MTT پرکھ کے ساتھ Cistanche Tubulosa سے Phenylethanoid Glycosides کی مداخلت

1. تعارف

طفیلی پوداCistanche tubulosa(شرینک) آر وائٹ (Orobanchaceaeخاندان) شمالی افریقی، عرب اور ایشیائی ممالک میں وسیع پیمانے پر تقسیم کیا جاتا ہے [1]۔ سے تناC. tubulosaاورC. deserticolaروایتی چینی ادویات میں اہم ہیں، جو بڑی آنت کی جڑت کی وجہ سے نامردی، بانجھ پن، لمباگو اور قبض کے علاج کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ اس کے علاوہ، کے ethanolic نچوڑC. tubulosaچوہوں میں دماغی ہائپوکسیا کے خلاف ایک اہم حفاظتی اثر دکھایا گیا ہے [3]۔

اینڈوتھیلیل خلیات ہائپوکسک پلمونری ہائی بلڈ پریشر کے روگجنن میں ایک اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ EA.hy926 اینڈوتھیلیل سیل لائن کافی حد تک بنیادی اینڈوتھیلیل سیلز سے ملتی جلتی ہے۔ EA.hy926 endothelial خلیات پر C. tubulosa ethanolic extract کے اینٹی ہائپوکسک اثر کے مطالعہ کے دوران، ہم نے دیکھا کہ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl){{7 }},5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) پرکھ، جو عام طور پر cytotoxicity اور cytostatic سرگرمی کے مطالعے میں سیل کی قابل عملیت کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال ہوتا ہے، علاج کے بعد EA.hy926 سیل کی قابل عملیت میں اضافہ دکھا کر متضاد نتائج پیدا کرتا ہے۔

دواؤں کے ایجنٹ کے ممکنہ سائٹوٹوکسک یا سائٹو پروٹیکٹو اثرات کی نشاندہی کرنے کے لیے سیل کی قابل عملیت کا درست اندازہ ضروری ہے۔ لہذا، ہم نے تحقیق کی کہ C. tubulosa ethanolic extract میں موجود کون سے اجزاء MTT پرکھ کے ساتھ مشاہدہ کیے گئے متضاد نتائج کے لیے ذمہ دار ہو سکتے ہیں۔ ہم نے دو اہم کو الگ تھلگ کیا۔phenylethanoid glycosides (PhGs)C. tubulosa ethanolic نچوڑ سے،echinacoside (اس کے بعد کمپاؤنڈ 1) اور ایکٹیوسائیڈ (اس کے بعد کمپاؤنڈ 2). ہم نے مختلف طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے EA.hy926 سیل کی عملداری پر ان کے اثر کا تعین کیا۔ اس کے علاوہ، مزید واضح کرنے کے لیے کہ مرکبات 1 اور 2 کا کون سا متبادل متضاد نتائج کے لیے ذمہ دار ہو سکتا ہے، ہم نے EA پر ان کے aglycones، caffeic acid (اس کے بعد مرکب 3) اور 3،4-dihydroxylphenylethanol (اس کے بعد مرکب 4) کا تجربہ کیا۔ اسی طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے .hy926 سیل کی عملداری۔

Apoptosis PHGS75% ECH 30% ACT 12% روکنے کے لیے نیچرل CISTANCHE TUBULOSA

2. نتائج اور بحث

2.1 مرکبات کی شناخت

سے الگ تھلگ دو مرکبات کے ڈھانچےC. tubulosa ethanolic اقتباسجوہری مقناطیسی گونج (NMR) اور ماس اسپیکٹومیٹری (MS) کے تجزیوں سے شناخت کی گئی تھی، جیسا کہ شکل 1 میں دکھایا گیا ہے۔ کمپاؤنڈ 1 کی شناخت پہلے کی اطلاع شدہ NMR (ٹیبل 1) اور MS (m/z 785 [M−H) کے مقابلے میں ایکچیناکوسائیڈ کے طور پر کی گئی تھی۔ ]- ) ڈیٹا [4]۔ کمپاؤنڈ 2 NMR سپیکٹرا کمپاؤنڈ 1 سے بہت زیادہ ملتا جلتا تھا، سوائے ایک -D-glucopyranosyl گروپ (ٹیبل 1) کی عدم موجودگی کے۔ کمپاؤنڈ 2 (m/z 623 [M−H]− ) کی شناخت کی گئی تھی۔ایکٹیوسائیڈ[5]۔ اہم بات یہ ہے کہ دونوں مرکبات میں ایک ہی ایگلائکون ہے، جس میں کیفیک ایسڈ (مرکب 3) اور 3،4-ڈائی ہائیڈروکسائلفینیلتھانول (مرکب 4) شامل ہیں۔

