FGIN-1-27 ایک مصنوعی مائٹوکونڈریل ڈائیزپام بائنڈنگ انحیبیٹر ریسیپٹر (MDR) ہےایگونسٹ جس نے پرو اپوپٹوٹک، اینٹی اینزائٹی، اور سٹیرایڈوجینک سرگرمی کا مظاہرہ کیا ہےمختلف مطالعات میں. یہاں ہم رپورٹ کرتے ہیں، کے لیےپہلاوقت، مخالف میلانوجینک افادیتکیFGIN-1-27وٹرو میںاورجاندار کےاندر. FGIN-1-27 نمایاں طور پرروکا بیسل اور میلانوسائٹ محرک ہارمون ( -MSH)-، 1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol (OAG)-اور اینڈوتھیلین-1 (ET-1) - سیلولر زہریلا کے بغیر میلانوجینس کی حوصلہ افزائی۔مشروم ٹائروسینیز سرگرمی پرکھ نے ظاہر کیا کہ FGIN-1-27 نے براہ راست روکا نہیںٹائروسینیز کی سرگرمی، یہ تجویز کرتی ہے کہ FGIN-1-27 براہ راست ٹائروسینیز روکنے والا نہیں تھا. اگرچہ یہ کیٹلیٹک سرگرمی کو ماڈیول نہیں کر سکامشروم ٹائروسینیزوٹرو میں, FGIN-1-27 نے اظہار کی سطح کو کم کر دیا۔کلیدی پروٹین جو melanogenesis میں کام کرتے ہیں۔ FGIN-1-27 نے یہ فنکشنز چلائےPKA/CREB، PKC کو دبا کر ، اور MAPK راستے۔ ایک بار غیر فعال، یہMITF، tyrosinase، TRP-1، اور TRP-2 کے اظہار کو کم کیا، اور روک دیاٹائروسینیز کی سرگرمی،آخر میںmelanogenesis کو روکنا. دورانجاندار کےاندرتجربات،FGIN-1-27 نے زیبرا فش کے جسم کے پگمنٹیشن کو روکا۔اور UVB کی حوصلہ افزائی کو کم کیا۔گنی پگ کی جلد میں ہائپر پگمنٹیشن، لیکن میلانوسائٹس کی ایک بڑی تعداد میں کمی نہیں۔ہمارینتائجاشارہ کیا کہ FGIN-1-27 نے کوئی سائٹوٹوکسیٹی نہیں دکھائی اور روکادونوں میں melanogenesisوٹرو میںاورجاندار کےاندرماڈلز یہ ایک کے طور پر کافی مفید ثابت ہوسکتا ہے۔محفوظ جلد کو سفید کرنے والا ایجنٹ۔

متعلقہ مطالعات کے مطابق،cistancheایک عام جڑی بوٹی ہے جسے "معجزہ جڑی بوٹی جو زندگی کو طول دیتی ہے" کے نام سے جانا جاتا ہے۔ اس کا بنیادی جزو cistanoside ہے جس کے مختلف اثرات ہوتے ہیں جیسےاینٹی آکسیڈینٹ, غیر سوزشی، اور مدافعتی فنکشن کو فروغ دینا۔ cistanche اور کے درمیان میکانزمجلد کی سفیدیcistanche glycosides کے اینٹی آکسیڈینٹ اثر میں مضمر ہے۔میلانینانسانی جلد میں ٹائروسین کے آکسیکرن کے ذریعے پیدا ہوتا ہے۔ٹائروسینیز، اور آکسیڈیشن ردعمل میں آکسیجن کی شرکت کی ضرورت ہوتی ہے، لہذا جسم میں آکسیجن فری ریڈیکلز میلانین کی پیداوار کو متاثر کرنے والا ایک اہم عنصر بن جاتے ہیں۔ Cistanche میں cistanoside ہوتا ہے، جو کہ ایک اینٹی آکسیڈنٹ ہے اور جسم میں آزاد ریڈیکلز کی پیداوار کو کم کر سکتا ہے، اس طرحمیلانین کی پیداوار کو روکتا ہے۔.

