حصہ Ⅰ غذائی پروٹین اور فائبر کی سطح کے نمو پر اثرات، گاؤٹ کی موجودگی، آنتوں کی مائکروبیل کمیونٹیز، اور گوسلنگ کے گٹ کڈنی محور میں امیونوریگولیشن

خلاصہ

موجودہ مطالعہ نے غذائی پروٹین اور فائبر کی سطح کے نمو کی کارکردگی، گاؤٹ کی موجودگی، آنتوں کے مائکروبیل کمیونٹیز، اور گوسلنگز کے گٹ-کڈنی محور میں امیونوریگولیشن پر اثرات کا جائزہ لیا۔ 2 CP لیولز (180 [18CP] اور 220 [22CP] g/kg) اور 3 خام فائبر (CF) لیولز (30 [کم CF]، 50 [وسط CF]، اور 70 [High CF] g/kg)۔ زیادہ CP یا کم CF غذا نے گوسلنگز کو گاؤٹ ہونے کا خدشہ ظاہر کیا۔ زیادہ پروٹین والی خوراک نے گردوں کے کام کو خراب کر دیا۔ UA اور Cr کے سیرم کے ارتکاز کے ساتھ ساتھ 9- دن پرانے goslings میں کھلائے جانے والے 22 فیصد CP غذا میں XOD سرگرمی نمایاں طور پر بڑھی تھی۔ اگرچہ CF کی سطح 3 سے 7 فیصد تک براہ راست گردے کی صحت پر اثر انداز نہیں ہوتی ہے، تاہم CF کی سطح میں اضافہ گوسلنگ کے سیکم میں پروبائیوٹکس کے اضافے کو تیز کر سکتا ہے اور نقصان دہ بیکٹیریا کو روک سکتا ہے، جس سے زیادہ پروٹین والی غذا کی وجہ سے ہونے والے گٹ ڈیس بائیوسس کو ختم کیا جا سکتا ہے۔ 16Sr RNA کی ترتیب کے ذریعے cecal microbiota کے تجزیے سے یہ بات سامنے آئی کہ 22CP گروپ میں Enterococcus کی کثرت 18CP گروپ کے مقابلے میں زیادہ تھی لیکن d 9 کو CF کی سطح میں اضافے کے ساتھ کم ہوئی۔ Lactobacillus کی کثرت CF کی سطح میں اضافے کے ساتھ بڑھ گئی۔ مزید برآں، سیرم، ٹانسل، اور گردے کے ٹشوز میں اعلیٰ سیرم ایل پی ایس اور پروئنفلامیٹری سائٹوکائن کی ارتکاز اور اپریگولیٹڈ ایم آر این اے ایکسپریشن لیول اس بات کا اشارہ ہے کہ ہائی پروٹین والی غذا TLR4/MyD88/NFkB راستے کو چالو کر سکتی ہے اور آنتوں اور گردوں کی سوزش دونوں کو متاثر کرتی ہے۔ ڈی 9 پر سیرم ایل پی ایس کی تعداد میں اضافہ CF کے ساتھ کم ہوتا ہوا پایا گیا، حالانکہ غذائی CF کی سطح میں تبدیلی سے گوسلنگ کے سیرم کے مدافعتی اشاریے براہ راست متاثر نہیں ہوئے۔ آخر میں، اعلی CP غذا نے گاؤٹ کی موجودگی، مائکروبیل کمیونٹیز، اور گوسلنگ کے گٹ-کڈنی محور میں امیونوریگولیشن پر منفی اثر ڈالا، جبکہ غذائی ریشہ کی سطح میں مناسب اضافہ نے آنتوں کے توازن کو برقرار رکھنے اور سیرم ایل پی ایس کی حراستی کو کم کرنے میں مدد کی۔ ہم گوسلنگ فیڈ کے لیے بہترین امتزاج کے طور پر 5 فیصد CF کے ساتھ 18 فیصد CP کی خوراک تجویز کرتے ہیں۔

مطلوبہ الفاظ

خام فائبر، پروٹین، گوسلنگ گاؤٹ، آنتوں کی مائکروبیل کمیونٹیز، گٹ-کڈنی کا محور،Cistanche کے فوائد.

