گوسیپیٹرن، ایک قدرتی طور پر واقع ہونے والا فلیونوئڈ، ایٹینیوٹس آئرن سے متاثرہ نیورونل اور مائٹوکونڈریا نقصان حصہ 3

براہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

4۔ مواد اور طریقے 4.1.ریایجنٹس

تمام ری ایجنٹ سگما الڈرچ کارپوریشن (سینٹ لوئس، ایم او، امریکہ) سے حاصل کیے گئے تھے۔ گوس کے اسٹاک حل ڈی ایم ایس او میں تیار کیے گئے تھے اور 1/1000 (او/او) پتلا پن پر خلیات کی ثقافتوں یا مائٹوکونڈریا کی تیاریوں میں شامل کیا گیا تھا۔

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں

4.2.پودے کا مواد

تلیپاریتی ایلاٹم (ایس ڈبلیو) سے پودوں کا مواد (پھول) (سن۔ ہسبسکس ایلیٹس ایس ڈبلیو) (مالواکی) مارچ 2020 کے دوران سینٹر فار ریسرچ اینڈ بائیولوجیکل ایویلیوایشن، انسٹی ٹیوٹ آف فارماسیوٹیکل اینڈ فوڈ سائنسز، لا لیزا، ہوانا، کیوبا کے آس پاس کے علاقوں سے جمع کیا گیا تھا۔ ان کی تصدیق یونیورسٹی آف Camagüey کے ہرباریا کے ماہرین نے کی جہاں واؤچر کے نمونے جمع کرائے گئے تھے: جی پارڈو، ایچ پی سی-12 520 (ایچ آئی پی سی)۔

سیستانچے قوت مدافعت کو بہتر بنا سکتا ہے

4.3. عرق اور نمونہ تیاری

ایتھنولٹیلاٹم کے سرخ پھولوں سے اقتباسات تیار کیے گئے تھے جیسا کہ پہلے بتایا گیا تھا [29]۔ روتوبخارات کے بعد ٹھوس کو دوبارہ کرسٹل ائزیشن کے طریقہ کار سے پاک کیا جاتا تھا[29]. الگ تھلگ مرکبات کی خصوصیت 1ڈی 'ایچ(400 میگا ہرٹز) اور 13سی (100 میگا ہرٹز) این ایم آر کے ذریعے کی گئی تھی۔ این ایم آر ڈیٹا پروسیسنگ ونڈوز (سپلیمنٹری میٹریل، فگرز ایس 1-ایس 3) کے لئے میسٹرینووا سافٹ ویئر ورژن 6.1.0-6224 کے ساتھ انجام دی گئی۔ گوس سے جمع کردہ این ایم آر ڈیٹا کا موازنہ پچھلے نتائج [56] سے کیا گیا تھا۔

4.4. یو وی/ ویس اور آئی آر اسپیکٹرواسکوپک اسٹڈیز

یو وی/ ویس سپیکٹرا 10 ملی میٹر آپٹیکل پاتھ لمبائی کے کوارٹز کیوویٹس میں پیش کیا گیا تھا اور جذب ایک یو وی ویس میں ریکارڈ کیا گیا تھاطیف فوٹو میٹرایمرشم بائیو سکی (لٹل چلفونٹ، برطانیہ) سے الٹروسپک 2100 پرو کمرے کے درجہ حرارت پر ویو اسکین سافٹ ویئر (سوئفٹ 1، 1.2) کے ساتھ ایک کمپیوٹر کے ساتھ مل کر۔ گوس اور فیرس آئن کے درمیان تعامل کی پیمائش یو وی/ ویس اسپیکٹرم میں تبدیلیوں کی نگرانی کے ذریعے کی گئی تھی۔ جاب کا طریقہ گوس اور فی (دوم) آئن کے درمیان اسٹوئیچیومیٹرک تناسب کا تعین کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ گوس اور ایف ای (ایل آئی) کے اسٹاک حل بالترتیب میتھانول اور فاسفیٹ بفر میں روزانہ تیار کیے جاتے تھے۔ آئی آر سپیکٹرا کو 4000-400 سینٹی میٹر-1 کی رینج پر جسکو ایف آئی/آئی آر-440 اسپیکٹرو میٹر پر ریکارڈ کیا گیا تھا، جس میں نمونوں کی تیاری کے لئے پوٹاشیم برومائڈ پیلٹ کا استعمال کیا گیا تھا۔

