رابطہ:joanna.jia@wecistanche.com/ واٹس ایپ: 008618081934791

اس مضمون کے حصہ II (تعارف، مواد اور طریقے) کے بارے میں معلومات کے لیے یہاں کلک کریں۔

عام انسانی گردے کے قریبی نلی نما اور گلومیرولس کی قریبی سنگل سیل پروٹومکس پروفائلنگ

تارا کے سگدل¹، پال ڈی پیہووسکی²، سدیشنا رائے¹، جولین لیبرٹو¹، جوشوا آر ہینسن²، ایڈم سی سوینسن²، روئی زاؤ³، ینگ زو³، پرینکا رشمی¹، اینڈریو شروڈر¹، ایزابیلا ڈیم¹، سواستیکا سور¹، Jinghui Luo4، Yingbao Yang4، Wei-Jun Qian²* اور منی ایم سروال¹* کڈنی پریسجن میڈیسن پروجیکٹ (KPMP) کنسورشیم کے لیے

¹ڈویژن آف ملٹی آرگن ٹرانسپلانٹیشن، شعبہ سرجری، یونیورسٹی آف کیلیفورنیا، سان فرانسسکو، سان فرانسسکو، سی اے، ریاستہائے متحدہ

²پیسیفک نارتھ ویسٹ نیشنل لیبارٹری، بائیولوجیکل سائنسز ڈویژن، رچلینڈ، ڈبلیو اے، ریاستہائے متحدہ

³ماحولیاتی مالیکیولر سائنسز لیبارٹری، پیسیفک نارتھ ویسٹ نیشنل لیبارٹری، رچلینڈ، WA، ریاستہائے متحدہ

⁴شعبہ پیتھالوجی، یونیورسٹی آف مشی گن، این آربر، ایم آئی، ریاستہائے متحدہ

مطلوبہ الفاظ:گلوومیرولسماس سپیکٹرو میٹری، سنگل سیل تجزیہ، پروٹومکس،گردہ

واحد خلیے کی سطح پر مالیکیولر تشخیصات بیماری اور صحت دونوں میں سیلولر آرگنائزیشن اور ٹشو ہیٹروجنیٹی کا تفصیلی جائزہ فراہم کرکے حیاتیاتی تحقیق کو تیز کر سکتے ہیں۔ انسانگردہپیچیدہ کثیر سیلولر ریاستیں مختلف فعالیت کے ساتھ ہیں، جن میں سے زیادہ تر کو اب قریب ترین واحد خلیے کی سطح پر ٹشو پروٹومکس میں حالیہ تکنیکی ترقی کے ساتھ مکمل طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ہم عام انسان کے ذیلی حصوں کے تجزیہ کے لیے اس ماس اسپیکٹومیٹری (MS) پر مبنی پروٹومکس طریقہ کے پہلے اطلاق میں بنیادی اقدامات پر تبادلہ خیال کرتے ہیں۔گردہ، کڈنی پریسجن میڈیسن پروجیکٹ (KPMP) کے حصے کے طور پر۔ ~30–40 لیزر کیپچرڈ مائیکرو ڈسیکٹڈ کڈنی سیلز کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے 2,500 سے زیادہ انسانی پروٹین کی نشاندہی کی،قریبی نلی نما(PT؛ n=25 پروٹین) اور گلومیرولر (Glom; n=67 پروٹین) کے علاقےگردہاور ان کے منفرد میٹابولک افعال۔ یہ پائلٹ اسٹڈی ہمارے قریبی سنگل سیل پروٹومکس ورک فلو کے استعمال کے لیے دوسرے رینل مائیکرو کمپارٹمنٹس کے تجزیے کے لیے، بڑے پیمانے پر، عام گردے میں رینل ذیلی سیلولر فنکشن کے ساتھ ساتھ مختلف ایٹولوجیز کو کھولنے کے لیے روڈ میپ فراہم کرتی ہے۔ شدید اور دائمیگردے کی بیماری.

cistanche گردے کے کام کو بہتر بنا سکتا ہے۔

تعارف

مالیکیولر پروفائلنگ میں حالیہ پیشرفت، خاص طور پر ایک خلیے کی سطح پر نقلی تجزیہ، متضاد طبی بافتوں کے اندر خلیے کی نایاب آبادی کو ننگا کر سکتا ہے، جو گردے کی حیاتیات، اور اس کے سالماتی عمل (1–7) کے بارے میں ہماری سمجھ میں معاون ثابت ہو رہا ہے۔ ایسے طریقے تیار کرنے کی ضرورت ہے جو RNA اور DNA کی سطح پر جامع حیاتیاتی معلومات فراہم کر سکیں اور سنگل سیل پروٹومک ٹشوز کے تجزیہ کی بھی اجازت دیں۔