جاننے کے لیے یہاں کلک کریں۔Cistanche کا گردہ پر کیا اثر ہے؟

تعارف

گیز، جو سبزی خور ہیں، معمول کی سرگرمیاں انجام دینے کے لیے غذائی ریشہ پر انحصار کرتے ہیں۔ غذا میں اعتدال پسند خام فائبر (سی ایف) کی سطح بیماریوں کے خلاف مزاحمت کو بڑھانے اور آنتوں کے مائکرو ایکولوجیکل توازن کو تبدیل کرکے اور مدافعتی افعال کو بڑھا کر پولٹری میں ترقی کو فروغ دینے کے لیے جانا جاتا ہے (جھا اور مشرا، 2021) Wils-Plotz et al. (2013)۔ نے اطلاع دی ہے کہ غذائی پیکٹین کی شمولیت نے ileal mucosa میں IL- 12 اظہار کو بڑھا دیا ہے اور cecal tonsils میں interferon-g کی پیداوار میں اضافہ ہوا ہے۔ متعدد مطالعات نے اشارہ کیا ہے کہ کم سی ایف غذا مائکروبیل تنوع کو کم کرتی ہے اور ساتھ ہی ڈی 70 کو geese ceca میں فائدہ مند مائکرو بائیوٹا کی نسبتا کثرت کو کم کرتی ہے، اس طرح ان گیز کی ترقی کی کارکردگی، غذائی اجزاء کے استعمال، اور آنتوں کی بلغم کی قوت مدافعت کو منفی طور پر متاثر کرتی ہے (لی ایٹ ال۔ 2017؛ Li et al.، 2018a)۔ ڈائیٹری سی ایف بلغمی ڈھانچے اور افعال کو مضبوط بنا کر آنتوں کی رکاوٹ کے کام کو برقرار رکھنے میں مدد کر سکتا ہے، ساتھ ہی معدے میں کامنسل بیکٹیریا کی آبادی اور تنوع کو بڑھا کر۔ زیادہ اہم بات یہ ہے کہ نوجوان پرندے مبینہ طور پر بالغوں کے مقابلے غذائی غذائی اجزاء اور آنتوں کے مائکروبیل کمیونٹیز میں ہونے والی تبدیلیوں کے لیے زیادہ حساس ہوتے ہیں (Gao et al.، 2017)۔ تاہم، گٹ مائکرو بائیوٹا پر غذائی CF کی سطح کے اثرات اور گوسلنگز میں بیماری کے خلاف مزاحمت کے بارے میں مطالعہ بہت کم ہیں۔

