حصہ دو DsbA-L Mitochondionmediated Tubular Cell Apoptosis میں VDAC1 کے ساتھ تعامل کرتا ہے اور گردے کی شدید بیماری کے بڑھنے میں تعاون کرتا ہے۔

نتائج

1. اسکیمک چوٹ نے BUMPT خلیوں اور چوہوں اور مریضوں کے گردوں میں DsbA-L کے اظہار کی حوصلہ افزائی کی۔

اس بات کی جانچ کرنے کے لیے کہ آیا اسکیمک چوٹ نے DsbA-L کے اظہار کی حوصلہ افزائی کی، ہم نے ATP کے BUMPT خلیات کو 2 گھنٹے کے لیے ختم کر دیا، اور پھر انہیں 4 گھنٹے کی کل مدت تک صحت یاب ہونے کی اجازت دی۔ RT-qPCR اور امیونوبلوٹنگ کے نتائج نے اشارہ کیا کہ DsbA-L کا اظہار I/R 2-0 پر ہوا، I/R 2-2 پر ایک چوٹی پر پہنچ گیا، اور پھر آہستہ آہستہ I/R پر دیکھی جانے والی سطحوں تک کم ہو گیا۔ 2-0 (شکل 1a، e اور i)۔ DsbA-L کے امیونو فلوروسینس سٹیننگ نے ان نتائج کی مزید تصدیق کی اور اشارہ کیا کہ DsbA-L بنیادی طور پر BUMPT خلیوں کے سائٹوپلازم میں ظاہر ہوتا ہے (شکل 1 m اور n)۔ ہم نے اسکیمیا (28 منٹ) اور ریپرفیوژن انجری (24 h اور 48 h) کے ساتھ علاج کیے جانے والے C57BL/6 چوہوں میں DsbA-L کے اظہار کا مزید پتہ لگایا۔ RT-PCR اور امیونو بلوٹنگ کے نتائج نے اشارہ کیا کہ DsbA-L کا اظہار چوہوں کے گردے کے پرانتستا اور بیرونی میڈولا دونوں میں ریفرفیوژن کے 24 گھنٹے بعد ہوا تھا اور ریفرفیوژن کے بعد 48 گھنٹے کی چوٹی پر پہنچ گیا تھا (شکل 1 b, c, f, g) ، j، اور k)۔ ان نتائج کی مزید تصدیق DsbAL (شکل 1 o اور p) کے امیونو ہسٹو کیمیکل داغ سے ہوئی۔ آخر میں، ہم نے تفتیش کی کہ آیا اسکیمیا کی وجہ سے AKI والے مریضوں میں DsbA-L کے اظہار کی سطح کی حوصلہ افزائی کی گئی تھی۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ DsbA-L mRNA اور پروٹین کی سطحوں میں نمایاں طور پر اضافہ ہوا ہے AKI کے مریضوں میں جب اسکیمیا کی وجہ سے MCD مریضوں (شکل 1. d, h, اور l) کے مقابلے میں۔ ان نتائج کی مزید توثیق DsbA-L کے امیونو فلوروسینس سٹیننگ (شکل 1. q اور r) سے ہوئی۔

شکل 1. DsbA-L کو BUMPT خلیات اور چوہوں اور مریضوں کے گردوں میں I/R کی طرف سے حوصلہ افزائی کی گئی تھی۔ BUMPT خلیات میں I/R ماڈل کو 10 mM antimycin A اور 1.5 mM کیلشیم ionophore 2 گھنٹے کے لیے تیار کیا گیا اور 0، 2، اور 4 گھنٹے کے لیے بازیافت ہوا۔ I/R چوہوں کا ماڈل دو طرفہ رینل اسکیمیا کے ذریعہ 28 منٹ اور 24 اور 48 گھنٹے کے لئے ریفرفیوژن کے ذریعہ تیار کیا گیا تھا۔ رینل بایپسی کے نمونے I/R-حوصلہ افزائی AKI مریضوں اور Minimal Change Disease (MCD) کے مریضوں سے جمع کیے گئے تھے۔ (ad) BUMPT خلیوں میں DsbA-L اظہار کی RT-qPCR کا پتہ لگانا، چوہوں کے گردے کے کارٹیکل ٹشو اور میڈولا اور گردے کے مریضوں سے باہر یا I/R حالت کے بغیر۔ (e-h) BUMPT خلیوں میں I/R ماڈل کے تحت BUMPT خلیوں میں DsbA-L اور b-tubulin کا ​​امیونو بلوٹ تجزیہ، کارٹیکل ٹشو، میڈولا اور گردے کے مریضوں سے باہر۔ (i- l) DsbA-L اور b-tubulin پروٹین اظہار کا کثافت کا تجزیہ۔ (m, o, اور q) بالترتیب BUMPT خلیوں اور چوہوں کے گردوں اور I/R حالت والے یا اس کے بغیر مریضوں میں DsbA-L کا امیونو فلوروسینس اور امیونو ہسٹو کیمیکل داغ۔ (n، p، اور r) DsbA-L داغدار ہونے کا مقداری تجزیہ۔ اصل میگنیفیکیشن x 400۔ اسکار بار: 10µM in m100µM o اور q میں۔ ہر تجربہ (e-h، m، o، اور q) کو اسی طرح کے نتائج کے ساتھ آزادانہ طور پر 6 بار دہرایا گیا۔ دو دم والے اسٹوڈنٹ ٹی ٹیسٹ دو گروپ موازنہ کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ (a-d, i-l, n, p, اور r) # صفحہ<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.