2.2 سیل وائبلٹی اسیسز

MTT اور CCK{{0}} اسیس کا استعمال EA.hy926 سیل کی قابل عملیت پر مرکبات 1–4 کے اثر کا تجزیہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ MTT پرکھ سے پتہ چلتا ہے کہ 25 اور 50 μM مرکبات 1، 2، یا 3 (166.3% اور 174.1% کمپاؤنڈ 1 کے لیے 205.8% اور 224.3% مرکبات کے لیے علاج کے بعد EA.hy926 خلیوں کی عملداری میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ 2، اور 164.8% اور 189.6% مرکب 3 کے لیے، بالترتیب p <0.05) جب کنٹرول سیل (شکل 2A) کے مقابلے میں۔ مزید برآں، خلیوں کے مورفولوجیکل معائنہ نے یہ طے کیا کہ 50 μM کمپاؤنڈ 1، 2، یا 3 کے ساتھ علاج سے جامنی رنگ کے فارمازان کرسٹل کی تشکیل میں اضافہ ہوا، جو زندہ خلیوں کے تناسب کا براہ راست اشارہ ہیں (شکل 3)۔ اس کے برعکس، CCK-8 پرکھ نے تجویز کیا کہ 12.5، 25، اور 50 μM مرکب 1، 2، یا 3 (75.5%، 45.1%، اور 43.7% مرکب 1، 85.5%، 51.8%، اور 34.3% کمپاؤنڈ 2 کے لیے، اور 64.5%، 48.2%، اور 36.4% کمپاؤنڈ 3 کے لیے، p <0.05)، کنٹرول سیلز (شکل 2B) کے مقابلے؛ مرکب 4 نے MTT یا CCK-8 پرکھ میں سیل کی قابل عملیت کو متاثر نہیں کیا۔ دونوں پرکھوں کے ساتھ حاصل کردہ نتائج کے درمیان تضاد سے پتہ چلتا ہے کہ دونوں پرکھوں میں سے ایک EA.hy926 سیل کی عملداری پر مرکبات 1 اور 2 کے اثرات کو درست طریقے سے ظاہر نہیں کر سکتا۔

2.3۔ ہوچسٹ کے ذریعہ اپوپٹوسس کی تشخیص

سٹیننگ ہوچسٹ 33342 ایک سیل پارگمیبل ڈی این اے داغ ہے جو الٹرا وایلیٹ روشنی سے پرجوش ہوتا ہے اور 460 سے 490 nm پر نیلے رنگ کا فلوروسینس خارج کرتا ہے۔ اپوپٹوٹک خلیوں کا گاڑھا کروماٹین عام خلیوں کے کرومیٹن سے زیادہ چمکدار ہوتا ہے [6]۔ جبکہ کنٹرول سیلز یکساں طور پر منتشر کرومیٹن، نارمل آرگنیلز، اور برقرار سیل جھلیوں کی نمائش کرتے ہیں، 48 گھنٹے کے لیے 50 μM مرکبات 1، 2، یا 3 کے ساتھ لگائے گئے خلیات نے اپوپٹوٹک خلیوں کے مخصوص داغ کو دکھایا (شکل 4A)۔ اس کے برعکس، کمپاؤنڈ 4 کے 50 μM تک خلیوں کی نمائش نے کنٹرول ٹریٹمنٹ کے مقابلے میں اپوپٹوٹک نیوکللی کی تعداد میں اضافہ نہیں کیا۔