پروٹومک ٹیکنالوجیز، جینومکس کے برعکس، سیلولر ریاستوں اور ریگولیٹری نیٹ ورکس (2) پر فعال معلومات فراہم کر سکتی ہیں۔ ماس سپیکٹروسکوپی (MS) پر مبنی پروٹومکس کے لیے ایک تکنیکی چیلنج مواد کی شروعات کی حد ہے۔ ٹرانسکرپٹومکس کے برعکس، پروٹومکس مالیکیولر ایمپلیفیکیشن کی اجازت نہیں دیتا ہے۔ اس حقیقت کے نتیجے میں ایم ایس پر مبنی پروٹومکس کی تجزیاتی حساسیت کو بڑھانے کی خاطر خواہ کوششوں کا نتیجہ نکلا ہے، جس میں ٹیکنالوجی کی مائنیچرائزیشن اور الیکٹرو اسپرے آئنائزیشن سورس (8, 9) میں اعلیٰ افادیت شامل ہے، اس طرح کہ تجزیاتی حساسیت اب سنگل مموں میں پروٹین کا پتہ لگانے کے لیے کافی ہے۔ خلیات اعلی تجزیاتی حساسیت کے باوجود، چھوٹے نمونوں کے حجم میں پروٹومک ایپلی کیشنز نے اضافی چیلنجز متعارف کرائے ہیں، جیسے کہ ری ایکشن ٹیوبوں کی سطحوں پر پروٹین اور پیپٹائڈس کا غیر مخصوص جذب، ہاضمہ کی ناکارہ حرکیات، صفائی کی ضرورت، اور ترسیل کے ساتھ چیلنجز۔ ہمارے گروپ نے حال ہی میں HeLa خلیات میں قریبی سنگل سیل پروٹومکس (nscProteomics) کے طریقہ کار کے بارے میں اطلاع دی ہے، جو کہ ایک چھوٹی سی تعداد (10) سے پروٹین کی ذیلی نانوگرام مقدار کے ساتھ نمونوں کی پروٹوم پیمائش کے لیے انتہائی جدید اور حساس ٹیکنالوجی فراہم کرتا ہے۔ اس طریقہ کار کے لیے انتہائی حسب ضرورت نمونہ پروسیسنگ آلات کی ضرورت ہوتی ہے اور اس کی ترقی کی موجودہ حالت میں دیگر تحقیقی لیبز میں منتقل کرنا مشکل ہے۔ پروسیسنگ انسانگردہاس پائپ لائن کے ذریعے ٹشوز کو پروٹوکول کی ترقی پر گہری توجہ کی ضرورت ہے تاکہ ٹشو کے تحفظ اور سیل کیپچر کو بہتر بنایا جا سکے۔

اس مطالعہ میں، ہم نے مختلف ذیلی حصوں کی پروٹومک تفتیش کی کامیاب پیمائش کے لیے ایک روڈ میپ فراہم کرنے پر توجہ مرکوز کی ہے۔گردہ, قریبی واحد سیل کی سطح پر، درج ذیل ڈیلیوری ایبلز کے ساتھ: (i) nscProteomics کے لیے بہترین گردے کے ٹشو جمع کرنے اور ذخیرہ کرنے کا اندازہ؛ (ii) nscProteomics کے لیے مناسب حوالہ معیار کی شناخت؛ (iii) لیزر کیپچر مائکروڈیسیکشن (LCM) کے لیے گردے کے ٹشو کی موٹائی کی اصلاح؛ (iv) LCM پیرامیٹرز کی اصلاح؛ (v) LC-MS پر مبنی، مکمل طور پر خودکار مائیکرو POTS طریقہ استعمال کرتے ہوئے nscProteomics طریقہ کی تفصیل (μPOTS؛ ٹریس نمونوں کے لیے ایک برتن میں پروسیسنگ) (11)؛ (vi) ڈیٹا اینالیٹکس برائے nscProteomics۔