Cistanche کے فوائد جاننے کے لیے یہاں کلک کریں۔

PT-DsbA-LKO چوہوں میں IR-حوصلہ افزائی گردوں کی چوٹ، نلی نما سیل اپوپٹوسس، اور مائٹوکونڈریل نقصان کو کم کیا گیا تھا۔

PT-DsbA-L-WT اور PT-DsbA-L-KO چوہوں کے لیٹر میٹس کا علاج اسکیمیا (28 منٹ) اور ریپرفیوژن انجری (24 h اور 48 h) کے ساتھ یا اس کے بغیر کیا گیا تھا۔ اس علاج کے بعد، ہم نے مزید معائنے کے لیے خون کے نمونے اور گردے کے ٹشوز کے نمونے حاصل کیے۔ فعال طور پر، PT-DsbA-L-WT چوہوں میں خون میں یوریا نائٹروجن (BUN) اور کریٹینائن کی بڑھتی ہوئی سطحوں کی وجہ سے I/R-حوصلہ افزائی گردوں کے فنکشن کی خرابی کی خصوصیت تھی۔ اس اثر کو PT-DsbA-L-KO چوہوں (شکل 2a اور b) میں نمایاں طور پر کم کیا گیا تھا۔ ہسٹولوجی اور ٹونیل کے تجزیوں نے یہ بھی تصدیق کی کہ PT-DsbA-L-WT چوہوں میں I/R کی حوصلہ افزائی قابل ذکر ٹشو نقصان اور اپوپٹوس، حالانکہ یہ PT-DsbA-L-KO چوہوں (شکل 2c,d,f, اور جی)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ الیکٹران مائکروسکوپی (EM) کے تجزیوں نے اشارہ کیا کہ PT-DsbA-L-KO چوہوں نے I/R-حوصلہ افزائی مائٹوکونڈریل نقصان (شکل 2 e اور h) کی نمایاں توجہ ظاہر کی۔ امیونوبلوٹنگ نے مزید تصدیق کی کہ PT-DsbA-LKO چوہوں نے بھی کلیویڈ کیسپیس کی نچلی سطح کا اظہار کیا-3، مائٹوکونڈریا میں بیکس کے کم جمع ہونے کی شرح، اور سائٹوکوم سی (Cyt-c) کی کم سطح کو سائٹوسول (شکل 2) میں خارج کیا۔ I-o)۔ RT-qPCR تجزیہ کے نتائج نے ظاہر کیا کہ PT-DsbA-L-KO نے NRF1 اور PCG-1کی کمی کو I/R(شکل 2 p اور q) کی وجہ سے تبدیل کر دیا، جس کی مزید تصدیق امیونوبلوٹنگ تجزیہ ( شکل 2 r-t)۔ ان اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ DsbA-L نے I/R-حوصلہ افزائی AKI میں ایک اہم کردار ادا کیا۔

