آنتوں میں رکاوٹ کے افعال کو بہتر بنانے اور معدے کے نظام کی سوزشی بیماریوں کو روکنے کے قابل انتہائی فعال پروبائیوٹک تناؤ کی وٹرو تشخیصⅡ

2. مواد اور طریقہ

2.1 سیل کلچرز

ہیومن کاکیشین بڑی آنت کے ایڈینو کارسینوما Caco{{0}} خلیات (ATCC® HTB-37™) اور ہیومن کالون اپیٹیلیل بلغم کو سیکریٹ کرنے والے HT29-MTX خلیات (Sigma Aldrich) کو پہلے الگ الگ کلچر کیا گیا تھا، دونوں کا استعمال DMEM (Gibco) میڈیم 10% فیٹل بووائن سیرم (Gibco)، 100 IU/mL پینسلن، 100 mg/mL streptomycin (Gibco) اور 2 mM glutamine (Gibco) کے ساتھ، 5% CO2 ماحول میں 37 ◦C پر۔ پھر، co-Cultures کو 12-wellTranswell® پلیٹوں میں (12 ملی میٹر پولی کاربونیٹ داخل اور 0.4 µm سوراخوں کے ساتھ) بیسولیٹرل کمپارٹمنٹ میں سیلوں کو 75:25 کے تناسب سے Caco-2:HT میں چڑھا کر ترتیب دیا گیا تھا۔ 29-MTX، اور 21 دنوں کے لیے انجام دیا گیا، ہر 2 دن بعد میڈیم تبدیل ہوتا ہے۔

قبض کو تیزی سے دور کرنے کے لیے کلک کریں۔

2.2 بیکٹیریل تناؤ

Lactobacillus strains، بشمول Limosilactobacillus fermentum بھینس کے دودھ سے الگ تھلگ [32]، Levilactobacillus brevis SP-48، Lacticaseibacillus rhamnosus IMC501، Limosilactobacillus reuteri LR92 اور I&L کی طرف سے فراہم کردہ لییکٹو بیکیلس ریوٹیری LR92 اور لییکٹیکوبیسیلس پراجیکٹ۔ BSA Farmaceutici Italia، بائیو ری ایکٹر ابال میں کاشت کیے گئے تھے۔ ابتدائی مواد کے طور پر استعمال ہونے والے پاؤڈر حاصل کرنے کے لیے عمل اور منجمد خشک کیا جاتا ہے۔ تجربے سے پہلے، پاؤڈر کو دوبارہ معطل کیا گیا اور مین، روگوسا، اور شارپ شوربے (MRS-Oxoid) میں 37 ◦C پر مائیکرو ایروفیلک حالات میں 24 گھنٹے تک اگایا گیا۔

2.3 سیل ٹریٹمنٹ

شریک مہذب خلیوں کا علاج لییکٹوباسیلس ایس پی پی کے مختلف تناؤ سے کیا گیا تھا۔ (108 CFUs/mL) 100 کے کثیر انفیکشن (MOI) پر، اکیلے یا S. Typhimurium کے 20 µg/mL of lipopolysaccharide (LPS) کے ساتھ مل کر، 24 گھنٹے کے لیے 37 ◦C پر 5% CO2 پر DMEM کے بغیر۔

2.4 ریئل ٹائم پی سی آر

پرو اور اینٹی سوزش سائٹوکائنز، HBD-2، اور TJs کے اظہار کا اندازہ کرنے کے لیے، علاج کے اختتام پر خلیوں کو جراثیم سے پاک PBS کے ساتھ تین بار دھویا گیا، اور کل RNA کو ہائی پیور RNA آئسولیشن کٹ (High Pure RNA Isolation Kit) کے ذریعے نکالا گیا۔ Roche Diagnostics)۔ کل 2{{20}}0 ng سیلولر آر این اے کو رینڈم ہیکسامر پرائمر (رینڈم ہیکسامرز، روچے) کا استعمال کرتے ہوئے تکمیلی ڈی این اے (سی ڈی این اے) میں ریورس ٹرانسکرائب کیا گیا تھا۔ مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق، 45 منٹ کے لیے 42 ◦C۔ ریئل ٹائم PCR برائے IL-6, IL-8, TNF-, IL-1, TGF-, HBD-2, Occludin, Zonulin-1, and Claudin{{ 14}} LC فاسٹ سٹارٹ DNA ماسٹر SYBR گرین کٹ (Roche Diagnostics) کے ساتھ 2 µL cDNA کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا، جو کہ 20 µL فائنل والیوم میں کل RNA کے 10 ng کے مساوی ہے، 3 mMMgCl2 اور 0.5 µM پرائمر سینس اور اینٹی سینس جدول 1)۔ ایمپلیفیکیشن کے بعد، 20 ◦C/s کے درجہ حرارت کی منتقلی کی شرح پر 15 s کے لیے 95 ◦C پر گرم کرکے، 20 ◦C/s کی درجہ حرارت کی منتقلی کی شرح کے ساتھ 15 s کے لیے 60 ◦C پر ٹھنڈا کرکے، اور پھر نمونے کو 0.1 ◦C/s سے 95 ◦C پر گرم کرنا۔ اس کے بعد لائٹ سائکلر سافٹ ویئر (Roche Diagnostics) کا استعمال کرتے ہوئے نتائج کا تجزیہ کیا گیا۔ ہر پرائمر جوڑے کا معیاری وکر سی ڈی این اے کے سیریل ڈائیوشنز کے ساتھ قائم کیا گیا تھا۔ تمام پی سی آر سہ رخی میں چلائے گئے تھے۔ خاصیتایمپلیفیکیشن پروڈکٹس کی تصدیق الیکٹروفورسس کا استعمال کرتے ہوئے 2٪ ایگروز جیل پر کی گئی تھی اور ایتھیڈیم برومائڈ سٹیننگ [6] کے ذریعہ تصور کیا گیا تھا۔

