Jasminum Sambac Cell Extract as Antioxidant Booster Against Skin Ageing Part 1

خلاصہ: آکسیڈیٹیو تناؤ جلد کی عمر بڑھنے کے عمل میں ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں کی پیداوار اور اعلی درجے کی گلیکشن اینڈ پروڈکٹس (AGEs) کی تشکیل کے ذریعے اہم کردار ادا کرتا ہے۔ اس لیے سکن کیئر مارکیٹ میں اینٹی آکسیڈینٹ اجزاء کی ضرورت ہوتی ہے اور پودوں کے خلیوں کی ثقافتوں سے آنے والے مالیکیولز کا استعمال ایک منفرد موقع فراہم کرتا ہے۔ اس مقالے میں، Jasminum sambac خلیات (JasHEx) کے ذریعہ حاصل کردہ ہائیڈرو ایتھانولک نچوڑ کی خصوصیات کی کھوج کی گئی۔ اینٹی آکسیڈینٹ اور اینٹی AGE خصوصیات کی چھان بین ایک کثیر الضابطہ نقطہ نظر سے کی گئی جس میں ماس سپیکٹرو میٹرک اور بائیو انفارمیٹک ان وٹرو اور ایکس ویوو تجربات کو ملایا گیا۔ JasHEx میں فینولک ایسڈ مشتقات، lignans، اور triterpenes شامل ہیں اور یہ پایا گیا کہ یہ خارجی تناؤ کے سامنے آنے والے keratinocytes میں cytosolic reactive آکسیجن کی پیداوار کو کم کرتا ہے۔ اس نے ایکسٹرا سیلولر میٹرکس میں AGE کی تشکیل کو کم کرنے اور کولیجن قسم I کی پیداوار کو بڑھانے کی صلاحیت بھی ظاہر کی۔ ڈیٹا نے ظاہر کیا کہ JasHEx اینٹی آکسیڈینٹ خصوصیات کا تعلق اس کی فری ریڈیکل اسکیوینگنگ اور میٹل چیلیٹنگ سرگرمیوں اور Nrf2/ARE پاتھ وے کو چالو کرنے سے تھا۔ یہ ایل پی ایس محرک میکروفیجز میں NO کی سطح میں کمی سے متعلق JasHEx اینٹی سوزش سرگرمی کی اچھی طرح وضاحت کر سکتا ہے۔ اس طرح، JasHEx کو آکسیڈیٹیو تناؤ کی وجہ سے جلد کی عمر بڑھنے کے خلاف ایک طاقتور اینٹی آکسیڈینٹ بوسٹر سمجھا جا سکتا ہے۔

سیستانچ کا گلائکوسائیڈ دل اور جگر کے بافتوں میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بھی بڑھا سکتا ہے، اور ہر ٹشو میں لیپوفسن اور ایم ڈی اے کے مواد کو نمایاں طور پر کم کر سکتا ہے، مختلف رد عمل آکسیجن ریڈیکلز (OH-، H₂O₂، وغیرہ) کو مؤثر طریقے سے ختم کر سکتا ہے اور DNA کو پہنچنے والے نقصان سے بچا سکتا ہے۔ OH ریڈیکلز کے ذریعہ۔ Cistanche phenylethanoid glycosides میں آزاد ریڈیکلز کی مضبوطی سے صاف کرنے کی صلاحیت ہوتی ہے، وٹامن C سے زیادہ کم کرنے کی صلاحیت، سپرم معطلی میں SOD کی سرگرمی کو بہتر بناتی ہے، MDA کے مواد کو کم کرتی ہے، اور سپرم کی جھلی کے کام پر ایک خاص حفاظتی اثر رکھتی ہے۔ Cistanche polysaccharides D-galactose کی وجہ سے تجرباتی طور پر حساس چوہوں کے erythrocytes اور پھیپھڑوں کے ٹشوز میں SOD اور GSH-Px کی سرگرمی کو بڑھا سکتے ہیں، نیز پھیپھڑوں اور پلازما میں MDA اور کولیجن کے مواد کو کم کر سکتے ہیں، اور elastin کے مواد کو بڑھا سکتے ہیں۔ ڈی پی پی ایچ پر اچھا اثر ڈالتا ہے، سینسنٹ چوہوں میں ہائپوکسیا کے وقت کو طول دیتا ہے، سیرم میں ایس او ڈی کی سرگرمی کو بہتر بناتا ہے، اور تجرباتی طور پر سنسنی والے چوہوں میں پھیپھڑوں کے جسمانی انحطاط میں تاخیر کرتا ہے، سیلولر مورفولوجیکل انحطاط کے ساتھ، تجربات سے معلوم ہوا ہے کہ Cistanche میں اینٹی آکسیڈنٹ کی اچھی صلاحیت ہے۔ اور جلد کی بڑھتی ہوئی بیماریوں کو روکنے اور علاج کرنے کے لیے ایک دوا بننے کی صلاحیت رکھتا ہے۔ ایک ہی وقت میں، Cistanche میں echinacoside میں DPPH فری ریڈیکلز کو ختم کرنے کی قابل ذکر صلاحیت ہے اور یہ رد عمل آکسیجن کی انواع کو ختم کر سکتا ہے، آزاد ریڈیکل-حوصلہ افزائی کولیجن کے انحطاط کو روک سکتا ہے، اور تھامین فری ریڈیکل ایون کے نقصان پر بھی اچھا مرمتی اثر رکھتا ہے۔

