعے کم کیا جانا چاہیے۔ اس مفروضے کو جانچنے کے لیے، "امیونوجینک" AAV8 اور AAV2 ویکٹر لاٹس کو AAV محرک سے 30 منٹ پہلے DNase I (100 µg/ml) کے ساتھ پریٹریٹ کیا گیا۔ pDCs یا AAV ذرات پر DNase علاج کے غیر مخصوص اثرات کو خارج کرنے کے لیے، صرف AAV محرکات میں، pDC محرک سے پہلے ویکٹروں کو DNasemock ٹریٹمنٹ کا نشانہ بنایا گیا تھا۔ DNase کے بغیر ان فرضی علاجوں میں، AAV ذرات کو DNase سے علاج شدہ AAVs کی طرح اسی مدت کے لیے ایک جیسے DNase ہاضمہ میڈیم میں 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ دس، پی ڈی سی کو ڈی نیس پری ٹریٹڈ یا فرضی علاج شدہ "امیونوجینک" اے اے وی ویکٹر لاٹ (MOI: 1:1 × 106 vg) کے ساتھ سیڈ اور حوصلہ افزائی کی گئی۔ pDCs جو صرف DNase کے ساتھ لگائے گئے تھے یا کسی گاڑی کے ساتھ دھوکہ دہی سے سلوک کیا گیا تھا جو کنٹرول کے طور پر کام کرتے ہیں۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ "امیونوجینک" AAV8 اور AAV2 ویکٹر لاٹس کے DNase علاج سے رد عمل والے خلیوں کے پھیلاؤ میں کمی آئی (تصویر 4a) اور یا تو مکمل طور پر ختم کر دی گئی (AAV8 لاٹ A-HEK-2 اور A-Sf9-1؛ AAV2 لاٹ B-Sf9-1 اور B-Sf9-2) یا نمایاں طور پر کم ہوا (AAV8 لاٹ A-HEK-1 اور A-HEK-3) IP{{40} }، MIP-1، TNF- اور IFN- AAV محرک کے بعد (تصویر 4b،c)۔ اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ مشاہدہ شدہ DNase اثر دراصل ایکسٹرا وائرل DNA کے ہاضمے کی وجہ سے ہوا تھا نہ کہ DNase کے ویکٹر کی سالمیت پر اثر سے، ہم نے تفتیش کی کہ آیا AAV ویکٹر لاٹوں کے DNase علاج نے AAV کی نقل و حمل کی صلاحیت کو متاثر کیا۔ چونکہ AAV ایپلیکیشن کے نتیجے میں کوئی قابل شناخت پی ڈی سی نقل و حمل نہیں ہوا تھا، اس لیے HEK سیلز ان اسسیس کے لیے استعمال کیے گئے تھے کیونکہ HEK سیلز AAV ٹرانزیکشن 19 پر ٹرانزیکشن کی کارکردگی کا تجزیہ کرنے کے لیے ایک معروف سیل ماڈل ہیں۔ ہم نے HEK293T خلیوں کو DNase-treated اور sham-treated AAV8 اور AAV2 ویکٹر لاٹس (MOI: 1:8× 104 vg) کے ساتھ متحرک کیا اور ویکٹر کی درخواست کے 3 دن بعد فلوروسینس مائکروسکوپی کے ذریعے نقل و حمل کی کارکردگی کا اندازہ کیا۔ جیسا کہ بیان کیا گیا ہے، AAV2 ویکٹرز نے AAV8 ویکٹرز کے مقابلے میں زیادہ نقل و حمل کی طاقت ظاہر کی۔ اہم بات یہ ہے کہ، مزید یہ کہ، DNase کے ساتھ پہلے سے علاج نے نہ تو HEK سے حاصل کردہ اور نہ ہی Sf9- سیل سے اخذ کردہ AAV8 اور AAV2 ویکٹر لاٹس (تصویر S5a,b) میں نقل و حمل کی کارکردگی کو کم کیا ہے۔ یہ نتائج مزید ثبوت فراہم کرتے ہیں کہ ویکٹر لاٹس کی امیونوجینک خصوصیات پر DNase کا اثر ایکسٹرا وائرل DNA کے انحطاط کی وجہ سے ہے۔ اگرچہ TLR9 مخالف H154 نے بنیادی طور پر چاروں امیونوجینک AAV8 لاٹس (تصویر 3) کے لیے سوزش والی سائٹوکائنز کی رہائی کو ختم کر دیا، DNase پری ٹریٹمنٹ AAV8 لاٹس A-HEK کے لیے سوزش والی سائٹوکائن ردعمل کو بھی ختم کر سکتا ہے{{75} } اور A-Sf9-1، جبکہ اس نے اسے AAV8 لاٹوں A-HEK-1 اور A-HEK-3 (تصویر 4) کے لیے مکمل طور پر نہیں ہٹایا۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا DNase کے علاج کے وقت میں اضافہ اس سائٹوکائن ردعمل کو منسوخ کر سکتا ہے، ہم نے متعلقہ لاٹوں (A-HEK-1 اور A-HEK{{87}) کے DNase انکیوبیشن ٹائم میں دس گنا اضافے کے بعد pDCs کے نقلی تجربات کو دہرایا۔ })۔ ہم نے مشاہدہ کیا کہ 5 گھنٹے تک ویکٹروں کے DNase علاج کے بعد، AAV- محرک خلیوں کے سپرنٹنٹ میں اوسط سائٹوکائن کی تعداد میں مزید کمی واقع ہوئی ہے جو گاڑیوں کے کنٹرول سے زیادہ مختلف نہیں رہی۔ اس ردعمل کے نمونے کی تصدیق تین تجربات میں کی جا سکتی ہے، ہر ایک انفرادی عطیہ دہندہ کے خلیات (تصویر S6) کے ساتھ انجام دیا جاتا ہے۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ pDCs میں TLR9-انحصار پرو سوزش مدافعتی ردعمل کی مرکزی وجہ درحقیقت اضافی وائرل DNA ہے۔ یہ جانچنے کے لیے کہ آیا انٹرا وائرل ڈی این اے کا اخراج AAV ویکٹرز کی مدافعتی سرگرمی کو بڑھاتا ہے، ہم نے جان بوجھ کر "امیونوجینک" AAV8 لاٹ A-HEK-1 کے وائرل کیپسڈز کو 95 ڈگری پر 10 منٹ تک ہیٹ ٹریٹمنٹ کے ذریعے کھولا۔ . گرمی سے علاج شدہ ویکٹر لاٹ کو پھر پی ڈی سی کی حوصلہ افزائی کے لئے استعمال کیا جاتا تھا۔ اگرچہ حرارت کے علاج کے ساتھ اور اس کے بغیر AAV8 لاٹ A-HEK{103}} محرک پر رد عمل والے خلیوں کے پھیلاؤ میں کوئی فرق نہیں تھا، لیکن IP{104}}، MIP-1 کے اجراء میں نمایاں اضافہ ہوا تھا۔ , TNF- اور IFN- گرم علاج شدہ حالت میں، یہ بتاتا ہے کہ ویکٹر معطلی میں انکیپسولیٹڈ وائرل ڈی این اے کی رہائی مدافعتی ردعمل کو شامل کرنے میں حصہ لے سکتی ہے (تصویر 5)۔ ایک ساتھ، یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ AAV ویکٹر کی تیاریوں میں اضافی وائرل DNA contaminants شامل ہو سکتے ہیں جو pDCs میں بہت سے مخصوص مدافعتی ردعمل کو متحرک کر سکتے ہیں۔ یہ ردعمل TLR9 سگنلنگ کے ذریعے ثالثی کرتے ہیں اور DNase کے ساتھ ویکٹر لاٹ کے علاج کے ذریعے کم/ختم کیے جا سکتے ہیں۔

