سفید کرنے والی کاسمیٹکس کی مارکیٹ کا ایک بڑا پیمانہ اور وسیع ترقی کے امکانات ہیں جبکہ روایتی چینی ادویات کی سفیدی کرنے والی مصنوعات ہمیشہ تحقیق کا مرکز رہی ہیں۔ اس تحقیق میں، پلیٹی کوڈن گرینڈی فلورم (PGE) کے سفید کرنے والے ایکٹو ایکسٹریکٹ کو پہلی بار الگ تھلگ اور صاف کیا گیا تھا، اور سفید کرنے کی سرگرمی کے طریقہ کار اور PGE کی کیمیائی ساخت کو واضح کیا گیا تھا۔ اعلی کارکردگی والے مائع کرومیٹوگرافی-ماس اسپیکٹومیٹری (HPLC-MS) تجزیہ کے ذریعے کل 45 اجزاء کی شناخت کی گئی، بشمول arbutin، syringin، chlorogenic acid، glycoside E، platycodin D3، baicalin، platycodin D، luteolin۔ ڈی پی پی ایچ اور اے بی ٹی ایس فری ریڈیکلز کی طرف پی جی ای کی صفائی کی شرح بالترتیب 98.03 فیصد اور 84.30 فیصد تھی۔ ٹائروسینیز کی طرف پی جی ای کی روک تھام کی شرح 97.71 فیصد تک تھی۔ پی جی ای کے RAW264.7 میکروفیجز پر اہم سوزش کے اثرات تھے جو lipopolysaccharide (LPS) کے ذریعہ حوصلہ افزائی کرتے تھے اور A-MSH کے ذریعہ حوصلہ افزائی شدہ B16F10 خلیوں کی ٹائروسینیز اور میلانین جنریشن پر اہم روک تھام کے اثرات تھے۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ پی جی ای نے ٹائروسینیز، اینٹی آکسیڈیشن، اینٹی سوزش اثر، انزائم کی سرگرمی، اور میلانین کی پیداوار پر آکسیجن فری ریڈیکلز کے فعال ہونے کو روک کر ہم آہنگی سے سفیدی کا اثر حاصل کیا۔ قدرتی پودوں سے نکالے گئے سفید کرنے والے ایجنٹ کے طور پر، PGE میں پودوں کو سفید کرنے والے کاسمیٹکس کی تحقیق اور ترقی کی بہترین صلاحیت ہے، جو Platycodon grandiflorum وسائل کو مزید ترقی دینے اور استعمال کرنے کی بنیاد رکھتا ہے اور سبز اور نامیاتی سفیدی کاسمیٹکس کی ترقی کے لیے ایک نظریاتی بنیاد فراہم کرتا ہے۔
متعلقہ مطالعات کے مطابق،cistancheایک عام جڑی بوٹی ہے جسے "معجزہ جڑی بوٹی جو زندگی کو طول دیتی ہے" کے نام سے جانا جاتا ہے۔ اس کا بنیادی جزو ہے۔cistanoside، جس کے مختلف اثرات ہوتے ہیں جیسےاینٹی آکسیڈینٹ, aاینٹی سوزش، اور مدافعتی فنکشن کو فروغ دینا۔ cistanche اور کے درمیان میکانزمجلد کی سفیدیcistanche glycosides کے اینٹی آکسیڈینٹ اثر میں مضمر ہے۔ انسانی جلد میں میلانین ٹائروسین کے آکسیکرن کے ذریعے پیدا ہوتا ہے۔ٹائروسینیز، اور آکسیڈیشن ردعمل میں آکسیجن کی شرکت کی ضرورت ہوتی ہے، لہذا جسم میں آکسیجن فری ریڈیکلز میلانین کی پیداوار کو متاثر کرنے والا ایک اہم عنصر بن جاتے ہیں۔ Cistanche میں cistanoside ہوتا ہے، جو کہ ایک اینٹی آکسیڈنٹ ہے اور جسم میں آزاد ریڈیکلز کی پیداوار کو کم کر سکتا ہے، اس طرحمیلانین کی پیداوار کو روکتا ہے۔
مزید معلومات کے لیے:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
1. تعارف
عالمی خوبصورتی کی صنعت میں، فنکشنل کاسمیٹکس کو سفید کرنے کی متعدد قسمیں ہیں، اور مارکیٹ شیئر میں مزید توسیع کی توقع ہے۔ کاسمیٹک فارمولیشنوں کو سفید کرنے میں جلد کو سفید کرنے والے ایجنٹوں کی بڑھتی ہوئی مانگ کو پورا کرنے اور جلد کو سفید کرنے کے اثر کو حاصل کرنے کے لیے، کاسمیٹک انڈسٹری نے ہائیڈروکوئنون، سیسٹین، گلوٹاتھیون، وٹامن اے، اور گلوکوکورٹیکائیڈ سمیت متعدد کیمیائی اضافی اشیاء متعارف کروائی ہیں۔ ان مرکبات میں سفیدی کے اچھے اثرات ہوتے ہیں۔ تاہم، ان میں سے کچھ کے زہریلے ضمنی اثرات ہوتے ہیں۔ مثال کے طور پر، "روڈوڈینڈرون" صارف کی جلد میں سفید دھبوں کا سبب بنتا ہے، 1 "ہائیڈروکوئنون" میں سائٹوٹوکسک اور میوٹیجینک خصوصیات ہیں، 2 "گلوکوکورٹیکائیڈ" ہارمون پر منحصر جلد کی سوزش کا سبب بن سکتا ہے۔ ) کاسمیٹکس کی اجازت نہیں ہے۔ مصنوعات کا اثر واحد معیار نہیں ہے جس پر صارف کاسمیٹکس خریدتے وقت غور کرتا ہے۔ حالیہ برسوں میں، صحت کے حصول میں کاسمیٹک مصنوعات کی حفاظت کے مسائل کا مسلسل پھٹ رہا ہے۔ محققین نے پایا ہے کہ قدرتی جڑی بوٹیوں سے نکالے گئے فعال مادوں کو سفید کرنا کم زہریلا ہوتا ہے اور اس کے مضر اثرات بہت کم ہوتے ہیں۔ صارفین کی بڑھتی ہوئی تعداد مصنوعات کی حفاظت کو اہمیت دیتی ہے۔ مزید برآں، سبز، ماحول دوست، اور نامیاتی مصنوعات زیادہ مقبول ہو گئی ہیں، جس کی عکاسی بہت سے براہ راست فروخت کرنے والے برانڈز کے فروغ سے ہوتی ہے۔ لہذا، محفوظ اور صحت مند جلد کی دیکھ بھال کے اجزاء کی تحقیق اور دریافت جدید ترقی میں ایک رجحان بن گیا ہے۔ قدرتی پودوں سے چینی جڑی بوٹیوں کے عرق کو کاسمیٹکس میں خام مال کے طور پر استعمال کرنا دھیرے دھیرے سفیدی اور جلد کی دیکھ بھال کرنے والی مصنوعات کی ترقی میں ایک تحقیقی مرکز بن گیا ہے۔4
Platycodon grandiflorum، ایک روایتی چینی ادویاتی مواد، چین میں 2000 سالوں سے استعمال کیا جا رہا ہے۔ قدیم ترین ریکارڈ کا پتہ "شینونگ ہربل کلاسک" سے لگایا جاسکتا ہے۔ Platycodon grandiflorum میں saponins، avenues، phenolic acids، sterols، اور polysaccharides شامل ہیں۔6–8 کیمیائی اجزاء کی پیچیدگی اور تنوع ان کی حیاتیاتی سرگرمیوں کے تنوع کا تعین کرتا ہے۔ -ٹیومر، اینٹی آکسیڈیشن، امیون ریگولیشن، اور دیگر فارماسولوجیکل اثرات۔ 10,11 کوریا اور شمالی چین میں، Platycodon grandiflorum بڑے پیمانے پر کھانے اور کاسمیٹکس میں خام مال کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔ پلیٹی کوڈن گرانڈی فلوروم سے بنی کاسمیٹکس خام مال، جیسے سفید کرنے والا جوہر، سفید کرنے والا دودھ، اور سفید کرنے والا شاور جیل، کوریا، جاپان اور دیگر ایشیائی ممالک کے صارفین کی طرف سے پسند کیا جاتا ہے۔ 12 پلیٹی کوڈن گرینڈی فلورم کا عرق بین الاقوامی کاسمیٹک خام میں بھی درج ہے۔ مواد کی فہرست۔ 13 تاہم، پلیٹی کوڈن گرینڈی فلورم کے سفید کرنے کے فعال اجزاء اور عمل کا طریقہ کار ابھی تک واضح نہیں ہے، اور اس کی سفیدی کی سرگرمی پر کچھ ابتدائی مطالعہ کیے گئے ہیں۔ گونگ ایکس جے وغیرہ۔ مختلف چینی جڑی بوٹیوں کی ٹائروسینیز کی روک تھام کی سرگرمیوں کا موازنہ کیا اور پتہ چلا کہ Platycodon grandiflorum کا سب سے مضبوط روک تھام کا اثر ہے۔14 اس بنیاد پر، Xu BJ et al. پلاٹیکوڈن گرانڈیفلورم کے موثر جزو کے سفید کرنے کے اثر کا ایک ٹائروسینیز انحبیشن تجربے کے ذریعے جائزہ لیا اور پتہ چلا کہ پلاٹیکوڈن گرینڈی فلورم کا موثر جزو ممکنہ طور پر کل سیپونین مواد تھا۔ ، ہم نے پلاٹیکوڈن گرینڈی فلورم کے سفید کرنے والے ایکٹو نچوڑ کو فارماکوڈینامک ٹریکنگ کے طریقہ کار کے ذریعے تحقیقی مقصد کے طور پر استعمال کیا۔ سرگرمی اور اجزاء کا مطالعہ کرکے، ہم پلاٹیکوڈن گرینڈی فلورم کے سفید کرنے والے فعال مادوں کی ساخت کو واضح کرتے ہیں اور پلاٹیکوڈن گرینڈی فلورم کے سفید کرنے والے فعال مادوں کے سفید کرنے کے طریقہ کار کو دریافت کرتے ہیں۔ یہ مطالعہ کاسمیٹکس کو سفید کرنے کے لیے خام مال کے طور پر Platycodon grandiflorum کے بہتر استعمال کے لیے ایک نظریاتی بنیاد فراہم کرے گا۔