میں کہاں خرید سکتا ہوں پر کلک کریں۔

【مزید معلومات کے لیے:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

مطلوبہ الفاظجلد کی عمر رد عمل آکسیجن پرجاتیوں (ROS)؛ اعلی درجے کی گلیکشن اختتامی مصنوعات (AGEs)؛ Jasminum sambac hydroethanolic extract (JasHEx)؛ ماس سپیکٹومیٹری؛ میٹابولومکس؛ عالمی قدرتی مصنوعات سوشل مالیکیولر نیٹ ورکنگ (GNPS)؛ جوہری عنصر اریتھرایڈ 2- متعلقہ عنصر 2 (Nrf2)

1. تعارف

جینیاتی اندرونی عوامل اور خارجی ایجنٹ جیسے الٹرا وایلیٹ شعاع ریزی، انفراریڈ شعاع ریزی، زین بائیوٹکس اور ماحولیاتی آلودگی ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کی پیداوار کا سبب بنتے ہیں۔ وہ مائٹوکونڈریل سانس کی زنجیر، سائٹوکوم پی 450، اور این اے ڈی پی ایچ آکسیڈیسس [1] کے فعال ہونے سے پیدا ہوتے ہیں۔ ROS میں آزاد ریڈیکلز (سپر آکسائیڈ ایون، ہائیڈروپروکسائل ریڈیکل، الکوکسی ریڈیکل، اور ہائیڈروکسیل ریڈیکل) اور غیر ریڈیکل مالیکیولز (ہائیڈروجن پیرو آکسائیڈ، اور سنگلٹ آکسیجن) شامل ہیں [2]۔ جب اینٹی آکسیڈینٹ سسٹم مغلوب ہو جاتے ہیں تو، ROS خلیات کے اندر جمع ہوتا ہے اور نام نہاد آکسیڈیٹیو تناؤ پیدا کرتا ہے جو جلد کی عمر بڑھنے میں اہم کردار ادا کرتا ہے [3]۔

درحقیقت، آکسیڈیٹیو تناؤ ڈی این اے کو نقصان پہنچاتا ہے اور لپڈ اور پروٹین کے آکسیکرن کے ساتھ ساتھ mitogen-activated protein kinases (MAPK) پاتھ وے (AKT، JNK، ERK، اور p38) [4] کو متحرک کرتا ہے۔ یہ، بدلے میں، ٹرانسکرپشن عوامل AP-1 اور NF-κB کے محرک کے ذریعے پرو سوزش سائٹوکائنز، نمو کے عوامل، اور چپکنے والے مالیکیولز کے اظہار کو فروغ دیتا ہے۔ مزید یہ کہ، MAPK پاتھ وے ایکٹیویشن کولیجن کی سطح کو کم کرکے ڈرمل میٹرکس میں تبدیلی کا سبب بنتا ہے۔ یہ میٹرکس میٹالوپروٹینیسز (MMPs) اور ان کے ٹشو انحیبیٹرز TIMPs کے اظہار کو ماڈیول کرکے کولیجن کی خرابی کو تیز کرتا ہے اور یہ TGF- قسم II ریسیپٹر/Smad سگنلنگ کو روک کر نئے کولیجن کی ترکیب کو کم کرتا ہے۔ اس کے علاوہ، آکسیڈیٹیو تناؤ جلد کی حالتوں کو تبدیل کرتا ہے جو ایپیڈرمل کیلشیم کے میلان میں خلل ڈالتا ہے، جو کہ کورنیفائیڈ لفافے کی سالمیت اور کام کے لیے ضروری ہے، سیبیسیئس غدود کے کام کو متحرک کرتا ہے اور میلانوسائٹ انحطاط کا باعث بنتا ہے [5]۔

متوازی طور پر، ترمیم شدہ بائیو مالیکیولز کی تشکیل جسے ایڈوانسڈ گلائیکیشن اینڈ پروڈکٹس (AGEs) کہا جاتا ہے، خلیات اور بافتوں میں آکسیڈیٹیو تناؤ کو فروغ دیتا ہے [6]۔ ان عمر رسیدہ بائیو مارکروں کی نشوونما مختلف ماحولیاتی عوامل سے ہوتی ہے جیسے سگریٹ کا دھواں، اعلیٰ درجے کی بہتر اور سادہ کاربوہائیڈریٹ غذا، اعلی درجہ حرارت پر پکی ہوئی غذائیں، اور بیٹھے رہنے والے طرز زندگی؛ AGEs مستحکم اور ناقابل واپسی مصنوعات ہیں جو شکر اور پروٹین، نیوکلک ایسڈ یا لپڈ کو کم کرنے کے درمیان غیر انزیمیٹک رد عمل سے حاصل ہوتی ہیں، جس کے بعد مزید ترتیب دی جاتی ہے [7]۔ درحقیقت، AGE کی تشکیل کا نقطہ آغاز میلارڈ ری ایکشن ہے جس میں شکر کو کم کرنے والے کاربونیل گروپس کے مفت امینو گروپس، نیوکلک ایسڈز، یا امینو فاسفولیپڈ کے ساتھ الٹ رد عمل ظاہر کرتے ہیں تاکہ شیف بیسز بن سکیں۔ یہ امائنز خود بخود مزید مستحکم کیٹامین میں دوبارہ ترتیب دیتے ہیں، جسے امادوری مصنوعات کہتے ہیں۔ وہ ری ایکٹیو ڈیکاربونیلز (جیسا کہ گلائیکسل یا میتھائلگلائکسل) پیدا کرتے ہیں جو پروٹین کے لائسین اور ارجینائن فنکشنل گروپس کے ساتھ رد عمل ظاہر کرتے ہیں، جس سے AGEs کی ایک بڑی قسم حاصل ہوتی ہے [8,9]۔ فلوروسینس کے اخراج اور کراس لنکس بنانے کی ان کی صلاحیت کی بنیاد پر انہیں مختلف گروپوں میں درجہ بندی کیا گیا ہے۔