2.4 اپوپٹوٹک سیلز کا فلو سائٹومیٹرک تجزیہ

annexin V-FITC/PI ڈبل سٹیننگ پرکھ اپوپٹوٹک خلیوں کی شناخت فاسفیٹائڈیلسرین کے ساتھ annexin V-FITC کے اعلی وابستگی کے ذریعہ کرتا ہے، جو اپوپٹوسس سے گزرنے والے خلیوں میں بیرونی ہوتا ہے [7]۔ اس پرکھ میں، قابل عمل خلیے انکسین V یا PI سے منسلک نہیں ہوتے ہیں اور اس وجہ سے داغدار نہیں ہوتے ہیں (نچلے بائیں کواڈرینٹ)، ابتدائی اپوپٹوٹک خلیات annexin V-FITC (نچلے دائیں کواڈرینٹ) اور دیر سے اپوپٹوٹک خلیات کے پابند ہونے سے سبز رنگ کے ہوتے ہیں۔ annexin V-FITC کے فاسفیٹائڈیلسرین اور PI کو بالترتیب (اوپری دائیں کواڈرینٹ) سے necrotic خلیات کے ساتھ باندھنے سے سبز اور سرخ رنگ کے داغ ہیں۔ جیسا کہ شکل 4B میں دکھایا گیا ہے، 48 گھنٹے کے لیے 50 μM مرکبات 1، 2، یا 3 کے ساتھ لگائے گئے خلیات، اپوپٹوٹک سیلز کا فیصد بالترتیب 3.74٪ (کنٹرول سیل) سے بڑھ کر 10.32٪، 12.95٪، اور 11.30٪ ہو گیا۔ کنٹرول خلیوں کے مقابلے میں، کمپاؤنڈ 4 نے اپوپٹوٹک EA.hy926 خلیوں کی فیصد میں اضافہ نہیں کیا۔

CCK-8 پرکھ کے ساتھ اور Hoechst 33342 سٹیننگ کے ذریعے حاصل کردہ نتائج سے ہم آہنگ، فلو سائٹومیٹری پرکھ نے ظاہر کیا کہ EA.hy926 خلیوں میں مرکبات 1، 2، اور 3 حوصلہ افزائی شدہ اپوپٹوس۔ مجموعی طور پر، یہ مشاہدات بتاتے ہیں کہ مرکبات 1–3 کے ساتھ علاج کے بعد MTT پرکھ کے ساتھ مشاہدہ کیا گیا EA.hy926 سیل کی عملداری میں اضافہ غلط مثبت نتیجہ کی نمائندگی کرتا ہے۔

PHGS75% ECH 30% AC قوت مدافعت بڑھانے کے لیے قدرتی CISTANCHE TUBULOSAT 12%

2.5 بحث

1983 میں، Mosmann نے سیل کے پھیلاؤ اور cytotoxicity [8] کی پیمائش کے لیے رنگین میٹرک MTT مائکروپلیٹ پرکھ تیار کی۔ یہ سادہ پرکھ، اور اس میں کی گئی تبدیلیاں، اب پوری دنیا میں سیل بائیولوجی لیبارٹریوں میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتی ہیں۔ ممالیہ کے خلیوں میں فرکشنیشن اسٹڈیز نے اشارہ کیا کہ کم ہوا پائریڈائن نیوکلیوٹائڈ کوفیکٹر، NADH، زیادہ تر MTT کی کمی کے لیے ذمہ دار ہے۔ پورے خلیات کا استعمال کرتے ہوئے مطالعہ کی طرف سے اس کی حمایت کی گئی تھی [9]. اس لیے ایم ٹی ٹی کی کمی کا تعلق میٹابولک طور پر فعال خلیات سے ہے اور یہ نہ صرف مائٹوکونڈریل سانس کے ساتھ جوڑا جاتا ہے بلکہ سائٹوپلازم اور نان مائٹوکونڈریل جھلیوں کے ساتھ بھی شامل ہے جس میں اینڈوسوم/لائسوسوم کمپارٹمنٹ اور پلازما میمبرین شامل ہیں [10]۔ ایم ٹی ٹی مالیکیول پر خالص مثبت چارج پلازما جھلی کی صلاحیت کے ذریعے سیلولر اپٹیک کا بنیادی عنصر ہے۔

