مقامی غیر پٹیوٹری گروتھ ہارمون بڑھاپے کے ساتھ متاثر ہوتا ہے اور اپیٹیلیل کو پہنچنے والے نقصان کو آسان بناتا ہے۔

از راہ کرم رابطہ کریںoscar.xiao@wecistanche.comمزید معلومات کے لیے

خلاصہ

عمر سے متعلق DINA نقصان کو ماڈیول کرنے والے مائکرو ماحولیاتی عوامل واضح نہیں ہیں۔ غیر پٹیوٹری گروتھ ہارمون (این پی) انسانی بڑی آنت، غیر تبدیل شدہ انسانی بڑی آنت کے خلیات، اور فائبرو بلاسٹس، اور عمر سے وابستہ ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کے ساتھ 3- جہتی آنتوں کے آرگنائڈز میں پیدا ہوتا ہے۔ آٹوکرائن/پیراکرائن npGH p53 کو دباتا ہے اور TRIM29 کو شامل کرکے اور ATM فاسفوریلیشن کو کم کرکے DNA ڈیمیج رسپانس (DDR) کو کم کرتا ہے، جس سے DNA کی مرمت اور DNA کو پہنچنے والے نقصان کو کم کیا جاتا ہے۔ 4 ماہ تک مہذب آرگنائڈز عمر بڑھنے والے مارکر، p16، اور SA- -galactosidase کو ظاہر کرتے ہیں اور telomere کی لمبائی میں کمی کے ساتھ ساتھ DNA کو پہنچنے والے نقصان کو جمع کرتے ہیں، جس میں npGH میں اضافہ ہوتا ہے، p53 کو دبایا جاتا ہے، اور کم DDR ہوتا ہے۔ عمر رسیدہ آرگنائڈز میں GH کو دبانے سے p53 بڑھتا ہے اور ڈی این اے کے نقصان کو کم کرتا ہے۔ ڈبلیو ٹی چوہے عمر پر منحصر بڑی آنت کے ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کو ظاہر کرتے ہیں، جب کہ بڑی عمر کے چوہوں میں بڑی آنت کے جی ایچ سگنلنگ سے محروم ہوتے ہیں، ڈی این اے کو پہنچنے والا نقصان کم رہتا ہے، جس میں p53 بلند ہوتا ہے۔ چونکہ عمر سے وابستہ این پی جی ایچ انڈکشن ایک پرو پرولیفیریٹو مائیکرو ماحولیات کو قابل بناتا ہے، این پی جی ایچ سگنلنگ کو منسوخ کرنے کو ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان اور عمر سے متعلق پیتھالوجیز کو روک کر اینٹی ایجنگ تھراپی کے طور پر نشانہ بنایا جا سکتا ہے۔

تعارف

عمر بڑھنے کے ساتھ ساتھ عمر سے متعلق بیماری میں اضافے کے ساتھ حیاتیاتی افعال میں کمی آتی ہے۔flavonoidsعمر سے متعلقہ پیتھالوجی ڈی این اے کو جمع ہونے والے نقصان اور ڈی این اے کی مرمت میں کمیوں سے چلتی ہے جو اتپریورتنوں اور عمر سے وابستہ کروموسومل خرابی کا سبب بنتی ہے۔ ڈی این اے کا مستقل نقصان سیل کے پھیلاؤ کو بھی روک سکتا ہے، جس کے نتیجے میں سنسنی اور اپوپٹوسس ہوتا ہے، اس طرح عمر بڑھنے کے عمل کو مزید آگے بڑھاتا ہے (او اور شوماکر، 2018)۔ ڈی این اے کا نقصان جنگلی قسم (WT)، غیر تبدیل شدہ انسانی اور مورین خلیوں میں عمر کے ساتھ جمع ہوتا ہے، جیسا کہ فاسفوریلیٹڈ ہسٹون 2A ویرینٹ (yH2AX) میں اضافہ سے ظاہر ہوتا ہے، جو کہ ڈبل اسٹرینڈ ڈی این اے بریکس (DSBs) کا نشان ہے (Sedelnikova et al. 2004) اور غیر مرمت شدہ DNA نقصان (Dolle et al.,1997; Hasty et al.,2003; Lombard et al., 2005; Petr et al., 2020)۔ ڈی این اے کی خراب مرمت کے نتیجے میں جینومک عدم استحکام سیلولر تبدیلی کے حق میں ہو سکتا ہے (نیگرینی ایٹ ال۔، 2010)۔ ڈی این اے کا نقصان ایٹیکسیا-ٹیلانجییکٹاسیا-میوٹیٹڈ (اے ٹی ایم) جینوں کے فاسفوریلیشن کو متحرک کرتا ہے، جو سنگل اسٹرینڈ ڈی این اے بریکس اور ڈی ایس بی کی مرمت کے لیے ذمہ دار ہے۔ اے ٹی ایم فاسفوریلیٹس اور ٹیومر دبانے والے p53 کو مستحکم کرتا ہے، اس طرح ڈی این اے کی مرمت کے کئی راستوں کو سہولت فراہم کرکے ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کی مرمت کو یقینی بناتا ہے۔ اس طرح، اے ٹی ایم ڈی این اے ڈیمیج رسپانس (ڈی ڈی آر) اور ڈی این اے کی مرمت (او اور شوماکر، 2018) دونوں کو فعال کرنے میں کلیدی کردار ادا کرتا ہے۔

مزید جاننے کے لیے براہ کرم یہاں کلک کریں۔

ATM کا اظہار اور سرگرمی عمر کے ساتھ بگڑتی ہے (Feng et al..2007; Gutierrez-Martinez et al.,2018)، جس کے نتیجے میں عمر سے متعلق فنکشنل p53 نقصان ہوتا ہے اور ڈی این اے کو نقصان اور کروموسومل عدم استحکام کا باعث بنتا ہے (سائمن ایٹ ال، 2009) پرانے چوہوں (فینگ ایٹ ال، 2007) اور بوڑھے افراد (گوکاسیئن ایٹ ال، 2000) سے اخذ کردہ انسانی ڈرمل فائبرو بلاسٹس میں تابکاری جیسے تناؤ کے لیے ردعمل کم ہیں۔ اس طرح، عمر بڑھنے کے نشانات میں ڈی ڈی آر کی سرگرمی میں کمی اور جمع شدہ غیر مرمت شدہ ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کے ساتھ p53 دبانا شامل ہے، یہ سب اپکلا پھیلاؤ کے لیے سازگار ماحول کو قابل بناتے ہیں (لوپیز اوٹن ایٹ ال۔، 2013)۔