جلد کی سفیدی کے اثرات میں جلد میں میلانین کی پیداوار میں کمی شامل ہوتی ہے۔ میلانین جلد اور بالوں کے رنگوں کو کنٹرول کرنے کے لیے اہم روغن ہے۔ یہ ایک اعلی سالماتی مرکب ہے جو جانوروں اور پودوں میں وسیع پیمانے پر تقسیم ہوتا ہے۔ جب ضرورت سے زیادہ میلانین پیدا ہوتا ہے تو، میلانین جلد میں جمع ہو جاتا ہے، جس سے دھبے اور جھریاں بن جاتی ہیں، جو جلد کے شدید کینسر کا باعث بن سکتے ہیں۔ میلانوسائٹس ایپیڈرمل بیسل پرت میں واقع ہیں اور ٹائروسینیز کے ذریعہ کنٹرول کیے جاتے ہیں۔ ری ایکٹیو آکسیجن کی انواع ٹائروسینیز کی سرگرمی کو چالو کرتی ہیں، اور ٹائروسینیز 3،4-ڈائی ہائیڈروکسی فینیلالینین (DOPA) کو DOPA quinone پیدا کرنے کے لیے اور پھر DOPA quinone کو آٹو آکسیڈیشن اور انزائم ری ایکشن کے ذریعے میلانین پیدا کرنے کے لیے اتپریرک کرتی ہے۔ لہذا، ٹائروسینیز اور میلانوسائٹ کے پھیلاؤ کی روک تھام میلانین کی پیداوار کو نمایاں طور پر روک سکتی ہے۔17 اس کے علاوہ، اچھے اینٹی آکسیڈیٹیو اور سوزش کے اثرات جلد کے آکسیڈیشن اور سوزش کی وجہ سے ہونے والے نقصان کو کم کر سکتے ہیں، جلد کی عمر میں تاخیر کر سکتے ہیں، اور جلد کو لچکدار اور ہموار رکھ سکتے ہیں۔ ہم آہنگی سے سفیدی کا اثر ڈالیں۔18,19
لہذا، سفیدی، اینٹی آکسیڈیٹیو، اور سوزش کی خصوصیات کے ساتھ پلاٹیکوڈن گرینڈفلورم سے قدرتی فعال اقتباس تلاش کرنے کے لیے، یہ مطالعہ بنیادی طور پر پلاٹیکوڈن گرینڈی فلورم ایکسٹریکٹ (PGE) کے ٹائروسینیز انحبیشن، انٹرا سیلولر ٹائروسینیز انحبیشن، اور سیل کی روک تھام کی سرگرمی پر مرکوز تھا۔ میلانین نسل. اس مطالعے کا مقصد ٹائروسینیز کی سرگرمی اور میلانین کی پیداوار پر پی جی ای کے روکنے والے اثر کا تجزیہ کرنا اور پی جی ای کے سفید ہونے اور جلد کی دیکھ بھال کے اثر اور اس کے اینٹی آکسیڈینٹ اور سوزش کے اثرات کا جامع جائزہ لینا تھا۔ پی جی ای کی کیمیائی ساخت کی نشاندہی اور ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی (HPLC) اور مائع کرومیٹریگرافی (LC)/ماس اسپیکٹومیٹری (MS) کے ذریعے کی گئی اور PGE کے مخصوص سفید کرنے والے فعال مواد کی وضاحت کی گئی۔ نئی Platycodon grandiflorum مصنوعات تیار کرنا اور Platycodon grandiflorum صنعت کی ترقی کو فروغ دینا بہت ضروری ہے۔
2. مواد اور طریقہ
2.1 مواد
فارمک ایسڈ، میتھانول، 2،2-ڈفینائل-1-پکریل ہائیڈرزائل (DPPH)، 2،20-کیسینو-بیس (3-ایتھیل بینزوتھیازولین-6-سلفونک ایسڈ) (ABTS )، acetylacetone، NaOH، K2S2O8، اور Ehrlich reagent بیجنگ کیمیکل پلانٹ سے حاصل کیے گئے تھے۔ Platycodin D، arbutin، platycodin D3، glycoside E، syringin، chlorogenic acid، baicalin، اور luteolin حوالہ جاتی مصنوعات چائنا انسٹی ٹیوٹ آف فارماسیوٹیکل بائیولوجیکل مصنوعات کی شناخت سے حاصل کی گئیں۔ chromatographically خالص acetonitrile اور methanol JT Baker Co., USA سے حاصل کیے گئے تھے۔ Tyrosinase، L-tyrosine، sodium hyaluronate، اور hyaluronate بیجنگ سولیبو ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ سے حاصل کیے گئے تھے۔ اصل 264.7 خلیات اور B16F10 خلیے چین کے شنگھائی انسٹی ٹیوٹ آف بائیولوجیکل سائنسز کے سیل ریسورس سینٹر سے خریدے گئے تھے، اور اس میں محفوظ کیے گئے تھے۔ چانگچون یونیورسٹی آف چائنیز میڈیسن سے وابستہ میڈیکل کالج کی لیبارٹری۔ Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)، fetal bovine serum، اور antibiotics (penicillin and streptomycin) Gibco USA سے حاصل کیے گئے تھے۔ Triton X-100, a-MSH, ELISA kit (NO, IL-6, TNF-a)، اور سیل گنتی کٹ-8 (CCK-8) کٹ اس سے حاصل کی گئی تھی چانگچن بائیجن بائیوٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ خالص پانی واہاہا فوڈ کمپنی لمیٹڈ سے حاصل کیا گیا تھا۔