AGE ایکشن AGEs (RAGEs) کے ریسیپٹرز کے ذریعے ثالثی کیا جاتا ہے جو کہ امیونوگلوبلین سپر فیملی سے تعلق رکھنے والے ٹرانس میبرن پروٹین ہوتے ہیں جو قسم I سیل کی سطح کے مالیکیولز سے تعلق رکھتے ہیں، جن کا اظہار مختلف سیل اقسام بشمول کیراٹینوسائٹس، فائبرو بلاسٹس اور میکروفیجز میں ہوتا ہے۔ پابند AGEs/RAGEs بنیادی طور پر NADPH oxidases (NOXes) اور mitochondrial سانس کی زنجیر کو چالو کرنے سے ROS کی پیداوار کو بڑھاتا ہے، جس سے آکسیڈیٹیو تناؤ اور اوپر بیان کردہ تمام نتائج [6,8] ہوتے ہیں۔

مزید برآں، ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ECM) پروٹین، خاص طور پر کولیجن، گلائیکیشن کے لیے انتہائی حساس ہوتے ہیں۔ درحقیقت، کولیجن سے اخذ کردہ AGE ڈھانچے کی پینٹوسیڈائن کی سطح نوجوان مضامین کی نسبت بوڑھوں میں نمایاں طور پر زیادہ ہوتی ہے [10]۔ کولیجن گلیکشن نہ صرف خود کولیجن کی میکانکی خصوصیات کو تبدیل کرتا ہے، جو سخت اور زیادہ ٹوٹنے والا ہو جاتا ہے [11] بلکہ ایکسٹرا سیلولر میٹرکس کی خصوصیات بھی، جو رہائشی خلیوں کے رویے کو متاثر کرتی ہیں (ترقی، تفریق، حرکت پذیری، جین کا اظہار، اور ردعمل سائٹوکائنز) اور میٹرکس – سیل کے تعاملات [12]۔

اس منظر نامے میں، AGE کی تشکیل اور ان کے متعلقہ آکسیڈیٹیو جھرنے کو کم کرنے کے لیے کاسمیٹک فیلڈ میں اینٹی آکسیڈینٹ اجزاء کی بہت زیادہ مانگ ہے: Oleaceae خاندان سے تعلق رکھنے والے Jasminum sambac کی نسل سے اخذ کردہ نچوڑ اپنی اینٹی آکسیڈینٹ خصوصیات اور لوک میں ان کے مشترکہ استعمال کے لیے دلچسپ ہیں۔ جلد کی بیماریوں کے علاج کے لیے دوا [13]۔ تاہم، پودوں کے نچوڑ کئی نقصانات کو ظاہر کرتے ہیں جیسے کہ ناقص حیاتیاتی پائیداری، کیڑے مار ادویات، کھادوں، یا پیتھوجینز کے ساتھ ممکنہ آلودگی، اور موسموں اور ماحولیاتی حالات سے متاثر ہونے والی ان کے معیار اور مقداری ساخت کی تغیر۔ بائیو ایکٹیو کاسمیٹک اجزاء کے ایک ذریعہ کے طور پر پودوں کا ایک درست متبادل، پودوں کے خلیوں کی ثقافتوں کے ذریعہ پیش کیا جاتا ہے جو کئی فوائد پیش کرتے ہیں: (i) پیداواری عمل کی اعلی پائیداری، چونکہ کسی زرعی زمین کی ضرورت نہیں ہے۔ (ii) جغرافیائی، موسم اور پودوں کی تولیدی سائیکل پر انحصار کے بغیر قدرتی مصنوعات کی مسلسل فراہمی؛ (iii) پیتھوجینز، ماحولیاتی آلودگی، اور زرعی کیمیکل کی باقیات سے آلودگی کا کوئی خطرہ نہیں؛ (iv) معیاری بڑھتے ہوئے حالات جو بایوماس اور میٹابولائٹ پیداوار کی اعلیٰ اور زیادہ تولیدی شرح حاصل کرنے کی اجازت دیتے ہیں۔ (v) اعلی استعداد، چونکہ مرکبات کے ارتکاز کو ثقافتی حالات کو تبدیل کرکے اور (vi) آسان اور کم وقت لینے والے نکالنے والے پروٹوکول کے ذریعے بہتر بنایا جا سکتا ہے، جارحانہ سالوینٹس کی ضرورت کو کم کر کے [14,15]۔