جیسا کہ پیٹیوٹری گروتھ ہارمون (GH) کا اخراج عمر کے ساتھ کم ہوتا جاتا ہے، تبدیل شدہ GH سگنلنگ کو عمر بڑھنے کے عمل میں ملوث کیا گیا ہے (Ho and Hoffman,1993) اس کے باوجود، شواہد کا ایک حصہ عمر بڑھنے پر GH کی کشندگی کے فائدہ مند اثرات کی حمایت کرتا ہے۔ سیل میں، murine ، اور انسانی بیماریوں کے ماڈل (Brown-Borg et al., 1996; Junnila et al.,2013)، GH کی کمی کے فوائد بنیادی طور پر ثانوی عوامل کی حمایت کرنے والے مشاہدات سے پیدا ہوتے ہیں جو زندگی کی مدت کو بڑھاتے ہیں، بشمول انسولین کی حساسیت میں اضافہ، جگر کے پروٹین آکسیڈیشن میں کمی ، کینسر کے واقعات میں کمی، اور عمر سے وابستہ سوزش میں کمی (Aguiar-Oliveira and Bartke,2019; Bartke,2016; Junnila et al.,2013; Spadaro et al.,2016)۔ Leiden کی اولاد خاندانی لمبی عمر اور کم عمر والے خاندانوں کا مطالعہ کرتی ہے۔ ماحولیاتی طور پر مماثل کنٹرولز کے مقابلے میں کم مربوط گردش کرنے والی GH کی سطح (van der Spoeletal.,2016) ہے، جبکہ GHexcess عمر کو کم کرتا ہے جیسا کہ ایکرومیگالی کے مریضوں میں دیکھا جاتا ہے (Chesno-kova et al.,2019a; Melmed,2020; Waters and Barclay,200) 7) اور ٹرانسجینک مورائن ماڈلز میں اوور ایکسپریسنگ جی ایچ (بارٹکے، 2003)۔hesperidin استعمال کرتا ہےکچھ لوگوں نے انسانوں میں قد اور لمبی عمر کے درمیان منفی تعلق تجویز کیا ہے (He et al., 2014; Samaras and Storms, 1992) اور کتوں میں (Greer et al., 2007)، ہم نے قیاس کیا کہ عمر بڑھنے پر GH کے منفی اثرات، کم از کم جزوی طور پر، جمع شدہ DNA نقصان (Ches-nokova and Melmed, 2020) سے منسوب کیا جائے۔ اس بنیاد کی حمایت میں، اکرومیگالی کے مریضوں سے حاصل کردہ لیمفوسائٹس بڑھتے ہوئے کروموسومل ابریشن (بیرام ایٹ ال، 2014) کے ساتھ ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کی نمائش کرتے ہیں، جبکہ ڈی این اے کا غیر مرمت شدہ نقصان زیبرا فش ایکرومیگالی ماڈل (ایلبیلی ایٹ ال، 2014) کے جگر میں جمع ہوتا ہے۔ زیادہ گردش کرنے والی GH کی سطح مورین کولون ڈی این اے کی مرمت کو کم کرتی ہے، ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کو متحرک کرتی ہے، جبکہ انسانی بڑی آنت کے خلیوں میں GH ریسیپٹر (GHR) کو روکنے کے بعد اور منسوخ شدہ GHR سگنلنگ (Chesnokova et al.,2019a) کے ساتھ چوہوں میں ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کو کم کیا جاتا ہے۔

غیر پٹیوٹری جی ایچ (این پی) مقامی طور پر پیریفرل ٹشوز میں ترکیب شدہ اینڈوکرائن جی ایچ 1 کی طرح ہے جو پٹیوٹری کے ذریعہ تیار کیا جاتا ہے اور آٹوکرائن/پیراکرائن میکانزم کے ذریعے وسیع پیمانے پر اظہار کردہ GHR (Ballesteros et al.,2000) کے ذریعے کام کرتا ہے جو پٹیوٹری GH اور GH دونوں کو پہچانتا ہے۔ Waters and Barclay, 2007; Waters et al, 2006)۔کھوئی ہوئی سلطنتجیسا کہ DDR ایکٹیویشن npGH(Chesnokova et al.,2013) کو آمادہ کرتا ہے، ہم نے قیاس کیا کہ عمر سے وابستہ جمع بڑی آنت DNA کو پہنچنے والے نقصان سے npGH اظہار ہوتا ہے، جس کے نتیجے میں، DNA کو پہنچنے والے نقصان کی مرمت کو مزید محدود کر دیا جائے گا۔

Cistanche بڑھاپے کو روک سکتا ہے۔

وٹرو اور ایکس ویوو دونوں ہیومن ماڈلز کا استعمال کرتے ہوئے جو کہ ایجنگ کی عکاسی کرتے ہیں، ہم یہاں دکھاتے ہیں کہ این پی جی ایچ کی حوصلہ افزائی ہوتی ہے اور ڈی این اے کا نقصان عمر رسیدہ انسانی بافتوں میں جمع ہوتا ہے، جیسا کہ H2AX فاسفوریلیشن (yH2AX) میں اضافہ سے ظاہر ہوتا ہے۔ مزید برآں، بڑی عمر کے ڈبلیو ٹی چوہوں میں بڑی آنت کے ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان میں نمایاں اضافہ ہوا ہے، جب کہ عمر سے مماثل GHR--چوہوں میں جو GH سگنلنگ سے عاری ہیں اور بڑی آنت کے مخصوص GHR ناک آؤٹ چوہوں (GHRcolKO) میں اپکلا ڈی این اے کا نقصان کم رہتا ہے۔

مقامی npGH کو عمر رسیدہ 3-جہتی (3D) in-testinal organoids میں بھی شامل کیا گیا تھا جو حوصلہ افزائی انسانی pluripotent اسٹیم سیلز (iPSCs) (Barrett et al,2014; Chesnokova et al, 2019a) سے تیار کیا گیا تھا۔ Organoid npGH، بدلے میں، p53 کو دبایا اور DNA کو پہنچنے والے نقصان کی مرمت کو کم کر دیا۔مائکرونائزڈ پیوریفائیڈ فلاوونائڈ فریکشن 1000 ملی گرام استعمال کرتا ہے۔این پی جی ایچ کے اثرات ممکنہ طور پر پیراکرائن تھے، کیونکہ کولن انٹیسٹائن چپ مائیکرو فلائیڈک ڈیوائسز کے ساتھ GH-اظہار کرنے والے فائبرو بلاسٹس کو مشترکہ طور پر کلچر کرنا انسانی کالونائڈز کے ساتھ پی 53/p21 کو دبانے اور ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کو بڑھاتا ہے۔ اس کے برعکس، عمر رسیدہ آرگنائڈز میں GH کو دبانے سے ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کو روکا گیا۔