شکل 4. DNase پری ٹریٹمنٹ "امیونوجینک" AAV8-CMV-eGFP اور AAV2-CMV-eGFP ویکٹر لاٹ کے ذریعہ پیدا ہونے والے مدافعتی ردعمل کو کم کرتا ہے۔ انسانی پی ڈی سی کو 18 گھنٹے (MOI: 1:1× 106 vg) کے لئے DNase سے علاج شدہ "امیونوجینک" AAV8 ویکٹر لاٹ کے ساتھ متحرک کیا گیا تھا۔ (a) "امیونوجینک" AAV ویکٹر لاٹس (اوپری امیج) اور 1{{30}}}0 ug/ml DNase کے ساتھ پہلے سے علاج شدہ "امیونوجینک" AAV ویکٹر لاٹس کے ساتھ متحرک پی ڈی سی کی نمائندہ روشن فیلڈ امیجز میں (نچلی تصویر) اسکیل بار 500 μm ہے۔ (b) IP-10، MIP-1، TNF-، اور IFN- 2 کی سائٹوکائن ریلیز AAV8-متحرک pDCs کے ذریعے۔ (c) AAV2-متحرک pDCs کے ذریعہ سائٹوکائن کی رہائی۔ چونکہ IFN- 2 پیمائش (b اور c) اور TNF- پیمائش (b) میں، کچھ قدریں پرکھ کی حد سے نیچے آگئیں، اس لیے مستقل 1 کو تمام ماپا جانے والے IFN- 2 اور TNF- قدروں میں شامل کیا گیا نیم لوگاریتھمک پلاٹ میں پیشکش۔ دکھائے گئے ذرائع اور معیاری انحرافات۔ شماریاتی اہمیت کا تعین یک طرفہ ANOVA اور Holm–Sidak کے پوسٹ ہاک تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ P اقدار: 0.05 سے کم یا اس کے برابر: *؛ 0.01 سے کم یا اس کے برابر: **؛ 0.001 سے کم یا اس کے برابر: ***۔