Cistanche Tubulosa پر کلک کریں۔

مزید معلومات کے لیے: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

تعارف

Melanogenesis جلد میں melanocytes کا سب سے اہم کام ہے۔ melanogenesis میں شامل کئی اہم عوامل کو واضح کیا گیا ہے (Raposo and Marks, 2007; Noguchi et al., 2014)۔ کلیدی انزائم جو melanogenesis کو منظم کرتا ہے وہ ٹائروسینیز ہے اور یہ ٹائروسینیز سے متعلقہ پروٹین 1 (TRP1) اور ٹائروسینیز سے متعلق پروٹین 2 (TRP2) کے ساتھ میلانین کی ترکیب کو فروغ دینے کے لیے کام کرتا ہے (Zhu et al.، 2015)۔ پگمنٹیشن میں شامل ایک اور اہم عنصر مائیکرو فیتھلمیا سے وابستہ ٹرانسکرپشن فیکٹر (MITF) ہے، جو نہ صرف میلانوسائٹس کے پھیلاؤ اور بقا کو کنٹرول کرتا ہے بلکہ ٹائروسینیز، TRP1، اور TRP2 اظہار کو بھی منظم کرتا ہے (Kawasaki et al.، 2008؛ Levy and Fisher) )۔ ماحولیاتی محرکات، جیسے الٹرا وائلٹ (UV) شعاع ریزی، میلانوجینیسیس میں اہم کردار ادا کرتی ہے (عبد الناصر ایٹ ال۔، 2003)۔ UV شعاعوں کے سامنے آنے پر، چالو کیراٹینوسائٹس اور میلانوسائٹس ایک میلانوسائٹ محرک ہارمون ( -MSH)، ڈائیسیلگلیسرول (DAG)، اور اینڈوتھیلین-1 (ET-1) (D'Mello et al. 2016؛ بی ہاربو اور پارک، 2012)۔ جب -melanocyte-stimulating hormone (-MSH) melanocytes میں melanocortin-1 ریسیپٹر (MC1R) سے منسلک ہوتا ہے، تو یہ سائکلک اڈینوسین مونو فاسفیٹ (cAMP) کی انٹرا سیلولر سطح کو بڑھا سکتا ہے اور پروٹین کناز A (PKA)/ (CREB) کو چالو کر سکتا ہے۔ ) راستہ، آخر کار میلانوجینیسیس کو فروغ دیتا ہے (کور ایٹ ال۔، 2004؛ ریزپکا ایٹ ال۔ Diacylglycerol (DAG) melanocytes میں پروٹین kinase C- (PKC-) کو چالو کرنے کے لیے ضروری ہے، جو ٹائروسینیز کی سرگرمی کو بڑھاتا ہے اور پگمنٹیشن (Kim et al., 2006; Kawaguchi et al., 2012; Yuan and Jin, 2018) )۔ 1-Oleoyl-2- acetyl-sn-glycerol (OAG) ایک مصنوعی، جھلی سے پارگئیبل DAG اینالاگ ہے جسے PKC- (رینبو ایٹ ال۔، 2011) کے فارماسولوجیکل ایکٹیویٹر کے طور پر بڑے پیمانے پر استعمال کیا گیا ہے۔ Endothelin-1 (ET- 1) mitogen-activated protein kinase (MAPK) پاتھ وے (Park et al., 2015; Regazzetti et al., 2015) کو چالو کرنے کے ذریعے میلانوسائٹس میں میلانوجینیسیس کو اکساتا ہے۔

میلانین بالائے بنفشی تابکاری کے نقصان دہ اثرات سے جلد کی حفاظت میں اہم کردار ادا کرتا ہے، جیسے کہ جلد کا کینسر اور عمر بڑھنے سے (Slominski et al.، 2004)۔ بہر حال، میلانین کی ضرورت سے زیادہ پیداوار اور غیر معمولی جمع جلد کی جمالیاتی پریشانیوں کا باعث بنتے ہیں، جیسے میلاسما، فریکلز اور سیاہ دھبوں (Jadotte and Schwartz, 2010)۔ کوجک ایسڈ اور اربوٹین سمیت کئی فعال سفید کرنے والے مرکبات کو پہلے ہی کاسمیٹک اضافی کے طور پر منظور کیا جا چکا ہے (Kim et al.، 2008)۔ لیکن یہ بتایا گیا ہے کہ arbutin میں سائٹوٹوکسک اثرات ہوتے ہیں اور کوجک ایسڈ کینسر کا باعث بن سکتا ہے (Singh et al.، 2016)۔ اس طرح، زیادہ موثر اور محفوظ جلد کو سفید کرنے والے ایجنٹوں کی دریافت سب سے اہم ہے۔