اس طرح، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ عمر بڑھنے کے دوران اپیٹیلیل این پی جی ایچ کی مضبوطی سے حوصلہ افزائی ہوتی ہے اور یہ کہ این پی جی ایچ ڈی این اے کی مرمت کو کم کرتا ہے اور عمر سے وابستہ ڈی این اے کو نقصان پہنچانے میں سہولت فراہم کرتا ہے۔ مجموعی طور پر، نتائج بتاتے ہیں کہ مقامی بڑی آنت کے اپکلا این پی جی ایچ ایک میوکوسل فیلڈ میں تبدیلی کو متحرک کرتا ہے، جس سے کروموسومل عدم استحکام کا ماحول پیدا ہوتا ہے جو عمر رسیدہ ٹشو میں نوپلاسٹک کی نشوونما کے لیے موزوں ہے۔

اہم بات یہ ہے کہ اگرچہ عمر بڑھنے کے عمل پر زبردست اثر نہ ہونے کے باوجود GH کا ایک "اینٹی ایجنگ" ہارمون کے طور پر بڑے پیمانے پر نامناسب استعمال ہے (Blackman et al.,2002; Clemmons et al..2014; Lieut al.,2007; Melmed,2019)، ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ مقامی GH سگنلنگ ٹشو مائیکرو ماحولیات میں حصہ ڈالتا ہے، جو عمر سے متعلق پیتھالوجیز کی نشوونما کے حق میں ہے۔ منفی اپکلا ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کو روکنے کے لیے مقامی npGH سگنلنگ کو دبانا اس وجہ سے ایک انوولینٹ عمر کے علاج کا ہدف پیش کر سکتا ہے۔ ان مطالعات کے نتائج عمر میں توسیع (یعنی مقامی GH سگنلنگ کی شمولیت کے بجائے دبانے) کے لیے ایک اختراعی نقطہ نظر سے آگاہ کرتے ہیں۔ نتائج

انسانی بڑی آنت کے ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان اور این پی جی ایچ بڑھاپے کے ساتھ جمع ہوتے ہیں۔

عمر سے وابستہ ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کا اندازہ غیر ٹیومر والے انسانی بڑی آنت کے پیرافن ٹشو کے نمونوں میں کیا گیا جو 3 عمر کے گروپوں پر محیط مریضوں کے گروپوں سے اخذ کیا گیا تھا: نوجوان (18-39 سال)، ادھیڑ عمر (40-60 سال)، اور عمر رسیدہ (40-60 سال) 61-88 سال)۔ جب yH2AX کے لیے اسکور کیا گیا تو نوجوان گروہ میں 11 میں سے 3 نمونے (27 فیصد) نے ڈی این اے کو نقصان ظاہر کیا، 16 میں سے 8 (50 فیصد) نے درمیانی عمر میں ڈی این اے کو نقصان ظاہر کیا، اور 18 میں سے 8 (45 فیصد) عمر کے نمونوں نے ڈی این اے کو نقصان پہنچایا (اعداد و شمار) 1A-1C اور 1J)۔

جیسا کہ ہم نے پہلے دکھایا تھا کہ ڈی این اے کا نقصان npGH (Chesnokova et al، 2013) کو اکساتا ہے، ہم نے اس بات کا تعین کرنے کی کوشش کی کہ آیا ڈی این اے کے نقصان کی عمر پر منحصر جمع غیر ٹیومر والی بڑی آنت کے بافتوں میں GH اظہار سے وابستہ ہے۔ جیسا کہ neuroendocrine بڑی آنت کے خلیات (Chesnokova et al، 2016) میں نہیں کا اظہار کیا گیا ہے، ہم نے ان خلیوں کو تجزیہ سے خارج کر دیا۔

اپیتھیلیل جی ایچ اظہار کا پتہ 16 فیصد -17 فیصد عام بڑی آنت کے نمونوں میں پایا گیا جو درمیانی عمر اور عمر کے ساتھیوں (بالترتیب 38 اور 42 نمونے) سے لیا گیا تھا لیکن صرف 2 فیصد نوجوان گروہ (37 نمونے) میں، جبکہ درمیانی عمر کے گروہ میں GH اظہار کے اسکور میں اضافہ کیا گیا تھا اور عمر رسیدہ گروہ کے نمونوں میں مزید اضافہ ہوا تھا (p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">otflavonoidخلاصہ یہ کہ یہ نتائج ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کی طرف اشارہ کرتے ہیں جس میں بڑی آنت میں کوئی شمولیت نہیں ہوتی۔

DDR ایکٹیویشن مقامی npGHin murine اور انسانی بڑی آنت کو اکساتا ہے۔

ہم نے اس کے بعد غور کیا کہ آیا فعال DDR مقامی بڑی آنت کے npGH اظہار کو متحرک کرتا ہے اور p53 (Vassilev et al, 2004) کو مستحکم کرنے کے لیے nutlin3 کے ساتھ چوہوں کا علاج کرتا ہے اور induced colon p53 اور up (Figure 2A) کا مشاہدہ کرتا ہے۔ ڈی این اے کو نقصان پہنچانے والے علاج سے پہلے اور بعد میں (ٹیبل ایس 1)، ہم نے مطالعہ کیے گئے تمام 6 مریضوں کے نمونوں میں علاج کے بعد معمولی سے پہلے کے اپکلا این پی جی ایچ اظہار اور تھراپی کے بعد این پی جی ایچ اظہار میں اضافہ دیکھا (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR وٹرو میں GH اظہار کو چالو کرتا ہے۔

ہم نے topoisomerase Il inhibitor etoposide کا استعمال سنگل اسٹرینڈ DNA بریکس اور DSBs (Walles et al, 1996) دونوں پیدا کرنے کے لیے کیا اور یہ تعین کرنے کے لیے کہ آیا DDR وٹرو میں GH کو چالو کرتا ہے۔ این سی سی، ایچ این سی ایف، اور ایچ سی ٹی 116 انسانی بڑی آنت کے اڈینو کارسینوما خلیات (اعداد و شمار 3A اور S1A-S1C) میں ڈی این اے کو نقصان پہنچانے والی این پی جی ایچ؛ organo-ids میں، etoposide سے induced GH اور GH mRNA (اعداد و شمار 3B اور S1D)، جبکہ IGF1 اور prolactin mRNA کی سطح میں کوئی تبدیلی نہیں کی گئی (شکل S1E)۔ STAT5 فاسفوریلیشن، ایک ڈاون اسٹریم GH سگنل (واٹرس، 2016)، تمام سیل اقسام میں شامل کیا گیا تھا (اعداد و شمار 3A-3C اور S1A-S1C)۔ اس کے برعکس، GH چھوٹے مداخلت کرنے والے RNA (siRNA) کے ساتھ npGH کو منسوخ کرنے سے etoposide کو pSTAT5 (Fig-ures 3C اور S1F) کو شامل کرنے سے روک دیا گیا، جو اس بات کا ثبوت فراہم کرتا ہے کہ DNA کو نقصان پہنچانے والی بڑی آنت npGH فعال طور پر فعال ہے۔ 24 گھنٹے تک ایٹوپوسائیڈ کے ساتھ علاج کیے جانے والے این سی سی کی امیجنگ نے متعدد خلیوں میں GH اور yH2AX مشترکہ اظہار دکھایا (شکل 3D)۔

ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان سے گزرنے والے اپیتھیلیل خلیے GH کا اخراج کرتے ہیں اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا induced intracellular npGH آٹوکرائن/پیراکرائن اثرات مرتب کرتا ہے، ہم نے ایٹوپوسائیڈ علاج کے بعد این سی سی اور آرگنائڈ کلچر میڈیم میں خفیہ ہونے والے جی ایچ کی سطح کا اندازہ کیا۔ اے این سی سی سے علاج کے بعد 8 اور 24 گھنٹے پر اور علاج کے بعد 4-48 گھنٹے پر آرگنائڈز سے جمع کردہ میڈیم نے DDR ایکٹیویشن کے بعد وقت پر منحصر GH میں اضافہ دکھایا (شکل 3E)۔ چونکہ NCC اور organoids GH ریسیپٹرز کا اظہار کرتے ہیں جیسا کہ انسانی بڑی آنت کے ٹشو (Chesnokova et al.,2016)، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ DNA کو پہنچنے والے نقصان کے جواب میں مقامی GH کی حوصلہ افزائی عمر بڑھنے والے ٹشو کو آٹوکرائن/پیرا کرائن ایکشن کا نشانہ بنا سکتی ہے۔

آٹوکرائن/پیراکرائن GH انسانی بڑی آنت کے سیل p53 کو دباتا ہے۔

جیسا کہ اینڈوکرائن GH murine بڑی آنت p53(Chesnokova et al,2016) کو دباتا ہے، ہم نے تعین کیا کہ آیا مقامی GH انسانی اپکلا بڑی آنت کے خلیوں میں اسی طرح کے au-autocrine/paracrine اثرات کا استعمال کرتا ہے۔ ایچ جی ایچ کے ساتھ نیوکلیوفیکشن کے بعد دو مختلف مریضوں سے اخذ کردہ دو الگ الگ این سی سی لائنوں کا تجزیہ یا لینٹیو وائرس ایکسپریس-اینگ جی ایچ (لینٹی-جی ایچ) (فگرز 4A، 4B، اور ایس 2) کے ساتھ انفیکشن کے ساتھ ساتھ ایچ جی ایچ (فگر 4C) کو مستحکم طور پر ظاہر کرنے والے آرگنائڈز کو دبے ہوئے دکھایا گیا ہے۔ p53 اور ہم آہنگ اوور ایکسپریشن۔ lenti-GH یا خالی ویکٹر (lenti-V) سے متاثرہ organo-ids سے اخذ کردہ خلیات نے bromodeoxyuridine (BrdU) کے ساتھ نبض شدہ p53 دبانے کا مظاہرہ کیا جس کے بعد معمولی لیکن نمایاں طور پر BrdU شامل کرنے میں اضافہ ہوا جیسا کہ فلوروسینس ایکٹیویٹڈ سیل (CSF SortingFA) کے ذریعے اندازہ لگایا گیا ہے۔ S3A)۔ اس کے برعکس، چھوٹے ہیئرپین GH (GH) کو ظاہر کرنے والے لینٹیو وائرس کے ساتھ GH دبانے کی وجہ سے NCC (اعداد و شمار S3B اور S3C) میں کالونی کی تشکیل اور کالونی کے سائز میں کمی واقع ہوئی، جو ادب نواز NpGH کی کارروائیوں کی نشاندہی کرتی ہے۔

انسانی بڑی آنت میں پیراکرین جی ایچ کے اثرات آنتوں کے بلغم کے اپکلا خلیات پر این پی جی ایچ کے پیراکرائن اثرات کا اندازہ لگانے کے لیے، ہم نے lenti-GH اور Colon Intestine-Chip microfluidic آلات (Kasendra et al، 2020) سے متاثرہ UNCF کو صحت مند colonic کے ساتھ مل کر بنایا۔ 8 دن کے لئے آرگنائڈ سے ماخوذ اپکلا خلیات۔ درمیانے درجے میں hNCF سے مقامی GH کے اخراج کی تصدیق ELISA(338ng/mL/1×10 ڈگری سیلز) سے ہوئی۔{10}Ethynyl-2'-deoxyuridine （EdU） （20 μM） کو 7 دن کو شامل کیا گیا تھا۔ ، چپس کو 24 گھنٹے بعد طے کیا گیا تھا، اور EDU، اور H2AX کے لیے داغ دیا گیا تھا، اور EDU پلس نیوکلی کو اپکلا خلیوں میں شمار کیا گیا تھا۔ چپس کا ایک الگ سیٹ سیڈ

اپکلا خلیوں کے ساتھ مغربی بلاٹ کے ذریعہ p53/p21 کا اندازہ کرنے کے لئے استعمال کیا گیا تھا۔ چپ اپکلا خلیوں کے پھیلاؤ میں اضافہ ہوا (p<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

آٹوکرائن/پیراکرائن GH DDR کو دباتا ہے۔

DNA کو پہنچنے والے نقصان فاسفوریلیٹس H2AX پر ATM کا ایکٹیویشن، جو DDR کو چالو کرنے اور مرمت کو فروغ دینے کے لیے DNA کی خراب سائٹس کو نشان زد کرتا ہے (Turinetto and Giachino,2015)۔ATM p53 کو بھی فاسفوریلیٹ کرتا ہے، جس سے DNA کی مرمت میں مزید اضافہ ہوتا ہے (Blackford and Jackson 2017)۔ hNCC کے ساتھ ساتھ pIRES2-ZsGreen1hGH یا lentil-GH سے متاثرہ organoids میں، GH اوور ایکسپریشن نے ATM اور DNA-protein kinase (PK)cs کے فاسفوریلیشن کو دبا دیا، دونوں DNA کی مرمت میں ملوث ہیں (بلیک فورڈ اور جیکسن۔ 2017)، اور ہدف پروٹین p53 (اعداد و شمار 5A-5C) کے فاسفوریلیشن میں کمی واقع ہوئی۔

Tip60 ہسٹون ایسٹیلیز اے ٹی ایم (جیکسن اور بارٹیک، 2009) کو متحرک کرتا ہے اور اسے TRIM29 (Sho et al., 2011; Sun et al, 2005) کے ذریعے منفی طور پر منظم کیا جاتا ہے۔ ہم نے مشاہدہ کیا کہ NCC اور organoids میں GH اوور ایکسپریشن کا نتیجہ بھی TRIM29 انڈکشن میں ہوا، جس کے نتیجے میں Tip60 (اعداد و شمار 5A-5C) کو دبا دیا گیا۔ اسی طرح کے نتائج دوسری این سی سی لائن میں 48 گھنٹے کے بعد نیوکلیوفیکشن کے بعد پلاسمڈ کے ساتھ GH ظاہر کرنے کے بعد اور lenti-GH (فگرز S4A اور S4B) کے انفیکشن کے 6 دن بعد دیکھے گئے۔

