چوہوں میں 5-Fu/5-Fu+L-OHP سے متاثر بون میرو سپریشن کے ماڈل پر حصہ چہارم کا مطالعہ

فی الحال، بون میرو دبانے کے جانوروں کے ماڈلز بنانے کے لیے عام طور پر استعمال ہونے والے طریقوں میں ریڈی ایشن ماڈلنگ [1,2]، سائکلو فاسفمائڈ انٹراپیریٹونیل انجیکشن ماڈلنگ [3-5]، 5-فلوروراسیل (5-فلوروراسیل، 5- {5}}FU) انٹراپریٹونیل انجیکشن ماڈلنگ [6,7]، تابکاری کے ساتھ مل کرکیموتھراپی کی دواکمپاؤنڈ ماڈلنگ [8,9]، اینٹی ایپی لیپٹک ڈرگ کاربامازپائن گیویج ماڈلنگ [10]، وغیرہ۔ مختلف ماڈلنگ کے طریقے بون میرو کو دبانے کے مختلف میکانزم کا سبب بنتے ہیں، اور خون کے مختلف خلیوں پر اثرات اور ان کی ڈگری مختلف ہوتی ہے۔ مختلف کیموتھراپی ادویات، ان کے مختلف طریقہ کار کی وجہ سے، بون میرو ہیماٹوپوائسز پر اپنے اثرات میں بھی کچھ فرق ظاہر کرتی ہیں۔ لہذا، بون میرو دبانے کا ایک مثالی جانوروں کا ماڈل بون میرو ہیماٹوپوائسز پر کیموتھراپی ادویات کے اثرات کا مطالعہ کرنے کے لیے بہت اہمیت کا حامل ہے۔

کلینیکل پریکٹس میں،کولوریکٹل کینسر کے لئے معاون کیموتھریپیبنیادی طور پر 5-FU regimen اور 5-Fu کو oxaliplatin (oxaliplatin، L-OHP) کے ساتھ مل کر اپناتا ہے۔ ہڈیوں کے گودے کو دبانے کا جانوروں کا ماڈل بنانے کے لیے اکیلے 5-فو کے استعمال پر متعلقہ مطالعات ہوئے ہیں۔ تاہم، 5-فو کے استعمال کا دائرہ نسبتاً وسیع ہے۔ لٹریچر رپورٹس میں 110 mg/kg، intraperitoneal انجکشن (ip) d1 پر اور d5 ماڈلنگ کے لیے [7, 150 mg/kg, ip, d1 ماڈلنگ کے لیے 16, 11], 200 mg/kg, ip, d1 ماڈلنگ کے لیے [{{ 15}}]، اور 250 mg/kg, ip, d1 ماڈلنگ کے لیے [16]۔ تاہم، L-OHP کے ساتھ مل کر بون میرو کو دبانے کے جانوروں کا ماڈل بنانے کے لیے 5-Fu کے استعمال کے بارے میں کوئی رپورٹ نہیں ملی ہے۔ یو لنگھونگ وغیرہ۔ جگر کی چوٹ کا جانوروں کا نمونہ قائم کرنے کے لیے L-OHP کے ساتھ مل کر 5- Fu کا استعمال کیا گیا۔ انتظامیہ کے طریقہ کار اور لٹریچر کی خوراک کا حوالہ دیتے ہوئے، ٹیم نے L-OHP کے ساتھ مل کر 5-Fu کی خوراک کی ابتدائی تحقیق کی تاکہ ہڈیوں کا جانوروں کا ماڈل قائم کیا جا سکے۔میرو دبانے، اور 5-Fu 200 mg/kg, ip, d1 اور 5-Fu 187.5 mg/kg + L-OHP 9 mg/kg, ip, d1 کے ماڈلنگ کے طریقہ کار کا موازنہ کیا۔ نتائج سے معلوم ہوا کہ ان دو ماڈلز کی خوراک بہت زیادہ تھی۔ لہذا، اس مطالعہ کا مقصد یہ ہے کہ 5-Fu-Induced bone marrow suppression animal model کی بہترین خوراک اور L-OHP ماڈلنگ کے ساتھ مل کر 5-Fu کی خوراک کی تلاش جاری رکھیں، تاکہ فراہم کی جا سکے۔ کے لئے سب سے مثالی جانوروں کا ماڈلافادیت کا مطالعہ کرنے کا اگلا مرحلہاورQitu Erzhi نسخے کا طریقہ کار.