4.5. خلیات ثقافتیں

چوہاہپوکیمپسایچ ٹی-22 سیلز (اے ٹی سی سی) کو ڈی ایم ای ایم میڈیم میں کلچر کیا گیا تھا جس میں 10 فیصد ایف سی ایس، ایل گلوٹامائن (1 ایم ایم) اور پینسلین/اسٹریپٹومائیسن (1 فیصد) شامل تھے اور مرطوب 5 فیصد سی او 2 انکیوبیٹر میں 37° سی پر برقرار رکھا گیا تھا۔ خلیوں (2×104 سیل/کنویں) کو 96 کنویں کی پلیٹوں (نونک، روسکیلڈ، ڈنمارک) میں 200 μL ثقافت میڈیم میں 24 گھنٹہ 37 سی پر بیج دیا گیا تھا۔

4.6.گوس کے ساتھ سیل آکسیڈیٹیکو نقصان اور علاج کی شمولیت

گوس (0.001-100 μM) کے نیورو پروٹیکٹو ایکشن کا تجربہ ایچ ٹی-22 پر گوس یا ٹرولوکس (500 μM)، ایف ای سی ایل 2 (100μM) اور سیٹریٹ (1 ایم ایم) کے ساتھ 24 ایچ کے لئے کو انکیوبیشن کے ذریعے کیا گیا تھا۔ 24 ھ کے بعد سیل سپرناٹنٹ کو ہٹا دیا گیا اور خلیات کی قابلیت کی پیمائش [3-(4,5-میتھائلتھیازول-2-یل)-2,5-ڈفینیئل ٹیٹرازولیم برومائڈ] (ایم ٹی ٹی)کلریمیٹرک پرکھ.

4.7۔ سیل قابل عمل سنی

علاج کے بعد، خلیات (2× 104) کو 3 ایچ ایٹ 37 سی کے لئے 10 یو ایم ایم ٹی ٹی کے ساتھ انکوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد رنگین ایم ٹی ٹی ڈیریویٹو کو ڈی ایم ایس او کے 50μL میں تحلیل کر دیا گیا اور جذب کرنے کی گنتی مائیکرو پلیٹ ریڈر (فلوسٹار اومیگا، بی ایم جی لیبٹیک، اورٹنبرگ، جرمنی) پر 570 این ایم پر کی گئی۔ خلیات کی قابلیت کا اظہار غیر علاج شدہ خلیوں کے کنٹرول کے خلاف فیصد کے طور پر کیا جاتا ہے۔

4.8.مائٹوکونڈریا جھلی کی صلاحیت (△وائی)ایچ ٹی-22 خلیوں میں سنی

مائٹوکونڈریاجھلی کی صلاحیت کا جائزہ فلوریسنٹ سیکیشنک پروب روڈامین 123 [57,58] کے خلیات کو برقرار رکھنے کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔ گوس (0.001-100 μM) یا ٹرولوکس (500 μM) کی غیر موجودگی (کنٹرول) یا موجودگی میں 2 ایچ لوہے/ اسکوربیٹ چوٹ کے بعد، نیورونل خلیات (2×10*) کو 1 μM روڈامائن 123 کے ساتھ 10 منٹ میں انکوبیٹ کیا گیا۔ 0.1 فیصد ٹرائیٹن ایکس 100 کے 1 ملین ایل میں سینٹریفیوجیشن اور ری سسپنشن کے بعد، تحقیقات کے ارتکاز کا تعین 505/535 این ایم ایکسٹیشن/اخراج طول موج جوڑے پر مائیکرو پلیٹ ریڈر (فلواسٹار اومیگا، بی ایم جی ایل اے بی ٹیک، اورٹنبرگ، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے سپرناٹنٹ میں کیا گیا تھا۔ ڈیٹا کا اظہار فیصد بمقابلہ غیر علاج شدہ خلیوں کے کنٹرول کے طور پر کیا جاتا ہے۔