Mitochondrial diazepam binding inhibitor receptor (MDR) لپڈ اور سٹیرایڈ کی ترکیب کے ریگولیشن میں مرکزی کردار ادا کرتا ہے اور جلد سمیت پردیی ٹشوز میں وسیع پیمانے پر تقسیم کیا جاتا ہے (Alho et al.، 1993)۔ ہماری پچھلی تحقیقوں میں، ڈائی زیپم، ایک MDR ایگونسٹ، PKA/CREB پاتھ وے (Lv et al.، 2019) کے ذریعے پگمنٹیشن کو منظم کرتا ہے۔ مزید برآں، حالیہ نتائج نے تجویز کیا کہ MDR ایکٹیویشن نے زیبرا فش میں نئے میلانوسائٹس کی تعداد میں قدرے اضافہ کیا ہے (ایلن ایٹ ال۔، 2020)۔ diazepam کے مقابلے میں، FGIN-1-27 (N, N-Dihexyl-2-(4-fluorophenyl)indole-3- acetamide) MDR (Freeman) کے لیے نسبتاً زیادہ تعلق اور مخصوصیت کو ظاہر کرتا ہے۔ اور ینگ، 2000)۔ FGIN-1–27 نے پرو اپوپٹوٹک اور سٹیرایڈوجینک سرگرمی کا مظاہرہ کیا ہے (Lacapère and Papadopoulos, 2003)۔ حال ہی میں، یہ اطلاع دی گئی ہے کہ FGIN-1-27 نے Vivo (Lima-Maximino et al., 2018) میں اینٹی اینزائٹی اور اینٹی پینک اثرات پیدا کیے ہیں۔ تاہم، وٹرو اور ویوو میں پگمنٹیشن پر FGIN-1-27 کے اثر کی اطلاع نہیں دی گئی ہے۔

مواد اور طریقے

مواد

FGIN-1-27(N, N-Dihexyl-2-(4-fluorophenyl)indole-3-acetamide), OAG (1-Oleoyl-2-acetyl-sn -گلیسرول)، اور PKC کے خلاف اینٹی باڈیز- (1:200)، p-PKA بلی (فاسفو T197)(1:200)، PKA بلی (1:500)، p-CREB (1:200)، CREB (1:200)، p-ERK(1:200)، ERK (1:200)، p-p38 (1:200)، p38 (1:200)، p-JNK (1:200)،اور JNK (1:200) سانتا کروز بائیو ٹیکنالوجی سے حاصل کیے گئے تھے۔(CA، USA)۔ مشروم سے ٹائروسینیز، -ایم ایس ایچ، ای ٹی-1(Endothelin-1)، اور PTU(N-Phenylthiourea) حاصل کیے گئےعلاء (شنگھائی، چین) سے۔ کے خلاف اینٹی باڈیزtyrosinase (1:1,000), TRP-1(1:1,000), TRP-2 (1:1,000), MITF(1:2000)، اور -ایکٹین (1:3،000) ابکم سے حاصل کیے گئے تھے۔(کیمبرج، یوکے)۔ میسن-فونٹانا میلانین سٹیننگ سلوشنسینبیجیا بائیولوجیکل ٹیکنالوجی (نانجنگ،چین)۔ RT-qPCR کٹس تکارا بائیو میڈیکل سے خریدی گئیں۔ٹیکنالوجی (بیجنگ، چین)۔ سیل لیسس بفر اور بی سی اے پروٹینپرکھ کی کٹ بیو ٹائم بائیو ٹیکنالوجی (شنگھائی،) سے حاصل کی گئی تھی۔چین)۔

سیل کلچر

سیل وائبلٹی پرکھ

SK-MEL-2 خلیات اور HEM کی قابل عملیت کو MTT پرکھ (Zhou et al.، 2014) کے ذریعے ماپا گیا۔ SK-MEL-2 خلیات اور HEM کو بالترتیب 96-کنویں پلیٹوں میں 2×104 سیل فی کنویں کی کثافت پر چڑھایا گیا تھا۔ FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4, 8, 16 μM) SK-MEL-2 سیلز اور HEM پر 48 گھنٹے کے لیے لاگو کیا گیا تھا۔ MTT محلول (20 μL) ایک کنویں کی پلیٹ کے ہر کنویں میں مزید 4 گھنٹے کے لیے شامل کیا گیا۔ حل کو ہٹانے کے بعد، DMSO (200 μL) کو ہر ایک کنویں میں شامل کیا گیا اور مائکروپلیٹ سپیکٹرو فوٹومیٹر (بائیو ٹیک آلات) کا استعمال کرتے ہوئے 570 nm پر جاذبیت کی جانچ کی گئی۔