گردے کی صحت کے لیے جڑی بوٹیوں کا نظام

Wecistanche کی معاون سروس

ای میل:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

مواد اور طریقے

1 تجرباتی مواد

1.1 تجرباتی جانور

100 مخصوص پیتھوجین فری (SPF) BALB/c نر چوہے، جن کا وزن 20g±2g ہے، SBEF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. سے خریدا گیا تھا اور انہیں Xiyuan ہسپتال کے تجرباتی جانوروں کے مرکز، چائنا اکیڈمی آف چائنیز میڈیکل میں پنجروں میں رکھا گیا تھا۔ سائنسز (قابلیت کا سرٹیفکیٹ: SYXK (بیجنگ) نمبر 2015-0011)۔ تمام چوہوں کو 1 ہفتے کے لئے انکولی طور پر کھلایا گیا تھا، اور کھانا کھلانے کی مدت کے دوران پانی اور خوراک تک مفت رسائی حاصل تھی۔ کھانا کھلانے کے حالات: اندرونی درجہ حرارت 20-26 ڈگری، رشتہ دار نمی 40%~60%، روشنی/تاریک وقت 12 گھنٹے/12 گھنٹے۔ یہ تجربہ Xiyuan ہسپتال، چائنا اکیڈمی آف چائنیز میڈیکل سائنسز کی تجرباتی جانوروں کے انتظام کی اخلاقیات کمیٹی کے متعلقہ ضوابط کی سختی سے تعمیل کرتا ہے اور جانوروں کی اخلاقیات کے معیارات کی تعمیل کرتا ہے۔

1.2 اہم تجرباتی ادویات اور ریجنٹس

5-Fu (fluorouracil injection) Oxaliplatin برائے انجکشن

0.01M فاسفیٹ بفر (PBS بفر) خون کے خلیات کے تجزیہ کے لیے diluent (MEK-640)

خون کے خلیات کے تجزیہ کے لیے صفائی کا حل (MEK-680) خون کے خلیات کے تجزیہ کے لیے ہیمولٹک ایجنٹ (MEK-680) خون کے خلیوں کے تجزیہ کار کے لیے صفائی کا حل

ہیرس ہیماتوکسیلین داغ 0.5% eosin داغ

غیر جانبدار گم سگ ماہی میڈیم

معدنی تیزاب کی قسم ٹشو نمونہ decalcification حل

1.3 اہم آلات اور آلات

خودکار بلڈ سیل کاؤنٹر (MEK6318) کیپلیری خون جمع کرنے والی ٹیوب (20 μL)

1000μL پائپیٹ ٹپ

Tissue-TEK VIP6 حیاتیاتی ٹشو ڈی ہائیڈریٹر Tissue-TEK TEC حیاتیاتی ٹشو ایمبیڈنگ مشین Leica RM2235 ٹشو سلائسر

Leica HI1210 سلائس چننے والا Leica HI1220 سلائس بیکنگ مشین

Leica ST5020 خودکار سٹینر Leica CV5030 خودکار کور سلپر اولمپس Bx53 مائکروسکوپ

پاتھ کیو سی پیتھالوجی کوالٹی کنٹرول اور ڈیٹا مینجمنٹ سسٹم

دیگر: پائپیٹ، عام الیکٹرانک پیمانہ، جراحی کی قینچی، چمٹی، 75 فیصد الکحل، طبی گوج، جراثیم سے پاک روئی کی گیندیں، سرنجیں وغیرہ۔