2.5 ایلیسا پرکھ

IL-6, IL-8, IL-1, TNF-, TGF-, HBD-2, Zonulin-1, Occludin, and Claudin{{7 کی موجودگی }} Caco کے سیلولر لائسیٹس میں-2/HT29-LPS کے ساتھ یا اس کے بغیر لییکٹوباسیلی کے مختلف تناؤ سے متاثر ہونے والی MTX شریک ثقافتوں کا تجزیہ انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA; Invitrogen, IL{{12} }}، IL-8، IL-1 الفا، TNF الفا، اور TGF بیٹا-1 HumanELISA Kit؛ Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Defensin 2، beta (Human)—ELISA Kit؛ Elabscience Biotechnology Inc. Human Zonulin، Human OCLN(Occludin) اور Human CLDN1(Claudin 1) ELISA Kit)۔

2.6۔ آسنجن اور حملہ آوری پرکھ

L. brevis، L. reuteri، اور L. rhamnosus کی S. Typhimurium اور EIEC کی چپکنے اور ناگوار ہونے کی صلاحیت کو کم کرنے کی صلاحیت تین مختلف تجرباتی اقسام میں چھان بین کی گئی تھی: (i) مسابقتی پرکھ، جس میں آنتوں کے اپکلا خلیے ایک ہی طرح سے بنائے گئے تھے۔ lactobacilli (108 CFUs/mL) اور S. Typhimuriumor EIEC (108 CFUs/mL) کے ساتھ 2 گھنٹے کے لیے۔ (ii) روکنا پرکھ، جس میں خلیوں کو 2 گھنٹے کے لیے لیکٹو بیکیلی (108 CFUs/mL) کے ساتھ پہلے سے انکیوبیٹ کیا گیا تھا، اور پھر S. Typhimurium یا EIEC (108 CFUs/mL) کو شامل کیا گیا تھا اور اضافی 2 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ (iii) نقل مکانی پرکھ جس میں خلیات کو S. Typhimurium یا EIEC (108 CFUs/mL) کے ساتھ 2 گھنٹے کے لیے پہلے سے انکیوبیٹ کیا گیا تھا اور پھر lactobacilli (108 CFUs/mL) کو شامل کیا گیا تھا اور مزید 2 گھنٹے کے لیے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس وقت کے اختتام پر، متاثرہ monolayers کو PBS میں بڑے پیمانے پر دھویا گیا، پھر کمرے میں 10 منٹ کے لیے PBS میں 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) کے محلول کے ساتھ لیس کیا گیا۔ اندرونی بیکٹیریا کی گنتی کے لیے درجہ حرارت۔ سیل لائسیٹس کے ایلی کوٹس کو ہیکٹون ایگر (OXOID) پر سیریلی طور پر پتلا اور چڑھایا گیا تھا اور مکمل طور پر سیل سے وابستہ بیکٹیریا (CFU/mL) کی مقدار درست کرنے کے لیے راتوں رات 37 ◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ ناگوار جانچ کے لیے، بیکٹیریا کے ساتھ انکیوبیشن کے بعد، متاثرہ monolayers کو جراثیم سے پاک پی بی ایس کے ساتھ بڑے پیمانے پر دھویا گیا اور مزید 2 گھنٹے کے لیے ڈی ایم ای ایم میڈیم میں انکیوبیٹ کیا گیا، جن میں gentamicinsulfate (250 µg ml–1) (Sigma-Aldrich کو مارنے کے لیے) پھر خلیوں کو لیس کیا گیا اور چڑھایا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے تاکہ اندرونی بیکٹیریا (CFU/mL) کی کل تعداد کا اندازہ لگایا جاسکے۔