AAV8 ویکٹر کی تیاریوں میں اضافی وائرل DNA آلودگیوں کا تحقیقی تجزیہ۔

AAV ویکٹر لاٹ میں ایکسٹرا وائرل DNA اجزاء کی پہلی تحقیقاتی خصوصیات کو انجام دینے کے لیے، ایک نمائندہ "امیونوجینک" (A-HEK-1) اور "نان امیونوجینک" (B-HEK-1) HEK سیل سے ماخوذ ویکٹر لاٹ کا تجزیہ کیا گیا۔ ان لاٹوں کو یا تو پی ڈی سی میڈیم میں 30 منٹ تک 37 ڈگری پر DNase سے علاج کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، یا 100 kDa کٹ آف فلٹرنگ ڈیوائس کا استعمال کرتے ہوئے فرضی سلوک کیا گیا اور الٹرا فلٹر کیا گیا، یا صرف فرضی علاج کیا گیا (تصویر S7a– g)۔ مسلسل بایو اینالائزر لیب چِپ کی علیحدگی اور پیوریفائیڈ ڈی این اے کی تشخیص سے ہر لاٹ کے علاج شدہ اور فرضی علاج شدہ نمونوں میں ویکٹر ڈی این اے (تصویر S7b–g) کی تقابلی مقدار کی موجودگی کا انکشاف ہوا ہے کہ نہ تو الٹرا فلٹریشن اور نہ ہی DNase-علاج نے DNA کے مواد کو متاثر کیا۔ کیپسڈ کے اندر. مزید برآں، اس نے ظاہر کیا کہ صرف "امیونوجینک" (تصویر S7a–d) لیکن "نان امیونوجینک" ویکٹر لاٹ (تصویر S7a,e–g) میں 100 سے 450 bp کے سائز کے اضافی DNA مالیکیولز موجود ہیں۔ S7c،d اور h)۔ اہم بات یہ ہے کہ یہ اضافی ڈی این اے مالیکیولز فرضی علاج شدہ نمونے اور الٹرا فلٹرڈ نمونے میں پائے جا سکتے ہیں لیکن DNase سے علاج شدہ نمونے (تصویر S7a–d) میں عملی طور پر غائب تھے۔ اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ یہ ڈی این اے مالیکیول اضافی وائرل ڈی این اے آلودگیوں کی نمائندگی کرتے ہیں جنہیں DNase کے ذریعے کم کیا جا سکتا ہے لیکن الٹرا فلٹریشن کے ذریعے ویکٹر کی معطلی سے ہٹایا نہیں جا سکتا۔ یہ فنڈنگ ​​کہ ان آلودگیوں کا پتہ صرف "امیونوجینک" میں پایا جا سکتا ہے لیکن "نان امیونوجینک" ویکٹر لاٹ میں نہیں یہ ثابت کرتا ہے کہ ان اضافی وائرل ڈی این اے مالیکیولز کی موجودگی بہت زیادہ مخصوص ہے اور اس کے علاوہ یہ تجویز بھی کر سکتی ہے کہ یہ مالیکیولز کی حوصلہ افزائی یا شراکت ویکٹر کی مدافعتی خصوصیات کو۔ "امیونوجینک" (A-HEK-1) اور "غیر امیونوجینک" (B-HEK-1) میں آلودگی پھیلانے والے DNA کے ممکنہ ذریعہ کا اندازہ لگانے کے لیے HEK کے بہت سے مقداری (q)PCR تجزیہ سیل ڈی این اے، پلاسمڈ ڈی این اے، اور اے اے وی ویکٹر ڈی این اے انجام دیا گیا۔ ڈی نیس ٹریٹڈ، موک ٹریٹڈ اور الٹرا فلٹرڈ اور ہر لاٹ کے صرف فرضی ٹریٹڈ نمونے سے ٹیمپلیٹ ڈی این اے ایلو ریپیٹ، نیوکلیئر جینوم ملٹی کاپی این پی آئی پی جین، اور آئی جی ان کے مائٹوکونڈریل 16 ایس آر آر این اے جین سیکوینسز (mt16S) کے ایمپلیفیکیشن کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ، ایک AAV8 الٹا ٹرمینل ریپیٹ ایمپلیکون (ITR2؛ ویکٹر اور ٹرانسجن پلاسمڈ DNA اصل) کے ایمپلیفیکیشن کے لیے، اور بلہ (امپیسلن ریزسٹنس) جین (Amp؛ پلاسمڈ DNA اصل) (ٹیبل S4) کے لیے ایک ایمپلیکون کے پروردن کے لیے۔ HEK سیل DNA-specific amplicon بمقابلہ ITR2 amplicon کی ΔCt اقدار کے تناسب کا موازنہ (یعنی Alu بمقابلہ ITR2، NPIP بمقابلہ ITR2، اور mt16S بمقابلہ ITR2) اور پلاسمڈ DNA-مخصوص امپلیکون بمقابلہ ITR2 (ITR2) بمقابلہ ITR2)، بالترتیب اشارہ کرتا ہے کہ دو لاٹوں میں HEK سیل نیوکلیئر اور mitochondrial DNA کی نہ ہونے کے برابر مقدار موجود ہے۔ اس کے برعکس، تجزیے سے "امیونوجینک" اور "نان امیونوجینک" ویکٹر لاٹ (بالترتیب 1/32 واں اور 1/50 واں، AAV DNA کے نسبت کاپی نمبر کے لحاظ سے) دونوں میں پلاسمڈ DNA کی معقول مقدار کا انکشاف ہوا۔ ایک تناسب جو دیگر AAV ویکٹرز 12 (تصویر S7) کے لیے رپورٹ کردہ اقدار کی حد کے اندر ہے۔ بہر حال، دونوں ویکٹر لاٹس (تصویر S8) کے DNase-علاج شدہ اور فرضی علاج شدہ یا الٹرا فلٹرڈ اور فرضی علاج شدہ نمونوں کے درمیان ویکٹر DNA سے پلازمیڈ اور HEK سیل DNA کے نسبتہ تناسب میں کوئی واضح فرق نہیں تھا۔ یہ تجویز کر سکتا ہے کہ غیر پیکج شدہ آلودگی والے ڈی این اے ٹارگٹ سیکونس کمپوزیشن میں پیکیجڈ ڈی این اے کی طرح ہے۔ تاہم، qPCR تجزیہ کی ایک حد آلودگی والے DNA (100–450 bp) کا سائز ہے جس میں نامکمل ہدف کی ترتیب کے ساتھ ٹکڑوں کا ایک معقول حصہ ہوگا۔

شکل 5. ویکٹرز کے گرمی کے علاج سے انٹرا وائرل ڈی این اے کی رہائی pDCs میں سوزش کے حامی سائٹوکائن ردعمل کو بڑھاتی ہے۔ حرارت سے علاج شدہ AAV8 لاٹ A-HEK-1 (MOI: 1:1×106 vg)۔ افقی لکیریں ذرائع اور معیاری انحراف کی نشاندہی کرتی ہیں۔ ہیٹ ٹریٹڈ اور غیر علاج شدہ ویکٹرز کی طرف سے حوصلہ افزائی سائٹوکائن ردعمل کے درمیان اعداد و شمار کے لحاظ سے اہم فرق کا تعین اسٹوڈنٹ ٹی ٹیسٹ کے ذریعے کیا گیا تھا۔ P قدر: اس سے کم یا اس کے برابر 0.01: **; 0.001 سے کم یا اس کے برابر: ***۔