آٹوکرائن/پیراکرائن جی ایچ ڈی این اے کی مرمت کو کم کرتا ہے۔

اس کے بعد ہم نے DSB کی مرمت کے طریقہ کار پر اثرات کی پیمائش کی، خاص طور پر غلطی کا شکار نان ہومولوجس اینڈ جوائننگ (NHEJ) (جیکسن اور بارٹیک، 2009) اور ایرر پروف ہومولوگس ری کمبینیشن (HR) (بیچر ایٹ ال، 2009) ؛ بلیک فورڈ اور جیکسن، 2017؛ چیپ مین اور دیگر، 2012)۔ ہم نے پی سی ڈی این اے 3 کے ساتھ NHEJ اور HR رپورٹر کیسٹوں کو مستحکم طور پر ظاہر کرنے والے NCC کو نیوکلیو فیکٹ کیا ہے۔{8}}انسانی GH1 (hGH1) پلازمیڈ، پلاسمڈ انکوڈنگ I-Excel endonuclease کے ساتھ شریک منتقلی کے ذریعے DSBs کی حوصلہ افزائی کی، اور DSB رپورٹرز کے دوبارہ شامل ہونے کی پیمائش کی۔ منتقلی کی کارکردگی کو پلازمیڈ انکوڈنگ DsRed (Seluanov et al، 2010) کے ساتھ شریک منتقلی کے ذریعے کنٹرول کیا گیا تھا۔ پی سی ڈی این اے 3 کے بعد NHEJ کی کارکردگی۔<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

آٹوکرائن/پیراکرائن جی ایچ غیر مرمت شدہ ڈی این اے نقصان کو بڑھاتا ہے۔

اس بات کا جائزہ لیتے ہوئے کہ آیا npGH ڈی این اے کے نقصان کو بڑھاتا ہے، ہم نے مشاہدہ کیا کہ lenti-GH سے مستحکم طور پر منتقل ہونے والے NCC اور organoids نے endogenous unrepaired DNA نقصان کو ظاہر کیا جیسا کہ Comet Asay (p< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

GH عمر رسیدہ 3D انسانی آنتوں کے آرگنائڈز میں شامل ہوتا ہے اور DDR کو کم کرتا ہے۔

عمر رسیدہ انسانی بڑی آنت کے نمونوں میں مشاہدہ شدہ GH اظہار اور DNA کو پہنچنے والے نقصان کے بعد، ہم نے عمر رسیدہ انسانی بافتوں کے ماڈل کو دوبارہ ترتیب دینے کے لیے تین آزاد iPSC لائنوں سے تیار کردہ "عمر رسیدہ" آرگنو آئی ڈیز بنائے۔ یہ آرگنائڈز انٹروسائٹس، گوبلٹ سیلز، پینیتھ سیلز، اور انٹرو اینڈوکرائن سیلز پر مشتمل ہوتے ہیں اور ایکسپریس کاڈل ٹائپ ہومیو باکس 2(CDX2)(Barrett et al..2014؛ Gao et al.،2009؛ Workman et al.,2017) تین میں سے دو iPSC لائنیں (لائنز 1 اور 3) 60 سال سے زیادہ عمر کے افراد سے حاصل کی گئی تھیں، اور تیسری iPSC لائن (لائن 2) ایک 30- سالہ فرد کے فبرو بلاسٹس سے حاصل کی گئی تھی۔ لائن 1 اور 3 سے پیدا ہونے والے آرگنائڈز کو 2 مہینوں تک مہذب کیا گیا تھا، اس مقام پر سیل کے پھیلاؤ میں نمایاں کمی آئی۔ اس کے برعکس، لائن 2 سے پیدا ہونے والے آرگنائڈز 4 ماہ تک ثقافت میں مضبوطی سے پھیلتے ہیں۔ سیلولر عمر بڑھنے کی تصدیق تمام 3 لائنوں میں پی 16 میں اضافے کے ساتھ ساتھ ٹیلومیر کی لمبائی میں کمی سے ہوئی (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

چونکہ یہ ان وٹرو آرگنائڈ خصوصیات عمر رسیدہ انسانی بافتوں کے ساتھ سیلولر تبدیلیوں کو ایمانداری کے ساتھ دوبارہ بیان کرتی دکھائی دیتی ہیں (بیکر ایٹ ال۔،2011؛ لیئٹ ال۔ انسانی بڑی آنت کے اپکلا عمر بڑھنے والے سگنلنگ میکانزم کا مزید مطالعہ کرنے کے لیے ماڈل۔ لائن 1 میں، GH mRNA کی سطح ثقافت میں 1 ماہ کے بعد پیدا ہوئی اور 2 ماہ کے بعد مزید بڑھ گئی (p <0.05) (شکل="" 6c)،="" جو="" کہ="" ویسٹرن="" بلاٹ="" اور="" امیونو="" ہسٹو="" کیمسٹری="" (ihc)="" دونوں="" پر="" عمر="" رسیدہ="" آرگنائڈز="" میں="" نمایاں="" طور="" پر="" بڑھے="" ہوئے="" npgh="" کے="" مطابق="" ہے۔="" (اعداد="" و="" شمار="" 6d،="" 6e،="" اور="" s5b)۔="" yh2ax="" کو="" طویل="" کلچر="" کے="" ساتھ="" بھی="" مضبوطی="" سے="" حوصلہ="" افزائی="" کی="" گئی="" تھی،="" جو="" کہ="" وٹرو="" ایگنگ="" کے="" ساتھ="" جمع="" شدہ="" اینڈوجینس="" ڈی="" این="" اے="" کو="" پہنچنے="" والے="" نقصان="" کی="" نشاندہی="" کرتی="" ہے۔="" ncc="" میں="" دبائے="" ہوئے="" p53="" اور="" gh="" (فگرز="" 4a-4c)="" کے="" ساتھ="" منتقلی="" والے="" آرگنائڈز="" کو="" ظاہر="" کرنے="" والے="" نتائج="" سے="" مطابقت="" رکھتے="" ہوئے،="" ہم="" نے="" 1="" اور="" 2="" مہینوں="" کی="" ثقافت="" میں="" دبائے="" ہوئے="" p53="" کا="" مشاہدہ="" کیا،="" جو="" بڑھے="" ہوئے="" npgh="" (فگرز="" 6e="" اور="" s5b)="" کے="" ساتھ="" ہم="" آہنگ="" ہے۔="" اسی="" طرح="" کے="" نتائج="" (="" a="" اور="" b)="" (a)="" ancc،="" hncf،="" اور="" hct116="" خلیات="" اور="" (b)="" organoids="" کا="" مغربی="" دھبہ۔="" خلیوں="" کا="" علاج="" ایٹوپوسائیڈ="" کی="" اشارے="" شدہ="" خوراکوں="" سے="" کیا="" گیا="" اور="" 24="" گھنٹے="" بعد="" تجزیہ="" کیا="" گیا۔="" آرگنائڈز="" کا="" علاج="" 3="" یو="" ایم="" ایٹوپوسائڈ="" (ای="" ٹاپ)="" سے="" کیا="" گیا="">