مذکورہ بالا کاموں کو حاصل کرنے کے لیے، ہم نے 11 منفرد انسانوں پر کارروائی کی ہے۔گردہبایپسی اور انسان کے پروٹومک اظہار کو جمع کرنے، عمل کرنے اور پوچھ گچھ کرنے کے لیے تیار کردہ پروٹوکول اور طریقہ کارگردہنمونے بذریعہ μPOTS۔ جب انتہائی حساس LC-MS کے ساتھ مل کر، ہم ایک مکمل طور پر خودکار μPOTS طریقہ کی نمائش کرتے ہیں جو تولیدی صلاحیت کو قابل بناتا ہے اور 10 سے 100 لیزر کیپچر مائیکرو ڈسیکٹڈ (LCM) گردے کے خلیوں تک ~3،000 پروٹین کی مقداری پروٹومک پیمائش فراہم کرتا ہے۔ کوریج کی سطح صرف ہزاروں سیلوں (12-17) کے لیے پہلے حاصل کی گئی تھی۔ یہ مطالعہ شدید اور دائمی گردے کی بیماری کی مختلف وجوہات والے مریضوں کے گردے کی بایپسی میں ٹشو سیلولر ہیٹروجنیٹی اور پیتھالوجی کی مالیکیولر خصوصیات کے لیے مدد کرے گا۔ یہ انوکھی ٹیکنالوجی پروٹومک ہیٹروجنیٹی اور منفرد پروٹین مارکر کو مختلف طریقوں سے کھولنے کی صلاحیت رکھتی ہے۔گردہبیماری کی ذیلی اقسام اور ذیلی ڈھانچے جو بیماری کے روگجنن، تشخیص، اور خطرے کی سطح بندی سے مربوط ہوں گے۔ مطالعہ کا خلاصہ شکل 1 میں کیا گیا ہے۔

شکل 1. قریب ترین سنگل سیل پروٹومکس (nscProteomics) ورک فلو کو انسانی پروسیسنگ کے لیے بہتر بنایا گیا ہے۔گردہٹشوز ورک فلو میں بہترین کی شناخت شامل ہے۔گردہٹشو اکٹھا کرنا اور ذخیرہ کرنا، گردے کے خلیوں کے لیے لیزر کیپچر مائیکرو ڈسیکشن کے قیام کے لیے کوالٹی کنٹرولز nscProteomics طریقہ کار۔

تجرباتی طریقہ کار

مطالعہ ڈیزائن

11 منفرد انسانی معمول پر کیے گئے پروٹومک مطالعات کی منصوبہ بندی کی نمائندگیگردےشکل 2A میں دکھایا گیا ہے۔ بلک اور لیزر کیپچر مائیکرو ڈسیکٹڈ (LCM) nscProteomics کے لیے کل 28 ماس اسپیکٹومیٹری (MS) رنز جوڑے والے گلومیرولر (Glom) اور proximal convoluted tubular (PT) سیکشنز پر کیے گئے۔ پہلے دو سے ٹشوزگردےFFPE کے طور پر اور بہترین کٹنگ ٹمپریچر کمپاؤنڈ (OCT) میڈیم میں محفوظ تھے۔ 9 مزید گردوں سے گردے کے ٹشوز کے مسائل پر صرف OCT (شکل 2A) میں کارروائی کی گئی۔

شکل 2. (A) مطالعہ کے نمونوں اور اسیسز کا خلاصہ۔ (B) OCT ٹشو کا استعمال کرتے ہوئے عمل کی تولیدی صلاحیت کے لیے QC پلاٹ۔ او سی ٹی ٹشو کا استعمال کرتے ہوئے 2 الگ الگ رنز کے لئے پروٹین کے درمیان سپیکٹرل گنتی کے فرق کو 1،257 پروٹینوں کے لئے اوسط پروٹین سپیکٹرل گنتی کے خلاف تیار کیا گیا تھا۔ پلاٹ میں، نیلی لکیر مطلب فرق کو ظاہر کرتی ہے۔ سرخ اور سبز لائنیں بالترتیب 2 SD اور 3 SD کی حدود کو ظاہر کرتی ہیں۔ 97.96 فیصد پروٹین 13.52 کی حساب سے تولیدی صلاحیت کی حد کے اندر ہیں جو اعلی درجے کی تولیدی صلاحیت کو ظاہر کرتا ہے۔ یہ بھی دیکھا گیا ہے کہ OCT ٹشو پر مشتمل عمل کی انٹر-رن تغیر پذیری FFPE ٹشو پر مشتمل عمل سے کم ہے (حساب تولیدی حد: 24.43)۔ (C) OCT اور FFPE میں 374 عام پروٹینوں کی سپیکٹرل گنتی کی تقسیم کا موازنہ۔ او سی ٹی ٹشو سے پروٹین کی ایک بڑی تعداد اعلی اسپیکٹرل گنتی کو ظاہر کرتی ہے جبکہ ایف ایف پی ای ٹشو سے پروٹین کے لیے کم اسپیکٹرل گنتی کی زیادہ اہمیت دیکھی جاتی ہے۔ (D) FFPE میں 76 منفرد پروٹینوں اور OCT میں 244 منفرد پروٹینوں کی سپیکٹرل گنتی کی تقسیم کا موازنہ۔ او سی ٹی ٹشوز میں کم اسپیکٹرل کاؤنٹ پروٹین کی زیادہ اہمیت دیکھی جاتی ہے۔ یہ اس بات کی نشاندہی کر سکتا ہے کہ موجودہ منظر نامے میں کم وافر پروٹین کا پتہ لگانے کے لیے OCT ٹشو تکنیک بہتر ہے۔ 2 OCT منجمد ٹشوز سے شناخت شدہ پروٹین کے درمیان ارتباط کا گتانک 0.96 (P < 0.001)="">