بحث

AAV ویکٹر جین تھراپی میں سب سے زیادہ امید افزا ٹولز میں سے ایک ہیں۔ تاہم، جمع ہونے والے ثبوت اس نظریہ کو چیلنج کرتے ہیں کہ AAV کی مدافعتی صلاحیت نہ ہونے کے برابر ہے۔ اس کی روشنی میں، ان میکانزم کو بہتر طور پر سمجھنا ضروری ہو گیا ہے جن کے ذریعے AAV کے خلاف مدافعتی ردعمل ہوتا ہے۔ اس مطالعے میں ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ (1) AAV8 اور AAV2 انسانی pDCs میں بہت سے مخصوص پیدائشی مدافعتی ردعمل پیدا کرتے ہیں جو نہ تو capsid/vg تناسب کے لیے مخصوص ہیں اور نہ ہی پروڈکشن پلیٹ فارم اور نہ ہی مینوفیکچرر/پیوریفیکیشن طریقہ؛ (2) pDCs میں فطری قوت مدافعت کا انحصار TLR9 سگنلنگ پر ہوتا ہے اور DNase کے ساتھ پہلے سے علاج کے ذریعے اسے کم کیا جا سکتا ہے۔ (3) DNase ٹریٹمنٹ ویکٹر پارٹیکل کی سالمیت کو متاثر نہیں کرتا کیونکہ یہ HEK293T سیلوں میں AAV8 اور AAV2 ویکٹر لاٹس کی نقل و حمل کی شرح کو کم نہیں کرتا ہے۔ اور (4) AAV ویکٹر لاٹ ایکسٹرا وائرل DNA مالیکیولز پر مشتمل ہو سکتے ہیں جنہیں DNase کے ساتھ ویکٹر لاٹ کے علاج سے ہٹایا جا سکتا ہے۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ HEK- اور Sf9- سیل سے ماخوذ AAV تیاریوں میں اضافی وائرل DNA نجاست شامل ہو سکتی ہے جو ایک پیدائشی مدافعتی ردعمل کو متحرک کرتی ہے۔ ایک حالیہ مطالعہ میں، مختلف میزبان سیل پرجاتیوں (HEK خلیات اور Sf9 خلیات) 11 سے AAV ویکٹر کا استعمال کرتے ہوئے ایک تقابلی تجزیہ کیا گیا۔ مصنفین نے پایا کہ HEK- اور Sf9-ماخوذ ویکٹرز ان کے PTMs اور ان کی بقایا میزبان سیل پروٹین کی نجاستوں کے لحاظ سے ان تمام AAV سیرو ٹائپس اور مینوفیکچررز میں مختلف ہیں جن کا انہوں نے تجربہ کیا۔ مزید برآں، انہوں نے AAV ٹرانزیکشن کے لیے بنیادی انسانی فائبرو بلاسٹس کے سائٹوکائن ردعمل کا تجزیہ کیا اور پایا کہ HEK- اور Sf9-ماخوذ ویکٹر اپنی امیونوجینک خصوصیات میں مختلف ہو سکتے ہیں۔ اپنے مطالعے میں، ہم نے مختلف مینوفیکچررز اور دو مختلف سیرو ٹائپس سے ایک ہی AAV تعمیر کے مختلف لاٹوں کا استعمال کرتے ہوئے ان دو اہم پیداواری نظاموں کا موازنہ بھی کیا۔ تاہم، ہم نے اپنے انسانی پی ڈی سی ماڈل میں جن ویکٹر سے متاثر مدافعتی ردعمل کا مشاہدہ کیا ہے وہ خاص طور پر کسی دیئے گئے پروڈکشن سسٹم، مینوفیکچرر، یا سیرو ٹائپ سے متعلق نہیں تھے، اس کے بجائے، وہ بہت مخصوص تھے۔ ریٹنا جین تھراپی کے پچھلے پری کلینیکل اور کلینیکل اسٹڈیز میں بتایا گیا ہے کہ AAV ویکٹرز کے لیے مدافعتی ردعمل، جیسے آنکھ کی سوزش یا مدافعتی خلیوں کی دراندازی، capsid/vg ratios18 یا خوراک کے فرق میں فرق سے متاثر ہو سکتی ہے۔ Timmers et al.18 نے ظاہر کیا کہ وائرل معطلی سے خالی AAV کیپسڈز کو ہٹانے سے سوزش کم ہوتی ہے اور غیر انسانی پریمیٹ کے ساتھ پری کلینیکل اسٹڈی میں وائرل ٹرانزیکشن میں بہتری آتی ہے۔ پھر بھی، ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ایلیویٹڈ کیپسڈ/وی جی تناسب دونوں "امیونوجینک" اور "نان امیونوجینک" اے اے وی ویکٹر لاٹ میں موجود تھے، مطلب یہ ہے کہ وائرل سسپنشن میں کیپسڈز (خالی کیپسڈز) کی زیادہ تعداد اس کی شمولیت کے لیے ذمہ دار نہیں تھی۔ ہمارے انسانی پی ڈی سی ماڈل میں ویکٹر لاٹ مخصوص مدافعتی ردعمل۔ اس کے علاوہ، ہم نے پہلے دکھایا ہے کہ AAV8 غیر انسانی پریمیٹ 6,8 میں خوراک پر منحصر انداز میں مدافعتی ردعمل کو اکساتا ہے۔ تاہم، اس مطالعے میں "نان امیونوجینک" AAV ویکٹر کی خوراک میں اضافہ انسانی pDCs میں مدافعتی ردعمل کو متحرک کرنے کے لیے کافی نہیں تھا۔ لہذا، ویکٹرز کی امیونوجینک خصوصیات میں فرق کی وجہ کو سمجھنے کے لیے، ہم نے "امیونوجینک" AAV لاٹس کی شناخت میں شامل میکانزم کی چھان بین کی۔ وٹرو امیونوکمپیٹنٹ سیل ماڈلز کے استعمال نے سائنسدانوں کو AAV ویکٹر 9,10 کے ذریعے پیدا ہونے والے پیدائشی مدافعتی ردعمل میں TLR راستوں کے کردار کا زیادہ درست مطالعہ کرنے کی اجازت دی ہے۔ Zhu et al.9frst نے بیان کیا کہ pDCs، لیکن روایتی DCs یا غیر pDCs نہیں، AAV محرک کے جواب میں قسم I IFN اور پرو سوزش والی سائٹوکائنز کی بڑی مقدار جاری کرتے ہیں اور AAV8 اور AAV2 کی پہچان میں TLR9 راستے کی شمولیت کا مظاہرہ کرتے ہیں۔ ماؤس پی ڈی سی کا استعمال کرتے ہوئے. مصنفین نے یہ بھی مشاہدہ کیا کہ AAV2 نے انسانی pDCs میں TLR9-انحصار مدافعتی ردعمل کی حوصلہ افزائی کی۔ ہمارے مطالعے میں، ایک انتہائی مخصوص TLR9 مخالف، H1549,21–24 کے استعمال کے ساتھ، ہم نے بالواسطہ طور پر دکھایا ہے کہ نہ صرف AAV2، بلکہ AAV8 ویکٹر بھی انسانی pDCs میں TLR9-انحصار پیدائشی مدافعتی ردعمل پیدا کرتے ہیں، لیکن بہت مخصوص انداز میں۔ چونکہ TLR9 ایک DNA ریسیپٹر ہے، اس سے یہ تجویز کیا گیا کہ "امیونوجینک" AAV ویکٹر لاٹ کے لیے مدافعتی ردعمل DNA اجزاء کے ذریعے پیدا کیے گئے تھے۔ تاہم، اگرچہ ہماری ddPCR پیمائشوں نے اس بات کی تصدیق کی تھی کہ ایک ہی پیکڈ DNA اجزاء دونوں "امیونوجینک" اور "نان امیونوجینک" ویکٹر لاٹس میں موجود تھے، لیکن "نان امیونوجینک" لاٹس نے pDCs میں مدافعتی ردعمل کو متحرک نہیں کیا۔ مزید برآں، DNase علاج نے یا تو "امیونوجینک" AAV ویکٹر لاٹس کی مدافعتی خصوصیات کو کم یا ختم کر دیا، لیکن HEK خلیوں میں ان ویکٹروں کی نقل و حمل کی صلاحیت میں کمی نہیں آئی، یہ تجویز کرتا ہے کہ AAV کے DNase علاج نے غیر انکیپسولڈ اضافی وائرل DNA کو نشانہ بنایا۔ ویکٹر معطلی لیکن برقرار کیپسڈ کے اندر ویکٹر جینوم کی سالمیت کو متاثر نہیں کیا۔ اس کی مزید تصدیق نمائندہ DNase سے علاج شدہ اور فرضی علاج شدہ "امیونوجینک" اور "نان امیونوجینک" ویکٹر لاٹ کے تقابلی ڈی این اے تجزیوں سے ہوئی۔