میلانین پرکھ

SK-MEL-2 خلیات اور HEM کو بالترتیب 6-کنویں پلیٹوں میں 5×105 سیل فی کنواں کے ارتکاز پر چڑھایا گیا تھا۔ 37 ڈگری پر 24 گھنٹے انکیوبیشن کے بعد، FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4 μM) کو SK-MEL-2 سیلز اور HEM پر لاگو کیا گیا۔ خلیات کو مزید 48 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا، PBS سے دھویا گیا، اس کے بعد 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر 20 منٹ کے لیے سیل لیسز بفر کے ساتھ لیسز کیا گیا، اور لائسیٹس کو 13،000 rpm پر 10 منٹ کے لیے 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سیل گولی میں کل میلانین 100 μL NaOH محلول (1 mol/L، 10 فیصد DMSO پر مشتمل) میں 80 ڈگری سینٹی گریڈ پر 1 H ​​(Lv et al.، 2015) میں تحلیل ہو گیا تھا۔ مائکروپلیٹ سپیکٹرو فوٹومیٹر (بائیو ٹیک آلات) کا استعمال کرتے ہوئے آپٹیکل جاذبیت کو 405 nm پر ماپا گیا۔

ٹائروسینیز ایکٹیویٹی پرکھ

سیلولر ٹائروسینیز سرگرمی کی گئی تھی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (Lv et al., 2020)۔ SK-MEL-2 خلیات کو FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4 μM) یا OAG (200 μM) کی مختلف ارتکاز کے ساتھ 12 گھنٹے یا 48 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا اور پھر لیس کیا گیا۔ سیل لیسس بفر کے ساتھ۔ سیل لائسیٹس کو 13،000 rpm پر 10 منٹ کے لیے 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر سینٹرفیوج کیا گیا تاکہ ٹائروسینیز سرگرمی پرکھ کے لیے سپرنٹنٹ حاصل کیا جا سکے۔ پروٹین کی تعداد کا تعین ایک BCA کٹ کے ذریعے بوائین سیرم البومین (BSA) کے ساتھ معیاری کے طور پر کیا گیا تھا۔ 100 μL PBS (0.1 M, pH 6.5) جس میں 30 ug پروٹین 100 μL L-DOPA (0.1 فیصد) کے ساتھ ملایا گیا اور پھر 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ 1 گھنٹے کے لیے سی۔ مائیکرو پلیٹ سپیکٹرو فوٹومیٹر (بائیو ٹیک انسٹرومینٹس) کا استعمال کرتے ہوئے آپٹیکل جذب کو 475 nm پر ماپا گیا۔

ٹائروسینیز سرگرمی پر FGIN{{0}} کا براہ راست اثر پچھلے طریقہ کے مطابق کیا گیا تھا (Tomita et al., 2010; Lv et al., 2020)۔ 100 μL PBS (0.1 M, pH 6.5) جس میں FGIN-1-27 کے مختلف ارتکاز ہیں مشروم ٹائروسینیز (10 یونٹ) اور 50 μL L-tyrosine (0.05 فیصد) کے ساتھ ملایا جاتا ہے اور پھر 37 ڈگری پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔ مائیکرو پلیٹ سپیکٹرو فوٹومیٹر (بائیو ٹیک انسٹرومینٹس) کا استعمال کرتے ہوئے آپٹیکل جذب کو 475 nm پر ماپا گیا۔

میسن – فونٹانا امونیاکل سلور سٹیننگ

میلانین پگمنٹ کا پتہ لگانے کے لیے، SK-MEL-2 سیلز کو ایک 6-کنویں پلیٹ پر چڑھایا گیا تھا جس میں 13-ملی میٹر گلاس کور سلپس 20 ملی لیٹر کلچر میڈیم (10) پر مشتمل تھا۔ فی فیٹل بووائن سیرم) ہر کنویں میں۔ انتظامیہ کے 48 گھنٹے بعد، خلیوں کو 20 منٹ کے لیے فارملین (10 فیصد نیوٹرل بفرڈ) کے ساتھ طے کیا گیا۔

خلیوں اور جلد کی سلائیڈوں کو میسن – فونٹانا امونیاکل سلور سٹیننگ طریقہ (لی ایٹ ال۔، 2013) کے مطابق داغ دیا گیا تھا۔ خلیوں اور جلد کی سلائیڈوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر 16 گھنٹے کے لئے میسن-فونٹانا میلانین سٹیننگ سلوشن کے ساتھ لگایا گیا تھا۔ پھر خلیوں اور جلد کی سلائیڈوں کو 3 بار آست پانی میں دھویا گیا اور 7 منٹ تک ہائپو محلول کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ آست پانی میں اچھی طرح دھونے کے بعد، خلیات، اور جلد کی سلائیڈوں کو 7 منٹ کے لیے غیر جانبدار سرخ داغ کے ساتھ کاؤنٹر کیا گیا۔ خلیات اور جلد کی سلائیڈز کو Nikon Ti2-U مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے دیکھا گیا۔