پرندوں میں نشوونما کی کارکردگی پروٹین کی سطح میں تبدیلیوں کے لیے کم حساس ہوتی ہے بجائے اس کے کہ فیڈ میں غذائی توانائی میں تبدیلی ان کی اصل متشدد فطرت کو پورا کر سکے (شی ایٹ ال۔، 2006)۔ یہ اطلاع دی گئی ہے کہ 16 سے 22 فیصد تک غذائی پروٹین کی سطح کے ساتھ جیز میں وزن میں کوئی خاص فرق نہیں دیکھا گیا، جو کہ دائرہ کار میں حد سے زیادہ عام معلوم ہوتا ہے (Summers et al.، 1986)۔ اس کے برعکس، غذائی پروٹین کا ارتکاز آنتوں کے نباتاتی توازن اور پولٹری میں بیماریوں کے خلاف مزاحمت پر گہرا اثر ڈالتا ہے (لی ایٹ ال۔، 2020)۔ ویسرل گاؤٹ، جو بنیادی طور پر پرندوں میں پایا جاتا ہے، ایک میٹابولک بیماری ہے جو گردوں کی خرابی کی وجہ سے ہوتی ہے، جس کے بعد مختلف اعضاء میں یوریٹ کرسٹل جمع ہوتے ہیں (Zhang et al.، 2018)۔ ہمارے ایک پچھلے مطالعے نے یہ ظاہر کیا ہے کہ اعلی پروٹین والی غذایں گردے کی چوٹ اور گٹ مائکرو بائیوٹا ڈیسبیوسس میں شامل تھیں جو گاؤٹ ان گاؤٹ سے وابستہ تھیں (Xi et al., 2020a)۔ اس تحقیق کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ 16 اور 18 فیصد خام پروٹین (CP) کھانے والی گوسلنگز کے مقابلے میں، 22 فیصد سی پی ڈائیٹس کھلائے جانے والے گوسلنگز کو آنتوں کے اپکلا سیل کی چوٹ اور سیکل مائیکرو بائیوٹا ڈیس بائیوسس کا سامنا کرنا پڑتا ہے، جس سے گردے کی چوٹ، یا یہاں تک کہ گوسلنگ گاؤٹ کا سامنا کرنا پڑتا ہے۔ معدے کی نالی کا مائکرو بائیوٹا اور اس کے میٹابولائٹس پولٹری میں گٹ کڈنی کے محور کی قوت مدافعت کو مضبوط بنانے میں مرکزی کردار ادا کرتے دکھائی دیتے ہیں (De Cesare et al., 2019; Xi et al., 2020b)۔ اس طرح، ایک مناسب غذائی پروگرام کی نشاندہی کرنا، جو غذائی CF اور CP کی سطحوں کے اثرات پر توجہ مرکوز کرتا ہے، گاؤٹ کے واقعات کو کم کرنے اور آنتوں کے مائیکروکولوجیکل توازن کو برقرار رکھنے اور گوسلنگز میں نسبتاً مدافعتی ضابطے کو بہتر بنا کر قوت مدافعت کو بڑھانے میں مدد کر سکتا ہے۔

آنتوں کا مائکرو بایوم گٹ کے مدافعتی ضابطے پر گہرا اثر ڈالتا ہے، جو نظامی قوت مدافعت کو متاثر کرتا ہے اور مدافعتی توازن میں حصہ ڈالتا ہے۔ خوراک کی ساخت میں تبدیلیاں، بشمول CP اور CF کی سطحیں، مائیکرو بائیوٹا کی ساخت اور میٹابولک سرگرمیوں کو متاثر کرتی ہیں جو آنتوں کے ماحول سے مطابقت رکھتی ہیں (Liu et al.، 2014)۔ پولٹری میں، مائیکرو بایوم کی کوئی بھی رکاوٹ نظامی قوت مدافعت میں عدم توازن پیدا کر سکتی ہے، جس سے بیماری کے خلاف مزاحمت میں کمی واقع ہو سکتی ہے۔ ہمارے پچھلے مطالعے میں، ہم نے پایا کہ گٹ مائیکرو بائیوٹا ڈیسبیوسس نے گٹ کڈنی کے محور میں گٹ سے ماخوذ لیپوپولیساکرائیڈ (LPS) کی نقل مکانی کے ساتھ ساتھ سوزش میں اضافہ کرکے گوسلنگز میں ویسرل گاؤٹ کے خطرے کو بڑھا دیا ہے۔ اس پیچیدہ جھرن میں، LPS ligation جوہری عنصر کو چالو کرتا ہے، ایکٹیویٹڈ B سیل (NF-kB) پاتھ وے کے کپا-لائٹ-چین-بڑھانے والا اور پرو انفلامیٹری سائٹوکائنز کی پیداوار، جیسے کہ انٹرلییوکن 1b (IL1b) اور ٹیومر نیکروسس فیکٹر۔ a (TNFa)، اس طرح goslings کے گٹ اور گردے دونوں میں مدافعتی رواداری کی ترقی کو فروغ دیتا ہے (Xi et al., 2019)۔ موجودہ مطالعہ نے غذائی CP اور CF کی مختلف سطحوں کو کھلایا گوسلنگ کے سیکم میں آباد مائکروبیل کمیونٹیز کی تحقیقات پر توجہ مرکوز کی، اور گٹ-گردے کے محور میں پیدا ہونے والے امیونوریگولیشن اور سوزش کے ردعمل کا تجزیہ کرکے گاؤٹ کی موجودگی میں تبدیلیوں کی پیمائش کی۔

