LRRK2 Kinase inhibitor اعصابی خلیوں میں آکسیڈیٹیو تناؤ سے متاثرہ سیلولر سنسنی کو دوبارہ زندہ کرتا ہے حصہ 1

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

پس منظرلیوسین سے بھرپور ریپیٹ کناز 2 (LRRK2) پارکنسنز کی بیماری (PD) کے روگجنن میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ عمر بڑھنا PD کی ترقی کے لیے سب سے اہم خطرے کا عنصر ہے۔ عمر بڑھنے اور سیلولر سنسنی کے درمیان ارتباط قائم کیا گیا ہے. سیلولر سنسنی کا تعلق پروٹولائٹک پاتھ وے اور مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن کے dysregulation کے ساتھ ہے، جو کہ -synuclein ( -syn) کے مجموعے سے بھی وابستہ ہیں۔ LRRK2 kinase inhibitor GSK2578215A (GSK-KI) کی موجودگی یا غیر موجودگی میں انسانی ڈوپامینرجک نیوران نما خلیات (تفرق SH-SY5Y خلیات) کا روٹینون کے ساتھ 48 گھنٹے تک علاج کیا گیا۔ سیلولر سنسنی کے مارکر، بشمول p53، p21Wafi/Cip1(p21)، -galactosidase (-gal)، Rb فاسفوریلیشن، سنسنی سے وابستہ (SA) -gal سرگرمی، اورlysosomalسرگرمیوں کا جائزہ لیا گیا۔ ڈیش سیلز اور چوہے کے پرائمری کارٹیکل نیوران کا روٹینون کے ساتھ علاج سے 30 منٹ پہلے -syn fibrils کے ساتھ GSK-KI کی موجودگی یا غیر موجودگی میں 48 گھنٹے تک علاج کیا گیا۔ چوہوں کو روٹینون اور MLi-2 (LRRK2 kinase inhibitor) کے ساتھ ہر دو دن میں ایک بار دو ہفتوں کے لیے انٹراپریٹونی طور پر انجکشن لگایا گیا تھا۔ نتائج۔ روٹینون نے LRRK2 فاسفوریلیشن اور -gal لیولز کو p53-p21 سگنلنگ ایکسس اور نیچے ریگولیٹڈ Rb فاسفوریلیشن کو چالو کرنے کے ذریعے اپ ریگولیٹ کیا۔ مزید برآں، روٹینون نے SA-gal سرگرمی، رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کی سطح، اور LRRK2 کو اپ گریڈ کیافاسفوریلیشناور lysosome سرگرمی کو روکتا ہے. روٹینون کی حوصلہ افزائی LRRK2 اپ گریجشن نے a-syn fibrils کی کلیئرنس کو متاثر کیا۔ LRRK2 inhibitor کے ساتھ علاج روٹینون کی حوصلہ افزائی سیلولر سنسنی اور -syn جمع کو کم کرتا ہے۔ نتائج LRRK2 kinase سرگرمی کی روٹینون کی حوصلہ افزائی اپ گریجولیشن نے سیلولر سنسنی کو فروغ دیا، جس نے -syn جمع کو بڑھایا۔ تاہم، ایک LRRK2 kinase inhibitor کی انتظامیہ نے روٹینون کی حوصلہ افزائی سیلولر سنسنی کو پھر سے جوان کیا۔

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

1. تعارف

پارکنسنز کی بیماری (PD)، جو کہ سب سے زیادہ عام نیوروڈیجنریٹیو بیماری ہے، اس کی خصوصیت موٹر کنٹرول کی خرابی سے ہوتی ہے[1]۔ کئی جینیاتی اور ماحولیاتی عوامل PD[2-5] کے روگجنن میں حصہ ڈالتے ہیں۔LRRK2، PD کے لیے ایک اہم جینیاتی خطرے کا عنصر، GTPase اور kinase دونوں سرگرمیوں کو ظاہر کرتا ہے [6]۔ LRRK2 G2019S اتپریورتی، جو کناز کی بہتر سرگرمی کو ظاہر کرتا ہے، PD کی ترقی کو فروغ دیتا ہے [7]۔ G2019S اتپریورتی کو پناہ دینے والے مریضوں میں PD پیدا ہونے کا خطرہ عمر کے ساتھ بڑھتا ہے [8] کیونکہ عمر بڑھنے کا تعلق نیوروڈیجینریٹو بیماریوں کے بڑھنے سے ہوتا ہے [9]۔ اس سے پہلے، ہم نے اطلاع دی تھی کہ LRRK2 kinase سرگرمی نے سیلولر سنسنی کو فروغ دیا اور الفا-synuclein (-syn) مجموعوں کے انحطاط کو روکا [10]۔ -Syn لیوی باڈیز (LB) یا لیوی نیورائٹس کا ایک بڑا جزو ہے، جو PD کے پوسٹ مارٹم مارکر ہیں۔ -syn کی خرابی انحطاط کے نتیجے میں اس کی جمع ہوتی ہے [11]۔