4.9.اے ٹی پی اسسے

سیلولر اے ٹی پی کا تعین فائر فلائی لوسیفرن/لوسیفرس اسی سسٹم [59] نے اے وائی جیسے ہی حالات میں کیا تھا۔ بائیولومینسینس کی پیمائش مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق سگما الڈرچ اسسی کٹ سے کی گئی تھی، جس میں مائیکرو پلیٹ ریڈر (فلواسٹار اومیگا، بی ایم جی لیبٹیک، اورٹنبرگ، جرمنی) کے لومینسینس آپشن کا استعمال کیا گیا تھا۔

4.10.جانور

نر وسٹار چوہے (200 گرام) لیب اوریٹوری جانوروں کی پیداوار کے مرکز سے حاصل کیے گئے تھے (اس کے ہسپانوی مخفف ہوانا، کیوبا کے مطابق سی این پی اے ایل اے بی) اور درجہ حرارت پر قابو پانے والے ماحول (22-24° سینٹی میٹر) میں تجربات سے قبل 1 ہفتے تک جانوروں کی دیکھ بھال کی سہولت میں رکھے گئے تھے، جس میں 12-گھنٹہ ہلکا/تاریک چکر تھا اور خوراک اور پانی کے اشتہار تک رسائی تھی۔

4.11.مائٹوکونڈریا تنہائی

چوہے کے پیشرو مائٹوکونڈریا کو تفریقی مرکزکاری سے الگ تھلگ کیا گیا تھا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا [60]۔ ڈیجیٹونین 10 فیصد، سائناپٹوسوم میں خلل ڈالنے اور غیر سائناپٹوسومل پلس سائناپٹوسومل مائٹوکونڈریا کا مرکب پیدا کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ یہ سارا طریقہ کار 4° سی پر انجام دیا گیا۔ سانس پر قابو پانے کا تناسب (ریاست 3/حالت 4 سانس کی شرح) ہمیشہ 4.5 سے 6.0 کی حد میں تھا، جس کی پیمائش 5 ایم ایم سکینیٹ کو سبسٹریٹ کے طور پر استعمال کرتے ہوئے کی گئی تھی۔

4.12. مسلسل نگرانی مائٹوکونڈریا کے مضامین

مائٹوکونڈریا جھلی کی صلاحیت کا تعین 10 μM سفرینین او کو 495/586 این ایم ایکسٹیشن/اخراج طول موج پر مائیکرو پلیٹ ریڈر (فلوسٹار اومیگا، بی ایم جی لیبٹیک، اورٹنبرگ، جرمنی) میں 【 58,61】 کی تحقیقات کے طور پر استعمال کرتے ہوئے اسپیکٹروفلوریمیٹری طور پر کیا گیا تھا؛ یہ مضامین 0.1 ایم ای جی ٹی اے اور 2 ایم ایم کے، ایچ پی او اے کی موجودگی میں انجام دیئے گئے۔ مائٹوکونڈریا سوجن کا تخمینہ 540 این ایم پر ظاہری جذب میں کمی سے طیف فوٹو میٹرک طور پر لگایا گیا تھا۔ مضامین کے لئے، مائٹوکونڈریا کو 30 ° سی پر 125 ایم ایم سکروز، 65 ایم ایم کے سی اور 10 ایم ایچ ای پی ایس-کوہ، پی ایچ 7.4 پر مشتمل ایک معیاری میڈیم میں 5 ایم ایم پوٹاشیم سکینیٹ (جمع 2.5 یو ایم روٹینون) کے ساتھ توانائی بخشی گئی۔