(C) GH siRNA (siGH RNA) یا scramble RNA (Scr RNA) کے ساتھ 24 گھنٹے کے لیے کنٹرول کے طور پر NCC نیوکلیو فیکٹڈ کا علاج ایٹوپوسائیڈ (Etop) کی اشارے شدہ خوراکوں سے کیا گیا اور 24 گھنٹے بعد تجزیہ کیا گیا۔ مغربی بلاٹس کی امیج جے کی مقدار کو شکل S1 میں دکھایا گیا ہے۔

（D） NCC کی نمائندہ تصویر 20 μM etoposide کے ساتھ 24 گھنٹے کے لئے علاج کی گئی۔ GH، سرخ؛ yH2AX، سبز؛ phalloidin، سرمئی؛ DAPI، نیلا ایک چمکدار سبز نیوکلئس apoptosis کی نشاندہی کرتا ہے۔ اسکیل بار، 20 ام۔ کنٹرول، غیر علاج شدہ خلیات.

(ای) اے این سی سی کے کلچر میڈیم میں جی ایچ کا مغربی دھبہ اور بالترتیب 20 یا 5 یو ایم ایٹوپوسائڈ کے ساتھ علاج کیے جانے والے آرگنائڈز۔ میڈیم کو گرمی 8 اور 24 گھنٹے اور علاج کے بعد 4-48 گھنٹے میں آرگنائڈز سے جمع کیا گیا تھا۔ پونسیو کو لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا جاتا تھا۔ کم از کم 3 آزاد تجربوں سے نمائندہ دھبے دکھائے گئے ہیں۔

آئی پی ایس سی لائنوں 2 اور 3 سے بالترتیب 4 اور 2 ماہ کے لئے تیار کردہ آرگنائڈز کی ثقافت کے ذریعہ حاصل کیا گیا تھا (اعداد و شمار S6A-S6D)۔

مزید برآں، عمر رسیدہ آرگنائڈز میں npGH میں اضافہ ATM اور DNA-PKcs دونوں کے دبائے ہوئے فاسفوریلیشن اور فاسفوریلیٹڈ p53 (اعداد و شمار 6E اور S5B) کی نچلی سطح کے ساتھ، Atenuated DDR سے وابستہ تھا۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ دبائی ہوئی DDR سرگرمی جمع شدہ غیر مرمت شدہ DNA کو نقصان پہنچاتی ہے، جس کا ثبوت yH2AX انڈکشن (اعداد و شمار 6E اور S5B) سے بھی ملتا ہے۔ ثقافت میں 2 ماہ کے بعد، GH shRNA سے متاثرہ عمر رسیدہ آرگنائڈز نے p53 میں اضافہ دکھایا (اعداد و شمار 6F اور S7A) اور DNA کو پہنچنے والے نقصان کو کمیٹ پرکھ (p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

عمر رسیدہ چوہوں میں ویوو کولون ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان میں GH سگنلنگ کی کمی کم ہوتی ہے۔

عمر رسیدہ آرگنائڈز میں حاصل کردہ اپنے نتائج کی تصدیق کرنے کے لیے، ہم نے Vivo میں عمر رسیدہ WT اور GHR-7 چوہوں کا مطالعہ کیا۔ بڑی عمر کے (24-ماہ کے) بمقابلہ جوان (3-ماہ کے) WT چوہوں (p) میں بڑی آنت کے ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان میں نمایاں اضافہ ہوا تھا۔<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

بحث

ہم یہاں دکھاتے ہیں کہ npGH انسانی بڑی آنت کے ٹشووں اور 3D انسانی آنتوں کے آرگنائڈز میں عمر کے ساتھ بڑھتا ہے۔ ہم ثبوت کی کئی سطروں کا مظاہرہ کرتے ہیں جو تجویز کرتے ہیں کہ عمر رسیدہ انسانی بڑی آنت کے بافتوں میں، این پی جی ایچ ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان سے متاثر ہوتا ہے، جیسا کہ انسانی ماڈلز میں مشاہدہ کیا گیا ہے، بشمول اپکلا غیر ٹیومر خلیات، عام بڑی آنت کے فائبرو بلاسٹس، آرگنائڈز، اور ڈی این اے کو نقصان پہنچانے والے مریضوں کے بڑی آنت کے کینسر کے ٹشو۔ ; ہم متحرک DDR کے ساتھ چوہوں کے کالون میں Vivo میں بھی اسی طرح کے نتائج دکھاتے ہیں۔

3D انسانی آنتوں کے آرگنائڈز کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے پی 16 میں اضافہ، سنسنی، اور ٹیلومیر شارٹننگ کا مشاہدہ کیا، جو کہ انسانی بافتوں میں عمر سے وابستہ تبدیلیوں کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں (بیکر ایٹ ال۔ 2011؛ ​​لیو ایٹ ال۔ )۔ آرگنائڈ ماڈل کی حدود کے باوجود، ہمارے نتائج آنتوں کے آرگنائڈز کی حمایت کرتے ہیں تاکہ عمر سے وابستہ بڑی آنت کی تبدیلیوں (Hu et al.

ہم نے پایا کہ مقامی npGH، ایک آٹوکرائن/پیرا کرائن فیشن میں کام کرتے ہوئے، p53 کو دباتا ہے اور پڑوسی خلیوں کے پھیلاؤ کو بڑھاتا ہے۔ حوصلہ افزائی جی ایچ ڈی ڈی آر اور ڈی این اے کی مرمت کو بھی دباتا ہے، ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کو مزید بڑھاتا ہے۔ نتائج GH-secreting human pituitary tumors (Ben-Shlomo et al., 2020) کے اندر DNA نقصان کے جمع ہونے پر مشاہدہ شدہ اثرات سے بھی مطابقت رکھتے ہیں۔