1.4 کیموتھراپی ادویات کی تیاری

(1) سنگل ڈرگ 5-فو ریگیمین

40 ملی لیٹر 0.9% NaCl محلول میں {{0}}Fu (0.25 g/10 ml) کو حل کریں تاکہ اسٹینڈ بائی استعمال کے لیے 5 mg/ml کے ارتکاز کے ساتھ محلول تیار کریں۔

(2) 5-L-OHP طرز عمل کے ساتھ مل کر Fu

40 ملی لیٹر 0.9% NaCl محلول میں {{0}}Fu (0.25 g/10 ml) کو حل کریں تاکہ اسٹینڈ بائی کے لیے 5 mg/ml کی ارتکاز کے ساتھ محلول تیار کیا جا سکے۔ استعمال کریں L-OHP (50 mg) کی 1 ٹیوب کو 5 ملی لیٹر 5% گلوکوز محلول میں تحلیل کریں، اور استعمال کے لیے 0.5 mg/ml محلول میں 5% گلوکوز محلول کے ساتھ پتلا کرنا جاری رکھیں۔

جدول 4-1 ماڈلنگ ادویات کا طریقہ

مندرجہ بالا خوراک کے طریقہ کار کے مطابق، تمام چوہوں کا وزن کیا گیا اور جسمانی وزن کے مطابق انفرادی طور پر خوراک دی گئی۔ دوہری دوائیوں کے گروپ میں، 5-Fu اور L-OHP انتظامیہ کے درمیان وقت کا وقفہ 5 گھنٹے سے زیادہ تھا [17]۔

(2) بون میرو سوپریشن ماڈل کے تشخیصی اشارے

بون میرو سپریشن ماڈل کے تشخیصی اشارے میں پیریفرل بلڈ سیل کی تعداد میں کمی [18-22]، یا بون میرو نیوکلیٹیڈ سیلز کے ساتھ مل کر پیریفرل بلڈ سیل کی گنتی شامل ہیں [923-25]۔ اس مطالعہ نے ماڈلنگ کے اثر کو جانچنے کے لیے دوسرا طریقہ استعمال کیا۔

2.2 مشاہدے کے اشارے اور مواد

2.2.1 چوہوں کی عمومی حالت

تجربے کے دوران چوہوں کے ہر گروپ کی خوراک، شوچ، سرگرمی، حالت، دماغی حالت اور بالوں کی حالت کا روزانہ مشاہدہ کیا گیا۔ اگر چوہوں کی موت ہوئی تو وہ وقت پر ریکارڈ کیے گئے۔

2.2.2 ہر گروپ میں چوہوں کے وزن میں تبدیلیاں

ماڈلنگ (d0) کے دن خوراک دینے سے پہلے ہر ماؤس کا وزن کریں اور ریکارڈ کریں، اور ماڈلنگ کے بعد ہر دوسرے دن ہر ماؤس کا وزن کریں اور ریکارڈ کریں۔

2.2.3 پردیی خون کے خلیوں کی تعداد میں تبدیلیاں

ماؤس فکسر کے ساتھ ماؤس کو ٹھیک کریں، دم کو بے نقاب کریں، اور دم کو 45-50 ڈگری گرم پانی میں بھگو دیں۔ دم خشک کرنے کے بعد، دم کی نوک کا 1-2 ملی میٹر کاٹ دیں۔ تیزی سے اور آہستہ سے دم کو بیس سے سرے تک 2-3 بار ماریں۔ 20μL خون جمع کرنے کے لیے کیپلیری بلڈ کلیکشن ٹیوب کا استعمال کریں، اسے تیار شدہ خون کے خلیے میں پتلا کریں، اور مشین پر خون کے خلیوں کا تجزیہ کریں۔ ہر روز ایک مقررہ وقت پر خون جمع کریں؛ تمام خون جمع ایک شخص کے ذریعے مکمل کیا جاتا ہے۔ پتہ لگانے کے اشارے میں شامل ہیں: خون کے سفید خلیے، خون کے سرخ خلیے، ہیموگلوبن اور پلیٹلیٹس۔