معیاری Cistanche

مواد اور طریقے

1. اخلاقی منظوری

اس مطالعہ کو جیانگ سو اکیڈمی آف ایگریکلچرل سائنسز کی ریسرچ کمیٹی نے منظور کیا تھا اور تجرباتی جانوروں سے متعلق امور کی انتظامیہ کے ضوابط (8 جولائی 2014 کو جیانگ سو اکیڈمی آف ایگریکلچرل سائنس کے آرڈر نمبر 63) کے مطابق کیا گیا تھا۔ تمام تجربات ARRIVE (جانوروں کی تحقیق: رپورٹنگ آف In Vivo Experiments) کے رہنما خطوط کے ذریعہ کئے گئے تھے۔

2. تجرباتی ڈیزائن

یہ مطالعہ 2 سے 17 نومبر، 2020، جیانگسو اکیڈمی آف ایگریکلچرل سائنسز (نانجنگ، چین) کے تجرباتی جانوروں کے مرکز میں کیا گیا۔ کل 1,620 ایک دن پرانے Taizhou geese (Anser domestica، 100 فیصد،)، جو Tianzhiao Breeding Geese Limited Company (Chuzhou, China) کے ذریعے فراہم کیے گئے تھے، تصادفی طور پر تفویض کیے گئے تھے۔ 6 تجرباتی گروپ۔ ہر علاج میں 6 نقلیں تھیں، اور ہر نقل میں 45 پرندے تھے۔ تجربے کے لیے مکمل طور پر بے ترتیب 2£3 فیکٹریل ڈیزائن استعمال کیا گیا تھا۔ 2 سی پی لیولز اور تین سی ایف لیول والی چھ غذایں تیار کی گئیں (ٹیبل 1)۔ 2 CP کی سطحیں 180 (18CP) اور 220 (22CP) g/kg تھیں اور تین CF کی سطحیں 30 (کم CF)، 50 (وسط CF) اور 70 (اعلی) تھیں۔ CF) g/kg تمام گوسلنگز کو تھرموسٹیٹک گھر میں اٹھایا گیا تھا جس میں ایک جیسے سائز کے سٹینلیس سٹیل کے پنجرے تھے (1.20 £ 1.00 £ 0.50 m3، 9 گوسلنگ فی کیج، ذخیرہ کرنے کی کثافت: 7.5 برڈز/m2 )، جنہیں زمین سے 0.50 میٹر اوپر رکھا گیا تھا۔ گوسلنگ کو معیاری انتظامی حالات میں پیلٹ فیڈ اور ایڈ لیبٹم واٹر کے ساتھ کھلایا گیا۔ ہر پنجرے میں ہینگ فیڈرز اور نپل پینے والوں کی تعداد پورے مطالعے میں کافی تھی۔ تجربے کے اختتام تک محیطی درجہ حرارت d 0 سے 3 تک 30 ڈگری، d 4 سے 6 تک 29 ڈگری، d 7 سے 9 تک 28 ڈگری، اور d 10 سے 26 ڈگری پر تجربہ کے اختتام تک برقرار رکھا گیا۔ 21- دن کے تجرباتی دورانیے میں نسبتاً نمی تقریباً 60 فیصد تھی۔ روشنی کے ذرائع (سفید روشنی، 400 −760 nm) کو برڈ ہیڈ کی سطح پر 15 § 0.3 لکس کی روشنی کے برابر کیا گیا تھا، جس میں d 0 سے 3 تک 22 h روشنی، d سے 18 h کی روشنی ہوتی ہے۔ 4 سے 14، اور ایک 24- گھنٹہ سائیکل پر d 15 سے 21 تک روشنی کی 16 گھنٹے۔