سیلولر سنسنینس پروٹین کے انحطاط کی مشینری کو نقصان پہنچاتی ہے[12-14]۔ کم خوراک والے روٹینون کی نمائش، جس کے بارے میں بتایا جاتا ہے کہ PD کو آمادہ کرتا ہے، انسانی ٹریبیکولر میش ورک سیل لائن [15] میں سیلولر سنسنی کو فروغ دیتا ہے۔ مزید برآں، روٹینون نیوران میں LRRK2 کناز کی سرگرمی کو اپ گریڈ کرتا ہے [16]۔ لہذا، ہم نے قیاس کیا کہ روٹینون LRRK2 kinase کو چالو کرنے کے ذریعے سیلولر سنسنی کو فروغ دیتا ہے اور اس کے نتیجے میں -syn کی جمع کو بڑھاتا ہے۔

Cistanche قوت مدافعت کو بہتر بنا سکتا ہے۔

2. طریقے اور مواد

2.1 سیل کلچر اور علاج۔

انسانی نیوروبلاسٹوما سیل لائن (SH-SY5Y خلیات) ایک گروتھ میڈیم (Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM;10-013-CV; Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) میں 1{{ 48} فیصد فیٹل بوائین سیرم (ایف بی ایس، 35-010-سی وی، کارننگ سیلگرو)، 1 فیصد پینسلن/اسٹریپٹومائسن (P/S، 10378-016، گبکو، تھرمو فشر سائنٹیفک)، اور 1 فیصد مائکوپلاسما ہٹانے کا ریجنٹ (KOMA)) 5 فیصد CO، انکیوبیٹر (تھرمو فشر سائنٹیفک) میں 37 ڈگری پر۔ تفریق شدہ SH-SY5Y خلیات (dSH خلیات) 10μM آل ٹرانس ریٹینوک ایسڈ (R2625-100MG، سگما-الڈرچ، سینٹ لوئس، MO، USA) کے ساتھ علاج کے بعد حاصل کیے گئے تھے جو ہر دو بار ترقی کے وسط میں تیار کیے گئے تھے۔ سات دن کے لئے دن. ریٹینوائیڈ ایسڈ کے علاج کے بعد 7 ویں دن، خلیوں کو روٹینون (1 uM) اور GSK2572815A（GSK-KI; LRRK2 kinase inhibitor؛ 1μM） 48 گھنٹے کے لیے گروتھ میڈیم میں پہلے سے تیار۔ ڈائمتھائل سلفوکسائڈ (DMSO) کو روٹینون اور GSK-KI کے لیے بطور گاڑی استعمال کیا جاتا تھا۔ -syn fibrils کو پاک کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [10]۔ روٹینون- اور GSK-KI-علاج شدہ خلیوں کا علاج a-syn fibrils (70nM) سے کیا گیا تھا۔ چوہے کے بنیادی کارٹیکل نیوران کا علاج روٹینون (1μM)، GSK-KI (l μM)، اور a-syn fibril (70nM) سے 48 گھنٹے کے لیے کیا گیا۔ چوہے کے پرائمری کارٹیکل نیورونز کے علاج کے حالات ڈی ایس ایچ کے لیے ملازم تھے۔ خلیوں کو آئس کولڈ فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) سے دو بار دھویا گیا اور 1x نمونہ بفر (50mM Tris-HCl (pH6.8)، 2 فیصد سوڈیم ڈوڈیسائل سلفیٹ، 10 فیصد گلیسرول، 1 فیصد مرکاپٹوتھانول، اور 0.02 میں لیس کیا گیا۔ فیصد بروموفینول نیلا)۔