4.13.لپیڈ پیروکسیڈیشن مضامین

لپیڈ پیروکسیڈیشن کا تخمینہ مالونڈیاڈیالڈیہائیڈ (ایم ڈی اے) نسل [28,62] سے لگایا گیا تھا۔ مائٹوکونڈریا (1 ملی گرام/ایم ایل) کو 4 ایم ایم ٹیرٹ بوٹائلہائیڈروپروآکسائڈ یا 50یو ایم ایف ای (2) کے علاوہ 1 ایم ایم سوڈیم سیٹریٹ 37 °سی سی ایم ڈی اے ارتکاز کا حساب اس کے ایکسٹنکشن کوایفیشینٹ (سی =1.56×105 ایم-1.cm-1) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔

4.14۔ فی (دوم) ارتکاز کا تعین

فی (دوم) کے ارتکاز کا تعین 10 میٹر فاسفیٹ بفر پی ایچ 6.5(2 ایم ایل) میں 1,10-فینانتھرولین (5 میٹر) کے ساتھ ایک سرخ کمپلیکس کی تشکیل سے کیا گیا تھا، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا [24,28]۔

4.15.آکسیجن کی کھپت کی نگرانی

ایف ای (آئی آئی آئی) تکسیدی سے متعلق او کی کھپت کو کلارک قسم کے الیکٹروڈ (ہنسٹیک انسٹرومنٹس، پینٹنی، کنگز لین، برطانیہ) کے ساتھ 1.3 ملی لیٹر شیشے کے چیمبر میں 30° سی پر ناپا گیا۔ آکسیجن کی کھپت کی شرح (آر او سی) کا اظہار این ایم او ایل او 2/ایم ایل فی من کے طور پر کیا گیا تھا۔

4.16.2-ڈیوکسیریبوس آکسیڈیشن اسالی

ہائیڈروکسیل ("او ایچ) ریڈیکلز کی تشکیل کا تخمینہ ایم ڈی اے کو 2 ڈی آکسیربوس تنزلی کے بعد لگایا گیا تھا، جس کا حساب اس کے معدوم ہونے والے کوایفیشینٹ (ای=1.56×10° ایم-1· سینٹی میٹر) سے لگایا گیا تھا جیسا کہ پہلے بتایا گیا تھا [26,27]۔

4.17. گوس فے (دوم) کمپلیکس کا پتہ لگانا

فی (آئی آئی آئی) (فیسی ایل،0.4-1.6 μM) کو 2 ایم ایل (10 ایم ایم) فاسفیٹ بفر (پی ایچ 6.5) میں شامل کیا گیا جس میں 2 ایم ایم سیٹریٹ اور 1.6 μM گوس شامل تھے۔ 200-600 این ایم تک ایک طول موج اسکین ایک ہیتاچی 2001 اسپیکٹروفوٹو میٹر (ہیتاچی، ٹوکیو) میں 28° سینٹی سی پر کیا گیا تھا۔

4.18. شماریاتی تجزیہ

گراف پیڈ پرزم 5.0 (گراف پیڈ سافٹ ویئر، انک، سان ڈیاگو، سی اے، امریکہ) استعمال کیا گیا تھا. شماریاتی تجزیہ ایک طرفہ اے این او وی اے کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، جس کے بعد جوڑی کے لحاظ سے موازنہ کے لئے اسٹوڈنٹ نیومین-کیولس پوسٹ ہاک ٹیسٹ کیا گیا تھا۔ نتائج مع ص<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">

ضمنی مواد: مندرجہ ذیل آن لائن دستیاب ہیں۔ ڈی ایم ایس او ڈو میں گوسی پیٹرین کا فگر ایس 1:ایل ایچ-این ایم آر (400 میگا ہرٹز)سپیکٹرم، ڈی ایم ایس او ڈی میں گوسی پیٹرین کا فگر ایس 2:13 سی-این ایم آر (101 میگا ہرٹز)سپیکٹرم، فگر ایس 3: ڈی ایم ایس او ڈی جی میں گوسی پیٹرین کا ایچ ایس کیو سی اسپیکٹرم۔ جدول ایس 1:'ایچ (400 میگا ہرٹز) اور 13 سی (100 میگا ہرٹز) گوسیپیٹرین کے ڈیٹا بمقابلہ پچھلی رپورٹ.

