تیسرا حصہ DsbA-L Mitochondionmediated Tubular Cell Apoptosis میں VDAC1 کے ساتھ تعامل کرتا ہے اور گردے کی شدید بیماری کے بڑھنے میں تعاون کرتا ہے۔

7. PT-VDAC1-KO چوہوں کی نسل

AKI میں VDAC1 کے کردار کی چھان بین کرنے کے لیے، ہم نے ایک ماؤس ماڈل قائم کیا جس میں VDAC1 کے ناک آؤٹ کو گردوں کی قربتی نلیوں میں دکھایا گیا ہے۔ شکل 7a PT-VDAC1-KO بنانے کے لیے استعمال ہونے والا افزائش پروٹوکول دکھاتا ہے۔ RT-PCR کو PT- VDAC1-KO چوہوں کی جین ٹائپ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ یہ ایک 416-bp ڈی این اے فریگمنٹ فلوکسڈ ایلیل اور ایک 370-bp ڈی این اے ٹکڑا Cre جین (شکل 7، b؛ لین 4 اور 6) کو بڑھا کر کیا گیا تھا۔ جنگلی قسم کے چوہوں (PT-VDAC1-WT) میں Cre جین کی کمی تھی (شکل 7، b، لین 2 اور 3)۔ امیونو بلوٹ تجزیہ نے اشارہ کیا کہ PTVDAC1-KO چوہوں کے گردے کی کورٹیس میں VDAC1 کے اظہار کی سطح اسکیمک یا شیم ٹریٹمنٹ کے بعد PTVDAC1-WT چوہوں کی نسبت کم تھی (شکل 7 c اور d)۔ VDAC1 (شکل 7e) کے امیونو ہسٹو کیمیکل داغ کے ذریعہ اس کی مزید تصدیق ہوئی۔ ان اعداد و شمار نے تصدیق کی کہ ہم نے کامیابی کے ساتھ PT- VDAC1-KO ماؤس ماڈل قائم کیا ہے۔

شکل 7. PT-VDAC1-KO ماؤس ماڈل کی تخلیق اور خصوصیات۔ (a، b) PTVDAC1-KO چوہوں کی نسل کے لیے افزائش کا پروٹوکول اور VDAC1 اور PEPCK-Cre ایللی کے جنگلی قسم اور فلوکسڈ ایللیس کے جین ٹائپ کا PCR پتہ لگانا۔ (c) IR چوٹ کے بعد PT-VDAC1-KO اور PT-VDAC1-WT لیٹر میٹ چوہوں کے گردے کے کارٹیکل ٹشوز کا استعمال کرتے ہوئے VDAC1 اور b-tubulin کا ​​امیونو بلوٹ تجزیہ۔ (d) ان کے درمیان گرے اسکیل امیج کا تجزیہ۔ (e) IR چوٹ کے بعد جنگلی قسم اور VDAC1 چوہوں کے گردے کے کارٹیکل ٹشوز میں VDAC1 کا امیونو ہسٹو کیمیکل داغ۔ اصل میگنیفیکیشن x 400۔ اسکار بار: 100µM۔ ہر تجربہ (c & e) کو اسی طرح کے نتائج کے ساتھ آزادانہ طور پر 6 بار دہرایا گیا۔ ایک طرفہ انووا ایک سے زیادہ گروپ موازنہ (d) کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ # صفحہ<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.

Cistanche کے فوائد جاننے کے لیے یہاں کلک کریں۔

8. PTVDAC1-KO چوہوں میں I/R-حوصلہ افزائی گردوں کی چوٹ، ٹیوبلر سیل اپوپٹوس، اور مائٹوکونڈریل نقصان کو بہتر بنایا گیا

PT-VDAC1-WT اور PT-VDAC1-KO چوہوں کے لیٹر میٹس کا علاج اسکیمیا (28 منٹ) کے ساتھ کیا گیا جس کے بعد ریپرفیوژن انجری (48 گھنٹے) ہوئی۔ اس کے بعد ہم نے مزید معائنے کے لیے خون کے نمونے اور گردے کے ٹشوز حاصل کیے۔ ہم نے پایا کہ PT-VDAC1-KO نے خاص طور پر BUN اور کریٹینائن کی سطحوں میں I/R-حوصلہ افزائی کی بلندی کو دبایا (شکل 8 a اور b)۔ دوم، ہسٹولوجیکل اور ٹونیل تجزیوں نے مزید یہ ظاہر کیا کہ PT-VDAC1-KO نے I/R-حوصلہ افزائی ٹشو کو پہنچنے والے نقصان اور رینل سیل اپوپٹوس (شکل 8 سی، ڈی، ایف، اور جی) کو نمایاں طور پر کم کیا ہے۔ تیسرا، EM کے تجزیوں سے معلوم ہوا کہ PT-VDAC1-KO نے نمایاں طور پر I/R-حوصلہ افزائی مائٹوکونڈریل نقصان کو کم کیا (شکل 8 e اور h)۔ آخر میں، امیونوبلوٹنگ نے اس بات کی تصدیق کی کہ PT-VDAC1-KO چوہوں نے کلیویڈ کیسپیس کی سطح کو کم دکھایا-3، مائٹوکونڈریا میں بیکس کا کم جمع ہونا، اور سائٹوسول میں Cyt-c کے اخراج کی کم شرح (شکل 8 I-o)۔ ان اعداد و شمار نے اشارہ کیا کہ VDAC1 نے I/R-حوصلہ افزائی AKI میں بھی ثالثی کی۔