2.2.E16 چوہے کے ایمبریوز سے پرائمری کورٹیکل نیوران کی تنہائی اور ثقافت۔

حاملہ چوہوں کو CO، گیس کے ساتھ euthanized کیا گیا۔ بچہ دانی کو الگ کر دیا گیا، اور جنین کی تھیلیوں سے جنین کو برف سے سرد HBSS-/- (14175-079, Gibco, Thermo Fisher Scientific) میں رکھا گیا۔ کھوپڑی کو فورپس کا استعمال کرتے ہوئے چھیل دیا گیا تھا، اور کورٹیسز کو پورے دماغ سے الگ کر دیا گیا تھا۔ میننجز کو ہٹانے کے بعد، cortices کو 0.25 فیصد Trypsin-EDTA(25200-056, Gibco, Thermo Fisher Scientific) کے ساتھ 37 ڈگری سینٹی گریڈ پر 20 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ پانی سے غسل. اس کے بعد، cortices کو 40ug/mL DNase I (DN25، Sigma-Aldrich) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا، آہستہ سے گھمایا گیا، اور 37 ڈگری پانی کے غسل میں 5 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ زیادہ تر سپرناٹینٹ کو سکشن کے ذریعے ہٹا دیا گیا تھا، اور نمونوں کو سیرم انحیبیٹر پر مشتمل MEM(11090-08,Gibco, Thermo Fisher Scientific)، 1.5 فیصد DMEM، 5 فیصد FBS، 2.5mg/mL بوائین سیرم البومین کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ (BSA؛ A7906، Sigma-Aldrich)، اور 2.5 mg/mL trypsin inhibitor (T9253، Sigma-Aldrich)۔ سیرم روکنے والے کو ہٹا دیا گیا تھا، اور سیل گولی کو اس کے حجم کے 10 گنا بڑھنے کے وسط کے ساتھ دوبارہ معطل کردیا گیا تھا۔ گروتھ میڈیم کی ترکیب اس طرح تھی: نیورو بیسل میڈیم (21103-049، کارننگ سیلگرو، تھرمو فشر سائنٹیفک)، 2 فیصد B-27(17504044، کارننگ سیلگرو، تھرمو فشر سائنٹیفک)، اور 1x گلوٹا میکس{ {34}}(35050-061، کارننگ سیلگرو، تھرمو فشر سائنٹیفک)۔ الگ تھلگ چوہے کے پرائمری کارٹیکل نیوران سیلز (3×10 ڈگری/کنواں) کو کنویں کی پلیٹ (SPL30012, SPL Life Sciences, Pochoen, South Korea) میں سیڈ کیا گیا تھا اور 5 میں 37 ڈگری پر گروتھ میڈیم میں کلچر کیا گیا تھا۔ فیصد CO، 24 گھنٹے کے لیے انکیوبا ٹور۔ کلچر میڈیم کو 0.2mg/mL کے 5-fluoro-2'-deoxyuridine(F0503, Sigma-Aldrich) اور 96ug/mL uridine (U3750, Sigma-Aldrich) کے ساتھ بڑھایا گیا mitosis کو روکنا. دن 6 پر، خلیوں کا علاج 1uM روٹینون، 1uM GSK-KI، اور 70nM-syn fibrils کے ساتھ 48h کے لیے کیا گیا اور lx نمونہ بفر کے ساتھ کاٹا گیا۔