The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>تازہ فیڈ کا 1 فیصد) تصادفی طور پر 5 مقامات سے حاصل کیا گیا تجزیہ کے لیے ملایا گیا۔ CP اور CF کی پیمائش GB/T6432 (چینی قومی معیار: فیڈ میں خام پروٹین کا تعین) اور GB/T6434 (چینی قومی معیار: فیڈ میں خام فائبر کا تعین) کے مطابق کی گئی۔

ٹیسٹ کے دوران کھانا کھلانے سے پہلے الیکٹرانک اسکیل (YP60001, Hengji, Shanghai, China) کا استعمال کرتے ہوئے goslings کے ADFI اور BW (لائیو ویٹ) کو ریکارڈ کیا گیا اور تجربے کے اختتام پر ADG اور فیڈ کنورژن ریشو (FCR) کا حساب لگایا گیا۔ اس کے علاوہ، تجرباتی مدت کے بعد مختلف علاج کے درمیان تمام نقل (ہر نقل میں 45 پرندے ہوتے ہیں) کے گاؤٹ کی مجموعی بیماری کا خلاصہ کیا گیا۔ گاؤٹ کے لیے انتخاب کے معیار کی تعریف ایک گوسلنگ کے طور پر کی گئی تھی جس میں گردے کے مجموعی گھاووں اور سیرم یورک ایسڈ (UA) کا ارتکاز یوریٹ سپر سیچوریشن (مرد، 416 mmol/L اور خواتین، 357 mmol/L) سے زیادہ تھا۔ گردوں کے عام غالب مجموعی گھاووں کا رنگ پیلا، دبیز اور سوجن ہوتا ہے، اور گردوں کی نالیوں اور پیشاب کی نالیوں کو زیادہ یوریٹس (Xi et al., 2020a) کے ساتھ پھیلایا جاتا ہے۔

Herba Cistanche

3. سیرم میٹابولائٹ کی پیمائش

بالترتیب 9 اور 18 کو اینٹی کوگولنٹ کے بغیر خون جمع کرنے والی ٹیوبوں کے ذریعے، سر کاٹنے کے بعد، چھتیس گوسلنگ (n=6 goslings/علاج) کو تصادفی طور پر فوری طور پر خون جمع کرنے (5 mL/ gosling) کے لیے منتخب کیا گیا تھا۔ خون کے تمام نمونوں کو جمع کرنے کے بعد 2 گھنٹے کے لیے 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا گیا اور 15 منٹ کے لیے 1,5{{10}}0 £g پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ حاصل کردہ سیرا کو مزید تجزیہ تک 0.6 ملی لیٹر ایپنڈورف ٹیوبوں میں 80 ڈگری پر محفوظ کیا گیا تھا۔ سیرم UA کی سطح کا تعین فاسفوٹونگسٹک ایسڈ رنگین میٹری کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ کریٹینائن (Cr) اور یوریا نائٹروجن (UN) کے ارتکاز کے ساتھ ساتھ xanthine oxidase (XOD) سرگرمی کا تعین مائکروپلیٹ سپیکٹرو فوٹومیٹر (پرومیگا کارپوریشن، میڈیسن، WI) کا استعمال کرتے ہوئے انزیمیٹک کلورمیٹری کے ذریعے کیا گیا تھا۔ یہ کٹس جیانچینگ بائیو انجینئرنگ انسٹی ٹیوٹ (نانجنگ، چین) کی طرف سے فراہم کی گئی تھیں؛ کوڈز C012 (UA)، C011-2 (Cr)، C013-2 (UN)، اور A002 (XOD) تھے۔ تجرباتی گیز میں سیرم IgM، IgA، اور IgG ارتکاز کو شنگھائی J&I بائیوٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ (شنگھائی، چین) سے خریدی گئی گوز امیونوگلوبلین ELISA کٹس کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ سیرم گردش کرنے والے امیون کمپلیکسز (CIC)، IL-1b، اور TNF-a کے ارتکاز کا تعین کمرشل گوز ELISA کٹ (جیانچینگ بائیو انجینئرنگ انسٹی ٹیوٹ، نانجنگ، چین) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ ڈائمین آکسیڈیس (DAO) کی سرگرمی کو ایک خودکار بائیو کیمیکل تجزیہ کار (ہٹاچی، ٹوکیو، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے انزیمیٹک کلورمیٹری کے ذریعے ماپا گیا۔ سیرم ایل پی ایس کی پیمائش روایتی لیمولس پرکھ (لیمولس آسے بائیوٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ، زیامین، چین) کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ لیمولس پرکھ میں ایل پی ایس کی کھوج کی حدیں 0.015 سے 0.6 EU/mL تک تھیں۔ خون جمع کرنے اور اینڈوٹوکسین کی پیمائش کے لیے استعمال ہونے والے تمام مواد پائروجن سے پاک تھے۔ تمام اسسیس کارخانہ دار کی ہدایات کے مطابق انجام دی گئیں۔ سیرم کے نمونوں کی جانچ سہ رخی میں کی گئی۔ Assays کے لئے مختلف حالتوں کے انٹرا اور انٹراسسے گتانک تھے۔<10% and <15%, respectively.