2.2 Platycodon grandiflorum وائٹننگ ایکٹو ایکسٹریکٹ کی تیاری
Platycodon grandiflorum Hebei Renxin Pharmaceutical Co. Ltd کی طرف سے فراہم کیا گیا تھا۔ Platycodon grandiflorum کو ٹن پاؤڈر کچل دیا گیا، گرم کیا گیا، اور 95 فیصد ایتھنول محلول کے ساتھ تین بار، ہر بار 1 گھنٹہ کے ساتھ دوبارہ استعمال کیا گیا۔ اس کے بعد، پروڈکٹ کو فلٹر کیا گیا، اور فلٹریٹ کو بازیافت کیا گیا اور تین نچوڑ سے حاصل کردہ فلٹریٹ کے ساتھ ملایا گیا۔ ریزولوشن کے لیے فلٹریٹ کو خشک کرکے ڈسٹل واٹر کے ساتھ ملایا گیا، اور پانی سے سیر شدہ n-butanol (1:1 والیوم) پانچ بار نکالا گیا۔ n-butanol پرت کو ملایا گیا، n-butanol محلول کو ہٹا دیا گیا، اور PGE حاصل کیا گیا۔ Platycodon grandiflorum سے PGE نکالنے کی شرح 8.9 فیصد تھی۔
2.3 سیل کلچر
B16F10 ماؤس میلانوما خلیات اور RAW264.7 خلیات DMEM میں 10 فیصد برانن بوائین سیرم، 100 U mL―1 پینسلن، اور 100 g mL―1 streptomycin 5 فیصد CO2 کی مرطوب ہوا میں 37 ڈگری سینٹی گریڈ پر ہوتے ہیں۔ فیوژن کی حالت میں بڑھے تھے، وہ ٹرپسن کے ذریعے ہضم ہوتے تھے اور ہر دو دن بعد خلیات گزر جاتے تھے۔ تمام تجربات تین بار کیے گئے اور دوبارہ دہرائے جانے کو یقینی بنانے کے لیے تین بار دہرایا گیا۔
2.4 سیل وابستگی پرکھ
PGE کی حفاظت کا جائزہ لینے کے لیے، B16F10 اور RAW264.7 خلیوں پر PGE کے اثرات کا تعین CCK-8 طریقہ کار کے ذریعے مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق کیا گیا تھا۔ 10}} کنویں کی پلیٹیں 5 × 103 سیلز فی کنواں اور 1 × 10⒋ سیل فی کنواں 24 گھنٹے کے لیے اور پھر PGE یا DMEM کے ساتھ 72 گھنٹے کے لیے مختلف ارتکاز پر علاج کیا جاتا ہے۔ علاج کے بعد، ہر کنویں میں 10 ملی لیٹر CCK-8 ریجنٹ شامل کیا گیا، اور سیل کو مزید 2 گھنٹے کے لیے کلچر کیا گیا۔ مائکروپلیٹ ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے 450 nm پر جاذبیت کی پیمائش کی گئی۔
2.5 اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی
پی جی ای کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کا تعین ڈی پی پی ایچ اور اے بی ٹی ایس فری ریڈیکل اسکیوینجنگ ٹیسٹوں کے ذریعے کیا گیا تھا، اور ایسکوربک ایسڈ کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔
مزید برآں، PGE محلول، ascorbic acid، اور platycodin D مختلف ارتکاز کے ساتھ ({{0}.2، 0.4، 0.6، 0.8 , 10، اور 1.2 mg mL―1) کو ایک کلوگ ٹیسٹ ٹیوب میں شامل کیا گیا۔ پھر، ہر ٹیسٹ ٹیوب میں 2 ملی لیٹر DPPH محلول شامل کیا گیا۔ ٹیوبوں کو گھمایا گیا تھا، مرکب کو ملایا گیا تھا اور اسے 30 منٹ تک ایک تاریک چیمبر میں رد عمل ظاہر کرنے کی اجازت دی گئی تھی، اور A1 جاذبیت 520 nm پر طے کی گئی تھی۔ پھر، جاذبیت کی قدر A2 کا تعین کرنے کے لیے DPPH حل کی بجائے 2 mL میتھانول کو کنٹرول گروپ کے طور پر استعمال کیا گیا۔ جاذب قدر A0 کا تعین نمونے کے حل کو 2 ملی لیٹر میتھانول سے خالی کنٹرول گروپ کے طور پر تبدیل کرکے کیا گیا تھا۔ میتھانول کے ساتھ جذب کی قدر کو 0 پر ایڈجسٹ کیا۔ ڈی پی پی ایچ ریڈیکل اسکیوینگنگ ریٹ کا حساب درج ذیل فارمولے کے مطابق کیا گیا تھا۔
