حصہ 1 چوہوں میں بوائین سیرم البومین سے متاثرہ ہیپاٹک فائبروسس پر Cistanche Tubulosa سے Phenylethanol Glycosides کے روک تھام کے اثرات

رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com

خلاصہ

پس منظر:Cistanche tubulosa ایک روایتی چینی جڑی بوٹیوں کی دوا ہے جو بڑے پیمانے پر استثنیٰ کو منظم کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔cistanche سے فینائل ایتھنول گلائکوسائیڈزاس پلانٹ سے (CPhGs) بنیادی طور پر موثر مواد ہیں۔ اس مطالعے کا مقصد چوہوں میں BSA-حوصلہ افزائی ہیپاٹک فائبروسس پر CPhGs کے بچاؤ اور علاج کے اثرات اور ہیپاٹک سٹیلیٹ سیلز پر مشتمل متعلقہ مالیکیولر میکانزم کا جائزہ لینا تھا۔ بیجیرانگن (BJRG)، ایک اور روایتی چینی جڑی بوٹیوں کی دوا، کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا جاتا تھا۔ طریقے: Vivo تجربات میں، 75 SD چوہوں کو تصادفی طور پر 6 گروپوں میں تقسیم کیا گیا: نارمل (آست پانی سے علاج شدہ)، ماڈل (BSA-علاج شدہ)، مثبت دوا (BSA-علاج شدہ پلس BJRG 60{{29} } mg/kg/day)، اور BSA سے علاج شدہ پلس CPhGs (125، 250، اور 500 mg/kg/day) گروپس۔ جگر اور تلی کے اشاریے، اسپارٹیٹ امینوٹرانسفریز (AST) کے سیرم کی سطح، الانائن امینوٹرانسفریز (ALT)، ہیکساڈیسینوک ایسڈ (HA)، لامینین (LN)، قسم III پروکولجن (PCIII)، قسم IV کولیجن (IV-C)، ہائیڈروکسائپرولین ہائپ)، اور ٹرانسفارمنگ گروتھ فیکٹر 1 (TGF- 1) کو چوہوں کے جگر میں ماپا گیا۔ H&E اور میسن کے ٹرائیکروم سٹیننگ کا استعمال کرتے ہوئے ہر گروپ کے لیے جگر کے فبروسس کے لیے ہسٹوپیتھولوجیکل گریڈز کا اندازہ لگایا گیا۔ TGF- 1، کولیجن I (Col-I)، اور کولیجن III (Col-III) کے اظہار کا تعین امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ طریقہ سے کیا گیا تھا۔ مقداری ریئل ٹائم پی سی آر تجزیوں کے ذریعے NF-κB p65 اور Col-I کے اظہار کی سطحوں کا تعین کرکے ان اثرات کا مزید جائزہ وٹرو میں کیا گیا۔ کول-I پروٹین ایکسپریشن کا مغربی بلوٹنگ کے ذریعہ بھی معائنہ کیا گیا۔ نتائج: CPhGs کے تمام خوراک گروپس (125، 250، اور 500 mg/kg/day) نے جگر اور تللی انڈیکس کو نمایاں طور پر کم کیا، ALT، AST، HA، LN، PCIII، IV-C سیرم کی سطح میں کمی، TGF- 1 مواد (P <0.01، p=""><0.01، اور="" p=""><0.01)، اور="" ہائپ="" مواد۔="" cphgs="" نے="" جگر="" کے="" خلیوں="" کی="" سوجن="" کو="" بھی="" واضح="" طور="" پر="" کم="" کیا="" اور="" مؤثر="" طریقے="" سے="" ہیپاٹوسیٹ="" نیکروسس="" اور="" سوزشی="" خلیوں="" کی="" دراندازی="" کو="" روکا۔="" امیونو="" ہسٹو="" کیمیکل="" نتائج="" سے="" پتہ="" چلتا="" ہے="" کہ="" cphgs="" نے="" tgf-="" 1="" (p=""><0.01، p=""><0.01، اور="" p=""><0.01)، col-i،="" اور="" col-iii="" کے="" اظہار="" کو="" نمایاں="" طور="" پر="" کم="" کیا="" ہے۔="" hsc-t6="" پر="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50,="" اور="" 25="" ug/ml)="" کے="" وٹرو="" اثرات="" سے="" پتہ="" چلتا="" ہے="" کہ="" cphgs="" نے="" nf-κb="" p65="" اور="" col-i="" کے="" mrna="" اظہار="" کو="" نمایاں="" طور="" پر="" کم="" کیا،="" اور="" cphgs="" نے="" col-i="" پروٹین="" کے="" اظہار="" کو="" بھی="" کم="" کیا۔="" نتیجہ:="" cphgs="" کا="" ایک="" اہم="" اینٹی="" ہیپاٹک="" فائبروسس="" اثر="" ہوتا="" ہے،="" اور="" اسے="" ہیپاٹک="" فائبروسس="" کے="" علاج="" کے="" لیے="" ہیپاٹو="" پروٹیکٹو="" ایجنٹ="" کے="" طور="" پر="" استعمال="" کیا="" جا="" سکتا="">

مطلوبہ الفاظ: Hepatic fibrosis، Cistanche tubulosa، Phenylethanol glycoside، Chemokine BSA، روک تھام اور علاج۔