2.3۔ مغربی دھبہ۔

ویسٹرن بلوٹنگ کی گئی تھی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [17]۔ ویسٹرن بلوٹنگ کے لیے درج ذیل اینٹی باڈیز استعمال کی گئیں: خرگوش اینٹی LRRK2 فاسفو-S935 مونوکلونل (ab133450, Abcam, Cambridge, UK)، rabbit anti-LRRK2 فاسفو-S1292 مونوکلونل (ab203181، AbcamRnomouse)، anti-LRRK2 phospho-S1292 monoclonal N241A/34, Neu-roMab,UC Davis, CA, USA)، ماؤس اینٹی p53 مونوکلونل (انسانی p53:sc-126 کے لیے؛ ماؤس p53:sc-393031 کے لیے؛ سانتا کروز بائیو ٹیکنالوجی، ڈلاس، TX, USA), ماؤس اینٹی p21wafi/-Ccip1(p21) مونوکلونل (CM5131, ECM بایوسینس, Ver-sailles, KY, USA), ماؤس اینٹی Rb مونوکلونل (#9309S, سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی (CST), Danvers,MA , USA), anti-phosphoRb(Ser807/811)(#9308S, CST), ماؤس اینٹی- -galactosidase monoclonal (sc-377257, Santa Cruz Biotech-nology), ماؤس اینٹی p62 مونوکلونل (ab56416) ,Abcam), ماؤس اینٹی- -ایکٹین مونوکلونل (sc-47778; سانتا کروز بائیو ٹیکنالوجی), خرگوش اینٹی LC3B پولی کلونل (#2775S; CST), ماؤس اینٹی- -syn (کلون) 42)مونوکلونل (610786؛ BD بائیو سائنسز، سان ہوزے، CA، USA)،اینٹی فاسفو تھریونائن-argi-nine(#2351S, CST), anti-p53(SC-99, Santa Cruz Biotechnology), Anti-LaminB(SC-6216, Santa Cruz Biotech-nology), goat peroxidase-conjugated AffiniPure اینٹی ماؤس IgG(H plus L)(#115-035-003;Jackson Immunoresearch Labo-ratories Inc., West Grove, PA, USA)، اور بکریperoxidase-conjugatedAffiniPure اینٹی خرگوش IgG(H plus L)(#1l1-035-144؛ Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.)اینٹی باڈیز۔ نائٹروسیلوز جھلی میں مدافعتی سگنلز Luminata Crescendo Western HRP (#WBLUR0500, Merck & Co. Inc., Kenilworth, NJ, USA) کے ساتھ تیار کیے گئے تھے، اور تصاویر کو MicroChemi4.2 کیمرے (Shimadzu, Kyoto, Japan) سے لیا گیا تھا۔

2.4. Proximity Ligation Assay (PLA) اور Immunofluorescence (IF)۔

PLA کو Duolink⑨ In Situ Detection Reagents Green (DUO{{0}}RXN، Sigma-Aldrich)، DuolinkeIn Situ PLA4Probe اینٹی ماؤس مائنس اینٹی باڈی (DUO92002-100RXN، Sigma-Aldrich) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ ، اور اینٹی ریبٹ پلس اینٹی باڈی (DUO92004-100RXN، Sigma-Aldrich)، مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے۔ SH-SY5Y خلیات کو 96- اچھی طرح سے سیاہ پلیٹوں (655077, Greiner Bio-One, Krems-münster, Austria) میں تقسیم کیا گیا تھا، اور تفریق شدہ خلیوں کا علاج روٹینون اور GSK-KI سے ساتویں دن کیا گیا تھا۔ خلیات آئس کولڈ ڈلبیکو کے پی بی ایس (ڈی پی بی ایس) کے ساتھ دو بار دھویا گیا، کمرے کے درجہ حرارت (RT) پر 30 منٹ کے لیے 4 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ کے ساتھ فکس کیا گیا، اور آئس کولڈ ڈی پی بی ایس کے ساتھ تین بار دھویا گیا۔ اس کے بعد، DPBS میں تیار کردہ 0.1 فیصد Triton X-100 کا استعمال کرتے ہوئے خلیوں کو پارمیبلائز کیا گیا۔ ٹھنڈے ڈی پی بی ایس کے ساتھ تین بار دھونے کے بعد، خلیات کو 1 گھنٹہ کے لیے 37C پر مسدود کرنے والے محلول کی ایک بوند کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ مسدود کرنے والے حل کو ہٹا دیا گیا تھا، اور خلیات کو 3 گھنٹے کے لیے 37 ڈگری پر اینٹی باڈیز (50μL) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اینٹی باڈی مکسچر کٹ سے ایک اینٹی باڈی ڈیلوئنٹ پر مشتمل تھا (پی ایل اے کے لیے استعمال ہونے والی اینٹی باڈیز: ماؤس اینٹی ایل آر آر کے 2 مونو کلونل (1:20) اینٹی باڈی اور خرگوش اینٹی ایل آر آر کے 2 فاسفو-ایس 1292 مونوکلونل (1:20) اینٹی باڈی؛ اینٹی باڈی IF پرکھ کے لیے استعمال کیا جاتا ہے: chicken anti- -gal polyclonal antibody(1:400, ab9361, Abcam))۔ IF پرکھ میں، PLA درخواست کے مرحلے تک پورے عمل میں اینٹی باڈی کو شامل کیا گیا تھا۔ اس کے بعد نمونوں کو 5 منٹ کے لیے 1x واش بفر A کے ساتھ دو بار دھویا گیا۔ تحقیقاتی حل تیار کرنے کے لیے، Duolink⑧In Situ PLA· پروب اینٹی ماؤس مائنس اور اینٹی ریبٹ پلس کو اینٹی باڈی ڈیلوئنٹ (1:5) کے ساتھ ملایا گیا۔ IF پرکھ کے لیے، اینٹی{51}}گیل اینٹی باڈی کو بھی مرکب میں (1:400) شامل کیا گیا تھا۔ خلیوں کو 1 گھنٹہ کے لئے 37C پر تحقیقاتی حل کے 50μL کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد ، خلیوں کو 5 منٹ کے لئے ایل ایکس واش بفر اے کے ساتھ دو بار دھویا گیا۔ IF پرکھ کے لیے، ligase(40:1) اور anti{60}}gal antibody(400:1) ligation بفر میں ملا دیے گئے تھے۔ خلیوں کو 30 منٹ کے لئے 37 ڈگری پر ligation سلوشن (50μL) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا اور 5 منٹ کے لئے ایل ایکس واش بفر اے کے ساتھ دو بار دھویا گیا تھا۔ IF پرکھ کے لیے،پولیمریز(1:40)گوٹ اینٹی چکن IgY H plus L(Alexa Fluor② 594; ab150172) ثانوی اینٹی باڈی (1:500) کے ساتھ 37C پر 100 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ خلیوں کو 10 منٹ کے لئے 1x واش بفر B کے ساتھ دو بار دھویا گیا ، اس کے بعد 1 منٹ کے لئے 0.01x واش بفر B سے دھویا گیا۔ نیوکلئس پر داغ لگانے کے لیے، خلیوں کو 10 منٹ کے لیے RT میں DPBS میں تیار کردہ Hoechst 33342 (1:1000؛ 62249، تھرمو فشر سائنٹیفک) کے ساتھ لگایا گیا تھا۔ کنفوکل لیزر اسکیننگ مائیکروسکوپ (LSM 700، Carl Zeiss Jena, Germany) کا استعمال کرتے ہوئے کنویں کالی پلیٹوں میں موجود خلیات کی تصاویر لی گئی تھیں۔