گردے کے ٹشو کے نمونے کا حصول

انسانگردے کے ؤتکوںNIH کڈنی پریسجن میڈیسن میں پائلٹ ٹیکنالوجی فزیبلٹی اسٹڈی کے حصے کے طور پر، منظور شدہ IRB کے ساتھ، یونیورسٹی آف کیلیفورنیا سان فرانسسکو (UCSF) اور یونیورسٹی آف مشی گن (UM) سے حاصل کردہ کل 11 غیر شناخت شدہ جزوی نیفریکٹومیز سے جمع کیے گئے تھے۔ پروجیکٹ (KPMP)۔ کے صرف صحت مند علاقےگردہجیسا کہ ایک تربیت یافتہ پیتھالوجسٹ نے اس مقصد کے لیے استعمال کیا تھا۔ نمونوں کو گمنام کیا گیا تھا صرف انتباہ کے ساتھ کہ ٹشوز بالغوں سے جمع کیے گئے تھے۔ ٹکنالوجی کے لیے بہترین نمونہ جمع کرنے کے پروٹوکول کا اندازہ لگانے کے لیے، ابتدائی طور پر، ~102 گردوں سے 0 ملی گرام ٹشو کو مساوی طور پر تقسیم کیا گیا تھا اور یا تو فارمیلین فکسڈ پیرافین ایمبیڈڈ (FFPE) ٹشو سیکشن کے طور پر تیار کیا گیا تھا یا اسے منجمد کیا گیا تھا۔ Tissue-Plus™ OCT کمپاؤنڈ (فشر سائنٹیفک)۔ ہر OCT بلاک سے ایک 5 μm اور تین 10 μm موٹے سیکشنز کو کرائیو مائیکروٹوم کے ساتھ کاٹا گیا تھا اور 1.0 پولی تھیلین ٹیریفتھلیٹ (PET) میمبرین سلائیڈز (Zeiss) پر گلومیرولر اورproximal tubuleڈسکشن بڑے ہسٹولوجیکل ڈھانچے کے تصور کے لئے 5 μm موٹا حصہ H&E داغدار تھا۔ بقیہ 10 μm موٹے حصوں کو داغدار چھوڑ دیا گیا تھا۔ تمام سلائیڈز کو الگ کرنے تک −80 ڈگری پر محفوظ کیا گیا تھا۔

گردے کی خرابی کو بہتر بنانے کے لیے سیستانچ

پروٹومک آؤٹ پٹ پر ٹشو شپمنٹ اور پروسیسنگ کے اثرات کا اندازہ

OCT منجمد ٹشو کے پروٹومک تجزیہ پر تاخیر کے اثرات کا اندازہ لگانے کے لیے،گردہtissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 گھنٹے کا سفر، اور دوسرے مرکز پر کارروائی کی گئی، اور اس کے برعکس۔ بلک پروٹومکس دو 2 منفرد پر انجام دیا گیا تھا۔گردے(کڈنی #3، #4)، مشی گن یونیورسٹی سے حاصل کیا گیا، اور دونوں سائٹس پر ایک جیسے پروٹوکول اور MS پیرامیٹرز کا استعمال کرتے ہوئے MS تجزیہ کے لیے 2 مختلف مقامات (اوہائیو اسٹیٹ یونیورسٹی اور UCSF) پر بھیج دیا گیا۔ MS رنز کے نتائج کا پھر 2 سائٹس کے درمیان موازنہ کیا گیا۔