شکل 2. IR کی حوصلہ افزائی گردوں کی چوٹ، ٹیوبلر سیل اپوپٹوسس، مائٹوکونڈرین نقصان، اور PT-DsbA-L-KO چوہوں میں Bax، Cytc، اور کلیویڈ کیسپیس3 کا اظہار۔ PT-DsbA-L-KO اور PT-DsbA-L-WT لیٹر میٹ چوہوں کی دو طرفہ گردوں کی شریانوں کو 28 منٹ کے لیے بند کیا گیا اور پھر IR ماڈل قائم کرنے کے لیے 48 گھنٹے کے لیے چھوڑ دیا گیا۔ (a) BUN (b) سیرم کریٹینائن (c) Hematoxylin اور eosin سٹیننگ۔ (d) TUNEL- مثبت خلیوں کے نمائندہ حصے۔ (e) مائٹوکونڈریون مورفولوجی کا الیکٹران مائکروسکوپ کا پتہ لگانا۔ (f) نلی نما نقصان کا سکور۔ (g) TUNEL- مثبت خلیوں کی تعداد۔ (h) مائٹوکونڈریا کی چوٹ کا اسکور۔ (i) کلیویڈ کیسپیس 3 اور DsbA-L کے اظہار کا امیونو بلوٹ تجزیہ، اور مائٹوکونڈریل اور سائٹوسولک فریکشن میں BAX اور Cyt-c کا اظہار۔ b-tubulin اور GAPDH کو بالترتیب پورے lysate یا cytosolic لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ COX IV کو مائٹوکونڈریا لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ (j-o) ان کے درمیان گرے اسکیل امیج کا تجزیہ۔ (p اور q) RT-qPCR NRF1 اور PCG کے اظہار کا پتہ لگانا-1a۔ (r) NRF1 اور PCG کے اظہار کا امیونو بلوٹ تجزیہ-1a۔ (s اور t) ان کے درمیان گرے اسکیل امیج کا تجزیہ۔ اصل میگنیفیکیشن x 400 یا x6000۔ اسکار بار: 100µM in c&d 20µM e میں۔ اسی طرح کے نتائج کے ساتھ ہر تجربہ (ce، I، اور r) کو آزادانہ طور پر 6 بار دہرایا گیا۔ ایک طرفہ انووا ایک سے زیادہ گروپ موازنہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ (a, b,f-h, jo, pq&s-t) # صفحہ<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-DsbA-L-WT with IR group.

Cistanche tubulosa

3. BUMPT خلیوں میں DsbA-L ثالثی I/R حوصلہ افزائی اپوپٹوس

مزید تفتیش کرنے کے لیے کہ آیا DsbA-L I/R کے ذریعے BUMPT خلیوں میں apoptosis میں ثالثی کرتا ہے، ہم نے BUMPT خلیوں کو DsbA-L siRNA سے منتقل کیا اور پھر ان خلیوں کو ATP سے 2 گھنٹے کے لیے ختم کر دیا۔ اس کے بعد خلیوں کو 2 گھنٹے کے لیے ٹھیک ہونے دیا گیا۔ FCM کے تجزیوں سے پتہ چلا ہے کہ DsbA-L siRNA نے BUMPT خلیات (شکل 3a) میں I/R-حوصلہ افزائی اپوپٹوس کو نمایاں طور پر کم کیا۔ امیونوبلوٹنگ کے تجزیوں نے مزید اس بات کی تصدیق کی کہ DsbA-L siRNA نے کلیویڈ کیسپیس-3 اظہار میں I/R-حوصلہ افزائی اضافہ، مائٹوکونڈریا میں بیکس کے بڑھتے ہوئے جمع کو، اور سائٹوسول میں Cyt-c کی بڑھتی ہوئی ریلیز کو خاص طور پر دبایا (شکل 3 b- h)۔ RT-qPCR تجزیہ کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ I/R نے NRF1 اور PCG-1a کے اظہار کو دبا دیا، جسے DsbA-L siRNA (شکل 3 i اور j) نے الٹ دیا۔ امیونوبلوٹنگ کے نتائج RT-qPCR (شکل 3 کلومیٹر) کے نتائج کے مطابق تھے۔ اس کے برعکس، DsbA-L پلاسمڈ نے BUMPT خلیوں میں I/R-حوصلہ افزائی اپوپٹوس کو بڑھایا، کلیویڈ کیسپیس کے اظہار کو بڑھایا-3، بیکس کے جمع ہونے میں اضافہ کیا، اور سائٹوسول میں Cyt-c کی رہائی کو بڑھایا (شکل 3 o-u)۔ RT-qPCR تجزیہ کے نتائج نے اشارہ کیا کہ I/R نے NRF1 اور PCG-1a کے اظہار کو دبایا، جسے DsbA-L پلازمیڈ (شکل 3 v اور w) نے بڑھایا تھا۔ امیونوبلوٹنگ کے نتائج نے RT-qPCR (شکل 3 x-z) کے نتائج کی مزید تصدیق کی۔ ان اعداد و شمار نے مزید اس بات کی تصدیق کی کہ DsbA-L نے اسکیمک چوٹ کے دوران اپوپٹوسس کے ساتھ ساتھ مائٹوکونڈریل ڈیسفکشن کے عمل میں ثالثی کی۔