2.7۔ شماریاتی تجزیہ

گروپوں کے درمیان نمایاں فرق کا اندازہ گراف پیڈ پرزم 8 کا استعمال کرتے ہوئے دو طرفہ ANOVA کے ذریعے کیا گیا تھا۔ اعداد و شمار کو تین آزاد تجربوں کے ذرائع ± معیاری انحراف (SD) کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔

قبض سے نجات کے لیے قدرتی جڑی بوٹیوں کی دوا

Cistanche پرجیوی پودوں کی ایک نسل ہے جس کا تعلق Orobanchaceae خاندان سے ہے۔ یہ پودے اپنی دواؤں کی خصوصیات کے لیے مشہور ہیں اور صدیوں سے روایتی چینی طب (TCM) میں استعمال ہو رہے ہیں۔ Cistanche کی نسلیں بنیادی طور پر چین، منگولیا اور وسطی ایشیا کے دیگر حصوں کے بنجر اور صحرائی علاقوں میں پائی جاتی ہیں۔ Cistanche پودوں کی خصوصیات ان کے مانسل، پیلے رنگ کے تنوں سے ہوتی ہیں اور ان کی صحت کے ممکنہ فوائد کی وجہ سے بہت زیادہ قدر کی جاتی ہے۔ TCM میں، Cistanche کے بارے میں خیال کیا جاتا ہے کہ اس میں ٹانک خصوصیات ہیں اور اسے عام طور پر گردے کی پرورش، قوتِ حیات بڑھانے، اور جنسی فعل کو سپورٹ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ یہ عمر بڑھنے، تھکاوٹ، اور مجموعی طور پر بہبود سے متعلق مسائل کو حل کرنے کے لیے بھی استعمال ہوتا ہے۔ اگرچہ Cistanche روایتی ادویات میں استعمال کی ایک طویل تاریخ ہے، اس کی افادیت اور حفاظت پر سائنسی تحقیق جاری اور محدود ہے۔ تاہم، یہ مختلف بایو ایکٹیو مرکبات پر مشتمل ہے جیسے فینی لیتھانائڈ گلائکوسائیڈز، ایریڈائڈز، لگنانس، اور پولی سیکرائڈز، جو اس کے دواؤں کے اثرات میں حصہ ڈال سکتے ہیں۔

Wecistanche کیcistanche پاؤڈر، cistanche گولیاں، cistanche کیپسول، اور دیگر مصنوعات کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا جاتا ہےصحراcistancheخام مال کے طور پر، جن میں سے سبھی قبض کو دور کرنے پر اچھا اثر ڈالتے ہیں۔ مخصوص طریقہ کار مندرجہ ذیل ہے: خیال کیا جاتا ہے کہ Cistanche کے روایتی استعمال اور اس میں موجود کچھ مرکبات کی بنیاد پر قبض سے نجات کے لیے ممکنہ فوائد ہیں۔ اگرچہ سائنسی تحقیق خاص طور پر قبض پر Cistanche کے اثر پر محدود ہے، لیکن خیال کیا جاتا ہے کہ اس میں متعدد میکانزم ہیں جو قبض کو دور کرنے کی صلاحیت میں حصہ ڈال سکتے ہیں۔ جلاب اثر:Cistancheروایتی چینی طب میں طویل عرصے سے قبض کے علاج کے طور پر استعمال ہوتا رہا ہے۔ خیال کیا جاتا ہے کہ اس کا ہلکا جلاب اثر ہے، جو آنتوں کی حرکت کو فروغ دینے اور قبض پیدا کرنے میں مدد کر سکتا ہے۔ اس اثر کو Cistanche میں پائے جانے والے مختلف مرکبات، جیسے phenylethanoid glycosides اور polysaccharides سے منسوب کیا جا سکتا ہے۔ آنتوں کو نمی کرنا: روایتی استعمال کی بنیاد پر، Cistanche کو موئسچرائزنگ خصوصیات کا حامل سمجھا جاتا ہے، خاص طور پر آنتوں کو نشانہ بنانا۔ آنتوں کی ہائیڈریشن اور پھسلن کو فروغ دینے سے ٹولز کو نرم کرنے اور آسانی سے گزرنے میں مدد مل سکتی ہے، اس طرح قبض سے نجات ملتی ہے۔ سوزش کا اثر: بعض اوقات قبض کا تعلق ہاضمہ کی نالی میں سوزش سے بھی ہو سکتا ہے۔ Cistanche میں کچھ مرکبات ہوتے ہیں، بشمول phenylethanoid glycosides اور lignans، جن کے بارے میں خیال کیا جاتا ہے کہ ان میں سوزش کی خصوصیات ہیں۔ آنتوں میں سوجن کو کم کرکے، یہ آنتوں کی حرکت کی باقاعدگی کو بہتر بنانے اور قبض کو دور کرنے میں مدد کرسکتا ہے۔