عام بڑی آنت کے بافتوں میں جی ایچ کی کارروائیاں ایک پرو-لافریٹیو ماحول کی ترقی کے حامی ہیں جو بڑی آنت کے پولپس کی عمر سے متعلقہ بڑھتی ہوئی شرحوں کو کم کر سکتی ہے، جس کی مثال عمر سے منسلک ڈی این اے ڈیم-ایج اور کروموسومل عدم استحکام سے بڑی عمر کے مریضوں میں بڑی آنت کے کینسر کے پھیلاؤ کے ڈرائیور کے طور پر ملتی ہے۔ 50 سال (Aunan et al., 2017)۔ عمر سے متعلق ڈی این اے کا جو نقصان ہم یہاں دکھاتے ہیں وہ ان رپورٹس کے ساتھ بھی مطابقت رکھتا ہے کہ yH2AX عام بڑی آنت کے نمونوں میں عمر کے ساتھ لکیری طور پر بڑھتا ہے (Risques et al., 2008)۔ عمر رسیدہ آرگنائڈز میں yH2AX کی ہماری مشاہدہ شدہ اپ گریجولیشن ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کی نشاندہی کرتی ہے، کیونکہ yH2AX ڈی این اے کی مرمت کے پروٹینز (Turinetto and Giachino, 2015) کو اپنی طرف متوجہ کرنے کے لیے DNA کو پہنچنے والے نقصان کی جگہوں کو نشان زد کرتا ہے۔ یہ نتائج بظاہر اس حقیقت سے مطابقت نہیں رکھتے کہ عمر بڑھنے والے خلیوں میں GH H2AX فاسفوریلیشن کو دباتا ہے۔ تاہم، ہم ان مشاہدات کی تشریح یہ ظاہر کرنے کے لیے کرتے ہیں کہ GH ATM کے فاسفوریلیشن کو کم کر کے DDR کی سرگرمی کو کم کرتا ہے، جس کے نتیجے میں، H2AX سمیت ڈاون سٹریم پروٹین کی فاسفوریلیشن کم ہو جاتی ہے (لیکن مکمل طور پر ختم نہیں ہوتی)۔ جب DDR کو مناسب طریقے سے فعال نہیں کیا جاتا ہے، DNA کی مرمت کو تبدیل کر دیا جاتا ہے، لیکن yH2AX پھر بھی جمع ہو جاتا ہے کیونکہ یہ DNA کو نقصان پہنچانے والی جگہوں کو نشان زد کرتا ہے۔ اس طرح، عمر رسیدہ انسانی بافتوں اور آرگنائڈز میں مشاہدہ کردہ yH2AX کی سطح DDR سرگرمی اور غیر مرمت شدہ DNA کی مقدار کے خالص نتیجے کی عکاسی کرتی ہے۔

ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کی وجہ سے عمر بڑھنے والے بافتوں میں جمع ہو سکتا ہے جس کی وجہ سے ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کے p53 ردعمل کے نقصان کا امکان ہے (Cabelof et al., 2006; Simon et al., 2009, 2012)۔ ہمارے تجربات میں، بڑی آنت کے خلیوں اور آرگنائڈز میں p53 میں کمی آئی ہے، جو کہ GH کو دبانے والے p53 (Chesnokova et al.، 2016) کے ابتدائی نتائج کے مطابق ہے۔ اس کے برعکس، عمر رسیدہ GHR-/-چوہوں، جو کینسر کے خلاف مزاحم ہیں اور ان کی عمر لمبی ہے (Basu et al.,2018)، نیز بڑی آنت سے متعلق GHRcolKO چوہے بڑی آنت p53 کے بڑھتے ہوئے اظہار کو ظاہر کرتے ہیں، جس سے ڈی این اے کی مرمت میں اضافہ ہوتا ہے۔ جیسا کہ GH p53 (Chesnokova et al., 2013) کو دباتا ہے، npGH شامل کرنے کے نتیجے میں مقامی مائیکرو ماحولیات میں تبدیلیاں ہو سکتی ہیں جو عمر سے وابستہ کمی p53 (Feng et al., 2007; Goukassian et al., 2000) کے ساتھ مطابقت رکھتی ہے۔ GH پروموٹر ایک p53 بائنڈنگ سائٹ پر مشتمل ہے (Chesnokova et al., 2013)، اور DNA نقصان سے متاثر p53 GH اظہار کو متحرک کرتا ہے (Chesnokova et al. 2013,2019a)۔ اس طرح، ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ عمر رسیدہ آرگنائڈز میں، ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان سے این پی جی ایچ کی حوصلہ افزائی ہوتی ہے، جو بدلے میں، p53 کو نیچے کو منظم کرتا ہے۔

اہم بات یہ ہے کہ چونکہ npGH مقامی طور پر DNA سے تباہ شدہ خلیوں سے خفیہ ہوتا ہے، پڑوسی خلیوں پر خفیہ GH کے لیے پیراکرین ایکشن آپریٹو ہو سکتا ہے۔ بڑی آنت کے چپ کے ساتھ GH-اظہار کرنے والے hNCF کی مشترکہ ثقافت کرتے ہوئے، ہم نے ڈی این اے کے بڑھتے ہوئے نقصان اور پھیلاؤ کا مشاہدہ کیا اور چپ ایمبیڈڈ اپیتھیلیل خلیوں میں p53/p21 کو کم کیا جو فبروبلاسٹ سے اخذ کردہ پیراکرائن اثرات کے سامنے آئے۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ انسانی بافتوں میں مقامی غیر حوصلہ افزائی عمر رسیدہ ٹیومر کو دبانے والے پروٹین کو دبانے اور اپکلا پھیلاؤ اور ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کو بڑھا کر ٹشو مائیکرو ماحولیات کو تبدیل کرتی ہے۔

نتائج ان مشاہدات کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں کہ خارجی GH علاج ڈی جے-1 KO چوہوں (Chien et al.، 2016) میں افزائش کی صلاحیت، کالونی کی تشکیل، اور میٹاسٹیسیس کو بڑھاتا ہے، اور اس بات کے ثبوت کے ساتھ کہ انسانی ٹیومر کے خلیوں میں GH انڈکشن سے وابستہ ہے۔ کئی کینسروں کی ترقی (Perry et al.,2017)؛ یہ ہمارے نتائج کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں جو GH دبانے کے ساتھ کم کالونی کی تشکیل اور چھوٹی کالونی کا سائز دکھاتے ہیں۔

ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کی مرمت کے راستے کروموسومل عدم استحکام کے خلاف حفاظت کرتے ہیں جو سیلولر ٹرانسفارمیشن کو چلاتے ہیں (Negrini et al. 2010)۔ مثال کے طور پر، Tip60 ATM (Jackson and Bartek, 2009)، اور ATM، DDR کا ایک مرکزی ریگولیٹر، فاسفوریلیٹس اور p53 کو مستحکم کرتا ہے۔ عمر بڑھنے والے خلیے ATM اور p53 کو کم کرنے کے ساتھ ساتھ ڈی این اے کی مرمت کی خرابی کو ظاہر کرتے ہیں جس کے نتیجے میں ڈی این اے کو بغیر مرمت کے نقصان پہنچا ہے (Lan et al., 2019)۔ اس طرح، بڑی آنت کے خلیوں میں، ڈی این اے کا نقصان عمر کے ساتھ جمع ہوتا ہے (Risques et al., 2008; Schu-macher et al., 2008)، کم از کم جزوی طور پر DDR کی کارکردگی میں کمی کی وجہ سے (جیکسن اور بارٹیک، 2009)، اور p53 کو دبایا جاتا ہے۔ عمر رسیدہ چوہوں میں y-شعاع ریزی کا ردعمل p53-سٹیبلائزنگ ATM(Feng et al,2007) میں عمر سے متعلق کمی سے منسوب تھا۔ ہمارے تجربات میں، ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کے جواب میں حوصلہ افزائی نہ کرنے نے بھی Tip60 کو دبا دیا، جس کی وجہ سے ممکنہ طور پر ڈی این اے کی مرمت کو کم کرنا جیسا کہ بالترتیب ATM اور p53 فاسفوریلیشن سے ظاہر ہوتا ہے۔ یہ نتائج تجویز کرتے ہیں کہ مقامی npGHoverexpression عمر سے متعلقہ غیر منظم DDR اور DNA کی مرمت میں حصہ ڈال سکتا ہے۔ عمر رسیدہ آرگنائڈز میں، GH انڈکشن نے DDR کو کم کیا، جبکہ GH دبانے نے DDR کو چالو کیا، جیسا کہ ڈی این اے کے نقصان میں کمی کا ثبوت ہے۔ ان نتائج کی تائید ہمارے پہلے مشاہدات سے ہوتی ہے کہ اے این سی سی میں GH سگنلنگ کو مسدود کرنے سے ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان میں کمی واقع ہوئی (Chesnokova et al.,2019a)۔ مزید برآں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ بڑی آنت کے ڈی این اے کا نقصان بڑی آنت کے ہدف والے GHRcolKO چوہوں میں ایکسائزڈ GHR کے ساتھ جمع نہیں ہوتا ہے، لیکن یہ چھوٹی آنت میں جمع ہوتا ہے، جہاں GHR برقرار تھا۔ یہ نتائج، ہمارے مظاہرے کے ساتھ کہ بوڑھے GHR-7-چوہے بڑی آنت کے ڈی این اے کو نقصان نہیں پہنچاتے، اس مفروضے کے لیے vivo کی حمایت فراہم کرتے ہیں کہ مقامی npGH انڈکشن عمر کے خلیات کے ساتھ تبدیلی کے لیے حساس ہیں اور شاید کینسر کے علاج کے خلاف مزاحمت میں بھی حصہ ڈالتے ہیں۔ تجویز کیا گیا ہے (باسو اور کوپچک، 2019)۔

یہاں دکھائے گئے نتائج اس امکان کو بھی بڑھاتے ہیں کہ GH کے اثرات انسولین نما گروتھ فیکٹر 1 (IGF1) کے ذریعے ثالثی کر سکتے ہیں۔ GH کے برعکس، IGF1 سگنلنگ غیر ٹیومر اور ٹیومر والے خلیوں میں DNA کی مرمت کو متحرک کرتا ہے (Chesnokova and Melmed, 2020; Chitnis et al., 2014; Turney et al., 2012)، اور ہم نے دکھایا ہے کہ GH p53 کو دبانا اور DNA کی شمولیت ڈیم ایج عام بڑی آنت کے بافتوں میں IGF1 سے آزادانہ طور پر ہوتا ہے (Ches-nokova et al.,2019a, 2019b)۔ تاہم، خلیات اور بافتوں میں جن میں GH IGF1 کو متحرک کرتا ہے، بعد میں نمو کا عنصر بھی جینوم کے استحکام پر GH کی کارروائی کا مقابلہ کرنے کے لیے سیل کے مخصوص انداز میں اشارہ دے سکتا ہے۔

نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ڈی این اے کے جمع ہونے والے نقصان کے جواب میں بڑی آنت کے ٹشو میں این پی جی ایچ کی حوصلہ افزائی ڈی این اے کو مزید نقصان پہنچاتی ہے اور ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کی مرمت کا ایک منفی عامل معلوم ہوتا ہے۔ ان نتائج کا ایکسٹراپولیشن کئی ممکنہ طبی ایپلی کیشنز کے لیے ایک پلیٹ فارم مہیا کرتا ہے۔ چونکہ ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کا جمع ہونا عمر سے متعلقہ بیماریوں کی ایک پہچان ہے، اس لیے آٹوکرائن/پیراکرائن کو روکنے کے لیے GH سگنلنگ کو نشانہ بنانا عمر سے متعلقہ اپکلا ڈی این اے کو پہنچنے والے نقصان کو روکنے کے لیے کارآمد ثابت ہو سکتا ہے اور بالآخر عمر سے متعلقہ اپکلا پیتھالوجیز (Miman et al. ,2016) اس طرح کے نقطہ نظر سے کینسر کے مریضوں کو بھی فائدہ ہو سکتا ہے جو ڈی این اے کو نقصان پہنچانے والے علاج سے گزر رہے ہیں، جن میں آٹوکرائن/پیرا کرائن کے ذریعے اپکلا فیلڈ کی تبدیلیاں کسی بھی عمل سے پڑوسی کے عام ٹشو کو نقصان نہیں پہنچ سکتی ہیں۔ اس سلسلے میں، منظور شدہ GHR مخالف (List et al., 2011; Trainer et al, 2000) کے ساتھ GH سگنلنگ میں خلل ڈالنے سے طبی فوائد حاصل ہو سکتے ہیں۔ اہم بات یہ ہے کہ انسانی GH کو نامناسب طور پر ایک غیر منظور شدہ اینٹی ایجنگ اور طاقت بڑھانے والی تھراپی کے طور پر فروغ دیا گیا ہے (Giordano et al., 2008; Holt and Ho, 2019; Medeiros and Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019)۔ npGH کے مضر پاراکرین اثرات کے پیش نظر جن کی ہم یہاں رپورٹ کرتے ہیں، ایک اینٹی ایجنگ امرت کے طور پر طویل مدتی نامناسب GH ایڈمنسٹریشن GHR سگنلنگ کا باعث بن سکتی ہے اور اپکلا سیل DNA کو پہنچنے والے نقصان کے ساتھ ساتھ خفیہ پھیلاؤ والے گھاووں کے ممکنہ فعال ہونے کا خطرہ بھی پیدا کر سکتی ہے۔

یہ مضمون سیل رپورٹس 37، 110068، دسمبر 14، 2021، ª 2021 مصنف (مصنف) سے لیا گیا ہے۔ 1 یہ CC BY-NC-ND لائسنس (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/) کے تحت ایک کھلا رسائی والا مضمون ہے۔