مصنف کی شراکت:تصور، جی ایل پی-اے؛ طریقہ کار، ایم اے بی وی، آر ایف ڈی، وائی ایم پی اور جی ایل پی اے؛ توثیق، ایم اے بی وی، جے ایم پی، وائی ایم پی اور آر ایف ڈی؛ باضابطہ تجزیہ، وائی ایم پی، جے ایم پی، آر ایف اے اور جی ایل پی اے؛ تحقیقات، ایم اے بی وی، اے اے ایل، ڈی اے اے، وائی ایم پی، آر ایف ڈی اور جی ایل پی اے؛ ڈیٹا علاج، ایم اے بی وی وائی ایم-پی جے ایم پی اور آر ایف اے؛ تحریر—اصل مسودہ تیاری، ایم اے بی-وی؛ تحریر—جائزہ اور تدوین، آئی ایم پی، آر ایف اے، وائی ایم پی اور جی ایل پی اے؛ تصور، وائی ایم پی، اور جی ایل پی اے؛ نگرانی، جی ایل پی اے؛ فنڈنگ کے حصول، جی ایل پی اے تمام مصنفین نے مخطوطہ کے شائع شدہ ورژن کو پڑھا ہے اور اس پر اتفاق کیا ہے۔

فنڈنگ: اس تحقیق کی مالی معاونت وی ایل آئی آر (بیلجیم) نے کی تھی؛ گرانٹ نمبر سی یو 2018ٹیاے 457 اے 103، اور از منسٹریو ڈی سینسیا ٹیکنولوگیا وائی میڈیو ایمبینٹ (کیوبا)؛ گرانٹ نمبر پی این 223 ایل ایچ010-035. اے پی سی کو وی ایل آئی آر (بیلجیم) نے مالی امداد فراہم کی؛ گرانٹ نمبر سی یو 2018ٹی اے 457 اے 103.

ادارہ جاتی جائزہ بورڈ بیان:یہ مطالعہ ڈیکلریشن آف ہیلسنکی کے رہنما خطوط کے مطابق کیا گیا اور انسٹی ٹیوٹ آف فارماسیوٹیکل اینڈ فوڈز سائنسز، یونیورسٹی آف ہوانا، کیوبا (پروٹوکول کوڈ آئی ایف اے ایل-سی ای آئی 087-2019، اکتوبر 2019) سے ادارہ جاتی اخلاقیات کمیٹی نے اس کی منظوری دی۔

باخبر رضامندی بیان: قابل اطلاق نہیں۔ ڈیٹا دستیابی بیان: قابل اطلاق نہیں۔

اعترافات:اس کام کو جزوی طور پر ولامس انٹرونیورسیٹیئر راد (وی ایل آئی آر)-بیلجیم/منسٹریو ڈی ایڈوکاسیون سپیریئر (ایم ای ایس)-کیوبا پروجیکٹ سی یو 2018ٹیاے 457 اے 103 کی حمایت حاصل تھی، جس میں آرٹیکل پروسیسنگ فیس کا بھی احاطہ کیا گیا تھا، اور پروجیکٹ پی این 223 ایل ایچ 010-035 کی طرف سے "منسٹریو ڈی سینسیا ٹیکنولوگیا وائی میڈیو ایمبینٹ (کیوبا)، پروگراما ڈی سینسیاس بیسکاس وائی نیچرلز"۔ مفادات کے ٹکراؤ: مصنفین مفادات کے ٹکراؤ کا اعلان نہیں کرتے۔

نمونہ دستیابی: مرکبات کے نمونے متعلقہ مصنف سے دستیاب ہیں۔