2.2.4 بون میرو نیوکلیٹیڈ سیل شمار میں تبدیلیاں

نمونے لینے سے ایک دن پہلے، 1000 μL PBS محلول لینے کے لیے مائکرو پیپٹ کا استعمال کریں اور اسے 2 ملی لیٹر EP ٹیوب میں پتلا کریں، اور بعد میں استعمال کرنے کے لیے اسے 4 ڈگری ریفریجریٹر میں محفوظ کریں۔ ڈی 6 پر، 8 چوہوں کو تصادفی طور پر ہر گروپ سے منتخب کیا گیا اور گریوا کی سندچیوتی سے مارا گیا۔ جراثیم سے پاک صاف بینچ کے نیچے، فیمر کے قریب کھال کاٹنے، دائیں فیمر کو ہٹانے، اور بقایا نرم بافتوں کو ہٹانے کے لیے اسے میڈیکل گوز سے لپیٹنے کے لیے جراحی کی قینچی کا استعمال کیا جاتا تھا۔ EP ٹیوب میں PBS محلول نکالنے کے لیے 1 ملی لیٹر سرنج کی سوئی (نمبر 4 سوئی) کا استعمال کریں، ہڈیوں کے گودے کو EP ٹیوب میں فلش کرنے کے لیے فیمر کے ایک سرے میں سوراخ کریں۔ ہڈیوں کے گودے کے خلیات کو باہر نکالنے کے لیے بار بار فلش اور اسپریٹ کریں جب تک کہ فیمر سفید نہ ہوجائے۔ تیار شدہ بون میرو سیل سسپنشن کو ایک 200- میش نایلان نیٹ سے گزارا گیا۔ بون میرو نیوکلیٹیڈ سیلز کا پتہ لگانے کے لیے خودکار بلڈ سیل کاؤنٹر استعمال کریں۔ ڈی 13 کو، باقی چوہوں کو اسی طرح مارا گیا اور نمونے اکٹھے کیے گئے۔

2.2.5 بون میرو پیتھالوجی ایچ ای سٹیننگ

ڈی 6 پر، ہر گروپ کے چوہوں کو سروائیکل ڈس لوکیشن سے مارے جانے کے بعد، جراحی کی قینچی کا استعمال جراثیم سے پاک صاف بینچ کے نیچے فیمر کے قریب کھال کو کاٹنے، بائیں فیمر کو ہٹانے، موم کے بلاکس، سلائسیں بنانے اور ایچ ای کے داغ لگانے کے لیے کیا گیا۔

(1) موم بلاک کی تیاری اور سیکشننگ کے مراحل

① نمونہ: ٹشو کو 4% paraformaldehyde کے ساتھ 24 گھنٹے سے زیادہ کے لیے ٹھیک کریں، decalcification کے محلول میں 24-48 گھنٹے تک بھگو دیں، ٹشو کو پن سے چبھیں، ٹشو نرم ہونے کے بعد اسے کاٹ کر تراشیں، اور اسے ویکس بلاک میں ڈال دیں۔ باکس

② پانی کی کمی: ٹشو کو ترتیب وار 70% الکوحل (2 گھنٹے)، 80% الکوحل (1.5 گھنٹے)، 95% الکوحل I (1.5 گھنٹے)، 95% الکوحل II (1.5) میں رکھا جاتا ہے۔ گھنٹے)، 100% الکحل I (0.5 گھنٹے)، اور 100% الکحل II (0.5 گھنٹے)، اور تدریجی طریقے سے پانی کی کمی۔

③ شفافیت: ٹشو کو ترتیب وار اینہائیڈروس ایتھنول اور زائلین محلول (حجم کا تناسب 1:1)، زائلین I، اور زائلین II میں 40 منٹ کے لیے رکھا جاتا ہے۔