ABTS پلس $ مادر شراب تیار کرنے کے لیے، 35.2 mg ABTS اور 6.139 mg پوٹاشیم پرسلفیٹ کو 10 mL کے مستقل حجم میں ملایا گیا۔ شراب کو کمرے کے درجہ حرارت پر 12-16 گھنٹے کے رد عمل کے بعد میتھانول سے پتلا کر دیا گیا یہاں تک کہ 734 nm پر محلول کی جذب کی قدر تقریباً 7 ہو گئی۔{10} × 0.2۔ پھر، 30 mL PGE محلول، ascorbic acid، اور platycodin D مختلف ارتکاز کے ساتھ (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mg mL―1) 220 mL ABTS plus c محلول کے ساتھ ایک 96- اچھی طرح سے انزائم لیبل والی پلیٹ میں ملایا گیا، اور 734 nm پر جاذبیت کو 6 منٹ تک اندھیرے میں رد عمل کے بعد ماپا گیا۔
جہاں A0 خالی نمونے کی جاذبیت ہے، اور AS اس نمونے کی جاذبیت ہے جس کی پیمائش کی جائے گی۔
2.6۔ RAW264.7 macrophages کی Lipopolysaccharide-حوصلہ افزائی اینٹی سوزش سرگرمی
1 ملی لیٹر میڈیم میں RAW264.7 میکروفیجز کو ایک 24- کنویں کی پلیٹ میں سیڈ کیا گیا تھا، جس میں 1×104 سیل فی کنواں تھے، اور راتوں رات کلچر کیا گیا تھا تاکہ خلیات دیوار سے چپک جائیں۔ مختلف ارتکاز (10, 50, 100 mg mL―1) میں لیپوپولیساکرائڈ (LPS) اور PGE نچوڑ کی نمائش کے بعد خلیوں کو 24 گھنٹے تک مہذب کیا گیا تھا۔ سیل سپرنٹنٹ میں NO، IL-6، اور TNF-a کی ارتکاز کا تعین ELISA کٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا، جیسا کہ مینوفیکچرر کی ہدایت ہے۔23
2.7۔ ٹائروسینیز کی سرگرمی
لٹریچر میں بتائے گئے طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے، فاسفیٹ بفر (25 mmol، pH=6.8) بطور سالوینٹ، L-tyrosine substrate محلول (0.5 mg mL―1)، ایک ٹائروسین انزائم محلول (50 U mL―1)، اور 240 ملی لیٹر کل ری ایکشن سسٹم کی کنویں پلیٹوں میں دیگر محلول، 120 ملی لیٹر سبسٹریٹ محلول، 40 ملی لیٹر فاسفیٹ بفر، 40 ملی لیٹر نمونہ حل، اور بلینڈر کے ساتھ۔ اس کے بعد، اوپر والے نظام میں 40 ملی لیٹر ٹائروسین انزائم محلول شامل کیا گیا۔ 20 منٹ کے لیے 37 ڈگری سینٹی گریڈ پانی کے غسل کے مستقل درجہ حرارت کا ردعمل نوٹ کیا گیا، اور جذب 475 nm.24 پر ناپا گیا۔
جہاں A نمونے کے حل کا جاذب ہے جس کی جگہ مساوی بفر محلول لے لیتا ہے، B نمونے کے محلول کا جاذب ہے، ٹائروسینیز محلول کو مساوی بفر محلول سے بدل دیا جاتا ہے، C نمونے کے محلول کا جاذب ہے، اور D جذب ہوتا ہے۔ ٹائروسینیز حل کے بجائے مساوی بفر حل (ٹیبل 1)۔
2.8۔ میلانین کی تشکیل کی روک تھام کی سرگرمی
B16F10 میلانوما خلیوں کو 1 ملی لیٹر میڈیم میں ایک 24-وییل کلچر پلیٹ میں سیڈ کیا گیا تھا، جس میں فی کنواں 1×104 سیلز تھے، اور خلیات کو دیوار سے لگا رہنے کے لیے راتوں رات کلچر کیا جاتا تھا۔ خلیوں کو 48 گھنٹے کے لیے a-melanocyte-stimulating hormone (100 nM a-MSH) کے ساتھ کلچر کیا گیا تھا اور 24، 48، اور 72 h کے لیے مختلف PGE اور arbutin ارتکاز (100, 150, 200 mg mL―1) کے ساتھ کلچر کیا گیا تھا۔
انتظامیہ کے وقت کے بعد، خلیات کو PBS (pH=7.2) سے دو بار دھویا گیا اور PBS 200 mL کے ساتھ ملایا گیا جس میں 1 فیصد Triton X-100 تھا۔ خلیوں کو منجمد اور پگھلنے کے ذریعہ لیس کیا گیا تھا۔ سسٹم کو 30 منٹ کے لیے 12 000 rpm پر سینٹرفیوج کیے جانے کے بعد، سپرنیٹنٹ کو ہٹا دیا گیا، اور 1 M NaOH جس میں 10 فیصد ڈائمتھائل سلفوکسائیڈ (300 ملی لیٹر) شامل کیا گیا، سیل گرینولز میں شامل کیا گیا۔ پھر خلیوں میں میلانین کو لیس کرنے کے لیے 2 گھنٹے کے لیے 80 ڈگری پر رد عمل ظاہر کیا۔ 25 450 nm پر جذب کا تعین کیا گیا۔