یہاں، Jasminum sambac سیل کلچرز (JasHEx) سے ماخوذ ایک ہائیڈرو ایتھانولک نچوڑ کا مطالعہ کیا گیا۔ ہمارے مطالعے کا مقصد JasHEx کی ایک وسیع کیمیائی اور حیاتیاتی خصوصیات ہے، خاص طور پر اس کی اینٹی گلائیکیشن اور اینٹی ایجنگ خصوصیات کو تلاش کرنا۔ سب سے پہلے، نچوڑ کی تفصیلی ساختی خصوصیات حاصل کرنے کے لیے بڑے پیمانے پر سپیکٹرو میٹرک پر مبنی طریقوں کا استعمال کیا گیا۔ پھر، JasHEx کی حیاتیاتی سرگرمی کو اینٹی آکسیڈنٹ کے طور پر ثابت کرنے کے لیے ان وٹرو اور ایکس ویوو تجربات کیے گئے۔

2. مواد اور طریقہ

2.1 پلانٹ ٹشو کلچر اور ایکسٹریکٹ کی تیاری

مصدقہ عربی جیسمین (جیسمین سمباک) مقامی نرسری ("لاڈرے دی پیانٹے"، پسٹویا، ٹوسکانا ریجن، اٹلی) سے حاصل کی گئی تھی۔ Jasminum sambac کے پتوں کو 70 فیصد ایتھنول (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) میں 1 منٹ تک بھگو دیا گیا اور 1 فیصد (v/v) کمرشل بلیچ کے ساتھ Tween 2{{ کے ساتھ سٹرلائز کیا گیا۔ 9}} (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 8 منٹ کے لیے، اس کے بعد جراثیم سے پاک آست پانی میں تین کلی کریں۔ پھر، پتوں کو 0.5–10 سینٹی میٹر کے ٹکڑوں میں کاٹ کر مکمل طاقت والے ایم ایس میڈیم [16] پر کلچر کیا گیا جس میں 3 فیصد (w/v) سوکروز، 0 .2 mg/L 2,4D، اور 8 g/L فائٹو آگر۔ وضاحتیں تین ماہ کے لئے ایک تازہ میڈیم پر ماہانہ ذیلی ثقافت کی گئیں۔ ایک بار جب زرد سبز، نازک اور تیزی سے بڑھنے والا کالس حاصل کر لیا گیا تو، پودوں کے خلیوں کو مائع MS میڈیم میں منتقل کر دیا گیا، 3 فیصد (w/v) سوکروز اور 0.2 mg/L 2,4D کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا۔ معطلی کو رات 110 بجے اور ایک تاریک آب و ہوا والے کمرے میں 27 ◦C پر ایک جیریٹی شیکر میں ہلایا گیا۔ گہرے بڑھے ہوئے خلیوں کو ہر ہفتے چھوٹے پیمانے سے بڑے پیمانے پر فلاسکس تک اس وقت تک بڑھایا جاتا تھا جب تک کہ تقریبا 177 g/L کی مائع معطلی ثقافتوں تک نہ پہنچ جائے۔ Jasminum sambac cell culture hydro-ethanolic extract (JasHEx) کی تیاری 500 g خلیات میں ایتھنول/پانی (90/10, v/v) کے محلول کے 2000 mL کے اضافے سے کی گئی۔ مرکب کو 1500 rpm پر 3 منٹ اور 3800 rpm پر 6 منٹ کے لیے Grindomix GM300 چاقو مل (Retsch GmbH، ہان، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے ہم آہنگ کیا گیا تھا۔ حاصل کردہ معطلی کو 400 rpm پر 2 گھنٹے کے لیے 25 ◦C پر ہلایا گیا، روشنی کی نمائش سے گریز کیا گیا۔ اس کے بعد معطلی کو 6300 rpm پر 10 منٹ کے لیے 4◦C پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ سپرنٹنٹ کو ہٹا دیا گیا، فلٹر کیا گیا، اور پھر روٹری ایوپوریٹر (IKA RV8، IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Germany) میں خلا کے نیچے 25 ◦C پر مرکوز کیا گیا۔ آخر میں، pH کو 10 N NaOH کے ساتھ 7.0 پر لایا گیا اور پھر ٹھیک پاؤڈر حاصل کرنے تک منجمد خشک کر دیا گیا۔

2.2 UPLC–MS/MS تجزیہ برائے JasHEx کیمیائی خصوصیات

ایک biphasic butanol/پانی نکالنا حاصل کیا گیا۔ الٹی میٹ ™ 3000 یو پی ایل سی سسٹم (تھرمو سائنٹیفک، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) سے لیس Q-Exactive Classic Mass Spectrometer پر کئے جانے والے UPLC–MS/MS تجزیہ سے پہلے میتھانول (10 mg/mL) میں بٹانول کے حصے کو صاف اور پگھلا دیا گیا تھا۔ )۔ تمام کرومیٹوگرافک رن کیے گئے تھے جیسا کہ پہلے ہی Ceccacci et al نے بیان کیا ہے۔ [17]۔