2.5.Immunoprecipitation.

روٹینون （1 μM） اور GSK-KI（（1 uM） کے ساتھ علاج کیے جانے والے dSHcells کے پورے سیل lysates کو lysis سلوشن (PBS، 1 فیصد Triton X-100, 1x protease inhibitor cocktail، اور lx فاسفیٹیس کا استعمال کرتے ہوئے پہلے سے تیار کیا گیا تھا۔ روکنے والا کاک ٹیل)۔ لائسیٹس کو 5 منٹ کے لیے 4,000g اور 4 ڈگری پر سینٹری فیوج کیا گیا تھا، اور سپرنٹنٹ کو اینٹی p53 اینٹی باڈی (554293، BD بایوسینس) اور PierceProtein G Aga-rose (20398، تھرمو فشر سائنٹیفک) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ 12 گھنٹے کے لیے lysis محلول میں دوبارہ معطل کر دیا گیا۔ موتیوں کو دو بار لیسس سلوشن کے ساتھ دھویا گیا تھا، اور مالا-پروٹین کمپلیکس کو ایل ایکس سیمپل بفر سے ڈینیچر کیا گیا تھا۔

2.6۔ نیوکلیئر فریکشنیشن۔

مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے NE-PERr نیوکلیئر اور سائٹوپلاسمک ایکسٹریکشن ریجنٹس (78833، تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے جوہری حصے کو الگ تھلگ کیا گیا تھا۔

2.7۔ mRNA کی تیاری اور مقداری ریئل ٹائم پولیمریز چین ری ایکشن (qRT-PCR)۔

mRNA کو RNeasy Plus Mini kit (74134, QIAGEN, Hilden, Germany) کا استعمال کرتے ہوئے روٹینون/GSK-KI-علاج شدہ dSH خلیوں سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، mRNA کو TOPscript cDNA سنتھیسس کٹ (EZ005S, Enzynomics, Daejeon, Republic of Korea) کا استعمال کرتے ہوئے تکمیلی DNA (cDNA) میں الٹا نقل کیا گیا۔ ROX, UDG plus)(RT500M, Enzynomics)۔ درج ذیل پرائمر qRT-PCR کے لیے استعمال کیے گئے: انسانی p21,5'-ATG AAA TTC ACC CCC TTT CC-3'(آگے)) اور 5'-CCC ٹیگ GCT GTG CTC ACT TC-3'(الٹ)؛ انسانی p16INK4(p16),5'-CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC-3'(آگے) اور 5'-CAC GGG TCG GGT GAG AGT -3'(ریورس).qRT-PCR کو Mic qPCR سائیکلر (MIC-4,BioMolecular Systems,Upper Comera, Australia) پر انجام دیا گیا تھا۔