2.9 سیل ٹائروسینیز کی سرگرمی
B16F10 میلانوما سیلز کو 1 ملی لیٹر میڈیم میں ایک 24-وییل کلچر پلیٹ میں سیڈ کیا گیا، جس میں 1 × 104 سیل فی کنواں تھے، اور راتوں رات سیلز کو دیوار کے ساتھ لگا رہنے کے لیے کلچر کیا گیا۔ خلیوں کو 48 گھنٹے کے لیے میلانوسائٹ محرک ہارمون (100 nM a-MSH) کے ساتھ کلچر کیا گیا تھا اور PGE کے مختلف ارتکاز (100, 150, 200 mg mL―1) اور 24، 48، اور 72h کے لیے arbutin کے ساتھ کلچر کیا گیا تھا۔ انتظامیہ کے وقت کے بعد، خلیوں کو PBS (pH =7.2) سے دو بار دھویا گیا اور PBS 200 mL کے ساتھ ملایا گیا جس میں 1 فیصد Triton X-100 تھا۔ خلیوں کو منجمد اور پگھلنے کے ذریعہ لیس کیا گیا تھا۔ 30 منٹ کے لیے 12 000 rpm پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، سپرناٹینٹ کو ایک 96-کنویں پلیٹ میں، 100 ملی لیٹر فی کنواں، اور 100 ملی لیٹر 0.1 فیصد L-DOPA محلول کے ساتھ ملایا گیا۔ 2 گھنٹے کے لیے 37 ڈگری پر انکیوبیشن کے بعد، 475 nm پر جاذبیت کا فوری طور پر تعین کیا گیا۔
2.10 کیمیائی ساخت کا تجزیہ
2.10.1 HPLC تجزیہ۔PGE نمونے کے حل کا تجزیہ Shimadzu LC{{0}}AHT HPLC سسٹم کے ساتھ ایک ELSD6000 evaporative light scattering detector (Alltech CHROM) کے ذریعے کیا گیا تھا۔27 سیپیکس بائیو پر کرومیٹوگرافک علیحدگی کی گئی -C18 کالم (4.6×250 mm, 5 mm, Sepax Technologies, Delaware, USA سے)۔ موبائل فیز سسٹم موبائل فیز A (acetonitrile) اور موبائل فیز B (0.1 فیصد فارمک ایسڈ واٹر) پر مشتمل تھا۔ سالوینٹ گریڈینٹ ٹیبل 2 میں پیش کیا گیا ہے۔ کرومیٹوگرافک حالات درج ذیل تھے: بہاؤ کی شرح 0.8 ملی لیٹر منٹ ―1 تھی، ابتدائی بخارات سے متعلق روشنی کے بکھرنے کا پتہ لگانے (ELSD) درجہ حرارت 105×C تھا، گیس کے بہاؤ کی شرح 2.8 L منٹ― تھی۔ 1، اور انجیکشن کی مقدار 20 L تھی۔ PGE کے بیس بیچ تیار کیے گئے تھے۔
2.10.2. پی جی ای کیمیائی ساخت کا تجزیہ HPLC کے ذریعے ماس اسپیکٹرومیٹری کے ساتھ ملا کر۔Q-Orbitrap ہائی ریزولوشن LC/MS ٹیکنالوجی کا استعمال الٹیمیٹ 3000 RS کرومیٹوگرافی سسٹم پر Q Exactive ہائی ریزولوشن ماس اسپیکٹومیٹر کے ساتھ مل کر تجزیہ اور شناخت کے لیے کیا گیا تھا۔ MS.28 کے ذریعے PGE نمونے کے حل کی کیمیائی ساخت MS کی شرائط درج ذیل ہیں: آئن سورس: الیکٹرو سپرے آئنائزیشن سورس؛ اسکین موڈ: مثبت اور منفی آئن اسکیننگ سوئچ؛ پتہ لگانے کا طریقہ: مکمل ماس/dd-MS2؛ قرارداد: 70 000 (مکمل ماس)، 17 500 (dd-MS2)؛ سکیننگ رینج: 150۔{39}}–2000.0 m/z; الیکٹرو سپرے وولٹیج: 3.8 kV (مثبت)؛ کیپلیری درجہ حرارت: 300 ڈگری سینٹی گریڈ؛ تصادم گیس: اعلی پاکیزگی آرگن (طہارت $99.999 فیصد)؛ میان گیس: نائٹروجن (طہارت $99.999 فیصد، 40 ارب)؛ معاون گیس: نائٹروجن (طہارت $99.999 فیصد، 350 ڈگری)؛ ڈیٹا کے حصول کا وقت: 30.0 منٹ۔ کرومیٹوگرافک حالات: رنگین گرافک کالم: RP-C18 (150×2.1 ملی میٹر، 1.8 ملی میٹر، ویلچ)؛ بہاؤ کی شرح: 0.30 ملی لیٹر منٹ - 1؛ پانی کا مرحلہ: 0.1 فیصد فارمک ایسڈ آبی محلول؛ نامیاتی مرحلہ: 0.1 فیصد فارمک ایسڈ ایسٹونائٹرائل؛ سوئی دھونے کا مائع: میتھانول؛ کالم درجہ حرارت: 35 ڈگری سینٹی گریڈ؛ انجیکشن کا حجم: 5.00 ملی لیٹر۔ سالوینٹ گریڈینٹ ٹیبل 3 میں دکھایا گیا ہے۔
2.11۔ ڈیٹا کے اعدادوشمار