شکل 8. IR کی حوصلہ افزائی گردوں کی چوٹ، نلی نما سیل اپوپٹوسس، مائٹوکونڈریون نقصان، اور PT-VDAC1-KO چوہوں میں Bax، Cyt-c، اور کلیویڈ کیسپیس3 کا اظہار۔ PT-VDAC1-KO اور PT-VDAC1-WT لیٹر میٹ چوہوں کی دو طرفہ گردوں کی شریانوں کو 28 منٹ کے لیے بند کیا گیا اور پھر 48 گھنٹے کے لیے ایک IR ماڈل قائم کرنے کے لیے چھوڑ دیا گیا۔ (a) BUN (b) سیرم کریٹینائن۔ (c) ہیماتوکسیلین اور eosin کا ​​داغ۔ (d) TUNEL- مثبت خلیوں کے نمائندہ حصے۔ (e) مائٹوکونڈریون مورفولوجی کا الیکٹران مائکروسکوپ کا پتہ لگانا۔ (f) نلی نما نقصان کا سکور۔ (g) TUNEL- مثبت خلیوں کی تعداد۔ (h) مائٹوکونڈریا کی چوٹ کا اسکور۔ (i) امیونو بلوٹس کلیویڈ caspase3، VDAC1، اور DsbA-L کے اظہار کے ساتھ ساتھ مائٹوکونڈریل اور سائٹوسولک فریکشن میں BAX اور Cyt-c کے اظہار کا تجزیہ کرتے ہیں۔ b-tubulin اور GAPDH کو بالترتیب پورے lysate یا cytosolic لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ COX IV کو مائٹوکونڈریا لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ (j-p) ان کے درمیان گرے اسکیل امیج کا تجزیہ۔ اصل میگنیفیکیشن x 400۔ اسکار بار: c میں 100µM اور e میں d 20µM۔ ہر تجربہ (c-e&i) کو اسی طرح کے نتائج کے ساتھ آزادانہ طور پر 6 بار دہرایا گیا۔ ایک سے زیادہ گروپ موازنہ (a, b, f-h&j-p) کے لیے یک طرفہ انووا استعمال کیا گیا تھا۔ # صفحہ<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.

Cistanche tubulosa

9. PT-VDAC1-KO چوہوں میں DsbA-L کے بڑھے ہوئے I/R-حوصلہ افزائی گردے کے نقصان کی حد سے زیادہ کارکردگی کو کم کیا گیا تھا۔

اسکیمک چوٹ کے دوران DsbA-L کا۔ IR کے ماؤس ماڈل کے قائم ہونے سے ایک ہفتہ قبل، ہم نے DsbA-L پلازمیڈ کے ساتھ ہر ماؤس کی دم کی رگ کو انجیکشن لگایا (اس ہفتے کے دوران انجیکشن دو بار لگایا گیا تھا)۔ DsbA-L کے زیادہ اظہار نے BUN میں IR کی حوصلہ افزائی کی بلندی اور کریٹینائن اظہار، گردوں کو پہنچنے والے نقصان، اور رینل اپوپٹوسس کو بڑھا دیا۔ ان اثرات کو PTVDAC1-KO چوہوں میں کم کیا گیا تھا (شکل 9 a-d, e, اور f)۔ امیونو بلوٹ کے نتائج نے مزید اشارہ کیا کہ DsbA-L کے اوور ایکسپریشن نے کلیویڈ کیسپیس میں IR کی حوصلہ افزائی میں اضافہ کیا، مائٹوکونڈریا میں بیکس کا جمع ہونا، اور سائٹوسول میں Cyt-c کی رہائی؛ ان اثرات کو PT-VDAC1-KO چوہوں میں کم کیا گیا تھا (شکل 9 g اور h-l)۔ اجتماعی طور پر، ان نتائج نے مزید یہ ظاہر کیا کہ VDAC1 نے اسکیمک چوٹ کے دوران DsbA-L کے اثر میں ثالثی کی۔