S-100 کے لیے امیونو ہسٹو کیمسٹری

S-100 امیونو ہسٹو کیمسٹری کا انعقاد کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (لی ایٹ ال۔، 2013)۔ سلائیڈز کو کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے 5 فیصد BSA کے ساتھ بلاک کیا گیا اور پھر اینٹی S-100 پرائمری اینٹی باڈی (ڈاکو، کارپینٹیریا، CA) میں 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر راتوں رات بلاک کرنے والے محلول میں گھلایا گیا۔ اگلے دن، سلائیڈز TBST کے ساتھ 4 بار دھوئے گئے، اور ثانوی اینٹی باڈی (ڈاکو، کارپینٹیریا، CA) کے ساتھ لگائے گئے۔ اس کے بعد، حصوں کو تیار کرنے کے لیے سلائیڈوں کا علاج امینو ایتھائل کاربازول سے کیا گیا۔ جلد کی سلائیڈز کو Nikon Ti2-U مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے دیکھا گیا۔

ریورس ٹرانسکرپشن- مقداری PCR (RT-qPCR)

RT-qPCR کا انعقاد کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (Lv et al.، 2020)۔ مختصراً، SK-MEL-2 سیل کل RNA کو TRIzol reagent کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا اور اسپیکٹرو فوٹومیٹرک طور پر مقدار درست کی گئی۔ سنگل اسٹرینڈڈ سی ڈی این اے کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق سپر اسکرپٹ II ریورس ٹرانسکرپٹیس کا استعمال کرتے ہوئے ترکیب کیا گیا تھا۔ SYBR-Green مقداری PCR تجزیہ ABI PRISM سیکوینس ڈیٹیکشن سسٹم (اپلائیڈ بایو سسٹم) اور پہلے سے تصدیق شدہ پرائمر سیٹ کے ساتھ کیا گیا۔ تمام نمونے سہ رخی میں چلائے گئے تھے۔ تھریشولڈ سائیکلوں کو ایمپلیفیکیشن وکر کے لوگارتھمک حصے میں رکھا گیا تھا، اور نتائج کو GAPDH میں معمول بنایا گیا تھا۔ دونوں نمونوں کے درمیان گنا فرق کا تعین ڈیلٹا ڈیلٹا سی کیو طریقہ سے کیا گیا تھا۔ Mitf جین کے پرائمرز کی ترتیب 5′-AGAGCAGGGCAGAGAGAGTGAGTG-3′, 5′-AACTTGATT CCAGGCTGATGATGTC-3′ ہیں۔

ویسٹرن بلاٹ تجزیہ

پروٹین کی معطلی مذکورہ طریقہ کے طور پر حاصل کی گئی تھی۔ نکالے گئے انٹرا سیلولر پروٹین (30 ug) کو SDS-PAGE (10 فیصد) کے ذریعے الگ کیا گیا اور پھر گیلے ٹرانسفر معیاری پروٹوکول کے بعد پولی وینیلائیڈین ایل فلورائیڈ (PVDF) جھلی میں منتقل کر دیا گیا۔ جھلی کو کمرے کے درجہ حرارت پر 2.5 فیصد BSA کا استعمال کرتے ہوئے 1 گھنٹے کے لیے بلاک کر دیا گیا، رات بھر 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر مناسب پرائمری اینٹی باڈیز کا سامنا کرنا پڑا، اور 4 بار TBST سے دھویا گیا۔ جھلیوں کو HRP کے لیبل والے Goat Anti-Rabbit IgG (1:1,000) یا Goat Anti-Mouse IgG (1:1,000) سے کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے بے نقاب کیا گیا اور اسے دھویا گیا۔ TBST 4 بار (Liao et al.، 2017)۔ اس کے بعد جھلیوں کو ملٹی فنکشنل کیمیلومینیسینس امیجنگ سسٹم (ٹینن 4600) کا استعمال کرتے ہوئے تصور کیا گیا۔ اینٹی ایکٹین کے ساتھ اسی دھبے سے اندرونی کنٹرول کی تحقیقات کی گئیں۔