شکل 3. DsbA-L نے BUMPT خلیوں میں کلیویڈ caspase3، BAX، اور Cyt-c کے IR-حوصلہ افزائی اظہار کی ثالثی کی۔ DsbA-L کے پلازمیڈ اور siRNA کو BUMPT خلیوں میں منتقل کیا گیا اور پھر 2 گھنٹے کے لیے ATP کی کمی اور 2 گھنٹے کے لیے بحالی کا سامنا کرنا پڑا۔ (a&n) BUMPT خلیات اپوپٹوسس کا فلو سائٹومیٹری تجزیہ۔ (b&o) امیونو بلوٹس نے کلیویڈ کیسپیس 3 اور DsbA-L کے اظہار اور مائٹوکونڈریل اور سائٹوسولک فریکشن میں BAX اور Cyt-c کے اظہار کا تجزیہ کیا۔ b-tubulin اور GAPDH کو بالترتیب پورے lysate یا cytosolic لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ COX IV کو مائٹوکونڈریا لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ (c-h، اور q-u) ان کے درمیان گرے اسکیل امیج کا تجزیہ۔ (i,j اور v, w) RT-qPCR NRF1 اور PCG-1a کے اظہار کا پتہ لگاتا ہے۔ (k اور x) NRF1 اور PCG کے اظہار کا امیونو بلوٹ تجزیہ-1a۔ (l، m اور y،z) ان کے درمیان گرے اسکیل امیج کا تجزیہ۔ ہر تجربہ (a، b، k، n، o، اور x) اسی طرح کے نتائج کے ساتھ آزادانہ طور پر 6 بار دہرایا گیا۔ ایک طرفہ انووا ایک سے زیادہ گروپ موازنہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ (c-j,c-m, p-w&y, z) # صفحہ<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

Cistanche ضمیمہ

4. DsbA-L نے BUMPT خلیوں میں VDAC1 کے ساتھ بات چیت کی جو ATP کی کمی کے ساتھ ساتھ چوہوں کے گردوں اور AKI کے مریضوں میں بھی تھے۔