خاص طور پر، ایم ٹی ٹی پرکھ کبھی کبھار درست طور پر اس حقیقی اثر کی عکاسی نہیں کر سکتی ہے جو ایک ٹیسٹ شدہ مرکب مخصوص خلیوں پر ہوتا ہے۔ تاہم، کیمیاوی ڈھانچے یا گروہ جو MTT پرکھ میں متضاد نتائج کا سبب بن سکتے ہیں ان کی شناخت نہیں کی گئی ہے۔ حالیہ مطالعات نے ثابت کیا ہے کہ MTT پرکھ (−)-epigallocatechin-3-gallate کے antiproliferative اثر کو کم کر سکتا ہے، جو کہ سبز چائے میں سب سے زیادہ پایا جانے والا پولی فینول ہے [11]۔ ٹیومر کیمو حساسیت کا پتہ لگانے کے لیے ایم ٹی ٹی پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے مطالعہ میں، کینسر مخالف کیموتھراپیٹک ایجنٹس، جیسے ایپیروبیسن، پیلیٹیکسیل، ڈوسیٹیکسیل، اور امیٹینیب میسیلیٹ (گلیویک) نے سیل کی قابل عملیت میں اضافہ ظاہر کیا [12,13]۔ مزید برآں، متعدد مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ بعض پودوں کے عرق اور ریڈوکس ایکٹیو پولیفینول ایم ٹی ٹی پرکھ میں مداخلت کر سکتے ہیں کیونکہ وہ خلیوں کی غیر موجودگی میں ایم ٹی ٹی ٹیٹرازولیم نمک کو براہ راست کم کرتے ہیں [14]۔

مائکروپلیٹ ریڈر میں سپیکٹرو فوٹومیٹرک تجزیہ سے پہلے ایم ٹی ٹی فارمازان کرسٹل کو حل کرنے کی ضرورت اور رد عمل کی موروثی اختتامی نوعیت ایم ٹی ٹی پرکھ کے استعمال کو بعض ایپلی کیشنز تک محدود کرتی ہے۔ اس کی وجہ سے ٹیٹرازولیم اینالاگس کی ترقی ہوئی جس میں فینائل موئیٹیز کو منفی چارج شدہ سلفونیٹ گروپس سے سجایا گیا تھا، جیسے کہ 2،3-bis-(2-میتھوکسی-4-نائٹرو- 5- سلفوفینائل)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), ایک منفی چارج شدہ اندرونی نمک [15] اور 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)، ایک کمزور تیزابیت والا اندرونی نمک MTT سے گہرا تعلق ہے [16] . ان ترامیم کے نتیجے میں ثقافتی درمیانے گھلنشیل فارمازان مصنوعات کی پیداوار ہوئی جس نے مقدار سے پہلے حل پذیری کے مرحلے کی ضرورت کو ختم کردیا۔ اسی طرح، جیسا کہ ان مالیکیولز پر بڑھے ہوئے منفی چارج نے خلیے کی جھلیوں میں حرکت کرنے کی ان کی صلاحیت کو کم کر دیا [17]، انٹرمیڈیٹ الیکٹران قبول کرنے والے (IEA)، جیسے کہ 1-میتھوکسی-5-میتھائل فینازائن میتھائل سلفیٹ ({{25) }}میتھوکسی پی ایم ایس) ٹیٹرازول ڈائی میں کمی کو آسان بنانے یا کمی کی شرح کو بڑھانے کے لیے درکار تھے۔