فینوٹائپ پر مبنی تشخیص اور زیبرا فش میں میلانین مواد کا تعین

بالغ زیبرا فشوں کو درج ذیل شرائط کے ساتھ ٹینک میں رکھا گیا تھا: 28.5 ڈگری، 14/10 گھنٹہ روشنی/تاریک چکر کے ساتھ۔ ایمبریوز قدرتی اسپوننگ سے حاصل کیے گئے تھے جو صبح کے وقت روشنی کو آن کرنے سے پیدا ہوتے تھے۔ جنین کا مجموعہ 30 منٹ کے اندر مکمل ہو گیا تھا۔ فینوٹائپ پر مبنی تشخیص کی گئی تھی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا (چوئی ایٹ ال۔، 2007)۔ مختصراً، مطابقت پذیر ایمبریوز کو پپیٹ کے ذریعے جمع اور ترتیب دیا گیا تھا (3-4 ایمبریو فی کنویں میں 96-کنویں پلیٹوں میں جن میں 200 ul ایمبریو میڈیم شامل ہیں)۔ FGIN-1-27 اور PTU کو 0.1 فیصد DMSO میں تحلیل کیا گیا، پھر 35 سے 60 گھنٹے (25 گھنٹے کی نمائش) تک ایمبریو میڈیم میں شامل کیا گیا۔ زیبرا فش کے میلانوجینیسس پر اثرات سٹیریومیکروسکوپ کے تحت دیکھے گئے۔

UVB-حوصلہ افزائی ہائپر پگمنٹیشن گنی پگ ماڈل

انسٹی ٹیوٹ آف لیبارٹری اینیمل سائنس (بیجنگ، چین) سے آٹھ بھورے گنی پگ (6 ہفتے، تقریباً 300 گرام) حاصل کیے گئے تھے۔ گنی پگز کو معیاری لیبارٹری کے حالات میں درجہ حرارت پر قابو پانے والے کمرے میں انفرادی طور پر رکھا گیا تھا، جس میں 12 گھنٹے روشنی/12 گھنٹے تاریک سائیکل (9:00 AM سے 9:00 PM پر روشنی) کے ساتھ مستقل درجہ حرارت (23 ± 3 ڈگری) اور نمی (50 ± 10 فیصد)۔ ہر جانور کے پچھلے حصے کے الگ الگ علاقے (1 سینٹی میٹر قطر کا دائرہ) 500 mJ/ cm2 UVB (Sigma SH-4، شنگھائی، چین) سے دن میں ایک بار 1 ہفتے کے لیے سامنے آئے تھے (Fujimoto et al., 1988; Lee et al.، 2013)۔ پھر گاڑی (PEG400/ EtOH 7:3) اور FGIN-1-27 (1 فیصد ) ہائپر پگمنٹ والے علاقوں کو (20 ul محلول فی دائرہ) دن میں دو بار 3 ہفتوں تک دی گئی۔ پگمنٹیشن کی ڈگری سپیکٹرو فوٹومیٹر (YS3010, 3nh, Shenzhen, China) سے ماپا گیا۔ ΔL- قدر کا تعین اسپیکٹرو فوٹومیٹر کے ذریعہ ماپا جانے والی L- قدر کے مطابق کیا گیا تھا، جیسا کہ: ΔL L (ہر دن کی پیمائش پر) -L (دن 0 پر)۔ اس مطالعے کے لیے تمام جانوروں کے طریقہ کار "لیبارٹری جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کے لیے NIH گائیڈ" کے مطابق کیے گئے تھے اور چانگ زو یونیورسٹی کی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی کے ذریعے منظور کیے گئے تھے۔