پروٹین نکالنا اور بارش

یہ ٹشو پروٹومکس کے لیے بہترین طریقہ کے انتخاب کے لیے OCT اور FFPE ٹشو پریپ طریقوں دونوں پر کیا گیا تھا۔ او سی ٹی ٹشو کو کریومائکروٹوم کا استعمال کرتے ہوئے 10 μm موٹی حصوں میں تقسیم کیا گیا تھا۔ MS کے لیے پروٹین نکالنے کے لیے ضروری ٹشو کی کم سے کم مقدار کو منتخب کرنے کے لیے، تین کرل (ایک سیکشن جسے سلائیڈ پر پھیلانے کے بجائے ایپنڈورف ٹیوب میں ڈالا جاتا ہے)، اور منجمد ٹشو کے 5 کرل کو کاٹا، پگھلا، اور مائیکرو سینٹرفیوج ٹیوبوں میں منتقل کیا گیا۔ 5 ملی میٹر سٹینلیس سٹیل کی مالا (کیجین) پر مشتمل، ممالیہ سیل لائسس بفر کے سامنے (بشمول بینزونیس® نیوکلیز اور پروٹیز انحیبیٹر حل؛ کیجین)، اور 3 منٹ کے لیے 50 r/s پر TissueLyser LT (Qiagen) میں ہم آہنگ۔ پروٹین کے ارتکاز کی مقدار درست کی گئی تھی (بریڈفورڈ پرکھ؛ تھرمو سائنٹیفک) اور استعمال تک −20 ڈگری پر ذخیرہ کیا گیا تھا۔ ٹشو کے لیے ذخیرہ<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

ٹرپسن ہاضمہ

کل پروٹین کا تقریباً 150 ug (دستیاب ان پٹ کا ~ 15 فیصد) کو کم کرنے والے ایجنٹوں (200 mM DTT اور 100 mM Tris-HCl) اور الکائیلیٹنگ ریجنٹس (200 mM iodoacetamide اور 100 mM Tris-HCl) کا سامنا کرنا پڑا۔ اور پھر RNAse/DNAse مفت پانی سے پتلا کر کے یوریا کی ارتکاز کو 0.6 M تک کم کر دیا گیا۔ Porcine Trypsin (Sigma) کے چار ug شامل کیے گئے اور نمونہ 37 ڈگری پر ہضم ہوا۔ پروٹین کے ارتکاز کی مقدار درست کی گئی تھی (بریڈفورڈ پرکھ؛ تھرمو سائنٹیفک) اور ایم ایس کے لیے 10 یو جی پروٹین کا استعمال کیا گیا تھا۔

زیادہ سے زیادہ گردے کے ٹشو پروسیسنگ کے طریقہ کار کا اندازہ لگانے کے لیے بلک پروٹومکس کے لیے ایم ایس

ٹرپٹک پیپٹائڈ مرکب کو فارمک ایسڈ کے ساتھ تیزاب کیا گیا تھا، اسے C18 مونو اسپن کالموں سے صاف کیا گیا تھا، اور Orbitrap Q Exactive HF-X (تھرمو سائنٹیفک) پر تجزیہ کیا گیا تھا۔ MS/MS کو ہائر انرجی سی-ٹریپ ڈسوسی ایشن (HCD) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ ماس سپیکٹرا کا تجزیہ بائیونک v2.14.27 (پروٹین میٹرکس) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا جس سے 12 پی پی ایم بڑے پیمانے پر رواداری کی اجازت دی گئی۔ متغیر پوسٹ ٹرانسلیشنل ترمیمات کی اجازت دی گئی تھی، بشمول آکسیڈیشن، میتھیلیشن، کاربامیلیشن، اور فاسفوریلیشن۔ پروٹین صرف 1 فیصد جھوٹی دریافت کی شرح (FDR) سے بہتر اسکور کرنے والوں تک محدود تھے۔ پروٹین کی کثرت اور ایم ایس ڈیٹا کا موازنہ اس کے لیے بہترین طریقہ منتخب کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔گردہFFPE اور OCT کے درمیان ٹشو جمع کرنا۔

لیزر کیپچر مائکروڈیسیکشن

پی ای ٹی سلائیڈوں پر لگائے گئے غیر داغدار 5، 10، اور 20 μM موٹے حصے زیس پالم مائیکرو بیم لیزر مائیکروڈیسیکشن سسٹم (زیس) کے اسٹیج پر رکھے گئے تھے تاکہ زیادہ سے زیادہ کاٹنے کی موٹائی کو جانچ سکیں۔ گلومیرولر اورproximal tubuleخطوں کو فری ہینڈ ٹول کا استعمال کرتے ہوئے منتخب کیا گیا تھا اور 10X مقصد پر تقسیم کیے گئے تھے۔ ~ 4,580 μm2 رقبہ اور 10 uM موٹائی والے حصے پکڑے گئے تھے، جو ایک صحت مند بالغ میں گلوومیریلر خلیوں کے تخمینے کے پہلے شائع شدہ فارمولے کی بنیاد پر ~ 40 گلومیریولر سیلز کے لیے بنائے گئے تھے۔گردہ(18)۔ کے لئےقریبی نلی نماخلیات، ہم نے ~ 2,900 μm2 پر قبضہ کیا۔قریبی نلی نماخلیات، جو ~ 36 خلیات کے حساب سے ہیں۔ کٹ حصوں کو 200 μL مبہم چپکنے والی کیپ (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) میں کیپٹلٹ کیا گیا تھا اور −80 ڈگری پر محفوظ کیا گیا تھا۔