ابھی حال ہی میں، پانی میں حل پذیر ٹیٹرازولیم نمکیات کی ایک نئی نسل تیار کی گئی ہے جس کا WST-1 پروٹو ٹائپ ہے [18]۔ WST-1، ایک منفی چارج شدہ ڈسلفونیٹڈ اندرونی نمک جس میں آئوڈین کی باقیات ہوتی ہیں، 1-میتھوکسی PMS کی موجودگی میں XTT اور MTS سے زیادہ مستحکم ہے، یہ لازمی IEA ہے۔ اس کی وجہ سے WST-1/1-میتھوکسی PMS کی ایک آسان سنگل ریجنٹ سیل پھیلاؤ کٹ کے طور پر مارکیٹنگ ہوئی۔ WST سیریز میں کئی دوسرے ٹیٹرازولیم نمکیات تیار کیے گئے ہیں، جن میں سے سب سے زیادہ مفید شاید WST-8 [19]۔ ایسا لگتا ہے کہ WST-8 میں سیلولر کمی کی خصوصیات WST-1 سے بہت ملتی جلتی ہیں اور اسے آزادانہ طور پر CCK-8 پرکھ کے طور پر مارکیٹ کیا جا رہا ہے۔ WST-8 خلیہ ناقابل تسخیر ہے اور اس وجہ سے خلوی طور پر کم ہوتا ہے، انٹرا سیلولر NADH سے WST-8 تک الیکٹران کی نقل و حمل کے ذریعے پلازما میمبرین میں 1-میتھوکسی PMS کے ذریعے ثالثی کی جاتی ہے۔ اگرچہ MTT اور WST-8/1-میتھوکسی PMS میں کمی انٹرا سیلولر NADH سے ہوتی ہے، NADH کا ماخذ ان دو طریقوں میں مختلف دکھائی دیتا ہے۔ WST-8/1-میتھوکسی پی ایم ایس کی کمی میلے/ایسپارٹیٹ شٹل پر زیادہ انحصار کرتی ہے جو مائٹوکونڈریل ٹرائکاربو آکسیلک ایسڈ سائیکل-NADH کو ایکسٹرا مائٹوکونڈریل اسپیس کے ساتھ جوڑتی ہے [20]۔

ابتدائی تجربات میں، ہم نے تصدیق کی کہ مرکبات 1، 2، 3، اور 4 ایم ٹی ٹی ٹیٹرازولیم نمک کو براہ راست کم نہیں کرسکتے ہیں (نہیں دکھایا گیا)۔ موجودہ مطالعہ میں، MTT یا CCK-8 محلول کو شامل کرنے سے پہلے، مائکرو پلیٹس کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) کے ساتھ احتیاط سے دھو کر ری ایجنٹ کے ساتھ مرکبات کے براہ راست اثر کو ختم کر دیا گیا، جیسا کہ مینوفیکچرر کے پروٹوکول میں اشارہ کیا گیا ہے۔ اس کے باوجود، دو طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کردہ نتائج اب بھی متضاد تھے (شکل 2)۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، 1، 2 اور 3 مرکبات والے خلیوں کے انکیوبیشن نے کنٹرول گروپ (شکل 3) کے مقابلے میں ٹیٹرازولیم نمک کی جامنی شکل میں کمی کو بڑھا دیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ ایک مخصوص مرکب کی موجودگی میں ٹیٹرازولیم نمک کی محض کمی۔ ایم ٹی ٹی پرکھ میں مداخلت کرنے کی کمپاؤنڈ کی صلاحیت کا فیصلہ کرنے کے لیے کافی نہیں ہے۔

اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا مرکبات 1، 2، 3، اور 4 EA.hy926 خلیوں میں apoptosis پیدا کر سکتے ہیں، سیلولر مورفولوجیکل تبدیلیاں اور فاسفیٹائڈیلسرین ایکسٹرنلائزیشن کا جائزہ لیا گیا۔ CCK-8 پرکھ کے ساتھ مشاہدہ کردہ سیلولر وابستگی میں مسلسل کمی کے ساتھ، annexin V-FITC/PI کا استعمال کرتے ہوئے Hoechst سٹیننگ اور فلو cytometry تجزیہ کے نتائج نے تجویز کیا کہ مرکب 1، 2، اور 3 علاج کے بعد نمو کی روک تھام کا مشاہدہ کیا گیا تھا۔ کم از کم جزوی طور پر، EA.hy926 سیل اپوپٹوسس کی وجہ سے۔ ہمارے نتائج نے اس خیال کی بھی تائید کی کہ دونوں مرکبات 1 اور 2 میں موجود کیفیل گروپ MTT پرکھ کے ساتھ حاصل ہونے والے متضاد نتائج کے لیے ذمہ دار تھا۔