پس منظر

ہیپاٹک فائبروسس جگر کی شدید چوٹ کا زخم بھرنے والا ردعمل ہے جو مختلف عوامل کی وجہ سے دائمی ہیپاٹائٹس کے روگجنن میں ہوتا ہے۔ یہ عوامل وائرل انفیکشن، الکحل کی زیادتی، کولیسٹیسیس، اور میٹابولک اور آٹومیمون بیماریاں ہیں [1–3]۔ ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ECM) کا پروگریسو جمع ہونا اور دوبارہ تشکیل دینے میں کمی جگر کے عام فن تعمیر میں خلل ڈالتی ہے، جس کے نتیجے میں ہیپاٹک فائبروسس ہوتا ہے [4]۔ جگر کی دائمی بیماری میں ہیپاٹک فائبروسس بہت اہم ہے اور اکثر ناقابل واپسی سروسس اور سرطان پیدا کرتا ہے۔ فی الحال، ہیپاٹک فائبروسس کے علاج کے لیے کوئی طریقہ یا موثر ادویات موجود نہیں ہیں۔ لہذا، یہ فوری طور پر ایک اینٹی ہیپاٹک فائبروسس دوائی تلاش کرنے کی ضرورت ہے جو جگر کی چوٹ کو فائبروسس اور کینسر میں بڑھنے سے روکے گی۔Cistanche tubulosaڈبلیو (Orobanchaceae خاندان کا) ایک طفیلی پودا ہے جو چین میں سنکیانگ کے جنوبی علاقے میں بڑے پیمانے پر اگایا جاتا ہے [5]۔ لوگ اسے عام طور پر گردوں کو متحرک کرنے، خون کی پرورش، آنتوں کو آرام دینے اور جوانی میں تاخیر کے لیے استعمال کرتے ہیں۔ یہ سرکاری طور پر چینی فارماکوپیا [6] میں درج ہے۔ C. tubulosa فعال اجزاء کی ایک قسم پر مشتمل ہے. یہ شامل ہیںcistanche سے فینائل ایتھنول گلائکوسائیڈز(CPhGs)، iridoids، اور polysaccharides۔ میں بہت سے فعال اجزاء میں سے ایک کے طور پرC. tubulosa، CPhGs نے vivo اور وٹرو مطالعات دونوں میں قائل کرنے والے اینٹی آکسیڈینٹ، اینٹی تھکاوٹ، نیوروپروٹیکٹو، اور سوزش کے اثرات کی نمائش کی ہے [7]۔ حالیہ برسوں میں، یہ اطلاع دی گئی ہے کہ CPhGs(cistanche سے فینائل ایتھنول گلائکوسائیڈز) ہیپاٹوپروٹیکٹو اثرات ہیں۔ ان اثرات کے زیر اثر ممکنہ میکانزم آزاد ریڈیکلز کی صفائی، جگر کی جھلیوں کا تحفظ، امیونوریگولیشن، اپوپٹوسس کی روک تھام، HBsAg اور HBeAg کے اظہار کو روکنا، اور HBV DNA نقل کی روک تھام اور دیگر [8-11] ہیں۔ تاہم، ادب میں چند مطالعات گرافکس کے اینٹی ہیپاٹک فبروسس اثر پر توجہ دیتے ہیں۔ لہذا، اس مطالعے کا مقصد چوہوں میں بوائین سیرم البومین (BSA) کی حوصلہ افزائی ہیپاٹک فائبروسس کے ماڈل کا استعمال کرکے GPhCs کے اینٹی ہیپاٹک فائبروسس اثر کی تحقیقات کرنا ہے۔ HSC-T6 خلیوں میں متعلقہ مالیکیولر میکانزم کی چھان بین کی گئی۔

طریقے

کیمیکل اور ری ایجنٹس

ایک Hydroxyproline کٹ (Alkaline hydrolysis) (Lot: 20140616) Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (China) سے خریدی گئی تھی۔ Rat TGF- 1 سینڈوچ ELISA کٹس (Lot: 238240615) Lianke Biotech Co., Ltd. (China) سے خریدی گئی تھیں۔ Rabbit Anti-Collagen I antibody (Lot: 140619)، Rabbit Anti-Collagen III antibody (Lot: 980788 W)، اور Rabbit Anti-TGF- 1 اینٹی باڈی (Lot: 140619) بیجنگ بایو سنتھیسس بائیو ٹیکنالوجی کمپنی نے فراہم کی تھی۔ LTD (چین)۔ نارمل شیپ سیرم (کام کرنے والے سیال) (لاٹ: WP141214)، PV-6000 (لاٹ: WK141225)، اور DAB کٹ (لاٹ: K136621D) Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd (چین) سے خریدی گئی تھی۔ . پرائمری اینٹی باڈیز کا پتہ لگانے کے لیے 2. اینٹی باڈی سلوشن (Alk-Phos. Conjugated، Anti-rabbit) اور 2. اینٹی باڈی سلوشن (Alk-Phos. Conjugated، anti-mouse) (لاٹ: 272387) Invitrogen کمپنی (USA) سے خریدا گیا تھا۔ )۔ بووائن سیرم البومین (BSA) (لاٹ: SLBG8239V) سگما (USA) سے خریدا گیا تھا۔ استعمال سے پہلے، BSA کو عام نمکین میں 18 g/L پر تیار کیا جاتا تھا، بیکٹیریا کو فلٹریشن کے ذریعے ہٹا دیا جاتا تھا، اور BSA کو 4 ڈگری پر ذخیرہ کیا جاتا تھا۔ بھیڑوں کے بالوں سے 1 جی لپڈ پر مشتمل فریونڈ کا نامکمل معاون (لاٹ: AF0220LA14، Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (China,)) کو 2 جی مائع پیرافین کے ساتھ ملایا گیا تھا (لاٹ: 20130815، Tianjin Fuyu, Tianjin Fuyu. لمیٹڈ. BJRG گولیاں آست پانی میں 600 ملی گرام/کلو گرام کی حراستی میں۔

پلانٹ مواد

C. tubulosa(Orobanchaceae family) چین کے سنکیانگ کے علاقے منفینگ سے خریدا گیا تھا۔ اس مواد کی تصدیق محقق جون ژاؤ، کلیدی لیبارٹری فار ایغور میڈیسن، انسٹی ٹیوٹ آف میٹیریا میڈیکا آف سنکیانگ نے کی۔ واؤچر کے نمونے سنکیانگ کے انسٹی ٹیوٹ آف میٹیریا میڈیکا میں جمع کیے گئے تھے۔