④ موم کا وسرجن: ٹشو کو ترتیب وار زائلین اور پیرافین (1:1)، پیرافین I، اور پیرافین II کے مرکب میں 20 منٹ کے لیے رکھا جاتا ہے۔ پیرافین کو پگھلا رکھنے کے لیے موم کی ڈپنگ 58 ڈگری پر ایک مستقل درجہ حرارت والے آلے میں کی جاتی ہے۔

⑤ ایمبیڈنگ: ٹشو بلاک پر لیبل لگانے کے بعد، چمٹیوں کو پہلے سے گرم کریں، پگھلا ہوا پیرافین مولڈ میں لگائیں، اور پھر ٹشو بلاک کو اندر رکھیں اور پیرافین کے مضبوط ہونے کا انتظار کریں۔

⑥ سلائسنگ: ایمبیڈ کرنے کے بعد، ٹشو ویکس بلاک کو سلائسر پر رکھیں، سلائسر کے زاویہ کو ایڈجسٹ کریں، اور ٹشو بلاک کو 4-5 μm کی موٹائی کے ساتھ سلائسوں میں کاٹ دیں۔

⑦ چپکنا: پیرافین کے ٹکڑوں کو 42 ڈگری پانی میں پھیلائیں، سلائیڈ کے ساتھ سلائسز کو ایک ایک کرکے اٹھائیں، اور انہیں سلائیڈ پر چپکا دیں۔

⑧ بیکنگ: پھنسی سلائیڈ کو ایک مستقل درجہ حرارت والے باکس میں تقریباً 70 ڈگری پر رکھیں اور 1.5 گھنٹے تک بیک کریں۔

(2) وہ داغ لگانے کے مراحل:

① xylene I اور II میں 15 منٹ تک بھگو کر ڈیویکس کریں۔

② 100% الکوحل I اور II میں 5 منٹ تک بھگو دیں۔

③ 95%، 85%، اور 75% گریڈینٹ الکحل میں 3 منٹ تک بھگو دیں، اور ڈسٹل پانی سے دھو لیں۔

④ ہیماتوکسیلین کے داغ کو 1-3 منٹ تک لگائیں، اور کشید پانی سے دھولیں۔

⑤ ہائیڈروکلورک ایسڈ الکحل کی تفریق 2-3 کے لیے، آست پانی سے دھوئے۔

⑥ نیلے ہونے کے لیے امونیا کے پانی میں 1 منٹ تک ڈبو دیں، ڈسٹل پانی سے دھو لیں۔

⑦ Eosin کا ​​داغ 5 منٹ تک۔

⑧ 75%، 85%، 95% گریڈینٹ الکحل میں 2 منٹ تک ڈوبیں۔

⑨ 100% الکحل I، IⅡ میں 3 منٹ کے لیے ڈبو دیں۔

⑩ xylene I میں ڈوبیں، Ⅱ 5 منٹ ہر ایک کے لیے۔

⑪ غیر جانبدار گم کے ساتھ سیل کریں۔

2.3 شماریاتی طریقے

SPSS26۔{1}} کو ڈیٹا پر شماریاتی تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ پیمائش کے اعداد و شمار کو اوسط ± معیاری انحراف (x±s) کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔ سب سے پہلے، ڈیٹا کو نارملیت اور تغیر کی یکسانیت کے لیے جانچا گیا: عام طور پر تقسیم کیے گئے ڈیٹا کے لیے، ایک طرفہ ANOVA کا استعمال متعدد گروپوں کے درمیان موازنہ کے لیے کیا گیا: جب فرق برابر تھا، LSD ٹیسٹ جوڑے کے مقابلے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔ اگر تغیر برابر نہیں تھا، تو تمہانے کا T2 ٹیسٹ جوڑے کے مقابلے کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔ اگر یہ عام تقسیم کے مطابق نہیں تھا، تو ایک نان پیرامیٹرک ٹیسٹ استعمال کیا جاتا تھا۔ پی<0.05 was considered statistically significant.