شماریاتی تجزیہ

نتائج

FGIN-1-27 روکا ہوا -MSH، OAG یا ET-1-SK-MEL-2 سیلز میں میلانین کی حوصلہ افزائی

پگمنٹیشن پر FGIN-1-27 (Figure 1A) کے اثرات کی چھان بین کرنے سے پہلے، SK-MEL-2 سیل کی نشوونما پر FGIN-1-27 کے اثرات کو جانچنے کے لیے ایک سیل ویبلٹی پرکھ کی گئی۔ جیسا کہ شکل 1B میں دکھایا گیا ہے، FGIN-1-27 کا SK-MEL- 2 خلیوں کی نشوونما پر 48 گھنٹے کے بعد 1–16 μM کی خوراک کی حد میں کوئی اثر نہیں ہوا۔ میلانین مواد پرکھ میں، FGIN-1-27 نے بیسل میلانوجینیسیس کو روکا (شکل 1C)۔ -ایم ایس ایچ انٹرا سیلولر سی اے ایم پی کا ایک ایلیویٹر ہے، جو نمایاں طور پر میلانوجینیسیس (Rzepka et al.، 2016؛ Corre et al.، 2004؛ Lee et al.، 2013) کی حوصلہ افزائی کرتا ہے۔ FGIN-1-27 نے بھی روکا -MSH-حوصلہ افزائی میلانین ترکیب (شکل 1C)۔ مستقل طور پر، Masson-Fontana امونیاکل سلور سٹیننگ نے اشارہ کیا کہ FGIN-1-27 نے SK-MEL-2 سیلوں میں -MSH (Figure 1D) کے ساتھ یا اس کے بغیر میلانین کے ارتکاز میں نمایاں کمی کی۔ مزید برآں، OAG PKC کا ایک لفٹ ہے اور ET-1 MAPK پاتھ وے کا ایک ایکٹیویٹر ہے، یہ دونوں میلانین کی ترکیب کو فروغ دے سکتے ہیں (Kim et al., 2006; Park et al., 2015; Regazzetti et al., 2015)۔ جیسا کہ اعداد و شمار 1E اور 1F میں دکھایا گیا ہے، FGIN-1-27 نے OAG یا ET-1-حوصلہ افزائی میلانوجینیسیس کو بھی واضح طور پر روکا ہے۔

FGIN-1-27 دبایا ہوا ٹائروسینیز، TRP-1، TRP-2 اظہار اور سیلولر ٹائروسینیز کی سرگرمی میں کمی

میلانوجینیسیس کو تین اہم خامروں کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے: ٹائروسینیز، TRP-1، اور TRP-2 (Zhu et al.، 2015)۔ -MSH اور ET-1 نے تین اہم میلانوجینک خامروں کے اظہار کو بڑھا کر میلانین کی ترکیب کو فروغ دیا (Regazzetti et al., 2015; Lee et al., 2013)۔ یہ جاننے کے لیے کہ آیا FGIN-1-27 کے سفید ہونے کے اثرات ان پروٹین کے اظہار سے متعلق ہیں، ہم نے ٹائروسینیز، TRP-1، اور TRP{{10} کے اظہار پر FGIN-1-27 کے اثر کا مطالعہ کیا۔ }} ویسٹرن بلاٹ تجزیہ کے ذریعے۔ جیسا کہ شکل 2A میں دکھایا گیا ہے، FGIN-1-27 نے ٹائروسینیز کو دبایا، TRP-1، اور TRP-2 اظہار -MSH کے ساتھ یا اس کے بغیر۔ FGIN-1-27 نے ET-1- induced tyrosinase، TRP-1، اور TRP-2 اظہار میں اضافہ کو بھی مسلسل الٹ دیا (شکل 2B)۔ -MSH اور ET-1 کے برعکس، OAG نے سیلولر ٹائروسینیز سرگرمی کو براہ راست بڑھا کر میلانوجینیسیس کو فروغ دیا (D'Mello et al., 2016)۔ جیسا کہ اعداد و شمار 2C اور 2D میں دکھایا گیا ہے، FGIN-1-27 علاج 12 گھنٹے نے OAG کی حوصلہ افزائی سیلولر ٹائروسینیز سرگرمی میں اضافہ کو روکا اور ٹائروسینیز کے اظہار کو متاثر نہیں کیا۔ اس کے علاوہ، ٹائروسینیز کی سرگرمی پر FGIN-1-27 کے براہ راست اثرات کو جانچنے کے لیے مشروم ٹائروسینیز سرگرمی پرکھ کی گئی۔ جیسا کہ شکل 2E میں دکھایا گیا ہے، FGIN-1-27 نے مشروم ٹائروسینیز کی انزیمیٹک سرگرمیوں کو متاثر نہیں کیا۔ ان نتائج نے تجویز کیا کہ FGIN-1-27 نے ٹائروسینیز، TRP-1، اور TRP-2 کے اظہار کو دبایا، اور سیلولر ٹائروسینیز کی سرگرمی کو کم کیا، لیکن ٹائروسینیز کی انزیمیٹک سرگرمیوں پر اس کا کوئی براہ راست اثر نہیں ہوا۔