ہمارے نتائج کی طرح، Rottlerin، ایک طاقتور بڑے کنڈکٹنس پوٹاشیم چینل اوپنر، نے وٹرو میں MTT کی طرف رد عمل کا مظاہرہ نہیں کیا۔ تاہم، اس نے خلیوں کے اندر فارمازان کرسٹل کی تشکیل کو مضبوطی سے بڑھایا، جس کا نتیجہ NF-κB کے روٹلرین کی روک تھام اور ڈی این اے میں [3 H]-thymidine کے شامل ہونے کے تجزیہ سے مشاہدہ کردہ سیل کے پھیلاؤ کے ساتھ واضح تنازعہ میں تھا۔ وہ طریقہ کار جس کے ذریعے Rottlerin نے MTT میں کمی کو بڑھایا اس کی وجہ اس کے mitochondrial uncoupling effect [22] سے ہے۔ Rottlerin میں cinnamoyl acid کا متبادل گروپ ہوتا ہے۔ cinnamoyl acid کے مقابلے میں، مرکب 3 میں دو اضافی ہائیڈروکسیل باقیات ہیں، جو C-3 اور C-4 پر واقع ہیں۔ لہذا، ہم قیاس کرتے ہیں کہ وہ طریقہ کار جس کے ذریعے مرکبات 1 اور 2 MTT پرکھ میں متضاد نتائج کا باعث بنتے ہیں ان کے mitochondrial uncoupling اثرات سے بھی وابستہ ہو سکتے ہیں۔ اس مفروضے کو جانچنے کے لیے، مرکبات 1، اور 2، اور ایک کیمیکل انکپلر، جیسے کہ trifluorocarbonylcyanide phenylhydrazone (FCCP) کے درمیان تقابلی مطالعات کی ضرورت ہے۔

 جنسی فعل کو بہتر بنانے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. تجرباتی سیکشن

3.1 ریجنٹس اور کیمیکل

کمپاؤنڈ 3 (کیفیک ایسڈ – پاؤڈر، پیوریٹی=98.6%) چینگڈو پش بائیو ٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ (چینگڈو، چین) سے خریدا گیا تھا۔ کمپاؤنڈ 4 (3,4-dihydroxylphenylethanol– oil, pureity=98.5%) Chengdu Must Bio-technology Co., Ltd. (Chengdu, China) سے حاصل کیا گیا تھا۔ MTT اور dimethyl سلفوکسائڈ (DMSO) سگما-الڈرچ (سینٹ لوئس، MO، USA) سے حاصل کیے گئے تھے۔ CCK{11}} پرکھ Dojin Laboratories (Kumamoto, Japan) سے خریدی گئی تھی۔ Hoechst 33342 اور annexin V-FITC/PI apoptosis کا پتہ لگانے والی کٹس Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, China) سے خریدی گئیں۔

3.2 پلانٹ کا مواد

C. tubulosaتنوں کو یوٹیان پریفیکچر، سنکیانگ ایغور خود مختار علاقہ، چین سے اکٹھا کیا گیا تھا۔ واؤچر کے نمونے ہائی ایلٹیٹیوڈ میڈیسن کی کلیدی لیبارٹری، تھرڈ ملٹری میڈیکل یونیورسٹی (چونگ کنگ، چائنا) میں جمع کیے گئے تھے اور چینگڈو یونیورسٹی آف ٹریڈیشنل چائنیز میڈیسن (چینگڈو، چین) سے یی ژانگ نے تصدیق کی تھی۔

3.3 پودوں کے مواد کو نکالنا اور الگ کرنا

ہوا سے خشک C. tubulosa (0.6 kg) تنوں کو پاؤڈر کر کے 50% ایتھنول کے ساتھ 70 ڈگری پر 2 گھنٹے کے لیے نکالا گیا۔ کم دباؤ کے تحت سالوینٹس کو ہٹانے کے بعد، ایتھانولک نچوڑ (212.5 جی) کو پانی (2 L) میں تحلیل اور معطل کر دیا گیا اور n-butanol (2 L × 3) کے ساتھ نکالا گیا۔ n-butanol اقتباس (110 g) کو پولیامائڈ کالم پر کرومیٹوگراف کیا گیا تھا اور اسے ایتھنول/پانی (0:100، 5:95، 15:85، 30:70، 50:50) کے ساتھ تیار کیا گیا تھا جس سے پانچ حصے (A–E) تیار کیے گئے تھے۔ . فریکشن B (65 جی) کو ODS کالم پر الگ کیا گیا تھا۔ ایتھنول کے ساتھ اخراج: پانی (1:9) الگ شدہ مرکب 1 (3 جی)۔ فریکشن D (10.5 جی) کو ODS کالم پر تقسیم کیا گیا تھا۔ ایتھنول/پانی کے ساتھ اخراج (1:4) الگ شدہ مرکب 2 (1 جی)۔