CPhGs کی تیاری(cistanche سے فینائل ایتھنول گلائکوسائیڈز)

کے خشک اور کٹے ہوئے rhizomesC. tubulosa(60 کلوگرام) 70 فیصد ایتھنول کے ساتھ مسلسل تین بار ریفلکس کے نیچے سے نکالا گیا، اور ایتھنول کے عرق کو حاصل کرنے کے لیے سالوینٹس کو ہٹا دیا گیا۔ فینائل ایتھنول گلائکوسائیڈز (CPhGs) حاصل کرنے کے لیے ایتھنول کے عرق کو AB-8 رال کا استعمال کرکے صاف کیا گیا تھا۔ جانوروں کے مطالعے میں مختلف خوراک کے گروپس کے لیے استعمال ہونے والے CPhGs کے اسٹاک سلوشنز (بالترتیب 500 mg/kg، 250 mg/kg، اور 125 mg/kg،) 0.5 فیصد (5 g/L) کاربوکسی میتھائل سیلولوز (سوڈیم نمک) میں تحلیل کیے گئے تھے۔

CPhGs کی مقدار(cistanche سے فینائل ایتھنول گلائکوسائیڈز)

CPhGs میں دو اجزاء (echinacoside اور acteoside) کے مشمولات کا تعین HPLC نے پہلے اطلاع شدہ طریقہ (Zhang et al. 2004) [12] کے ذریعے کیا تھا۔ HPLC کو Shimadzu LC-10UV ڈیٹیکٹر سے لیس HPLC استعمال کرکے انجام دیا گیا۔ HPLC کالم ایک Phenomenex Gemini ODS کالم تھا (250 × 4.6 mm, 5 μm)۔ isocratic موبائل مرحلہ میتھانول-acetonitrile-1 فیصد ایسٹک ایسڈ (15:10:75, v/v/v) پر مشتمل تھا۔ Elution 40 منٹ کے لیے تھا اور بہاؤ کی شرح 0.6 mL/min رکھی گئی تھی۔ کالم کا درجہ حرارت 30 ڈگری پر مستقل رکھا گیا تھا۔ UV کا پتہ لگانا 334 nm پر تھا۔

جانور اور HSC-T6 سیل لائن

[گریڈ SPF] صحت مند بالغ مرد Sprague-Dawley (SD) چوہے (180–220 g) سنکیانگ میڈیکل یونیورسٹی اینیمل سینٹر، لائسنس نمبر: SCXK (نیا) 2011–0004 سے خریدے گئے تھے۔ چوہوں کو مخصوص پیتھوجین فری (ایس پی ایف) چاؤ کھلایا گیا۔ جانوروں کے تجربات سے متعلق تمام طریقہ کار کو سنکیانگ میڈیکل یونیورسٹی کے پہلے منسلک ہسپتال کی جانوروں کی اخلاقیات کمیٹی نے منظور کیا تھا۔ چوہوں کو کنٹرول شدہ ماحولیاتی حالات (25 ڈگری اور 12 گھنٹے کی روشنی/ تاریک سائیکل) کے تحت پنجروں میں رکھا گیا تھا اور انہیں معیاری چوہوں کے گولے کھانے اور نلکے کے پانی تک مفت رسائی حاصل تھی۔ علاج سے پہلے چوہوں کے عادی تھے۔ ایک لافانی چوہا ہیپاٹک سٹیلیٹ سیل لائن، HSC-T6، ووہان پروسیل جین بائیو ٹیکنالوجی کمپنی، LTD سے حاصل کیا گیا تھا۔ (ووہان، چین)۔ HSC-T6 خلیوں کو Dulbecco کے Modified Eagles Medium (High Glucose) (DMEM، بیجنگ، چین) میں 10 فیصد فیٹل بوائین سیرم (Gibco، جنوبی امریکہ)، 100 IU/ml penicillin، اور 100 ug/ml streptomycin کے ساتھ مکمل کیا گیا تھا۔ چین) 5 فیصد CO2 کے ساتھ 37 ڈگری پر مرطوب انکیوبیٹر میں۔

BSA سے متاثرہ جگر کی چوٹ اور علاج

75 SD چوہوں کو تصادفی طور پر چھ گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: نارمل (آست پانی سے علاج شدہ)، ماڈل (BSA علاج شدہ)، مثبت دوا (BSA-علاج شدہ پلس BJRG 600 mg/kg/day)، اور BSA-علاج شدہ پلس CPhGs(cistanche سے فینائل ایتھنول گلائکوسائیڈز)(125، 250، 5{{20}0 ملی گرام/کلوگرام فی دن) گروپس۔ BSA سے علاج شدہ پلس CPhGs (125, 250, 500 mg/kg/day) گروپوں میں ہر گروپ میں 13 چوہے تھے، اور دوسرے گروپ میں ہر گروپ میں 12 چوہے تھے۔ بی ایس اے کی حوصلہ افزائی جگر کی چوٹ کے ماڈل کو بنیادی حساسیت میں تقسیم کیا گیا ہے جس کے بعد مدافعتی حملہ ہوتا ہے) [13]۔ عام گروپ کو چھوڑ کر، دوسرے گروپوں کو 0.5 ملی لیٹر (9 ملی گرام/ملی لیٹر) بی ایس اے فرونڈ کے نامکمل معاون کے ساتھ ایک سے زیادہ ذیلی انجیکشن لگائے گئے تھے، دن 1، دن 15، دن 22، دن 29، اور دن 36 کو بنیادی حساسیت کے لیے۔ پانچویں انجیکشن کے سات دن بعد، خون چوہے کے ریٹنا رگ پلیکسس کے ذریعے حاصل کیا گیا اور سیرم البومین اینٹی باڈیز کے لیے ٹیسٹ کیا گیا۔ چوہے کے سیرم میں بی ایس اے اینٹی باڈی کا پتہ ڈبل آگر بازی کے طریقہ سے ہوا۔ حملے کا انجیکشن BSA کے 0.4 ملی لیٹر کو عام نمکین میں ڈال کر BSA اینٹی باڈی پازیٹو چوہوں میں ہفتے میں دو بار دس بار کاڈل رگ کے ذریعے لگایا گیا تھا۔ انجیکشن کے ارتکاز اور اوقات 5 تھے۔ g/L دن 46، دن 50، دن 53، دن 57، دن 60، دن 64، دن 67، دن 71، دن 74 اور دن 78، بالترتیب۔ عام گروپ میں، BSA کی بجائے امیونولوجیکل پرائمری (حساسیت) اور ثانوی (حملہ) انجیکشن کے لیے نارمل نمکین کا استعمال کیا جاتا تھا، اور دیگر حالات وہی تھے جو ماڈل گروپ میں تھے۔ عام گروپ کو زبانی طور پر 10 ملی لیٹر/کلوگرام/دن کی خوراک کے ساتھ آست پانی دیا جاتا تھا۔ ماڈل گروپ کو زبانی طور پر 10 ملی لیٹر/کلوگرام/دن 0.5 فیصد CMC-Na محلول دیا گیا۔ مثبت منشیات کے گروپ کو زبانی طور پر 600 ملی گرام / کلوگرام / دن BJRG دیا گیا تھا۔ BSA سے علاج شدہ پلس CPhGs (125،