4. ہسٹمورفولوجیکل مشاہدہ

36 goslings (n=6 goslings/treatment) کی سیکا (لمبائی {{0}} سینٹی میٹر) کو ہسٹولوجیکل تجزیہ کے لیے 9 اور 18 کو خون کے نمونے جمع کرنے کے بعد جمع کیا گیا تھا۔ گوسلنگ سے جمع کیے گئے نمونے 4 فیصد پیرافارمیلڈہائڈ میں طے کیے گئے، پیرافین میں سرایت کیے گئے، اور سیکشن کیے گئے (ٹکڑے کی موٹائی: 3 ملی میٹر؛ 4 سلائس فی گوسلنگ)۔ سیکم میں پیتھولوجیکل تبدیلیاں (پائیلورک اسفنکٹر سے تقریبا 7 سینٹی میٹر دور) کو ہلکی مائکروسکوپ (اولمپس، ٹوکیو، جاپان) کے تحت ہیماتوکسیلین اور ای اوسین (ایچ ای) کے داغ کے بعد جانچا گیا۔ امیج جے سافٹ ویئر (ورژن 1.8.0؛ نیشنل انسٹی ٹیوٹ آف ہیلتھ، بیتیسڈا، ایم ڈی) کا استعمال کرتے ہوئے سیکم کی وِلس کی اونچائی اور کریپٹ گہرائی کی پیمائش کی گئی۔ فی سلائس مختلف برقرار ولی کی آٹھ پیمائشیں ریکارڈ کی گئیں (3 لگاتار وژن فیلڈز میں 8 پیمائش)۔ ہسٹولوجیکل پیمائش کے شماریاتی تجزیے اوسطاً 32 پیمائش فی گوسلنگ (4 سلائس فی گوسلنگ اور 8 پیمائش فی سلائس) کی بنیاد پر کیے گئے۔ گوبلٹ سیل کی کثافت کا شمار گوبلٹ سیل کی گنتی کو متعلقہ ویلس کی لمبائی سے تقسیم کرنے کے طور پر کیا گیا تھا، جس کا اوسط لیا گیا تھا اور اسے گوبلٹ سیل نمبر فی 100 ملی میٹر ویلس کی لمبائی کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔

Cistanche tubulosa

5. 16S rRNA سیکم مواد کی ترتیب

goslings کے سیکم مواد (6 goslings / علاج £ 6 گروپ £ £ سیمپلنگ دو بار=72 goslings) d 9 اور d 18 کو 2 mL جراثیم سے پاک، اندرونی طور پر تھریڈڈ کرائیوجینک شیشیوں میں جمع کیے گئے تھے اور فوری طور پر مائع نائٹروجن میں 16S rD anasis کے لیے محفوظ کیے گئے تھے۔ . سیکم مواد کے نمونوں سے ڈی این اے کو کارخانہ دار کی ہدایات پر عمل کرتے ہوئے مائیکرو ایلوٹ جینومک ڈی این اے کٹ (D3096-01, Omega Biotek Inc., Norcross, GA) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا۔ غیر استعمال شدہ جھاڑیوں پر مشتمل نمونے کے خالی جگہوں پر ڈی این اے نکالنے کے ذریعے کارروائی کی گئی، اور ان کی جانچ پڑتال کی گئی کہ وہ 16S ایمپلیکن پیدا نہ کریں۔ مینوفیکچرر (QIAGEN، Dusseldorf، Germany) کے ذریعہ بیان کردہ ایک ترمیم شدہ طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے کل DNA کو 50 mL elution بفر میں نکالا گیا اور 80 ڈگری پر محفوظ کیا گیا۔

نمونوں کے کل DNA کو بطور ٹیمپلیٹ اور 16S rDNA پرائمر (343F - 50 - TACGGRAGGCAGCAG -30؛ 798R - 50 - AGGGTATCTAATCCT-30) کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے بیکٹیریل کے V3−V4 خطے کو بڑھا دیا۔ 16 ایس آر آر این اے۔ تمام رد عمل 25 ملی لیٹر (کل حجم) مکسچر میں کیے گئے تھے جس میں 25 این جی جینومک ڈی این اے ایکسٹریکٹ، 12.5 ملی لیٹر پی سی آر پریمکس، ہر پرائمر کا 2.5 ملی لیٹر، اور حجم کو ایڈجسٹ کرنے کے لیے پی سی آر گریڈ پانی شامل تھا۔ AxyPrep Mag PCR Normalizer (AxyPrep Mag PCR Normalizer) کا استعمال کرتے ہوئے PCR پروڈکٹس کو معمول بنایا گیا، جس نے ترتیب دینے کے لیے جمع PCR والیوم سے قطع نظر، مقدار کا تعین کرنے کے مرحلے کو چھوڑ دیا گیا۔ AMPure XT موتیوں (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA; OebioTech Co., Ltd, Shanghai, China کے ذریعہ انجام دیا گیا) کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دینے کے لیے امپلکن پول تیار کیے گئے تھے۔ امپلکن لائبریری کے سائز اور مقدار کا اندازہ بالترتیب LabChip GX (Perkin Elmer, Waltham, MA) اور ایک Kapa Library Quantification Kit for Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ PhiX کنٹرول لائبریری (v3) (Illumina) کو amplicon لائبریری (30 فیصد متوقع) کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ لائبریری کو تقریباً 570 K/mm2 کی کثافت پر کلسٹر کیا گیا تھا۔ لائبریریوں کو 300PE MiSeq رنز پر ترتیب دیا گیا تھا، جہاں ایک لائبریری کو معیاری Illumina سیکوینسنگ پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے دونوں پروٹوکول کے ساتھ ترتیب دیا گیا تھا، اس طرح تیسرے (یا چوتھے) انڈیکس پڑھنے کی ضرورت کو ختم کیا گیا تھا۔ ریڈز کو مائکروبیل ایکولوجی (QIIME؛) کوالٹی فلٹرز میں مقداری بصیرت کا استعمال کرتے ہوئے فلٹر کیا گیا تھا۔ CDHIT پائپ لائن کا استعمال OTU ٹیبل تیار کرکے آپریشنل ٹیکونومک یونٹس (OTUs) کو منتخب کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔ 97 فیصد مماثلت کے ساتھ ترتیب OTUs کو تفویض کیے گئے تھے۔ ہر او ٹی یو کے لیے نمائندہ ترتیبوں کا انتخاب کیا گیا تھا، اور اس کے بعد ریبوسومل ڈیٹا بیس پروجیکٹ (RDP) درجہ بندی کا استعمال کرتے ہوئے ہر نمائندہ ترتیب کو ٹیکسونومک ڈیٹا تفویض کیا گیا تھا۔ ان OTU نیوکلیوٹائڈ تسلسل کا GenBank الحاق نمبر SAMN21014082 ہے۔ الفا تنوع کا اندازہ لگانے کے لیے، OTU جدول کو نایاب کیا گیا، اور درج ذیل 4 میٹرکس کا حساب لگایا گیا: امیری کا اندازہ لگانے کے لیے Chao1 میٹرک؛ نمونے میں پائے جانے والے منفرد OTUs کی گنتی کے طور پر مشاہدہ شدہ پرجاتیوں کا میٹرک؛ شینن انڈیکس؛ اور سمپسن انڈیکس۔