NMR سپیکٹرا کو CD3OD میں Bruker Avance 600 سپیکٹرومیٹر پر Tetramethylsilane (TMS) کے ساتھ اندرونی معیار کے طور پر ریکارڈ کیا گیا تھا۔ ماس سپیکٹرا بائیوٹوف-کیو ماس سپیکٹرومیٹر پر کیا گیا تھا۔

3.4 سیل کلچر

EA.hy926 سیل لائنیں امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن (ماناساس، VA، USA) سے حاصل کی گئیں۔ سیلز کو RPMI 1640 میڈیم میں کلچر کیا گیا، 10% (v/v) فیٹل بوائین سیرم اور 1% (v/v) پینسلین-اسٹریپٹومائسن کے ساتھ ایک مرطوب ماحول میں 5% CO2 کے ساتھ 37 ڈگری پر۔

3.5 سیل وابستگی

سیل کی قابل عملیت کا اندازہ MTT اور CCK{{0}} اسسیس کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ مرکبات 1 اور 2، اور ان کے aglycones، caffeic acid (3) اور 3،4-dihydroxylphenylethanol (4) کلچر میڈیا میں حتمی DMSO ارتکاز <0.1% (v/v) تک DMSO میں تحلیل ہو گئے تھے۔

EA.hy926 سیلز کو 96-کنویں پلیٹوں پر 4 × 103 سیلز/کنویں پر سیڈ کیا گیا تھا۔ 24 گھنٹے تک انکیوبیشن کے بعد، خلیوں کا علاج 24 گھنٹے کے لیے 6.25–50 μM مرکب 1، 2، 3، یا 4 سے کیا گیا۔ کلچر میڈیم کو ہٹا دیا گیا تھا اور خلیوں کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) سے دو بار دھویا گیا تھا۔ ایلی کوٹس (10 μL) اسٹاک MTT محلول (5 mg·mL−1 ) ہر ایک کنویں میں شامل کیا گیا تھا جس میں 100 μL درمیانے درجے کا ہوتا تھا اور اسے 4 گھنٹے کے لیے خلیات سے لگایا جاتا تھا۔ انکیوبیشن کے بعد، میڈیم کو ہٹا دیا گیا اور فارمازان کرسٹل کو گھلنشیل کرنے کے لیے ہر کنویں میں DMSO کے 150 μL ایلی کوٹس شامل کیے گئے۔ مائکروپلیٹ ریڈر (Bio-Tek Synergy HT، Winooski، VT، USA) کا استعمال کرتے ہوئے جذب کو 490 nm پر ماپا گیا۔ سیل کی قابل عملیت کا اظہار ایم ٹی ٹی کی کمی کے فیصد کے طور پر کیا گیا تھا، جو کنٹرول سیل کے جذب کو 100٪ قدر تفویض کرتا ہے۔ تمام تجربات تین بار کیے گئے اور اوسط ± معیاری انحراف (SD) کے طور پر پیش کیے گئے۔

CCK-8 پرکھ معمولی ترمیم کے ساتھ ادب کے بعد انجام دیا گیا تھا [23]۔ خاص طور پر، خلیات کو 24 گھنٹے کے لیے 6.25–50 μM مرکبات 1، 2، 3، یا 4 کے ساتھ علاج کیا گیا اور 10 μL CCK-8 محلول اور 100 μL کلچر میڈیا کے اضافے سے پہلے PBS کے ساتھ دو بار دھویا گیا۔ مائکروپلیٹ کو 2 گھنٹے کے لئے 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کرنے کے بعد، مائکروپلیٹ ریڈر کا استعمال کرتے ہوئے جذب کو 450 nm پر ماپا گیا۔ سیل کی عملداری کو کنٹرول سیل (100٪) کے مقابلے میں قابل عمل خلیوں کی فیصد کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔ تمام تجربات تین بار کیے گئے تھے اور اوسط ± SD کے طور پر ظاہر کیے گئے تھے۔