پچھلے نتائج نے تجویز کیا کہ وولٹیج پر منحصر اینون چینل-1 (VDAC1)، بیرونی مائٹوکونڈریل جھلی کا ایک اہم پروٹین، سیل اپوپٹوسس میں شامل ہے لہذا، ہم نے قیاس کیا کہ DsbA-L نے AKI کی ترقی کو منظم کرنے کے لیے VDAC1 کے ساتھ بات چیت کی۔ امیونوپریسیپیٹیشن (آئی پی) کے نتائج نے یہ ظاہر کیا کہ اینٹی وی ڈی اے سی 1 اینٹی باڈی نے وی ڈی اے سی 1 اور ڈی ایس بی اے ایل دونوں پروٹینوں کو نیچے کھینچا ہے، جبکہ اینٹی ڈی ایس بی اے ایل نے ڈی ایس بی اے ایل اور وی ڈی اے سی 1 دونوں کو مکمل کنٹرول اور BUMPT خلیات کے I/R گروپس میں روک دیا ہے۔ چوہوں کے گردے اور مریضوں کے گردے (شکل 4a)۔ مزید برآں، BUMPT خلیوں کے mitochondrial lysates چوہوں کے گردے، اور مریضوں کے گردے بھی DsbA-L اور VDAC1 کے شریک IP کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ نتائج پورے لیسیٹ کے ساتھ مطابقت رکھتے تھے (شکل 4b)۔ DsbA-L کی ساخت میں نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ ڈومین/ATPase ڈومین (امائنو ایسڈ 1-51)، ایک امینو ٹرمینل ڈومین (NTD)، ڈائمرائزیشن کے لیے ایک ہیلیکل ریجن (امائنو ایسڈ 56-178)، اور ایک کاربوکسائل ٹرمینل ڈومین (CTD؛ امینو ایسڈ 185-216) (شکل 4c)۔ VDAC1 کی ساخت کی بنیاد پر، سافٹ ویئر کی پیشن گوئی نے اشارہ کیا کہ VDAC1 کا N-ٹرمینل ڈومین (امائنو ایسڈ 1 سے 25) DsbA-L (شکل 4d) کے ساتھ تعامل کر سکتا ہے۔ یہ واضح کرنے کے لیے کہ VDAC1 کے کون سے ڈومینز DsbA-L کے ساتھ تعامل کر سکتے ہیں، ہم نے HA-VDAC1 کے لیے تین پلازمیڈ بنائے جن میں امینو ایسڈ 1- 75، امینو ایسڈز 76-1098، اور مکمل جین (تصویر 4e) شامل ہیں۔ اینٹی HA اینٹی باڈی نے DsbA-L کو گروپوں میں تیار کیا جس میں VDAC1 کو امینو ایسڈ 1-75 اور مکمل جین کے ساتھ شامل کیا گیا تھا، لیکن VDAC1 اور پلاسمڈ کے ساتھ نہیں جس میں امینو ایسڈ 76-1098 شامل تھے۔ اس نے اشارہ کیا کہ DsbA-L نے VDAC1 کے علاقے کے ساتھ بات چیت کی جس میں امینو ایسڈ 1-75 (شکل 4f) کی خصوصیات ہیں۔ مزید تفتیش کرنے کے لیے کہ VDAC1 کے کن مخصوص علاقوں نے DsbA-L کے ساتھ تعامل کیا، ہم نے BUMPT خلیوں کو VDAC1 پلازمیڈ کے HA-Tag کے ساتھ D9-13, 22-27, D39-45, {{59} کے ساتھ منتقل کیا۔ }}، D9-13، 22-27، 39-45، 55-57۔ آئی پی کے نتائج نے یہ ظاہر کیا کہ اینٹی HA اینٹی باڈی نے D39-45 اور 55-57 پلاسمیڈ کے ساتھ صرف DsbA-L کو تیز کیا، نہ کہ D9-13 اور 22-27 پلاسمیڈ (تصویر 4 جی دیکھیں) )۔ اس نے مزید یہ ظاہر کیا کہ DsbA-L نے VDAC1 کے 9-13 اور 22-27 امینو ایسڈز کے ساتھ تعامل کیا۔ شکل 4g میں ایک ماڈل شامل ہے جس میں دکھایا گیا ہے کہ کس طرح DsbA-L VDAC1 (Figure 4g) کے امینو ایسڈ 9-13 اور 22-27 کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔ اجتماعی طور پر، یہ اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ DsbA-L VDAC1 کے امینو ایسڈ 9-13 اور 22-27 کے ساتھ تعامل کرتا ہے۔

شکل 4. BUMPT خلیوں میں DsbA-L اور VDAC1 کے درمیان تعامل اے ٹی پی کی کمی کے ساتھ یا اس کے بغیر اور گردوں کے I/R چوہوں اور مریضوں کے گردوں کے درمیان۔ (a&b n=3 فی گروپ) پوری یا mitochondrial lysate کو BUMPT خلیات میں DsbA-L اور VDAC1 کے باہمی coimmunoprecipitation کے لیے نکالا گیا تھا جس کا علاج ATP کی کمی اور بحالی اور I/R-حوصلہ افزائی AKI چوہوں اور مریضوں کے گردوں کے ساتھ کیا گیا تھا۔ (cn=3 فی گروپ) DsbA-L کے فنکشنل ڈومینز اور ڈھانچہ۔ (dn=3 فی گروپ) DsbA-L اور VDAC1 تعامل کا پیشین گوئی ماڈل۔ (e-gn=3 فی گروپ) HA کے لیے اینٹی HA امیونوپریسیپیٹیٹس کا تجزیہ کیا گیا اور پھر امیونوبلوٹنگ کا استعمال کرتے ہوئے DsbA-L کا پتہ چلا۔

Herba Cistanche

5. مائٹوکونڈریا میں DsbA-L یا VDAC1 کی شریک لوکلائزیشن، اور DsbA-L اور VDAC1 کی مشترکہ لوکلائزیشن (i) BUMPT خلیات ATP کے ختم ہو گئے اور (ii) چوہوں اور مریضوں کے گردے