2.8۔ Senescence-Associated (SA)Galactosidase (-Gal) سرگرمی، رد عمل آکسیجن اسپیسز (ROS)، اور Lysosome سرگرمی کی پیمائش۔

30 منٹ کے بعد کے علاج پر، زندہ dSH خلیات 2μM GlycoGREEN-Gal (GC611، Goryo Chemical Inc.، Hokkaido, Japan)، 5uM 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA; 287810, Calbio, Dichem-Calbio-CA) کے ساتھ داغے ہوئے تھے۔ USA）, 2μM LysoSensorm Blue DND-167 (L7533, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)، اور 1 μM Hoechst 33342 SA -gal سرگرمی، ROS، ایکٹو لائزوزوم، اور نیوکلئس کی جانچ کے لیے بالترتیب خلیات تھے۔ ProLongDiamond Antifade Mountant (P36965, Invitrogen) کے ساتھ نصب کیا گیا اور کنفوکل لیزر اسکیننگ مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے تصویر کشی کی گئی۔ کنفوکل لیزر سکیننگ مائیکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے مختلف مداخلت کنٹراسٹ تصاویر حاصل کی گئیں۔ {21}}وییل سیلولر سنسنینس پرکھ کٹ(CBA-213, Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA), مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے۔

2.10۔ماؤس ہینڈلنگ اور ڈرگ ایڈمنسٹریشن۔

چوہوں کو سنبھالا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا [18] Dankook Animal Ethics Committee (Dankook IACUC,18-026).C57BL/6] 16 ہفتوں کی عمر کے نر چوہوں کو intraperitoneally روٹینون (0) کے ساتھ انجکشن لگایا گیا تھا۔ .75 mg/kg جسمانی وزن) اور MLi-2 (LRRK2 kinase inhibitor؛ 1mg/kg جسمانی وزن) دو ہفتوں کے لیے ہر دو دن میں ایک بار۔

2.11. روٹروڈ ٹیسٹ اور دماغ کے ٹشو کی تیاری۔

علاج کے بعد چودہویں دن، چوہوں کو گھومنے کے قابل سلنڈر کی شکل والی چھڑی پر رکھا گیا۔ فرش پر گرنے کے لیے درکار وقت ریکارڈ کیا گیا۔ روٹروڈ ٹیسٹ کی تفصیلات کہیں اور بیان کی گئی ہیں [18]۔ اس کے بعد، چوہوں کو euthanized کیا گیا اور ٹرانسکارڈیلی طور پر آئس کولڈ HBSS کے ساتھ پرفیوز کیا گیا جس میں Ca2 اور Mg تھا۔ مڈ برین کو مائیکرو کینچی اور چمٹی سے الگ کیا گیا تھا۔ ٹشوز کو PBS میں لیس کیا گیا تھا جس میں 1 فیصد Triton X-100, 1xXpert Protease inhibitor Cocktail Solution (P3100, GenDEPOT, Katy, TX, USA) اور lx Xpert فاسفیٹیس انحیبیٹر کاکٹیل سلوشن (P3200,GenDEPOT) شامل تھے۔ نمونوں کو پیلٹ پیسٹل کورڈ لیس موٹر (سگما-الڈرچ) کا استعمال کرتے ہوئے ہم آہنگ کیا گیا تھا۔ سپرنٹنٹ کو ویسٹرن بلوٹنگ، SA-gal ایکٹیویٹی پرکھ، اور انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) کا نشانہ بنایا گیا۔

Oligomeric -Syn کے لیے 2.12.ELISA۔

اس سے پہلے، ہم نے ایک اینٹی باڈی کا استعمال کرتے ہوئے fibrillar -syn oligomers کے تجزیہ کے لیے ایک سینڈوچ ELISA قائم کیا تھا جو -syn کے مجموعوں کی تنتی شکل کو پہچانتا ہے [17]۔ خام مڈبرین لائسیٹس کو ELISA کا نشانہ بنایا گیا، اور -syn کے مجموعوں کو -syn فائبرل معیارات کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئی۔