250، اور 500 mg/kg/day) گروپوں کو زبانی طور پر 125، 250، اور 500 mg/kg/day CPhGs دیے گئے(cistanche سے فینائل ایتھنول گلائکوسائیڈز)بالترتیب چوہوں کی روزانہ خوراک آخری انجیکشن کے بعد دو ہفتوں تک جاری رہی۔ تجرباتی مدت کے بعد، چوہوں کو 10 فیصد کلورل ہائیڈریٹ سے پہلے 12 گھنٹے کے لیے روزہ رکھا گیا اور پھر فوری طور پر euthanized کر دیا گیا۔ ہر چوہے سے سیرم کے نمونے جمع کیے گئے اور فوری طور پر استعمال کیے گئے۔ جگر کو دو مقاصد کے لیے کاٹا گیا تھا: (1) ہائپ کٹس کے لیے مائع نائٹروجن میں تحفظ اور (2) ہسٹولوجیکل اور امیونو ہسٹو کیمیکل امتحانات کے لیے 10 فیصد فارملڈہائیڈ میں فکسیشن۔ جانوروں کے مطالعے کی پوری مدت 93 دن تھی۔

جگر اور تلی کے اشاریے۔

جگر اور تلی کو لیپروٹومی کے ذریعے الگ کیا گیا اور 4 ڈگری نارمل نمکین سے دھویا گیا۔ فلٹر پیپر کے ساتھ اضافی پانی جذب کرنے کے بعد، متعلقہ اشاریوں کا حساب لگانے کے لیے جگر اور تلی کا وزن کیا گیا: رشتہ دار اعضاء کا وزن=عضو کا وزن (g)/انفرادی جسم کا وزن (g) × 100 فیصد [14]۔

سیل کے تجربات

HSC-T6 سیلز کو ایک 96-کنویں پلیٹ میں چڑھایا گیا تھا۔ ابتدائی طور پر، خلیوں کو DMEM کے ساتھ کلچر کیا گیا تھا جس میں 48 گھنٹے کے لیے 10 فیصد FBS تھا۔ اس کے بعد میڈیم کو FBS کے بغیر DMEM سے تبدیل کر دیا گیا تاکہ خلیوں کو 12 گھنٹے تک بھوکا رکھا جا سکے۔ اس کے بعد خلیوں کو DMEM کے ساتھ کلچر کیا گیا جس میں 24 گھنٹے کے لیے 5.0 ng/mL TGF- 1 (FBS کے بغیر) شامل تھے۔ آخر میں، CPhGs کی مختلف تعداد(cistanche سے فینائل ایتھنول گلائکوسائیڈز)(100ug/ml، 50ug/ml، اور 25ug/ml)، ایکٹیوسائیڈ (6 ug/ml، 3 ug/ml، اور 1.5 ug/ml)، اور echinacoside (500ug/ml، 250ug/ml، اور 125ug/ml) پلیٹ میں چوکور کنوؤں میں کئے گئے اور 48 گھنٹے تک انکیوبیٹ کئے گئے۔