اپنے آئی پی کے نتائج کی تصدیق کے لیے، ہم نے ایک مشترکہ لوکلائزیشن پرکھ کی۔ امیونو فلوروسینس کنفوکل مائیکروسکوپی نے یہ ظاہر کیا کہ DsbA-L یا VDAC1 BUMPT خلیوں کے مائٹوکونڈریا اور شامی چوہوں اور MCD دونوں مریضوں کے گردوں میں مقامی ہے اور یہ اثر BUMPT خلیوں میں اور بڑھا ہوا ہے جو ATP سے محروم ہو چکے تھے، اور چوہوں کے گردوں میں۔ اور اے کے آئی کے مریض (شکل 5 اے، بی، ڈی، ای، جی اور ایچ)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ امیونو فلوروسینس کنفوکل مائیکروسکوپی نے تصدیق کی کہ BUMPT خلیوں میں DsbA-L اور VDAC1 کے شریک لوکلائزیشن سگنل، اور شمع چوہوں اور MCD مریضوں کے گردے نسبتاً کمزور تھے۔ تاہم، BUMPT خلیوں میں جو ATP ختم ہو چکے تھے، اور چوہوں اور AKI والے مریضوں کے گردوں میں شریک لوکلائزیشن سگنل میں نمایاں اضافہ ہوا تھا (شکل 5 c،f، اور i)۔ اجتماعی طور پر، یہ اعداد و شمار مائٹوکونڈریا میں DsbA-L اور VDAC1 کے تعامل کی حمایت کے لیے مزید ثبوت فراہم کرتے ہیں۔

شکل 5. BUMPT خلیات اور AKI چوہوں اور مریضوں کے گردوں کے مائٹوکونڈریا میں DsbA-L اور VDAC1 کا اجتماعی عمل۔ (a, d&g n=4 فی گروپ) BUMPT خلیوں میں مائٹوکونڈریا میں DsbA-L کی لوکلائزیشن ATP کی کمی اور بحالی کے ساتھ یا اس کے بغیر، چوہوں کے گردے شمع اور I/R گروپس کے ساتھ ساتھ MCD اور I/R مریض۔ (b، e&h n=4 فی گروپ) BUMPT خلیات میں مائٹوکونڈریا میں VDAC1 کی لوکلائزیشن اے ٹی پی کی کمی اور بحالی کے ساتھ یا اس کے بغیر، چوہوں کے ماڈل کے گردے شام اور I/R گروپوں کے ساتھ ساتھ MCD اور I/ آر (c، f&i n=4 فی گروپ) BUMPT خلیات میں مائٹوکونڈریا میں DsbA-L اور VDAC1 کی مشترکہ لوکلائزیشن ATP کی کمی اور بحالی کے ساتھ یا اس کے بغیر، شام اور I/R گروپس میں چوہوں کے ماڈل کے گردے نیز MCD اور I/R مریض۔

6. VDAC1-ثالثی BUMPT خلیات اسکیمیا ریپرفیوژن کی وجہ سے اپوپٹوس

اگلا، ہم نے یہ تعین کرنے کی کوشش کی کہ آیا VDAC1 BUMPT خلیوں میں I/R-حوصلہ افزائی apoptosis کے عمل میں شامل تھا۔ امیونوبلوٹنگ کے نتائج نے اشارہ کیا کہ VDAC1 اظہار I/R 2-0 پر ہوا تھا، اور I/R 2-2 پر ایک چوٹی پر پہنچ گیا تھا، اس سے پہلے کہ آہستہ آہستہ I/R 2-0 پر دیکھی جانے والی سطحوں تک کم ہو جائے ( شکل 6 a اور b)۔ FCM تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ BUMPT خلیوں میں I/R کی حوصلہ افزائی apoptosis؛ اس اثر کو VDAC1 siRNA (شکل 6c) کے استعمال سے کم کیا گیا تھا۔ امیونوبلوٹنگ کے نتائج نے مزید تصدیق کی کہ VDAC1 siRNA نے کلیویڈ کیسپیس کے اظہار میں I/R کی حوصلہ افزائی میں اضافے، مائٹوکونڈریا میں بیکس کے بڑھتے ہوئے جمع، اور سائٹوسول میں Cyt-c کی بڑھتی ہوئی ریلیز کو واضح طور پر بہتر بنایا (شکل 6d- k)۔ اس کے برعکس، مندرجہ بالا تبدیلیوں کو VDAC1 پلازمیڈ (شکل 6 l-s) کے اوور ایکسپریشن سے بڑھایا گیا تھا۔ ایک ساتھ، اس ڈیٹا نے یہ ظاہر کیا کہ VDAC1- BUMPT خلیوں میں I/R-حوصلہ افزائی اپوپٹوس میں ثالثی کرتا ہے۔