شکل 9. DsbA-L کے بڑھے ہوئے I/R-حوصلہ افزائی گردے کے نقصان کی حد سے زیادہ کارکردگی کو PT-VDAC1-KO چوہوں میں کم کیا گیا تھا۔ PT-VDAC1-KO اور PT-DsbA-L-WT چوہوں کا علاج DsbA-L پلازمیڈ کے ساتھ یا اس کے بغیر کیا گیا اور پھر ایک IR ماڈل قائم کیا۔ (a) BUN (b) سیرم کریٹینائن۔ (c) ہیماتوکسیلین اور eosin کا ​​داغ۔ (d) TUNEL- مثبت خلیوں کے نمائندہ حصے۔ (e) نلی نما نقصان کا سکور۔ (f) TUNEL- مثبت خلیوں کی تعداد۔ (g) امیونو بلوٹس نے کلیویڈ کیسپیس 3، VDAC1، اور DsbA-L کے اظہار کے ساتھ ساتھ مائٹوکونڈریل اور سائٹوسولک فریکشن میں BAX اور Cyt-c کے اظہار کا تجزیہ کیا۔ b-tubulin اور GAPDH کو بالترتیب پورے lysate یا cytosolic لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ COX IV کو مائٹوکونڈریا لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ (h-n) ان کے درمیان گرے اسکیل امیج کا تجزیہ۔ اصل میگنیفیکیشن x 400۔ اسکار بار: 100 ملی میٹر۔ ہر تجربہ (c-e) کو اسی طرح کے نتائج کے ساتھ آزادانہ طور پر 6 بار دہرایا گیا۔ ایک طرفہ انووا ایک سے زیادہ گروپ موازنہ (a، b، اور f-n) کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ # صفحہ<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.

Cistanche ضمیمہ

10. PTDsbA-L-KO چوہوں میں I/R-حوصلہ افزائی گردوں کے نقصان کی توجہ VDAC1 کے اوور ایکسپریشن سے کم ہوئی تھی۔

مزید تصدیق کرنے کے لیے کہ آیا DsbA-L- ثالثی والے نلی نما نقصان کا انحصار VDAC1 پر تھا، PTDsbA-L -WT اور PT- DsbA-L -KO چوہوں کے لیٹر میٹ چوہوں کو پہلے I/R علاج کے سامنے لایا گیا، اور پھر دم کی رگ کے ذریعے انجکشن لگایا گیا۔ VDAC1 اوور ایکسپریشن پلازمیڈ کے ساتھ۔ PT- DsbA-L-KO چوہوں میں BUN اور creatinine کی سطح میں I/R کی حوصلہ افزائی سے اضافہ ہوا؛ تاہم، اس اثر کو VDAC1 (شکل 10 a اور b) کے اوور ایکسپریشن سے روکا گیا تھا۔ HE اور TUNEL کے داغ سے پتہ چلتا ہے کہ PT-DsbAL-KO چوہوں میں IR-حوصلہ افزائی رینل ٹشو کو پہنچنے والے نقصان اور رینل سیل اپوپٹوسس کی متعلقہ حدیں کم ہو گئی تھیں اور یہ کہ ان اثرات کو VDAC1 (شکل 10 c-f) کے اوور ایکسپریشن نے روک دیا تھا۔ امیونوبلوٹنگ نے ظاہر کیا کہ PT- DsbA-L -KO چوہوں میں کلیویڈ کیسپیس کی نچلی سطح-3، مائٹوکونڈریا میں بیکس کے جمع ہونے کی نچلی سطح، اور سائٹوسول میں Cyt-c کے اخراج کی کم شرح؛ تاہم، یہ اثرات VDAC1 (شکل 10 g-m) کے اوور ایکسپریشن سے ختم ہو گئے تھے۔ ان اعداد و شمار نے اس حقیقت کی تائید کی کہ DsbA-L نے اسکیمک چوٹ کو اس انداز میں فروغ دیا جو VDAC1 پر منحصر تھا۔