قریبی-سنگل-سیل-پروٹومکس (nscProteomics)

LCM کے ساتھ کیپچر کیپس میں جمع کیے گئے پروٹین کو حل کرنے کے لیے، 0.1 فیصد DDM 50 mM Tris pH 8 کا 10 μL قطرہ براہ راست ٹوپی میں شامل کیا گیا تھا۔ بخارات کو کم کرنے کے لیے ایپنڈورف تھرمو ٹاپ تھرمو مکسر میں نمونوں کو 37 ڈگری پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا، اس کے بعد لیسیٹ کو شیشی میں منتقل کرنے کے لیے 2، 000 × g پر 1 منٹ کے لیے سینٹرفیوگریشن کیا گیا۔ پروٹین کو 5 ایم ایم ڈیتھیوتھریٹول کے ساتھ کم کیا گیا اور 30 ​​منٹ کے لئے 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ اندھیرے میں 25 ڈگری پر 45 منٹ انکیوبیشن کے ساتھ 10 ایم ایم آئوڈوسیٹامائڈ پر الکیلیشن کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، Ls-C کا 10 ng aliquot شامل کیا گیا جس کے بعد 25 ڈگری پر 3 گھنٹے کا انکیوبیشن ہوا۔ اس کے بعد ٹرپسن کا 10 این جی ایلی کوٹ شامل کیا گیا جس کے بعد 25 ڈگری پر راتوں رات ہاضمہ ہوا۔ ہضم شدہ پیپٹائڈس کو 18 MΩ پانی کے 15 μL ایلیکوٹ کے ساتھ ملایا گیا تھا۔

الٹرا سمال نمونوں کے لیے LC-MS پلیٹ فارم

پیپٹائڈ کے نمونے (25 μL) کو 60 سینٹی میٹر کالم کا استعمال کرتے ہوئے الگ کیا گیا تھا، جس میں 50 μm اندرونی قطر اور ایک مربوط ایمیٹر (نیا مقصد) تھا۔ کالم 1.7 μm قطر واٹرس BEH میڈیا کے ساتھ اندرون خانہ پیک کیے گئے تھے۔ Dionex Ultimate 3000 RSLC نینو پمپ (تھرمو سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے ایک 100- منٹ گریڈینٹ تیار کیا گیا تھا۔ اس نظام کو QExactive Plus ماس اسپیکٹومیٹر (Thermo Scientific) سے جوڑا گیا تھا۔ ماس سپیکٹرا کو 300 سے 1,800 m/z تک جمع کیا گیا تھا، جس میں ڈیٹا پر منحصر حصول کے ٹاپ 12 طریقہ استعمال کیے گئے تھے۔ MS1 سپیکٹرا 35K کے بڑے پیمانے پر ریزولوشن کے ساتھ اور MS2 کو 17.5K کے ساتھ جمع کیا گیا تھا۔ ایک 100 ms زیادہ سے زیادہ IT کا استعمال کم کثرت والے آئنوں سے شناخت بڑھانے کے لیے کیا گیا تھا۔

پروٹومک ڈیٹا نکالنا

تمام خام فائلوں کو خصوصیت کا پتہ لگانے، ڈیٹا بیس کی تلاش اور پروٹین/پیپٹائڈ کوانٹیفیکیشن (19) کے لیے میکس کوانٹ (ورژن 1.5.3.30) کا استعمال کرتے ہوئے پروسیس کیا گیا تھا (10) ٹینڈم ماس سپیکٹرا کو UniProtKB/Swiss-Prot انسانی ڈیٹا بیس میں تلاش کیا گیا (29 دسمبر 2018 کو ڈاؤن لوڈ کیا گیا اور 20,417 جائزہ شدہ اندراجات پر مشتمل ہے)۔ nscProteomics کے لیے MS پروٹومکس ڈیٹا ڈیٹاسیٹ شناخت کنندہ PXD015058 اور 10.6019/PXD015058 کے ساتھ PRIDE (20) پارٹنر ریپوزٹری کے ذریعے ProteomeXchange Consortium میں جمع کر دیا گیا ہے۔