cistanche tubulosa - مدافعتی نظام کو بہتر بنانا

Cistanche Enhance Immunity مصنوعات دیکھنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

【مزید پوچھیں】 ای میل:cindy.xue@wecistanche.com / واٹس ایپ: 0086 18599088692 / وی چیٹ: 18599088692

اجتماعی طور پر، یہ تمام تجربات اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ pDCs میں "امیونوجینک" ویکٹر لاٹ کے لیے مدافعتی ردعمل AAV ذرات میں موجود DNA (یعنی ویکٹر جینوم یا AAV capsids میں پیک کردہ ممکنہ DNA نجاست) کے ذریعے نہیں بنایا گیا تھا بلکہ قابل رسائی اضافی وائرل DNA کے ذریعے۔ وائرل سسپنشنز میں موجود اجزاء (یعنی DNA باہر یا وائرل کیپسڈ سے غیر محفوظ)۔ ہم نے یہ بھی مشاہدہ کیا کہ جب "امیونوجینک" ویکٹر لاٹ کے وائرل کیپسڈز میں موجود ڈی این اے کو ویکٹر کے ہیٹ ٹریٹمنٹ کے ذریعے خلیوں کے سامنے لایا گیا تو مدافعتی ردعمل میں اضافہ ہوا۔ یہ واضح نہیں ہے کہ کیپسڈز کو کھولنے کے بعد امیونوسٹیمولیٹری سرگرمی میں اضافہ ویکٹر کے واحد پھنسے ہوئے ڈی این اے کی وجہ سے تھا یا AAV کیپسڈز میں پیک کی گئی ممکنہ نجاست جیسے بقایا میزبان سیل نیوکلک ایسڈز، بقایا مددگار ڈی این اے کی ترتیب، ریڑھ کی ہڈی کی ترتیب۔ کیسٹ کے ساتھ پیک کیے گئے ٹکڑے یا ITRs سے ریورس پرائمنگ کے نتیجے میں ریڑھ کی ہڈی کے چھوٹے ٹکڑے AAV12,25 میں پیک کیے جاتے ہیں۔ پی ڈی سی کے ذریعہ ایکسٹرا وائرل ڈی این اے لینے کا صحیح طریقہ کار نامعلوم ہے۔ CpG oligonucleotides کے لیے pDCs کی ردعمل ظاہر کرتی ہے کہ pDCs مفت DNA26 پر رد عمل ظاہر کر سکتے ہیں۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ pDCs میں مدافعتی ردعمل ویکٹر معطلی میں موجود آزاد آلودگی والے DNA کے استعمال سے شروع ہوسکتا ہے۔ مزید برآں، یہ دکھایا گیا ہے کہ pDCs متبادل طور پر AAV ویکٹرز 27 لے سکتے ہیں جو تجویز کرتے ہیں کہ AAV ذرات کے اخراج کے دوران ممکنہ کیپسڈ پابند ڈی این اے کو سیل میں منتقل کیا جا سکتا ہے۔ اے اے وی ویکٹر کی تیاریوں میں اضافی وائرل ڈی این اے آلودگی کی موجودگی یا تو متعلقہ ویکٹر لاٹ کی موروثی خاصیت ہو سکتی ہے جس کے نتیجے میں ویکٹرز کی پیداوار اور صاف کرنے کے عمل کا نتیجہ ہوتا ہے، یا یہ ذخیرہ کرنے کے نامناسب حالات کی وجہ سے انکیپسولڈ ڈی این اے کے جاری ہونے کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ . ان تجربات میں جانچے گئے تمام ویکٹر لاٹس ایک ہی مدت کے دوران حاصل کیے گئے تھے (8 AAV8 میں سے 5 ویکٹر لاٹس کی جانچ کی گئی، جن میں سے دو "امیونوجینک" تھے (A-HEK-2؛ A-HEK-3) اور تین "غیر امیونوجینک" تھے (A-Sf9-2؛ B-Sf9-1؛ B-Sf9-2) یہاں تک کہ خاص طور پر اس مطالعہ کے متوازی طور پر تیار کیے گئے تھے۔ ہر کارخانہ دار کو ایک ہی نقل و حمل کے ڈبوں میں بھیج دیا گیا تھا اور، موصول ہونے پر، تمام لاٹوں کو ایک ہی دراز میں درجہ حرارت کے الارم سے محفوظ −80 ڈگری فریزر میں ساتھ ساتھ محفوظ کر لیا گیا تھا، اس سے پہلے کہ تمام لاٹوں کے ایلی کوٹس کو بیک وقت پگھلا کر پی ڈی سی پر لگایا جائے۔ ساتھ ساتھ تجربات میں۔ اس سے سختی سے پتہ چلتا ہے کہ AAV کی پیداوار اور صاف کرنے کا عمل، نامناسب اسٹوریج کے بجائے، اضافی وائرل DNA مواد اور ان لاٹوں کی مدافعتی خصوصیات میں فرق کے لیے ذمہ دار تھا۔ ماضی میں، جین تھراپی کے لیے تیار کیے گئے کلینیکل گریڈ AAV ویکٹر لاٹس (alipogene tiparvovec، Glybera) زیادہ مقدار میں نجاستوں بشمول ممکنہ طور پر امیونوجینک بقایا میزبان سیل DNA28 کی وجہ سے مجاز نہیں تھے۔ وائرل معطلی سے ڈی این اے کی نجاست کو ہٹانا عام طور پر پیداواری عمل کے دوران انجام دیا جاتا ہے۔ یہاں Benzonase29 یا DNase30 کا علاج معمول کے مطابق ہوتا ہے تاکہ آخری وائرل معطلی سے بقایا DNA کو ختم کیا جا سکے۔ یہ علاج، پروٹوکول پر منحصر ہے، 30 منٹ اور 3 گھنٹے کے درمیان رہتا ہے اور پھر انزائم کو کیمیکلز جیسے سیزیم کلورائیڈ نمکیات سے غیر فعال کر دیا جاتا ہے۔ ہمارے تجربات میں، آئیووا یونیورسٹی کی وائرل ویکٹر کور سہولت سے اخذ کردہ پانچ میں سے چار AAV8 لاٹ، اور Virovek سے AAV2 ویکٹر لاٹ دونوں pDCs میں امیونوجینک پائے گئے۔ جیسا کہ "مواد اور طریقے" سیکشن میں بیان کیا گیا ہے، ان دونوں مینوفیکچررز کی جانب سے ویکٹر لاٹوں کو صاف کرنے کے عمل میں کئی پیوریفیکیشن مراحل شامل ہیں، جن میں سے کچھ ایک دوسرے سے بہت مختلف ہیں۔ اس طرح، آئیووا میں بنیادی سہولت میں صاف کرنے کے عمل میں ٹربونیوکلیز ٹریٹمنٹ شامل ہے، جس کے بعد آئیوڈیکسانول گریڈینٹ الٹرا سینٹرفیوگیشن، اینین ایکسچینج کالم کرومیٹوگرافی، فلٹر سٹرلائزیشن، اور سینٹری فیوگل فلٹرز کا استعمال کرتے ہوئے بفر ایکسچینج شامل ہیں۔ اس کے برعکس، Virovek CsCl میں بینزونیز ٹریٹمنٹ، الٹرا سینٹرفیوگیشن کا اطلاق کرتا ہے جس کے بعد ڈیسالٹنگ اور فلٹر سٹرلائزیشن ہوتی ہے۔ دوسری طرف، Vigene کے صاف کرنے کا عمل DNase علاج پر مشتمل نہیں ہے، لیکن، جیسا کہ Iowa میں Core Facility کے ذریعے استعمال کیا جاتا ہے، اس میں iodixanol gradient ultracentrifugation شامل ہے۔ تاہم، حیرت انگیز طور پر، Vigene (AAV8: C-HEK-1؛ AAV2: C-HEK-1 اور 2) سے اخذ کردہ تین ویکٹر لاٹوں میں سے کسی نے بھی pDCs میں مدافعتی ردعمل پیدا نہیں کیا، جو تجویز کرتا ہے کہ "غیر امیونوجینک " ویکٹر لاٹ پیداواری عمل کے ساتھ بھی تیار کیے جا سکتے ہیں جن میں DNase علاج شامل نہیں ہوتا ہے۔