ریئل ٹائم پی سی آر تجزیہ

NF-κB، p65، اور کولیجن I کے mRNA اظہار کی سطح کا تعین ریئل ٹائم PCR کے ذریعے کیا گیا تھا۔ HSC-T6 خلیوں میں mRNA اظہار کا تعین کرنے کے لیے، خلیات (4 × 105 خلیات) کو 3 mL DMEM کے ساتھ 10 فیصد FBS کے ساتھ چھ کنویں پلیٹوں میں سیڈ کیا گیا اور راتوں رات 37 ڈگری اور 5 فیصد CO2 پر انکیوبیٹ کیا گیا، جس کے بعد سیل کلچر میڈیا سیرم فری DMEM میں تبدیل کر دیا گیا تھا۔ اگلا، CPhGs(cistanche سے فینائل ایتھنول گلائکوسائیڈز)(100 ug/ml، 50 ug/ml، اور 25 ug/ml)، acteoside (6 ug/ml، 3 ug/ml، اور 1.5 ug/ml)، اور echinacoside (500 ug/ml ، 250 ug/ml، اور 125 ug/ml) کو کنوؤں میں شامل کیا گیا۔ CPhGs یا monomeric کمپوزیشن کے ساتھ انکیوبیشن کے 48 گھنٹے کے بعد، کل RNA کو TRIzol reagent (Invitrogen، USA) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا اور 15 s تک کلوروفارم کے ساتھ بھرپور طریقے سے مشتعل کیا گیا۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 3 منٹ تک بیٹھنے کے بعد، لیسیٹ کو 12،000 × g پر 15 منٹ کے لیے 4 ڈگری پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ پانی کے مرحلے میں آر این اے کو آئسوپروپینول کے ساتھ تیز کیا گیا تھا، اور اوپری پانی کے مرحلے کو ایک نئی مائکرو سینٹرفیوج ٹیوب میں منتقل کیا گیا تھا۔ RNA کو 0.75 فیصد ایتھنول شامل کرکے تیز کیا گیا، جس کے بعد مائیکرو سینٹرفیوج ٹیوب اور سینٹرفیوج 12،000 × g پر 4 ڈگری پر 5 منٹ سے زیادہ نہیں۔ سپرنٹنٹ کو ہٹا دیا گیا تھا اور آر این اے کو کمرے کے درجہ حرارت پر 5-10 منٹ تک خشک کیا گیا تھا۔ پرائمر کے مخصوص سیٹ (سنگون، شنگھائی، چین) جو چوہے کے ایکٹین کو بڑھانے کے لیے استعمال کیے گئے تھے [GenBank: NM_031144.3]، Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1]، اور NF -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] جینز کو بیچ پرائمر 3 کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیا گیا تھا۔ فارورڈ (fw) اور ریورس (rv) پرائمر مندرجہ ذیل تھے: کولیجن I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA)، -actin (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G، rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A)۔ اندرونی کنٹرول کے طور پر ہاؤس کیپنگ جین -ایکٹین کے mRNA پر نتائج کو معمول پر لایا گیا تھا اور انہیں متعلقہ mRNA کی سطح کے طور پر پیش کیا گیا تھا۔ 8 μL iQ SYBR گرین سپرمکس، 1 μL 10 pM پرائمر جوڑی، 8.5 μL ڈسٹل واٹر، اور 2.5 μL cDNA کے ساتھ رد عمل کا مظاہرہ کیا گیا۔ ہر پولیمریز چین ری ایکشن مندرجہ ذیل شرائط کے تحت انجام دیا گیا: 3 منٹ کے لیے 95 ڈگری، پھر 95 ڈگری پر 10 سیکنڈ کے 40 چکر، 55 ڈگری پر 30 سیکنڈ، اور توسیع کے لیے 55 ڈگری - 95 ڈگری پر 10 سیکنڈ، اس کے بعد سنگل فلوروسینس پیمائش . حتمی نتائج کو متعلقہ اقدار (2-ΔΔCt) کے ساتھ بیان کیا گیا تھا۔ حساب اور تجزیہ iQ5 ریئل ٹائم پی سی آر ڈیٹیکشن سسٹم کے ذریعہ انجام دیا گیا تھا۔

مغربی دھبے کا تجزیہ

Collagen I (Abcam, Cambridge, UK, Art No: ab34710) پروٹین کے اظہار کی سطحوں کا تعین مغربی بلاٹنگ [with-actin (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, China) کے ذریعہ ایک ہاؤس کیپنگ کنٹرول کے طور پر کیا گیا تھا۔ ہول سیل کے نچوڑ کو ریڈیو امیونوپریسیپیٹیشن پرکھ (RIPA) (تھرمو سائنٹیفک، USA) بفر کا استعمال کرتے ہوئے 1 فیصد ہالٹ پروٹیز انحیبیٹر کاک ٹیل (تھرمو سائنٹیفک، یو ایس اے) اور 1 فیصد ہالٹ فاسفیٹیس انحیبیٹر کاک ٹیل (تھرمو سائنٹیفک، یو ایس اے) کے ساتھ تیار کیا گیا تھا۔ بریڈ فورڈ طریقہ [18] کے ذریعہ پروٹین کی حراستی کی پیمائش اور مقدار درست کی گئی۔ پروٹین (10–50 ug) کو 10 فیصد SDS-PAGE جیل پر الگ کیا گیا تھا اور PVDF جھلیوں (ملی پور، USA) میں منتقل کیا گیا تھا۔ 5 فیصد BSA کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر جھلیوں کو 1 گھنٹہ کے لیے بلاک کر دیا گیا تھا، اور بنیادی اینٹی باڈیز (اینٹی کولا جین آئی اینٹی باڈی، 1:200 ڈائلیشن یا ماؤس ایم اے بی آف -ایکٹین، 1:5000 ڈائلیشن) کو راتوں رات 4 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ متعلقہ Alk-Phos. conjugated ثانوی اینٹی باڈیز کمرے کے درجہ حرارت پر incubated تھے. آخر میں، جھلیوں کو 1 × Tris–HCl نمکین کے ساتھ 0.1 فیصد ٹوین 20 کے ساتھ تین بار دھویا گیا، اور GEL DOC XR امیجنگ سسٹم (Bio-Rad) کے ذریعہ سگنلز کو اسکین اور تصور کیا گیا۔ کثافت کا تجزیہ دلچسپی کے پروٹینوں پر کیا گیا اور GEL DOC امیج اسٹوڈیو سافٹ ویئر (Bio-Rad) کے ذریعہ ایکٹین میں معمول بنایا گیا۔ ایکٹین کو اندرونی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا جاتا تھا۔

شماریاتی تجزیہ

Shapiro-Wilk نارملٹی ٹیسٹ اور Levene کے variance homogeneity ٹیسٹ کا اطلاق نارملٹی کی تصدیق کے لیے کیا گیا تھا اور You et al. DARU جرنل آف فارماسیوٹیکل سائنسز (2015) 23:52 صفحہ 4 کا 13 یکسانیت کی تغیر۔ تغیرات کا تجزیہ (ANOVA) جس کے بعد Tukey کے پوسٹ ہاک ٹیسٹ کا استعمال اعداد و شمار کے فرق کی شناخت کے لیے کیا گیا، جو کہ عام طور پر تقسیم شدہ ڈیٹا ہے۔ Kruskal-Wallis نان پیرامیٹرک ٹیسٹ کو ڈیٹا کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا جو عام طور پر تقسیم یا یکساں نہیں ہے۔ نتائج کا اظہار اوسط ± SD کے طور پر کیا گیا تھا۔ اہمیت P < 0.05="" پر="" سیٹ="" کی="" گئی="" تھی۔="" تمام="" ڈیٹا="" کا="" تجزیہ="" spss="" 16.0="" سافٹ="" ویئر="" (سنکیانگ="" میڈیکل="" یونیورسٹی)="" کے="" ذریعے="" کیا="">