ڈیٹا تجزیہ

ایم ایس ڈیٹا پی این این ایل (این ایس سی پروٹومکس) اور اسٹینفورڈ یونیورسٹی (بلک پروٹومکس) میں انجام دیئے گئے رنز سے حاصل کیا گیا تھا۔ بلک پروٹومکس کے لیے۔ بہترین کے انتخاب کے لیے درج ذیل شماریاتی طریقے استعمال کیے گئے۔گردہٹشو جمع کرنے کا طریقہ، یا تو OCT میں منجمد کیا گیا یا FFPE کے طور پر پروسیس کیا گیا، جیسا کہ مقداری ٹشو بلک پروٹومکس سے اندازہ لگایا گیا، (i) مساوی ان پٹ ٹشو کی پروٹین کی پیداوار/ملی گرام کا حساب لگایا گیا؛ (ii) MS کی تولیدی صلاحیت کا تجربہ 2 گردوں میں سے ہر ایک سے FFPE اور OCT سیکشنز سے MS آؤٹ پٹ پر کیا گیا، ایک ہی پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے ایک ہی فرد کے ذریعہ تیار کیا گیا، کچھ دنوں کے علاوہ سیٹ پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے اسی MS انسٹرومنٹ پر تجزیہ کیا گیا (21)۔ تولیدی صلاحیت کی حد (22) کا استعمال کسی ایک عمل کے لگاتار رنز کے درمیان پیمائش کے فرق کے ساتھ ساتھ عمل کے درمیان موازنہ کے لیے درستگی کا تخمینہ فراہم کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ ارتباط کے گتانک، جو یکے بعد دیگرے رنز کے درمیان معاہدے کی ڈگری فراہم کرتا ہے (ایک ہی ٹشو کا استعمال کرتے ہوئے)، شمار کیا گیا تھا۔ (iii) پروٹین کی کثرت اور پیپٹائڈ فریگمنٹ سائز کی تقسیم کا حساب پروٹین کے انحطاط، فارملین کی وجہ سے کراس لنکنگ وغیرہ سے پیدا ہونے والی تغیرات کا جائزہ لینے کے لیے کیا گیا۔گردہحوالہ اور (v) تعصب کا حساب۔ سخت مقداری تجزیہ اور منفرد پروٹینوں کی شناخت صرف 5 (23) سے زیادہ یا اس کے برابر سپیکٹرل گنتی والے پروٹین کے ساتھ ڈیٹا استعمال کرتی ہے۔ فشر کے عین مطابق ٹیسٹ کا استعمال عام اور منفرد پروٹین کی افزودگی کا اندازہ لگانے کے لیے کیا گیا تھا جو دو عام انسانی گردوں (#1 اور #2) کے درمیان میپ کیے گئے تھے۔ مندرجہ بالا تجزیہ کی بنیاد پر (نتائج دیکھیں)، OCT منجمد ٹشو کو بعد کے تمام تجزیوں کے لیے جمع کرنے کے طریقہ کار کے طور پر منتخب کیا گیا تھا۔

اعداد و شمار کے تجزیہ کی توجہ کا اگلا مرحلہ دو منتخب کردہ ہر ایک سے حاصل کردہ ~ 10-100 سیلوں میں افزودہ یا مخصوص پروٹین سیٹوں کی شناخت، مقدار درست کرنا اور ان کی توثیق کرنا تھا۔گردہذیلی کمپارٹمنٹس—گلوم اور پی ٹی ریجنز، اسی سے حاصل کیے گئے ہیں۔گردہ، OCT منجمد کے بلک اور LCM کے ذریعہگردے کے ٹشو(n=9؛ گردے #3–11) اور nscProteomics کے ذریعے چلایا جاتا ہے۔