تمام تجربات کم از کم تین بار کیے گئے۔ اعداد و شمار کو اوسط قدر ± معیاری انحراف کے طور پر رپورٹ کیا گیا تھا۔ شماریاتی تجزیے SPSS 21 کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے۔{1}} اور اصل 9۔{3}}۔ متعدد موازنہوں کے لیے، اعداد و شمار کو یک طرفہ انووا (ترکی کا پوسٹ ہاک) کا نشانہ بنایا گیا اور شماریاتی اہمیت کا تعین کرنے کے لیے ٹی ٹیسٹ کا جوڑا بنایا گیا۔ p < 0.05 گروپوں کے درمیان شماریاتی لحاظ سے اہم فرق سمجھا جاتا تھا۔
3. نتائج
3.1 B16F10 خلیات اور 264.7 خلیات کی عملداری پر PGE کے اثرات
B16F10 میلانوما سیلز اور RAW264.7 میکروفیجز پر PGE کے اثرات CCK-8 طریقہ کے ذریعے معلوم کیے گئے۔ خلیوں کا 24 گھنٹے تک مختلف PGE ارتکاز کے ساتھ علاج کیا گیا اور پھر CCK-8 طریقہ استعمال کرتے ہوئے پتہ چلا۔ نتائج کو کنٹرول گروپ کے مقابلے میں بقا کے فیصد کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ 10–100 mg mL―1 کے PGE ارتکاز کے تحت (سیل کی قابل عملیت: 99.42 ±1.951–107.17 ±2.601 فیصد)، PGE نے کوئی نمائش نہیں کی۔ 264.7 خلیوں پر سائٹوٹوکسائٹی (تصویر 1)۔ تاہم، سیل کی سرگرمی میں نمایاں کمی 200 mg mL―1 کے PGE ارتکاز پر واقع ہوئی (سیل کی عملداری: 74.91 ±1.574 فیصد)۔ لہذا، 10-100 mg mL―1 کی خوراک کی حد (PGE کی نکالنے کی شرح Platycodon Grandiflorum میں 8.9 فیصد تھی۔ PGE کے 10-100 mg mL―1 کا ارتکاز Platycodon1 کے 0.11–1.12 mg mL―1 کے برابر ہے۔ گرانڈی فلورم۔ 1 ملی لیٹر دوائی پر مشتمل میڈیم فی کنواں شامل کرنا 0.11–0.12 ملی گرام پلاٹیکوڈن گرینڈ فلورم شامل کرنے کے مترادف ہے۔) کو منتخب کیا جانا چاہئے۔ یہاں، بالترتیب 10 ملی گرام mL―1، 50 mg mL―1، اور 100 mg mL―1 (پودوں کے ادویاتی مواد کا ارتکاز: 0.11 mg mL―1، 0.56 mg mL―1، 1.12 mg mL―1، بالترتیب منتخب کیا گیا تھا) کم، درمیانے اور زیادہ ارتکاز۔
B16F10 خلیات کی سرگرمی 264.7 خلیوں سے قدرے مختلف تھی۔ جب PGE کا ارتکاز 10–200 mg mL―1 تھا (سیل وابستگی: 99.03 ±1.965 فیصد –91.48 ±1.382 فیصد)، B16F10 خلیات کی سرگرمی کنٹرول گروپ سے نمایاں طور پر مختلف نہیں تھی۔ تاہم، جب ارتکاز 250 mg mL―1 تھا (خلیہ کی عملداری: 85.69 ±2.284 فیصد)، B16F10 خلیوں کی سرگرمی میں کمی آنا شروع ہو گئی، اور PGE 1000 mg mL―1 کے تحت سیل کی سرگرمی (خلیہ کی عملداری: 70.75 لہذا، خوراک کی حد 10-200 m3.337 فیصد) سب سے کم تھی۔ g mL―1 (PGE کی نکالنے کی شرح Platycodon Grandiflorum میں 8.9 فیصد تھی۔ PGE کے 100–200 mg mL―1 کا ارتکاز Platycodon Grandiflorum کے 1.12–2.24 mg mL―1 کے برابر ہے۔ دوائیوں میں 1 mL کا اضافہ کرنا میڈیم فی کنواں 1.12–2.24 ملی گرام Platycodon Grandiflorum شامل کرنے کے برابر ہے۔) کو منتخب کیا جانا چاہیے۔ یہاں، 100 ملی گرام mL―1، 150 mg mL―1، اور 200 mg mL―1 (پودوں کے دوائی مواد کا ارتکاز: 1.12 mg mL―1, 1.68 mg mL―1 2.24 mg mL―, بالترتیب ) کو بالترتیب کم، درمیانے اور زیادہ ارتکاز کے طور پر منتخب کیا گیا تھا (تصویر 2)۔
3.2 پی جی ای کی اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت
پی جی ای کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کی پیمائش کے لیے ڈی پی پی ایچ اور اے بی ٹی ایس فری ریڈیکل اسکیوینگنگ ٹیسٹ استعمال کیے گئے۔ ڈی پی پی ایچ اور اے بی ٹی ایس ریڈیکلز کی طرف پی جی ای کی صفائی کی سرگرمیوں کا تعین مختلف پی جی ای ارتکاز (0.5، 10، 1.5، 20، 2.5 ملی گرام mL― 1) کے تحت کیا گیا تھا۔ پلاٹیکوڈن ڈی اور ایسکوربک ایسڈ کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ جیسا کہ تصویر 3 میں دکھایا گیا ہے، DPPH اور ABTS فری ریڈیکلز کی طرف پی جی ای کی صفائی کی سرگرمی خوراک پر منحصر انداز میں بڑھی، مثبت کنٹرول گروپ کے نتائج کی طرح۔ جب PGE کا ارتکاز 6.25 mg mL― 1 تھا، DPPH ریڈیکل کی طرف اسکیوینگنگ سرگرمی 98 تھی۔{19}}3 ±0.60 فیصد، تقریباً ascorbic ایسڈ کی سکیوینگنگ سرگرمی جیسی ہی تھی۔ مزید برآں، PGE نے ABTS ریڈیکل (84.30 ± 0.53 فیصد) کی طرف بھی مضبوط اسکیوینگنگ سرگرمی دکھائی، جو کہ پلاٹیکوڈن ڈی کنٹرول گروپ سے زیادہ تھی۔
3.3 RAW264.7 میکروفیجز کے LPS-حوصلہ افزائی اشتعال انگیز ردعمل پر PGE میں کمی کا اثر
سیکشن 3.1 میں RAW264.7 میکروفیج سرگرمی پر PGE کے اثر کے نتائج کے مطابق، اثر کو جانچنے کے لیے بالترتیب 10، 50، اور 100 mg mL―1 کی PGE ارتکاز کو کم، درمیانی اور زیادہ خوراک کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔ LPS-حوصلہ افزائی RAW264.7 میکروفیج سوزش پر PGE کا۔ جیسا کہ تصویر 4 میں دکھایا گیا ہے، PGE خوراک پر انحصار کرتے ہوئے LPS-حوصلہ افزائی RAW264.7 میکروفیجز میں NO کی پیداوار کو کم کر دیا اور خوراک پر منحصر IL-6 اور TNF-ایک سوزشی عوامل کی سطح کو کم کر دیا۔
3.4 مشروم ٹائروسینیز کی سرگرمی پر پی جی ای کے اثرات، B16F10 میلانوسائٹس میں میلانین مواد، اور انٹرا سیلولر ٹائروسینیز سرگرمی
جیسا کہ تصویر 5 میں دکھایا گیا ہے، نچوڑ کے ارتکاز میں اضافے کے ساتھ PGE کی ٹائروسینیز انحیبیٹری سرگرمی میں نمایاں اضافہ ہوا۔ پی جی ای کا ارتکاز جتنا زیادہ ہوگا، ٹائروسینیز کی روک تھام کی سرگرمی اتنی ہی مضبوط ہوگی۔ 0.5، 10، 1.5، 2۔{8}}، 2.5، اور 3 میں PGE کی ٹائروسینیز روکی سرگرمیاں۔{12}} mg mL―1 6{ تھیں۔ {29}}.29 فیصد، 79.32 فیصد، 85.14 فیصد، 95.23 فیصد، 96.43 فیصد، اور 97.71 فیصد بالترتیب۔ تاہم، جب PGE کا ارتکاز 2.5–3 تھا۔{32}} mg mL― 1، ٹائروسینیز کی روک تھام کی سرگرمی میں نمایاں اضافہ نہیں ہوا۔ اس طرح، زیادہ ارتکاز کے ساتھ تجربات کرنے کی ضرورت نہیں تھی۔ انہی حالات میں، 3.0 mg mL‵1 PGE کی روک تھام کی شرح (پودوں کے ادویاتی مواد کا ارتکاز: 33.71 mg mL―1) arbutin (3 mg mL―1, 96.97 ±1.849 فیصد) اور اس سے زیادہ تھا۔ پلاٹیکوڈن ڈی (3 ملی گرام mL―1، 81.67 ±2.331 فیصد)۔
سیکشن 3.1 میں B16F10 میلانوسائٹس کی سرگرمی پر PGE کے اثر کے مطابق، میلانین مواد پر PGE کے اثر کو جانچنے کے لیے 100، 150، اور 200 mg mL―1 PGE کو کم، درمیانی اور زیادہ خوراک کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔ اور B16F10 melanocytes کی tyrosinase سرگرمی a-MSH کے ذریعہ حوصلہ افزائی کی۔ جیسا کہ تصویر 6 میں دکھایا گیا ہے، 100 nM a-MSH (کنٹرول گروپ) کے ذریعے متحرک B16F10 خلیوں کی ٹائروسینیز سرگرمی غیر محرک خلیوں کی نسبت نمایاں طور پر زیادہ تھی۔ PGE حراستی میں اضافے کے ساتھ، B16F10 خلیوں پر ٹائروسینیز اور میلانین کی پیداوار کی روک تھام کی سرگرمیوں میں خوراک پر منحصر انداز میں نمایاں اضافہ ہوا۔ انتظامیہ کے وقت میں اضافے کے ساتھ، B16F10 سیلز ٹائروسینیز اور میلانین کی پیداوار پر PGE کی روک تھام کی سرگرمی بتدریج بڑھ گئی۔
مزید معلومات کے لیے: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