نتائج

CPhGs کا مقداری تعین

C. tubulosa میں CPhGs میں دو phenylethyl الکحل glycosides، echinacoside، اور acteoside ہوتے ہیں، اور CPhGs میں ان کے مواد کو HPLC تجزیہ (تصویر 1) کے ذریعے 42.71 ± 0.42 فیصد اور 14.27 ± {{7} کا تعین کیا گیا تھا۔ }}.18 فیصد، بالترتیب۔

جگر اور تلی کے اشاریے۔

جیسا کہ جدول 1 دکھایا گیا تھا، ماڈل گروپ کے جگر اور تلی کے اشاریے نمایاں طور پر بلند ہوئے تھے [P < 0۔{3}}1,="" p=""><0.05]۔ مختلف="" خوراک="" کے="" گروپس="" میں="" مثبت="" دوائی="" bjrg="" اور="" cphgs="" کے="" جگر="" اور="" تلی="" کے="" اشاریے="" ماڈل="" گروپ="" [pliver="0.004،" pliver="0.003،" pliver="0" کے="" مقابلے="" میں="" نمایاں="" طور="" پر="" کم="" ہوئے="" تھے۔="" 004،="" pliver="0.005;" pspleen="0.017،" pspleen="0.027،" pspleen="0.024،" pspleen="0.070،" بالترتیب]۔="" جگر="" اور="" تلی="" کے="" اشاریے="" ماڈل="" گروپ="" کے="" مقابلے="" کم="">

ALT، AST سرگرمیوں، اور جگر کے فبروسس مارکر پر CPhGs کے اثرات

موجودہ مطالعے میں، ماڈل گروپ میں ہیپاٹک انزائمز AST اور ALT کے سیرم کی سطح میں نمایاں اضافہ ہوا، جو BSA کی حوصلہ افزائی جگر کے فبروسس چوہوں میں ہیپاٹوسیولر نقصان کی عکاسی کرتا ہے۔ تاہم، تجربات.

BJRG (600 mg/kg) اور CPhGs (125, 250، اور 5{{10}}0 کے ساتھ علاج دکھایا گیا mg/kg) نے AST [PAST < 0="" کو="" نمایاں="" طور="" پر="" کم="" کیا۔{57}}{{60}}1،="" ماضی="">< 0.001،="" ماضی=""><0.001، ماضی=""><0.001 ،="" بالترتیب]="" اور="" alt="" [palt="0.117،" palt="0.139،" palt="0.189،" palt="0.255،" بالترتیب]="" ہیپاٹک="" فائبروسس="" چوہوں="" میں="" سطح="" .="" (ٹیبل="" 2)۔="" ماڈل="" چوہوں="" میں="" ha,="" ln,="" pc="" اور="" iv-c="" کی="" سطحوں="" میں="" نمایاں="" اضافہ="" ہوا="" [pha=""><0.001, pln=""><0.001, ppciii="0.002," piv-c=""><0.001, بالترتیب]۔="" ماڈل="" گروپ="" کے="" ساتھ="" مقابلے="" میں،="" ha="" [pha="0.009،" pha="0.007،" pha="0.009،" pha="0.023،" بالترتیب]،="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," بالترتیب],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006،="" p="" pciii="0.067،" p="" pciii="0.136،" p="" pciii="0.296،" بالترتیب]،="" اور="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0.001،="" p="" iv-c=""><0.001، p="" iv-c=""><0.001، p="" iv-c=""><0.001، بالترتیب]="" چوہوں="" میں="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" اور="" cphgs="" کی="" طرف="" سے="" مختلف="" خوراک="" کے="" گروپس="" (125،="" 250،="" اور)="" میں="" واضح="" طور="" پر="" کمی="" واقع="" ہوئی۔="" 500="" ملی="" گرام/کلوگرام)="" (ٹیبل="" 3)۔="" جگر="" کے="" بافتوں="" میں="" ہائپ="" کی="" سطح="" کی="" پیمائش="" کرکے="" ہائیپ="" مواد="" اور="" ٹی="" جی="" ایف-="" 1="" کولیجن="" مواد="" کا="" بھی="" پتہ="" چلا۔="" جیسا="" کہ="" جدول="" 4="" میں="" دکھایا="" گیا="" ہے،="" اوسط="">ماڈل گروپ میں سطح عام گروپ کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھی، لیکن BJRG گروپ اور مختلف CPhGs خوراک گروپوں میں اس میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی۔ چوہوں میں ماڈل گروپ کے TGF{{0}} کی جگر کی حراستی میں نمایاں اضافہ ہوا [P < 0۔{8}}01]۔="" ماڈل="" گروپ="" کے="" مقابلے="" میں،="" مثبت="" دوائیوں="" کی="" tgf-="" 1="" سطحوں="" اور="" مختلف="" cphgs="" کے="" خوراک="" گروپوں="" میں="" واضح="" طور="" پر="" کمی="" واقع="" ہوئی="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1=""><0.001، p="" tgf-="" 1=""><0.001، ptgf-="" 1=""><0.001، بالترتیب]۔="" نتائج="" کا="" خلاصہ="" جدول="" 4="" میں="" دیا="" گیا="">