گمشدہ/نامکمل ڈیٹا کے مسائل سے نمٹنے کے لیے ایک {{0}} قدمی نیم قدامت پسند فلٹرنگ اپروچ اپنایا گیا، اور G-ٹیسٹ (24) کا استعمال اس بات کی شناخت کے لیے کیا گیا کہ آیا ڈیٹا بے ترتیب (MAR) میں غائب تھا۔ یا مسنگ ناٹ اٹ رینڈم (MNAR)۔ اضافی ڈیٹا کی وشوسنییتا کا جائزہ تمام نمونوں کے 50 فیصد سے زیادہ یا اس کے برابر میں مشاہدہ شدہ پروٹینوں کو سختی سے منتخب کرکے کیا گیا تھا۔ ٹی ٹیسٹ کا استعمال گلومنگ یا پی ٹی میں نمایاں طور پر پروٹین کی افزودگی کی شناخت کے لیے کیا گیا تھا اور 0.1 کی اہمیت کی حد کے ساتھ ایک سے زیادہ ٹیسٹنگ تصحیح (Benjamini-Hochberg FDR) کا اطلاق کیا گیا تھا۔ تجزیہ کے مقاصد کے لیے، Glom، PT، اور ایک واحد سے بلک فریکشنز سے حاصل کردہ رشتہ دار شدت کا MS ڈیٹا (لاگ 2 تبدیل)گردہجوڑا سمجھا جاتا تھا۔ ہم نے Glom میں افزودہ پروٹین کی شناخت کی (PT/ بلک میں کم سطح کے ساتھ)، اور Glom سے منفرد (PT میں غیر حاضر) کے ساتھ ساتھ PT میں افزودہ پروٹین (Glom/ بلک میں کم سطح کے ساتھ) اور PT کے لیے منفرد (گلوم میں غیر موجود) . افزودگی کا تجزیہ صرف اعداد و شمار پر کیا گیا تھا بغیر ہر گروپ میں اعتماد میں اضافہ کرنے کے لیے قدروں کی کمی کے۔ عام پروٹینوں کی کثرت کی قدروں کے درمیان ارتباط کو ایک ہی تجربے کے الگ الگ رنز کے درمیان افزودہ ذیلی کمپارٹمنٹ پروٹین کے درمیان معاہدے کی ڈگری کا اندازہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ ہم نے 2 مختلف رن، رن 1 اور رن 2 کے درمیان منفرد نمونوں کے سیٹ سے ان موازنہوں کو پارس کر کے ہر ایک کمپارٹمنٹ میں نمایاں طور پر افزودہ پروٹین کی کراس توثیق بھی کی۔ یہ استفسار کرنا کہ کیا معلوم ذیلی کمپارٹمنٹ افزودہ پروٹین کو ہیومن پروٹین اٹلس (https://www.proteinatlas.org/) (25) سے عوامی ڈیٹا میں ان کے مخصوص علاقوں میں واپس مقامی کیا جا سکتا ہے۔

گردے کی خرابی کی علامات کے لیے Cistanche

کراس اومکس ڈیٹا کا موازنہ/انٹیگریشن

آر این اے کی سطح پر پروٹین کے اظہار کی ہم آہنگی کا اندازہ لگانے کے لیے، 10 مقامی نیفریکٹومیز پر کیے گئے سنگل سیل آر این اے سیکوینسنگ (scRNA Seq) سے تیار کردہ ڈیٹا کا استعمال کیا گیا، جن میں سے 9 اس کے ساتھ اوورلیپ ہو رہے تھے۔گردےnscProteomics میں استعمال کیا جاتا ہے۔ اس کے لیے، V3 کیمسٹری کے ساتھ 10x جینومکس کرومیم پلیٹ فارم کو KPMP کنسورشیم کی ٹشو انٹروگیشن سائٹ (TIS) کے طور پر سروال لیب میں آپٹمائزڈ طریقہ استعمال کرتے ہوئے استعمال کیا گیا تھا (طریقہ کار اور نتائج کی تفصیل دینے والا ایک مخطوطہ زیر تیاری ہے)۔ اس کراس اومکس تجزیہ کے لیے، ہم نے 45,411 سے ٹرانسکرپٹوم ڈیٹا استعمال کیا۔گردہخلیات نو بڑے خلیوں کی اقسام میں حل ہوئے: پوڈوکیٹس، میسنجیئل سیل، گلومیرولر اینڈوتھیلیم، اسٹروما/انٹرسٹیٹیم، مدافعتی خلیات،proximal tubule, ہینلے کے لوپ کا موٹا چڑھتا ہوا اعضاء، ڈسٹل/جوڑنے والی نلی، اور جمع کرنے والی نالی۔ سنگل سیل ڈیٹا کا تجزیہ Seurat R پیکیج ورژن 2.3.4 کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ اس ڈیٹا کا مزید گہرائی سے تجزیہ جاری ہے (26)۔

منجانب: 'قریب سنگل سیل پروٹومکس پروفائلنگ آف دیProximal Tubularاورگلومیرولسعام انسان کیگردہتارا کے سگڈیل 1، پال ڈی پیہووسکی 2، سودیشنا رائے 1، جولین لیبرٹو 1، جوشوا آر۔ ہینسن2، ایڈم سی سوینسن2، روئی ژاؤ 3، ینگ زو 3، پریانکا رشمی 1، اینڈریو شروڈر1، ایزابیلا ڈیم 1، سواستیکا جے لوباو، 4 Yang4، Wei-Jun Qian2* اور Minie M. Sarwal1* کے لیےگردہپریسجن میڈیسن پروجیکٹ (KPMP) کنسورشیم

---اصل تحقیقی مضمون فرنٹ۔ میڈ، 17 ستمبر 2020 |