6. ریئل ٹائم پی سی آر

ings (n {{0}} goslings/treatment) 9 اور 18 کو ریئل ٹائم PCR (RT-PCR) تجزیہ کے لیے جمع کیے گئے تھے۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، ٹوٹل آر این اے ٹشوز سے نکالا گیا تھا، TRIzol reagent (Life Technologies, Grand Island, NY) کا استعمال کرتے ہوئے، اور ریورس ٹرانسکرپشن لیولز کٹ (TaKaRa، Dalian، China) کا استعمال کرتے ہوئے ریورس ٹرانسکرپٹ کیا گیا تھا۔ b-actin کو ایک غیر متزلزل کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ پرائمر کو پرائمر پریمیئر 5.0 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے ڈیزائن کیا گیا تھا اور ان کے سلسلے درج ہیں (ٹیبل 2)۔ RT-PCR SYBR Premix Ex Taq (Roche، Basel، Switzerland) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ تمام RT-PCRs کو سہ رخی میں انجام دیا گیا تھا۔ ہدف جینوں کے متعلقہ اظہار کی سطح کا تعین 2 DDCt طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔

7. ڈیٹا کا تجزیہ

IBM SPSS شماریات 16 پروگرام (IBM Corporation, Somers, NY) کا استعمال کرتے ہوئے فی علاج 6 نقلوں سے اخذ کردہ تجرباتی ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا۔ ہر نقل کو ایک تجرباتی اکائی کے طور پر سمجھا جاتا تھا اور استعمال شدہ شماریاتی طریقہ کار عام لکیری ماڈل طریقہ کار (GLM) کا استعمال کرتے ہوئے تغیر کا ایک کثیر الجہتی تجزیہ تھا۔ جب اہم اختلافات کا تعین کیا گیا تو، علاج کے ذرائع کو الگ کر دیا گیا اور ڈنکن کے متعدد رینج ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے موازنہ کیا گیا. دو دم والا ٹیسٹ 5 فیصد سے کم امکانی سطح پر شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھا جاتا تھا (P < 0.05)۔

Yumeng Xi *، Yuanpi Huang، y Yue Li*، Yunmao Huang #، Junshu Yan *، اور Zhendan Shi*.

* زراعت اور دیہی امور کی وزارت کی فصل اور جانوروں کی مربوط کاشتکاری کے لیے کلیدی لیبارٹری، حیوانات کے انسٹی ٹیوٹ، جیانگ سو اکیڈمی آف ایگریکلچرل سائنسز، نانجنگ 210014، چین؛

# کالج آف اینیمل سائنس، ژونگکائی یونیورسٹی آف ایگریکلچر اینڈ انجینئرنگ، گوانگزو 510000، چین۔