ہسٹوپیتھولوجیکل معائنہ

H&E اور میسن کے ٹرائیکروم سے داغے ہوئے جگر کے ٹشو کے عام حصوں کے مشاہدات میں الگ الگ ہیپاٹک لابیولز اور ہیپاٹک سینوسائڈز کی نمائش ہوتی ہے۔ ماڈل چوہوں میں جگر کے بافتوں کا ڈھانچہ خراب ہو گیا تھا، اور جگر کے ٹشو اور ہیپاٹک سینوسائڈز کی جگہ کنیکٹیو ٹشوز کی ایک بڑی مقدار لے لی گئی تھی۔ تاہم، ماڈل گروپ کے مقابلے علاج کے گروپ میں زیادہ نارمل سائٹو آرکیٹیکچر اور کم کنیکٹیو ٹشو کا پتہ چلا۔

H&E سٹیننگ

نارمل گروپ میں، غیر معمولی پورٹل ایریاز اور ہیپاٹک سینوسائڈز کے بغیر ہیپاٹک لوبول کی ساختی سالمیت دیکھی گئی۔ جگر کی ڈوریوں کو ایک منظم انداز میں ترتیب دیا گیا تھا، جس کا بنیادی حصہ گول اور صاف تھا۔ نیوکلی سیل کے بیچ میں واقع ہے، جس میں وافر سائٹوپلازم ہوتا ہے۔ صرف پورٹل ایریا میں تھوڑی مقدار میں ریشے دار ٹشو ہوتے ہیں (تصویر 2a)۔ ماڈل گروپ میں، لوبولر ڈھانچہ کو شدید نقصان پہنچا۔ جگر کے خلیات نے ہلکے پانی والے انحطاط کو ظاہر کیا، زیادہ تر غبارے کا انحطاط اور/یا چکنائی کا انحطاط۔ اشتعال انگیز خلیوں کی دراندازی کی تشکیل، وسیع ریشے دار ٹشو ہائپرپلاسیا، بڑی تعداد میں ریشے دار سیپٹم کی تشکیل، سپلٹ لوبولز، اور جگر کے خلیوں کا نمایاں پھیلاؤ بھی دیکھا گیا۔ ان مشاہدات نے ہیپاٹک فائبروسس (تصویر 2b) کے چوہے کی مدافعتی چوٹ کے جانوروں کے ماڈل کے قیام کی کامیابی کی تصدیق کی۔ ماڈل گروپ کے مقابلے میں، مختلف CPhGs میں سوزشی خلیوں کی دراندازی میں کمی تھی۔ جگر کے خلیوں کی کم نیکروسس اور فیٹی انحطاط کے ساتھ ساتھ فائبروسس کے خاتمے کا بھی مشاہدہ کیا گیا۔ CPhGs نے چوہوں میں BSA-حوصلہ افزائی ہیپاٹک فائبروسس کی پیتھالوجی کو نمایاں طور پر کم کیا، جگر کے خلیات کی سوجن کو کم کیا، اور مؤثر طریقے سے ہیپاٹوسیٹ نیکروسس اور سوزشی خلیوں کی دراندازی کو روکا، یہ تجویز کرتا ہے کہ CPhGs BSA-حوصلہ افزائی چوہوں پر حفاظتی اثر ڈالتے ہیں۔ (تصویر 2c–f)۔ میسن کا ٹرائیکروم سٹیننگ عام گروپ میں، جگر کے ٹشو نارمل تھے۔ ہیپاٹک پورٹل ایریا میں نیلے کولیجن ریشوں کی ایک چھوٹی سی تعداد دکھائی دیتی ہے، اور جگر کے بافتوں کی ساخت عام طور پر تھی (تصویر 3a)۔ عام گروپ کے جگر کے ٹشو کے مقابلے میں، ریشے دار ٹشو مرکزی لیفلیٹ کے ذریعے پھیلتے ہیں اور جگر کے پیرینچیما میں پھیل جاتے ہیں۔ کولیجن ریشے توسیع شدہ اور منسلک اور

پورے لوبول کو لپیٹ لیا اور مرکزی رگ کو گھیر لیا۔ ان اثرات کے ساتھ ہیپاٹوسائٹ فائبروسس، لوبولر ساختی نقصان، پیری پورٹل فبروسس، اور سیوڈولوبول کی تشکیل (تصویر 3b) نے اس بات کا ثبوت فراہم کیا کہ ماڈل قائم کیا گیا تھا۔ ماڈل گروپ کے ساتھ مقابلے میں، مثبت منشیات کے کنٹرول گروپ میں کولیجن ریشوں کو پیریفرل پورٹل ایریا (تصویر 3c) سے ہلکے سے باہر کی طرف بڑھایا گیا تھا۔ ماڈل گروپ کے ساتھ موازنہ کرتے ہوئے، مختلف CPhGs خوراک گروپوں میں کولیجن ریشوں کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا، فائبر کے پھیلاؤ کو روک دیا گیا تھا، اور جگر کے پیرینچیما کے اندر ریشے دار بافتوں کے پھیلاؤ کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا۔ ان نتائج نے تجویز کیا کہ CPhGs نے چوہوں کو BSA سے متاثر ہیپاٹک فائبروسس (تصویر 3d–f) سے محفوظ رکھا۔

امیونو ہسٹو کیمیکل داغ

اہم بات یہ ہے کہ کولیجن ٹائپ I اور کولیجن ٹائپ III کا اظہار ہیپاٹک فائبروسس کی نشوونما میں اہم کردار ادا کرتا ہے، اور جگر کے بافتوں میں ان کی نسل اور جمع ہونا اینٹی ہیپاٹک فائبروسس کی افادیت کے ایک اہم عامل کے طور پر کام کر سکتا ہے۔ نتائج کا خلاصہ جدول 5 میں دیا گیا ہے۔