cistanche سپلیمنٹ کے فوائد - مدافعتی نظام کو مضبوط کرنے کا طریقہ

مجموعی طور پر، تینوں مینوفیکچررز کے ذریعے استعمال کیے جانے والے جزوی طور پر ایک جیسے اور جزوی طور پر مختلف طہارت کے اقدامات پی ڈی سی میں مشاہدہ کیے گئے ویکٹروں کی امیونوجینک خصوصیات کو مینوفیکچرنگ کے عمل میں ایک قدم سے جوڑنا مشکل بنا دیتے ہیں۔ کلینیکل ٹرائلز اچھی مینوفیکچرنگ پریکٹس (GMP) گریڈ ویکٹرز کا استعمال کرتے ہیں جن پر سخت کوالٹی کنٹرول ہوتے ہیں۔ اس مطالعے میں استعمال ہونے والے تین مینوفیکچررز میں سے کوئی بھی ویکٹر اچھی لیبارٹری پریکٹس (GLP) گریڈ کا نہیں ہے اور اس وجہ سے کلینیکل گریڈ ویکٹرز سے کم پاکیزگی کا حامل ہو سکتا ہے۔ اس طرح، یہ تسلیم کرنا ضروری ہے کہ انسانوں میں کلینیکل ٹرائلز میں استعمال ہونے والے GMP ویکٹر ان اختلافات کو ظاہر کر سکتے ہیں یا نہیں کر سکتے ہیں جو ہم نے موجودہ مطالعہ میں دیکھا ہے اور یہ کہ جین کے علاج کے طبی استعمال کے لیے ہمارے نتائج کی مطابقت واضح نہیں ہے۔ تاہم، ہمارے اپنے تجربے میں، میزبان سیل پروٹین جیسے آلودہ اجزاء کے ارتکاز میں کافی خاص فرق GMP-گریڈ ویکٹر کے ساتھ بھی ہو سکتا ہے، اور یہاں تک کہ GMP-گریڈ ویکٹر میں بھی یکساں طور پر متفقہ وضاحتیں نہیں ہیں کہ کیا سطحیں ہیں۔ قابل قبول5. اجتماعی طور پر، AAV ویکٹرز کے مینوفیکچرنگ کے عمل کو بہتر بنانا وائرل معطلی میں بقایا نجاست کی موجودگی سے بچنے کے لیے کلیدی حیثیت رکھتا ہے تاکہ غیر ارادی مدافعتی ردعمل کے امکانات کو کم کیا جا سکے۔ آخر میں، ہم نے یہ ظاہر کیا کہ اضافی وائرل DNA نجاست انسانی pDCs میں AAV ویکٹر کی امیونوجینک خصوصیات کو متاثر کر سکتی ہے۔ جانوروں کے ماڈلز یا انسانی مریضوں میں AAV-ثالثی جین تھراپی کی حفاظت کے لیے ان نتائج کے مضمرات کی تحقیقات کے لیے مزید مطالعات کی ضرورت ہے۔

حوالہ جات

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV جینوم انجینئرنگ اڈینو سے وابستہ وائرس کا استعمال کرتے ہوئے: بنیادی اور کلینیکل ریسرچ ایپلی کیشنز۔ مول ٹیر 24، 458–464 (2016)۔

2. Garita-Hernandez، M. et al. انسانی حوصلہ افزائی pluripotent اسٹیم سیلز سے حاصل کردہ 3D ریٹینل آرگنائڈز کو AAV-ثالثی جین کی ترسیل۔ انٹر جے مول سائنس 21، 994 (2020)۔

3. رسل، ایس وغیرہ۔ RPE65-ثالثی وراثت میں ملنے والے ریٹنا ڈسٹروفی کے مریضوں میں voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) کی افادیت اور حفاظت: ایک بے ترتیب، کنٹرول شدہ، اوپن لیبل، فیز 3 ٹرائل۔ لینسیٹ 390, 849–860 (2017)۔

4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. حتمی علاج کی طرف AAV کے ذریعے فراہم کردہ علاج کو تیار کرنا۔ جے مول میڈ. 99، 1–25۔ https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021)۔

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD مدافعتی ردعمل ایڈینو سے وابستہ وائرل ویکٹرز کا استعمال کرتے ہوئے ریٹنا جین تھراپی کے لیے — علاج کی کامیابی اور حفاظت کے لیے مضمرات۔ پروگرام ریٹین آنکھ Res. 83، 100915 (2020)۔

6. ریچل، ایف ایف وغیرہ۔ AAV8 پرائمیٹ آنکھ میں فطری اور انکولی مدافعتی ردعمل پیدا کر سکتا ہے۔ مول ٹیر 25، 2648–2660 (2017)۔

7. Boyd، RF et al. کتوں میں پوسٹرئیر وٹریکٹومی کے بعد rAAV کی انٹرا وٹریل ڈیلیوری کے ساتھ ریٹنا کی نقل و حمل میں کمی اور ٹرانسجن ڈائریکٹڈ امیونوجنیسیٹی میں اضافہ۔ جین ٹیر۔ 23، 548–556 (2016)۔

8. Rodríguez-Bocanegra, E. et al. غیر انسانی پریمیٹ میں اڈینو سے وابستہ وائرس کی سبریٹینل ڈیلیوری کے بعد ریٹنا میں ہائپر ریفیکٹیو فوکی کی طولانی تشخیص۔ ترجمہ Vis. سائنس ٹیکنالوجی. 10، 15 (2021)۔

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9-MyD88 راستہ چوہوں میں اڈینو سے وابستہ وائرس جین تھراپی ویکٹروں کے لیے مدافعتی ردعمل کے لیے اہم ہے۔ جے کلین تفتیش کریں۔ 119، 2388–2398 (2009)۔

10. Hösel، M. et al. ٹول نما رسیپٹر نے ایڈینو سے وابستہ وائرل ویکٹرز کی طرف انسانی غیر پیرینچیمل جگر کے خلیوں میں پیدائشی مدافعتی ردعمل کی ثالثی کی۔ ہیپاٹولوجی 55، 287–297 (2012)۔

11. روماچک، این جی وغیرہ۔ طریقہ کار اہمیت رکھتا ہے: ریکومبیننٹ AAV کے لیے معیاری پروڈکشن پلیٹ فارم کیمیائی اور فعال طور پر الگ الگ ویکٹر تیار کرتے ہیں۔ مول ٹیر طریقے کلین۔ دیو 18، 98–118 (2020)۔