شکل 6. BUMPT خلیوں میں کلیویڈ caspase3، BAX، اور Cyt-c کا IR-حوصلہ افزائی اظہار VDAC1 کے ذریعہ ثالثی کیا گیا تھا۔ VDAC1 کے siRNA یا پلازمڈ کو BUMPT خلیوں میں منتقل کیا گیا اور پھر 2 گھنٹے کے لیے ATP کی کمی اور 2 گھنٹے کے لیے بحالی کا سامنا کرنا پڑا۔ (a) BUMPT خلیوں میں VDAC1 اور b-tubulin کا ​​امیونو بلوٹ تجزیہ۔ (b) ان کے درمیان گرے اسکیل امیج کا تجزیہ (c) BUMPT خلیات اپوپٹوسس کا فلو سائٹومیٹری تجزیہ۔ (d) امیونو بلوٹس نے کلیویڈ کیسپیس 3، VDAC1، اور DsbA-L کے اظہار اور مائٹوکونڈریل اور سائٹوسولک فریکشن میں BAX اور Cyt-c کے اظہار کا تجزیہ کیا۔ b-tubulin اور GAPDH کو بالترتیب پورے lysate یا cytosolic لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ COX IV کو مائٹوکونڈریا لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ (ek) ان کے درمیان گرے اسکیل امیج کا تجزیہ۔ (i) BUMPT خلیات اپوپٹوسس کا فلو سائٹومیٹری تجزیہ۔ (m) امیونو بلاٹس کلیویڈ کیسپیس 3، وی ڈی اے سی 1، اور ڈی ایس بی اے ایل کے اظہار اور مائٹوکونڈریل اور سائٹوسولک فریکشن میں BAX اور Cyt-c کے اظہار کا تجزیہ کرتے ہیں۔ b-tubulin اور GAPDH کو بالترتیب پورے lysate یا cytosolic لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ COX IV کو مائٹوکونڈریا لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ (ns) ان کے درمیان گرے اسکیل امیج کا تجزیہ۔ اسی طرح کے نتائج کے ساتھ ہر تجربہ (a,c,d,l&m) آزادانہ طور پر 6 بار دہرایا گیا۔ دو دم والے اسٹوڈنٹ ٹی ٹیسٹ دو گروپ موازنہ کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ (b)، ایک طرفہ انووا ایک سے زیادہ گروپ موازنہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ (e-k اور n-s)۔ # صفحہ<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.# P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

Cistanche اقتباس

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h اور Dongshan Zhang a,b *

ایمرجنسی میڈیسن کا شعبہ، عوامی جمہوریہ چین

b ایمرجنسی میڈیسن اور مشکل امراض کا ادارہ، دوسرا ژیانگیا ہسپتال، سنٹرل ساؤتھ یونیورسٹی، چانگشا، ہنان 410011، عوامی جمہوریہ چین

c شعبہ امراض چشم، عوامی جمہوریہ چین

d محکمہ پیشاب کی سرجری، عوامی جمہوریہ چین

ای ڈپارٹمنٹ آف چیسٹ سرجری، عوامی جمہوریہ چین

f جنرل سرجری کا شعبہ، دوسرا ژیانگیا ہسپتال، عوامی جمہوریہ چین

g ڈیپارٹمنٹ آف پبلک ہیلتھ، سینٹرل ساؤتھ یونیورسٹی، چانگشا، ہنان، عوامی جمہوریہ چین

ایچ ڈیپارٹمنٹ آف اینڈو کرائنولوجی، شینزین پیپلز ہسپتال، جنان یونیورسٹی کا دوسرا کلینیکل میڈیکل کالج، سدرن یونیورسٹی آف سائنس اینڈ ٹیکنالوجی کا پہلا منسلک ہسپتال، شینزین، عوامی جمہوریہ چین

1 Xiaozhou Li اور Jian Pan نے اس مطالعہ میں یکساں تعاون کیا۔