کولیجن قسم I

عام گروپ نے بنیادی طور پر خون کی نالیوں اور پورٹل ایریا میں کولیجن ٹائپ I کا اظہار کیا۔ ماڈل گروپ نے پورٹل علاقوں میں کولیجن ٹائپ I ویسکولر فائبروسس کا بہت زیادہ اظہار کیا۔ Disse کی جگہ میں، کولیجن قسم I کے داغ دھبے کی لکیریں یا ایک پیچیدہ تقسیم کے طور پر دیکھی گئیں۔ سیوڈولوبیول بنانے کے لیے کولیجن نے ریشے دار سیپٹا کو گھیر لیا۔ ان تجربات میں، BJRJ (600 mg/kg) اور CPhGs (125, 250, اور 500 mg/kg) [PCol I=0.002, PCol I {{ کے مختلف خوراک گروپس کے لیے کم ریشہ دار سیپٹا تشکیل دیا گیا تھا۔ 6}}.001، PCol I=0.023، اور P Col I=0.044، بالترتیب]۔ نیم مقداری نتائج نے انکشاف کیا کہ ماڈل گروپ (تصویر 4) کے مقابلے ان کے کولیجن قسم I کا اظہار نمایاں طور پر کم تھا۔

کولیجن کی قسم III

کولیجن کی قسم III کا عام گروپ میں کمزوری سے اظہار کیا گیا تھا، اور پورٹل اور جگر کی رگوں کے آس پاس کے پردیی علاقوں میں مسلسل ریشوں کی بجائے تھوڑی مقدار میں باریک پیلے رنگ کا مظاہرہ کیا گیا تھا (تصویر 5a)۔ ماڈل گروپ میں، کولیجن ریشوں نے وسیع اور موٹی ڈوریوں کی نمائش کی، جو مضبوط اظہار کی نشاندہی کرتے ہیں، جو بنیادی طور پر پورٹل اور ریشے دار ٹشو والے علاقوں میں واقع ہیں (تصویر 5b)۔ BJRJ (600 mg/kg) کے کولیجن فائبر اور CPhGs (125، 250، اور 500 mg/kg) کے مختلف خوراکی گروپوں کو فلیمینٹس اور مرکزی رگ اور پورٹل علاقوں میں تقسیم کیا گیا تھا۔ ماڈل گروپ کے مقابلے میں، کولیجن کے ریشے نمایاں طور پر کم ہو گئے تھے، داغ ہلکا اور پتلا تھا، اور امیونو ہسٹو کیمیکل سٹیننگ کمزور طور پر مثبت تھا (تصویر 5c–f)۔ یہ نیم مقداری نتائج ظاہر کرتے ہیں کہ مثبت اور مختلف خوراک کے گروپس [PCol III=0.015، PCol III=0.001، PCol III=0.010، اور P Col III=0.037، بالترتیب] ماڈل گروپ میں شامل لوگوں سے مختلف تھے۔

TGF- 1

عام چوہے کے جگر کے خلیوں میں TGIF{{0}} کا بہت کم اظہار تھا۔ اظہار مختصر تعداد میں بیچوالا خلیوں تک محدود تھا (تصویر 6a)۔ ماڈل گروپ میں، TGF- 1 اظہار کو پورٹل ایریا، ریشے دار جگہوں، ہیپاٹک سٹیلیٹ سیلز، سوزش والے خلیات، سینوسائیڈل وال اور سائٹوپلازم میں وسیع پیمانے پر تقسیم کیا گیا تھا۔ ایک خاص پورٹل ایریا نے بھورے پیلے رنگ کے داغ (تصویر 6b) کے ساتھ مضبوطی سے مثبت اظہار کا مظاہرہ کیا۔ پورٹل ایریا اور BJRJ (600 mg/kg) کے ریشے دار سیپٹا اور CPhGs (125، 250، اور 500 mg/kg) کے مختلف خوراک گروپس میں اظہار کی تھوڑی مقدار تھی۔ ماڈل گروپ کے مقابلے میں ان گروپوں میں مثبت داغ کی حد کو نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا۔ ریشے دار سیپٹا میں بیچوالے خلیوں میں داغ دھبے اور سوزش والے خلیوں کے سائٹوپلازم میں کمی واقع ہوئی تھی (تصویر 6c–f)۔ نیم مقداری نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ BJRJ اور CPhGs کے مختلف خوراک گروپس [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" .004،="" بالترتیب]="" ماڈل="" گروپ="" کے="" مقابلے="" میں="" اہم="" تھے۔="" جیسا="" کہ="" مضمون="" میں="" پہلے="" ذکر="" کیا="" گیا="" ہے،="" tgf-="" 1="" جگر="" کی="" پیتھوفیسولوجی="" میں="" ایک="" اہم="" سائٹوکائن="">

فبروسس، ایکسٹرا سیلولر میٹرکس کی پیداوار کو متحرک کرتا ہے [19]۔ ہم نے دکھایا کہ ماڈل گروپ میں TGF- 1 کی سطح جگر کے فبروسس کی شدت کے مطابق بڑھی ہے۔ جگر میں TGF- 1 کے اظہار کی سطح سیرم TGF- 1 سطحوں کے ساتھ مطابقت رکھتی تھی۔ اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ CPhGs ECM کی ترکیب اور انحطاط میں حصہ لے کر TGF- 1 اظہار کی وجہ سے جگر کے فبروسس کو نمایاں طور پر کم کر سکتے ہیں۔ کولیجن ٹائپ I، کولیجن ٹائپ III، اور TGF- 1 کا اظہار ہیپاٹک فائبروسس کے پیتھولوجیکل عمل کا پتہ لگا سکتا ہے۔ علاج کے گروپوں میں ان کے اظہار کی سطح میں نمایاں طور پر کمی واقع ہوئی اور یہ واضح کیا گیا کہ CPhGs کولیجینیز کی سرگرمی کو بہتر بنا سکتے ہیں، جگر کی ECM ترکیب اور انحطاط کے متحرک توازن کو برقرار رکھتے ہیں، اس طرح جگر کے فبروسس کی تشکیل میں تاخیر اور روک تھام ہوتی ہے۔