2.3 عالمی قدرتی مصنوعات سوشل مالیکیولر نیٹ ورکنگ تجزیہ

میٹابولائٹ کی شناخت کے لیے، گلوبل نیچرل پروڈکٹس سوشل مالیکیولر نیٹ ورکنگ کا استعمال کیا گیا تھا [18]۔ وہ تمام MS اور MSMS سگنل جو GNPS کے ذریعے تفویض نہیں کیے گئے تھے، دانشمندی سے جانچے گئے اور لٹریچر کے مطابق تفویض کیے گئے۔ خام فائلوں کو MS کنورٹر جنرل یوزر انٹرفیس سافٹ ویئر کے ذریعہ MzXML فارمیٹ میں تبدیل کیا گیا تھا، GNPS اسپیکٹرل لائبریری کی تلاش سے پہلے۔ یہ 0 کے پیشگی آئن بڑے پیمانے پر رواداری کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ نتائج کی دستی طور پر تصدیق کی گئی۔

ڈیٹا پری پروسیسنگ مزمین (ورژن 2.53، سافٹ پیڈیا، بخارسٹ، رومانیہ) [19] کے ذریعہ کی گئی تھی اور ایک خصوصیت پر مبنی مالیکیولر نیٹ ورکنگ (FBMN) کام [20] انجام دیا گیا تھا جیسا کہ Ceccacci et al نے رپورٹ کیا ہے۔ [17]۔ حاصل کردہ نیٹ ورک فائلوں کو سائٹوسکیپ (ورژن 3.9.1، یو ایس نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف جنرل میڈیکل سائنسز (این آئی جی ایم ایس)، بیتھسڈا، ایم ڈی، یو ایس اے میں درآمد کیا گیا تھا [21]۔

2.4 Lignans اور Triterpenes کا مقداری تجزیہ

معیار کے تجربات کے لیے بیان کردہ وہی UPLC سیٹنگیں لگنان کے مقداری تجزیہ کے لیے استعمال کی گئی تھیں، جب کہ ٹرائیٹرپینز کے لیے، انہیں بہتر کیا گیا تھا تاکہ وہ دو جوڑے آئیسومر، ارجنولک/ایشیٹک ایسڈ، اور اولیانولک/ursolic ایسڈ کو الگ کر سکیں۔ یہ تجزیہ Q-Exactive Classic Mass Spectrometer پر کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ علیحدگی Phenomenex Kinetex (Torrance, CA, USA) EVO C18 300 Å (150 × 2.1 ملی میٹر، پارٹیکل سائز 5 µm) کے ذریعے کی گئی۔ موبائل فیز میں A (5 mM امونیم ایسیٹیٹ آبی محلول، pH 9۔{8}} امونیم ہائیڈرو آکسائیڈ کے ذریعے ایڈجسٹ کیا گیا) اور B (1{{40}}0 فیصد ایسٹونیٹرائل) پر مشتمل تھا۔ 0–20 منٹ پر 13–28 فیصد B کا تدریجی اخراج، 20–24 منٹ پر 28–65 فیصد، 24–28 منٹ پر 65–75 فیصد B، 28–28.5 منٹ پر 75–95 فیصد، 28.5 پر 95 فیصد –32 منٹ، 32–32.1 منٹ پر 95–13 فیصد اور 32.1–44 منٹ پر 13 فیصد۔ بہاؤ کی شرح 0.450 mL/min تھی اور انجیکشن کا حجم 5 µL تھا۔ lignans اور triterpenes دونوں کے لئے، ڈیٹا بڑے پیمانے پر طریقہ کار کے ساتھ حاصل کیا گیا تھا جسے Ceccacci et al نے بیان کیا ہے۔ [17]۔ ہم نے بائیو سنتھ کاربوسنتھ سے نارٹاکیلوجینن (#LCA52174) خریدا، میٹائیرسینول (#80497) اور ماسلینک ایسڈ (#83209) PhytoLab GmbH & Co.KG سے، secoisolariciresinol (#60372) اور arjunolic acid (####60372) اور آرجونولک ایسڈ (####60372) ، MI، USA)، Asiatic acid (#0027)، oleanolic acid (#0041 S) اور ursolic acid (#0037 S) Extrasynthèse (Genay, France) سے۔ انشانکن کے منحنی خطوط کو لگنانس کے لیے 0.05 سے 25 µM اور ٹرائیٹرپینز کے لیے 0.1 سے 25/250 µM کے ارتکاز میں معیارات کے انجیکشن کے ذریعے حاصل کیا گیا تھا۔ معیارات کے لیے کھوج کی حد (LOD) اور مقدار کی حد (LOQ) کا تعین سگنل سے شور (S/N) کے تناسب کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔

2.5 سکن سیل کلچرز اینڈ ایکسپلانٹس

اڈیکس بائیو ٹیکنالوجیز (سان ڈیاگو، سی اے، یو ایس اے) سے خریدے گئے لافانی انسانی کیراٹینوسائٹس (HaCaT) کو Dulbecco کے Modified Eagle Medium (DMEM؛ Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) میں محفوظ کیا گیا تھا جو کہ 10 فیصد فی صد فیرمین کے ساتھ مکمل کیا گیا تھا۔ (FBS؛ Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 95 فیصد ہوا میں، 5 فیصد CO2، اور 37 ◦C پر مرطوب ماحول۔ انسانی ڈرمل فائبرو بلاسٹس (HDF) کو Dulbecco کے Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) میں محفوظ کیا گیا تھا جو فیٹل بوائین سیرم کے 10 فیصد (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) کے ساتھ ملتے ہیں۔ )95 فیصد ہوا میں، 5 فیصد CO2، اور 37 ◦C پر مرطوب ماحول۔ سرجری سینٹر ولا سنزیا (نیپلز، اٹلی) میں صحت مند خواتین عطیہ دہندگان (31 اور 40 سال کی عمر) کی جلد سے حاصل کیے گئے جلد کی وضاحتیں، ڈی ایم ای ایم/ایف بی ایس میں ٹرانس ویل پلیٹوں کے علاوہ ہوا میں مائع کی حالتوں میں اینٹی بائیوٹکس کے ذریعے کلچر کیے گئے تھے۔ 5 فیصد CO2 مرطوب ہوا میں 37 ◦C پر۔ ہیلسنکی کے اعلامیے کے مطابق، تمام عطیہ دہندگان نے جلد کے ٹشوز کے استعمال کے لیے اپنی تحریری باخبر رضامندی دی تھی۔

2.6۔ H2O2-تناؤ والے HaCaT خلیوں میں سائٹوسولک ROS پرکھ

اس عمل کے لیے، 1.8 × 104 HaCaT کو 96-کنویں پلیٹوں میں بیج کیا گیا اور 20 گھنٹے تک اگایا گیا۔ اس کے بعد خلیوں کا علاج 2 گھنٹے تک JasHEx (0.0006 فیصد، 0.002 فیصد، اور 0.006 فیصد p/v) کے ساتھ یا 500 µM ascorbic ایسڈ کے ساتھ کیا گیا، جو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔ اس کے بعد، انہیں پی بی ایس (فاسفیٹ بفرڈ نمکین) میں دھویا گیا اور 100 µL/کنویں کے ساتھ 37 ◦C پر انکیوبیٹ کیا گیا: 10 mM ہیپس، 1.3 mM CaCl2، 1 mM MgSO4، 5 mM گلوکوز، اور 5۔ µM CM-H2DCFDA (5-(اور-6)-chloromethyl-20,70 -dichlorodihydrofluorescein diacetate, Invitrogen)۔ 45 منٹ کے بعد، ایک پی بی ایس واش کیا گیا اور انسٹرومنٹ این ویژن (پرکن ایلمر، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) کا استعمال کرتے ہوئے خلیوں کی بیس لائن فلوروسینس کی شدت 535 این ایم (جوش 485 این ایم) پر ماپا گیا۔ اس کے بعد، 450 µM H2O2 شامل کرکے آکسیڈیٹیو تناؤ پیدا کیا گیا، اور نمونوں کی فلوروسینس 30 منٹ کے بعد ماپا گیا۔

2.7۔ Glyoxal Stressed Human Dermal Fibroblast (HDF) سیلز میں عمر کا پتہ لگانے کے لیے Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

اس مرحلے کے لیے، 1.5 × 104 HDF کو 96-کنویں کی پلیٹوں میں سیڈ کیا گیا اور 2 دن تک اگایا گیا۔ PBS کے ساتھ دھونے کے بعد، PBS میں 100 µL 4 فیصد formaldehyde کے ساتھ 1{{10}} منٹ کے لیے سیلز طے کیے گئے۔ اس کے بعد، ان کا علاج JasHEx (0.0006 فیصد اور 0.002 فیصد p/v) یا 1 µM Aminoguanidine کے مثبت کنٹرول کے ساتھ 0.5 فیصد glyoxal کی موجودگی میں 50 ◦C پر 1 ہفتہ تک کیا گیا۔ انکیوبیشن کے بعد، ان پر AGE (Abcam ab23722) کے خلاف ایک مخصوص اینٹی باڈی کا استعمال کرتے ہوئے انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) کے لیے کارروائی کی گئی۔

2.8۔ Fibrillin-1 کی کھوج کے لیے Methyl-Glyoxal Stressed Skin Explanants پر ImmunoHistoFluorescence Assay