12. رائٹ، JF کلینیکل گریڈ ریکومبیننٹ AAV ویکٹرز میں پروڈکٹ سے متعلق نجاست: خصوصیات اور خطرے کی تشخیص۔ بائیو میڈیسنز 2، 80–97 (2014)۔

13. کلیمنٹ، این اور گریجر، جے سی کلینیکل ٹرائلز کے لیے ریکومبیننٹ اڈینو سے وابستہ وائرل ویکٹرز کی تیاری۔ مول ٹیر طریقے کلین۔ دیو 3، 16002 (2016)۔

14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. فارماکولوجی آف ریکومبیننٹ اڈینو سے وابستہ وائرس کی پیداوار۔ مول ٹیر طریقے کلین۔ دیو 8، 166–180 (2018)۔

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Plasmacytoid dendritic cell Biology and its role in immun-mediated disease. کلین ترجمہ امیونول۔ 9، e1139 (2020)۔

16. فشر، ایم ڈی وغیرہ۔ کورائیڈریمیا کے مریضوں کے لیے اڈینو سے وابستہ وائرس ویکٹر کا استعمال کرتے ہوئے ریٹنا جین تھراپی کی افادیت اور حفاظت: ایک بے ترتیب کلینیکل ٹرائل۔ JAMA Ophthalmol. 137، 1247–1254 (2019)۔

17. ویلبر، آر جی وغیرہ۔ RPE کے لیے جین تھراپی کے 2 سال بعد کے نتائج آپتھلمولوجی 123، 1606–1620 (2016)۔

18. Timmers, AM et al. ایڈینو سے وابستہ وائرس ویکٹر کے انٹرا وٹریل انجیکشن کے لئے آنکھ کی سوزش کا ردعمل: جینوم اور کیپسڈ کی رشتہ دار شراکت۔ ہم جین ٹیر۔ 31، 80–89 (2020)۔

19. رن، جی اور دیگر. سائٹ سے ہدایت شدہ mutagenesis کیپسڈ لائبریری سے ماخوذ ریکومبیننٹ AAV ویکٹرز کی نقل و حمل کی کارکردگی کو بہتر بناتا ہے۔ مول ٹیر طریقے کلین۔ دیو 17، 545–555 (2020)۔

20. ایلس، بی ایل وغیرہ۔ نو قدرتی اڈینو سے وابستہ وائرس (AAV1-9) اور ایک انجنیئرڈ اڈینو سے وابستہ وائرس سیرو ٹائپ کے ساتھ ممالیہ کے بنیادی خلیوں اور سیل لائنوں کی سابق vivo/in vitro transduction Efficiency کا سروے۔ ویرول۔ J. 10, 1–10 (2013)۔

21. Yamada، H. et al. CpG-حوصلہ افزائی مدافعتی ایکٹیویشن پر دبانے والے DNA کا اثر۔ J. Immunol. 169، 5590–5594 (2002)۔

22. Zhang، P. et al. ٹول نما رسیپٹر 9 مخالف تجرباتی آٹو امیون مایسٹینیا گریوس میں مزاحیہ استثنیٰ کو دباتا ہے۔ مول امیونول۔ 94، 200–208 (2018)۔

23. Chan, YK et al. فطری قوت مدافعت اور اشتعال انگیز ردعمل سے بچنے کے لیے اڈینو سے وابستہ وائرل ویکٹر انجینئرنگ۔ سائنس ترجمہ میڈ. 13، eabd3438 (2021)۔

24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM سٹرکچر، میکانزم اور امیونوسوپریسیو oligonucleotides کے علاج کی افادیت۔ فارماکول۔ Res. 105، 216–225 (2016)۔

25. برمبل، ایم اے وغیرہ۔ 547. AAV تیاریوں میں براہ راست ITRs کے باہر پروڈکشن پلاسمڈ میں DNA کی ترتیب سے آلودگی ہوتی ہے۔ مول ٹیر 24، S218–S219 (2016)۔

26. Latz، E. et al. TLR9 سگنلز ER سے CpG DNA میں lysosome میں منتقل کرنے کے بعد۔ نیٹ امیونول۔ 5، 190–198 (2004)۔

27. Veron، P. et al. انسانی ڈینڈریٹک خلیوں کے بڑے ذیلی سیٹوں کو خود تکمیلی اڈینو سے وابستہ وائرس ویکٹر 1 اور 2. J. Virol کے ذریعے مؤثر طریقے سے منتقل کیا جاتا ہے۔ 81، 5385–5394 (2007)۔

28. اسسمنٹ رپورٹ: گلیبرا۔ https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment رپورٹ_en.pdf۔ رسائی شدہ 03 مارچ 2022 (2012)

29. Arden, E. & Metzger, J. مقامی اور بایو انجینیئرڈ ریکومبیننٹ اڈینو سے وابستہ وائرس پیوریفیکیشن کے لیے سستا، سیرو ٹائپ سے آزاد پروٹوکول۔ J. Biol طریقے 3, e38 (2016)۔

30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ پروڈکشن اور اڈینو سے وابستہ وائرل ویکٹرز کی خصوصیات۔ نیٹ پروٹوک 1، 1412–1428 (2006)۔

31. Kimura، T. et al. ان وٹرو اور ان ویوو ایپلی کیشنز کے لیے اڈینو سے وابستہ وائرس ویکٹرز کی پیداوار۔ سائنس Rep. 9, 13601 (2019)۔

32. Ayuso، E. et al. اعلی AAV ویکٹر کی پاکیزگی کے نتیجے میں سیرو ٹائپ- اور ٹشو سے آزاد نقل و حمل کی کارکردگی میں اضافہ ہوتا ہے۔ جین ٹیر۔ 17، 503–510 (2010)۔