3.6۔ ہوچسٹ 33342 سٹیننگ کے ذریعہ اپوپٹوس کی تشخیص

اپوپٹوٹک مورفولوجیکل تبدیلیاں ہوچسٹ 33342 داغ کے ذریعہ دیکھی گئیں۔ مختصراً، EA.hy926 خلیات کو 48-کنویں پلیٹوں (2 × 104 خلیات/کنویں) پر سیڈ کیا گیا اور 50 μM کمپاؤنڈ 1، 2، 3، یا 4 کے ساتھ 48 گھنٹے کے لیے 37 ڈگری پر علاج کیا گیا، PBS کے ساتھ دو بار دھویا گیا، اور کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ کے لیے 4% (v/v) paraformaldehyde کے ساتھ طے کیا جاتا ہے۔ PBS کے ساتھ دو بار کلی کرنے کے بعد، خلیات کو کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے Hoechst 33342 (10 ug·mL−1 ) سے داغ دیا گیا اور PBS کے ساتھ دو بار دھویا گیا۔ فلوروسینس مائیکروسکوپ (اولمپس، ٹوکیو، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے ہوچسٹ داغ والے نیوکلی کو تصور کیا گیا۔

3.7۔ فلو سائٹومیٹری کے ذریعہ اپوپٹوس تجزیہ

اپوپٹوٹک خلیوں کا پتہ انیکسین V-FITC/PI ڈبل سٹیننگ اور فلو سائٹوومیٹری تجزیہ کے ذریعہ پایا گیا۔ مختصراً، 48 گھنٹے کے لیے 50 μM کمپاؤنڈ 1، 2، 3، یا 4 کے ساتھ علاج کے بعد، خلیات کی کٹائی کی گئی اور PBS میں 1 × 105 خلیات·mL−1 پر دوبارہ معطل کر دی گئی۔ 25 ڈگری پر 5 منٹ کے لیے 500 × g پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، annexin V-FITC بائنڈنگ بفر کا 195 μL اور annexin V-FITC کا 5 μL شامل کیا گیا۔ ہلکے بھنور کے مکسنگ کے بعد، مکسچر کو اندھیرے میں کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ 25 ڈگری پر 5 منٹ کے لیے 500×g پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، FITC-conjugated annexin V بائنڈنگ بفر کے 190 μL اور 10 μL PI شامل کیے گئے۔ ہلکے بھنور کے اختلاط کے بعد، 30 منٹ کے اندر FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے نمونوں کا تجزیہ کیا گیا۔

3.8۔ شماریاتی تجزیہ

تمام تجرباتی اعداد و شمار کو اوسط ± SD کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔ تجرباتی نمونوں اور متعلقہ کنٹرول کے درمیان فرق کی اہمیت کا اندازہ SPSS سافٹ ویئر (ورژن 11.5) کا استعمال کرتے ہوئے تغیر (ANOVA) کے یک طرفہ تجزیہ سے لگایا گیا۔ شماریاتی اہمیت p < 0.05 پر سیٹ کی گئی تھی۔

4. نتائج

ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ ایم ٹی ٹی پرکھ میں مشاہدہ کیے گئے قابل عمل خلیوں کی تعداد کا ایک حد سے زیادہ اندازہ بعض مرکبات کی سائٹوٹوکسیٹی کو ماسک کر سکتا ہے۔ اس لیے، منشیات کی جانچ کے عمل کے دوران، ہم گمراہ کن نتائج پیدا کرنے سے بچنے کے لیے سیل کی قابل عملیت (جیسے CCK-8 اور 3 H-TdR assays) پر مخصوص مرکب کے اثر کا تعین کرنے کے لیے مختلف طریقے استعمال کرنے کی تجویز کرتے ہیں۔

ٹیسٹوسٹیرون کے اخراج کو فروغ دینے کے لیے نیچرل سیسٹینچ ٹیبلوسا PHGS75% ECH 30% ایکٹ 12%