جلد کی وضاحتیں 31 اور 40 سال کی عمر کے دو مریضوں سے حاصل کی گئیں۔ ہر جلد کی بایپسی سے، ایئر مائع انٹرفیس پر ہونے والے ہر علاج کے لیے تین مکے بنائے گئے تھے۔ پہلے دن، گھونسوں کا علاج JasHEx (0.002 فیصد اور 0.006 فیصد p/v) یا مثبت کنٹرول (1 mM Aminoguanidine) سے کیا گیا اور 24 گھنٹے کے بعد، 500 µM methyl- glyoxal شامل کیا گیا تھا. علاج کو ہر دو دن میں کل سات دنوں تک تازہ کیا جاتا تھا۔ مدت کے اختتام پر، پنچوں کو ہسٹولوجیکل تجزیہ کے لیے پروسیس کیا گیا، 4 فیصد پی ایف اے میں طے کیا گیا، 15 فیصد سوکروز میں انکیوبیٹ کیا گیا، پھر 30 فیصد سوکروز میں، اور −80 ◦C پر او سی ٹی کمپاؤنڈ (زیادہ سے زیادہ کاٹنے کا درجہ حرارت) میں کریو ذخیرہ کیا گیا۔ . 5 µm کا Cryosection cryostat CM1520 Leica (Leica Biosystems، Buffalo، IL، USA) کے ساتھ حاصل کیا گیا تھا۔ کرائی سیکشن والی سلائیڈز کو پی بی ایس میں 30 منٹ کے لیے ہائیڈریٹ کیا گیا اور 1 گھنٹے کے لیے "بلاکنگ" سلوشن (6 فیصد BSA، 5 فیصد سیرم، 20 ایم ایم ایم جی سی ایل 2، 0.2 فیصد ٹوین) میں رکھا گیا۔ اس کے بعد، انہیں پرائمری اینٹی فبریلن 1 اینٹی باڈی (MA5-12770, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔ 16 گھنٹے کے لیے 4 ◦C پر۔ سلائیڈوں کو پی بی ایس کے ساتھ 30 منٹ تک دھویا گیا اور پھر ثانوی اینٹی خرگوش Alexa-Fluor 546 اینٹی باڈی (A11035، تھرمو سائنٹیفک، والتھم، MA، USA) کے ساتھ 1 گھنٹہ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ نیوکلی کو DAPI (40, 6-5 diamidino-2-phenylindole) 1 g/mL PBS میں 10 منٹ تک داغ دیا گیا تھا۔ تصاویر کو فلوروسینس مائکروسکوپ کے ساتھ حاصل کیا گیا تھا اور امیج جے سافٹ ویئر (ورژن 1.53a، نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ، USA) کے ساتھ تجزیہ کیا گیا تھا۔

2.9 پروکولجن قسم I C-Peptide (PIP) مواد کی پیمائش کے لیے الفا لیسا پرکھ

اس مرحلے میں، 8 × 103 HDF کو ایک 96-کنویں پلیٹ میں سیڈ کیا گیا اور JasHEx (0) کے ساتھ 24 گھنٹے تک علاج کیا گیا۔{8}}006 فیصد، 0.002 فیصد، اور 0.006 فیصد p/v) یا TGF- (2.5 ng/mL) کے ساتھ۔ علاج کے بعد، خلیوں پر الفا LISA hPIP کولیجن کٹ فراہم کرنے والے (AL353HV، (PerkinElmer، Waltham، MA، USA)) کی ہدایات کے مطابق کارروائی کی گئی۔

2.10 Nrf2 Luciferase پر مبنی ٹرانسکرپشن ایکٹیویشن پرکھ

یہاں، ایک 96-کنویں پلیٹ میں 6 × 103 HaCaT خلیات کو بیج دیا گیا اور 16 گھنٹے تک بڑھایا گیا۔ اس کے بعد، انہیں ARE رپورٹر کٹ BPS Bioscience (San Diego, CA, USA, #60514) کا استعمال کرتے ہوئے، Nrf2 luciferase پر مبنی ٹرانسکرپشن ایکٹیویشن پرکھ کا نشانہ بنایا گیا۔ ایک ٹرانسفیکشن کے لیے تیار ARE luciferase رپورٹر ویکٹر (ARE ریسپانسیو عناصر کے کنٹرول میں ایک فائر فلائی لوسیفریز جین پر مشتمل ہے جو ایک کم سے کم پروموٹر کے اوپری حصے میں واقع ہے) ایک اندرونی کنٹرول کے ساتھ (ایک جزوی طور پر ظاہر کرنے والا رینیلا لوسیفریز ویکٹر) کو عارضی طور پر HaCaT خلیوں میں منتقل کیا گیا تھا۔ X-TREME جین HP DNA ٹرانسفیکشن ریجنٹ (Roche, Basilea, Switzerland, #6366244001)۔ 24 گھنٹے تک نقل و حمل کے بعد، خلیات کو 2 گھنٹے تک عرق (0.0006 فیصد، 0.002 فیصد، اور 0.006 فیصد p/v) یا مثبت کنٹرول Resveratrol (50 µM) کے ساتھ علاج کیا گیا۔ اس کے بعد، انہیں ڈوئل-گلو لوسیفریز پرکھ سسٹم (پرومیگا، روم، اٹلی #E2920) کے ساتھ لوسیفریز پرکھ کا نشانہ بنایا گیا۔ مختصراً، سیلز کو ایک 96-وییل پلیٹ ریڈر (وِکٹر نیوو، والتھم، ایم اے، یو ایس اے) میں لیومینیسینس کی پیمائش کرنے سے پہلے 10 منٹ تک فائر فلائی لوسیفریز سبسٹریٹ کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ Nrf2 ٹرانسکرپشن سرگرمی کو معمول پر لانے اور اس کا موازنہ کرنے کے لیے فائر فلائی اور رینیلا سے luminescence کا تناسب شمار کیا گیا تھا۔