2.13۔ تصویر اور ڈیٹا کا تجزیہ۔

PLA اور لائیو سیل سٹیننگ کی شدت کو Zen 2012 (Carl Zeiss) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ ہدف پروٹینوں کی کثافت کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا تھا۔

شکل 1: روٹینون کی حوصلہ افزائی LRRK2 کناز ایکٹیویشن مختلف انسانی نیوروبلاسٹوما سیل لائن میں سیلولر سنسنی کو فروغ دیتی ہے۔ 1 uM روٹینون یا 1 uM GSK2578215A(GSK-K)، ایک LRRK2 kinase inhibitor کے ساتھ 48 گھنٹے تک ٹارگٹ پروٹینز (a) کے خلاف اینٹی باڈیز کا استعمال کرتے ہوئے dSH خلیوں کا مغربی بلوٹنگ تجزیہ۔ پروٹین کی کثافت کو -ایکٹین (bg).n =3.(h) کے dSH خلیات کو 48 گھنٹے کے لیے 1 uM روٹینون یا 1uM GSK-KI کے ساتھ علاج کے لیے نارمل کیا گیا تھا۔ phospho-S1292 LRRK2 اور کل IRRK2 (PIA-pS1292) اور immunofluorescence (TF) تجزیہ -galactosidase، Nuclei کو Hoechst 33342 کے ساتھ داغ دیا گیا تھا۔ PLA اور IF سٹیننگ میں استعمال ہونے والے کنٹرولوں نے پین کی درستگی کا انکشاف کیا۔ PLA-pS1292(i) اور -galactosidase (j) کی شدت کو 4'،6-diamidino-2-phenylindole.n= 4; سیلز کی تعداد= 12-17۔

ملٹی گیج (فوجیلم، ٹوکیو، جاپان)۔ تمام ڈیٹا سیٹس کا تجزیہ کیا گیا اور پرزم 8 (گراف پیڈ سافٹ ویئر، سان ڈیاگو، CA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے گراف کیا گیا۔ dSH خلیات اور چوہے کے بنیادی کارٹیکل نیورونز کا استعمال کرتے ہوئے کیے گئے تجربات سے ڈیٹا کا دو طرفہ تجزیہ استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا۔ تغیرات کا (ANOVA)، اس کے بعد بونفرونی کا پوسٹ ہاک ٹیسٹ (n=3)۔ اسی دوران،the data obtained from mouse experiments, live-cell stain-ing,and PLA in the dSH cells were analyzed using two-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test (n>3)۔ تمام اعداد و شمار کو اوسط ± معیاری غلطی کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ *p<><><><0.0001,and n.s.="not">

شکل 2: LRRK kinase inhibitor مختلف انسانی نیوروبلاسٹوما سیل لائن میں p53 کو چالو کرنے سے روکتا ہے۔ (a) مکمل سیل لائسیٹس (20 فیصد)، جو امیونوپریسیپیٹیشن (آئی پی) کے ان پٹ کے طور پر استعمال ہوتے تھے، اور جوہری حصہ جمع کیا گیا تھا۔ تجزیے سے یہ بات سامنے آئی کہ 20 فیصد ان پٹ نے شکل 1 میں مشاہدہ کیے گئے نتائج سے ملتے جلتے نتائج دکھائے۔ (b، c) آئی پی کے نمونے ناکارہ کیے گئے اور مغربی بلوٹنگ کا نشانہ بنے۔ p53 میں TXR سائٹ فاسفوریلیشن کی سطح کو کل p53 کی سطح پر معمول بنایا گیا تھا۔ n=3.(de) نیوس میں کل p53 سطحوں کا مغربی بلوٹنگ کا استعمال کرتے ہوئے جانچ پڑتال کی گئی۔ LaminB جوہری p53 کی سطح کو معمول پر لانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ n=3.(f) ٹریٹمنٹ گروپ میں p21 اور pl6 کی mRNA لیولز کو گاڑی-(dimethyl سلفوکسائیڈ-) ٹریٹڈ گروپ، n =3 کے لیے نارمل کیا گیا۔

یہ مضمون ہندوی آکسیڈیٹیو میڈیسن اینڈ سیلولر لمبییوٹی والیوم 2021، آرٹیکل ID 9969842، 16 صفحات https://doi.org/10.1155/2021/9969842 سے ماخوذ ہے