FGIN-1-27 نے MITF اظہار میں کمی کی۔

MITF ایک ماسٹر ٹرانسکرپشن عنصر ہے جو ٹائروسینیز، TRP-1، اور TRP-2 (Kawasaki et al., 2008; Levy and Fisher, 2011) کے اظہار کو اکساتا ہے۔ جیسا کہ شکل 3A میں دکھایا گیا ہے، FGIN-1-27 نے MITF ٹرانسکرپشن کو روک دیا۔ FGIN-1-27 کی موجودگی یا غیر موجودگی میں -MSH کے ساتھ SK-MEL-2 خلیوں کا علاج کرنے کے بعد ہم نے MITF کے اظہار کی پیمائش کی۔ جیسا کہ شکل 3B میں دکھایا گیا ہے، -MSH نے MITF کے اظہار کو نمایاں طور پر فروغ دیا۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ FGIN-1-27 کی موجودگی میں MITF کے اظہار میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔ FGIN-1-27 نے بھی ET-1-کی حوصلہ افزائی MITF اظہار میں اضافہ (شکل 3C) کو مسلسل دبا دیا۔ ان نتائج نے تجویز کیا کہ FGIN-1-27 MITF کے اظہار کو روکتا ہے۔

FGIN-1-27 نے PKC-، p-PKA Cat، p-CREB، p-p38، اور p-ERK کے اظہار کو کم کیا

PKA، PKC، اور MAPK melanogenesis میں اہم نقل و حمل کے راستے ہیں (D'Mello et al.، 2016)۔ دوسرا میسنجر کیمپ PKA کو چالو کر سکتا ہے، جو CREB کو فاسفوریلیٹ کرتا ہے، آخر کار MITF کے اظہار کو فروغ دیتا ہے (Corre et al., 2004; Rzepka et al., 2016)۔ PKC- -منحصر راستہ ٹائروسینیز کے ایکٹیویشن کے ذریعے میلانوجینیسیس کو منظم کرتا ہے (Kim et al., 2006; Kawaguchi et al., 2012; Yuan and Jin, 2018)۔ MAPK، بشمول p38، ایکسٹرا سیلولر سگنل ریگولیٹڈ پروٹین کناز (ERK)، اور c-jun N-terminal kinase (JNK)، کو پگمنٹیشن (Zhou et al.، 2014) کو منظم کرنے کی اطلاع ملی ہے۔ FGIN-1-27 کے ذریعے میلانوجینیسیس ریگولیشن کے مالیکیولر میکانزم کو مزید سمجھنے کے لیے، ہم نے رنگت میں شامل نقل و حمل کے راستوں کی پیمائش کی۔ جیسا کہ شکل 4 میں دکھایا گیا ہے، FGIN-1-27 نے PKC-، p-PKA cat، p-CREB، p-p38، اور p-ERK کے اظہار میں نمایاں کمی کی۔

FGIN-1-27 انسانی میلانوسائٹس میں میلانوجینیسیس کو روکتا ہے۔

melanogenesis پر FGIN-1-27 کی روک تھام کا اندازہ انسانی ایپیڈرمس میلانوسائٹس (HEM) میں کیا گیا تھا۔ جیسا کہ ضمنی شکل S1 میں دکھایا گیا ہے، FGIN-1-27 کا 48 گھنٹے کے بعد 1–16 μM کی خوراک کی حد میں HEM کی نشوونما پر کوئی اثر نہیں ہوا۔ جیسا کہ شکل 5A میں دکھایا گیا ہے، FGIN-1-27 نے HEM میں میلانوجینیسیس کو نمایاں طور پر روکا۔ مغربی بلوٹنگ تجزیہ نے تجویز کیا کہ FGIN-1-27 نے HEM (شکل 5B) میں ٹائروسینیز، TRP-1، اور TRP-2 کے اظہار کی سطح کو کم کیا ہے۔ جیسا کہ ضمنی شکل S2 میں دکھایا گیا ہے، FGIN- 1-27 علاج 12 گھنٹے HEM میں OAG-حوصلہ افزائی سیلولر ٹائروسینیز سرگرمی میں اضافے کو روکتا ہے۔ اس کے علاوہ، ہم نے FGIN-1-27 کی موجودگی یا غیر موجودگی میں -MSH کے ساتھ HEM کے علاج کے بعد MITF کے اظہار کی پیمائش کی۔ جیسا کہ شکل 5C میں دکھایا گیا ہے، FGIN-1-27 کی موجودگی میں MITF کے اظہار میں نمایاں کمی واقع ہوئی ہے۔ مزید برآں، جیسا کہ SK-MEL-2 خلیات میں، PKC-، PKA، اور MAPK کی FGIN-1-27- میں ثالثی اینٹی میلانوجینک کی شمولیت کی HEM (شکل 5D) میں بھی تصدیق ہوئی۔

مزید معلومات کے لیے: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501