2.11۔ ایس او ڈی کے اظہار کا تجزیہ

اس عمل کے لیے، 1.5 × 105 HaCaT سیل فی کنواں 6-کنویں کی پلیٹوں میں 16 گھنٹے کے لیے اگائے گئے اور نچوڑ کے ساتھ 6 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیے گئے (0.002 فیصد اور 0.006 فیصد p/v) یا 50 µM Resveratrol بطور مثبت کنٹرول۔ انکیوبیشن کے اختتام پر، کل RNA کو "GenElute™ Total RNA Purification" کٹ (Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, USA سے) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا اور DNase I (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) سے 37 پر علاج کیا گیا۔ ◦C 30 منٹ کے لیے، جینومک DNA آلودگی کو دور کرنے کے لیے۔ کل RNA کے 500 ng کو انزائم ریورس ٹرانسکرپٹیس (تھرمو سائنٹیفک، والتھم، MA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے ریٹرو ٹرانسکرائب کیا گیا تھا۔ یونیورسل کی جوڑی کا استعمال کرتے ہوئے نیم مقداری RT-PCRs کیے گئے تھے۔ پرائمر 18S پرائمر/مسابقتی (Invitrogen- Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) اندرونی معیارات کے طور پر۔ PCR مصنوعات کو 1.5 فیصد ایگروز جیل پر الگ کیا گیا، اور iBright آلہ (انویٹروجن تھرمو سائنٹیفک، والتھم، MA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے دیکھا گیا۔ ایمپلیفیکیشن کے لیے استعمال کیے جانے والے پرائمر کی ترتیب درج ذیل تھی: HsSOD1Fw: GAAAGTAATGGACCAGTGAAGG؛ HsSOD1Rv: ATTGGGCGATCCCAATTACACC؛ OH-1Fw GAACTTTCAGAAGGGTAGG؛ OH-1GCTCAATGATTGAv.

2.12۔ LPS-Stimulated RAW 264.7 میں نائٹرک آکسائیڈ پرکھ

RAW 264.7 murine macrophages میں کسی بھی ارتکاز کا تعین نہیں کیا گیا، 1.5 × 10کے ارتکاز میں 5 خلیات/کنویں 96-کنویں پلیٹوں میں 24 گھنٹے تک بیج دیا گیا، اور نچوڑ کے ساتھ پہلے سے علاج کیا گیا ({{1 0}}.0006 فیصد، 0.002 فیصد، اور 0.006 فیصد p/v) یا 2 گھنٹے کے لیے 10 µM TPCK (مثبت کنٹرول) کے ساتھ، 18 گھنٹے کے لیے 2 µg/mL LPS کے ساتھ انکیوبیشن سے پہلے۔ NO کی مقدار، جو نائٹریٹ میں تبدیل ہوتی ہے، کا حساب گریس ریجنٹ (N-(1-naphthyl) کا حل) ethylenediamine اور sulfanilic acid، Invitrogen- Thermo Scientific، Waltham, MA, USA) اور 30 ​​منٹ کے بعد، شامل کرکے لگایا گیا تھا۔ جاذبیت کو ملٹی ویل پلیٹ ریڈر (EnVision، PerkinElmer، Waltham، MA، USA) کے ذریعے 540 nm پر ماپا گیا۔

3. نتائج

3.1 Jasminum sambac Cell Culture Hydro-Ethanolic Extract (JasHEx) کا معیار اور مقداری تجزیہ

JasHEx کا UPLC–MS/MS تجزیہ کیا گیا اور گلوبل نیچرل پروڈکٹس سوشل مالیکیولر نیٹ ورکنگ (GNPS) کا استعمال کرتے ہوئے ہائی ریزولوشن سپیکٹرو میٹرک ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا، جو کہ ایک ویب پر مبنی ماس سپیکٹرو میٹری سسٹم ہے جو قدرتی مصنوعات (NPs) کی تشریح میں مدد کرتا ہے [18] . خاص طور پر، ایک GNPS سپیکٹرل لائبریری کو آن لائن ڈیریپلیکشن حاصل کرنے کے لیے انجام دیا گیا تھا۔ کیمیکل پرجاتیوں کی شناخت GNPS کے ذریعہ نہیں کی گئی تھی اس کے مطابق لٹریچر کے مطابق تفویض کیا گیا تھا۔ جیسا کہ اعداد و شمار 1 اور 2 اور جدول 1 میں دکھایا گیا ہے، ثانوی میٹابولائٹس کے کئی طبقوں سے تعلق رکھنے والے 50 سے زیادہ مرکبات، بنیادی طور پر پولیفینول اور ٹیرپینز کی نشاندہی کی گئی۔ درحقیقت، JasHEx ایکسٹریکٹ میں فینولک ایسڈ مشتقات، lignans (secoisolariciresinol، nortrachelogenin، اور matairesinol)، اور triterpenoids (arjunolic acid، aspartic acid، maslinic acid، oleanolic acid، اور ursolic acid) شامل ہیں۔

【مزید معلومات کے لیے:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】