شکل 10۔ PT-DsbA-L-KO کو بہتر بنایا گیا IR-حوصلہ افزائی چوہوں کے گردوں کی چوٹ VDAC1 کے اوور ایکسپریشن سے کم ہوگئی۔ PT-DsbA-L-KO اور PT- DsbA-L-WT چوہوں کا علاج VDAC1 پلازمیڈ کے ساتھ یا اس کے بغیر کیا گیا اور پھر ایک IR ماڈل قائم کیا۔ (a) BUN (b) سیرم کریٹینائن۔ (c) ہیماتوکسیلین اور eosin کا ​​داغ۔ (d) TUNEL- مثبت خلیوں کے نمائندہ حصے۔ (e) نلی نما نقصان کا سکور۔ (f) TUNEL- مثبت خلیوں کی تعداد۔ (g) امیونو بلوٹس نے کلیویڈ کیسپیس 3، VDAC1، اور DsbA-L کے اظہار کے ساتھ ساتھ مائٹوکونڈریل اور سائٹوسولک فریکشن میں BAX اور Cyt-c کے اظہار کا تجزیہ کیا۔ b-tubulin اور GAPDH کو بالترتیب پورے lysate یا cytosolic لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ COX IV کو مائٹوکونڈریا لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ (hm) ان کے درمیان گرے اسکیل امیج کا تجزیہ۔ اصل میگنیفیکیشن x 400۔ اسکار بار: 100 ملی میٹر۔ ہر تجربہ (c، d، اور g) کو اسی طرح کے نتائج کے ساتھ آزادانہ طور پر 6 بار دہرایا گیا۔ ایک طرفہ انووا ایک سے زیادہ گروپ موازنہ (a، b، e، f، اور h-m) کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ # صفحہ<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.

Herba Cistanche

11. PT-DsbA-LKO یا PT-VDAC1-KO چوہوں میں CLP سے متاثر گردوں کی چوٹ کو کم کیا گیا تھا۔

سیپسس سے متاثرہ AKI کلینیکل پریکٹس میں AKI کی ایک اور عام وجہ ہے۔ PT- DsbA-L یا VDAC-WT اور PT-DsbA-L یا VDAC1-KO کے لیٹر میٹس کو CLP ماڈل کا نشانہ بنایا گیا اور پھر سرجری کے بعد 18 گھنٹے کے بعد خوشامد کی گئی۔ نتائج نے اشارہ کیا کہ PT-DsbA-L یا VDAC1- KO چوہوں نے BUN اور کریٹینائن کی سطحوں میں CLP کی حوصلہ افزائی کی بلندیوں کو نمایاں طور پر کم کیا، اور گردوں کے بافتوں کو پہنچنے والے نقصان اور رینل سیل اپوپٹوسس کی بڑھتی ہوئی سطح (اعداد و شمار S1 اور S2 a-f) )۔ امیونوبلوٹنگ نے اس بات کی تصدیق کی کہ PTDsbA-L یا VDAC1-KO چوہوں نے کلیویڈ کیسپیس کی کم سطح، مائٹوکونڈریا میں بیکس کے جمع ہونے کی نچلی سطح، اور سائٹوسول میں Cyt-c کے اخراج کی کم شرحیں بھی ظاہر کیں (اعداد و شمار S1 اور S2 g-n)۔ اجتماعی طور پر، ان اعداد و شمار نے یہ ظاہر کیا کہ DsbA-L اور VDAC1 دونوں نے سیپٹک AKI کی ترقی میں ثالثی کی۔

12. VAN سے متاثرہ گردوں کی چوٹ PT-DsbAL-KO یا PT-VDAC1-KO چوہوں میں کم کی گئی تھی۔

Vancomycin (VAN) کی حوصلہ افزائی AKI بھی AKI کے لیے ایک اہم ماڈل ہے۔ PT- DsbA-L یا VDAC1-WT اور PT-DsbA-L یا VDAC1-KO کے لیٹر میٹس کو لگاتار 7 دنوں تک VAN (600mg/kg) کے ساتھ انجکشن لگایا گیا تھا۔ نتائج نے اشارہ کیا کہ PT-DsbA-L یا VDAC1-KO چوہوں نے BUN اور کریٹینائن کی سطحوں، رینل ٹشوز کو پہنچنے والے نقصان، اور رینل سیل اپوپٹوس (اعداد و شمار S3 اور S4 anf) کی VAN سے حوصلہ افزائی کی بلندی کو واضح طور پر کم کیا۔ امیونو بلوٹ کے تجزیوں نے مزید تصدیق کی کہ PTDsbA-L یا VDAC1-KO چوہوں نے بھی کلیویڈ کیسپیس کی کم سطح کو ظاہر کیا-3، مائٹوکونڈریا میں بیکس کے جمع ہونے کی کم حد، اور Cyt-c کے اخراج کی کم شرحیں سائٹوسول (اعداد و شمار S3 اور S4 g-m)۔ خلاصہ طور پر، ان اعداد و شمار نے یہ ظاہر کیا کہ DsbA-L اور VDAC1 دونوں نے VAN-حوصلہ افزائی AKI میں ثالثی کی۔

Cistanche اقتباس

13. DsbA-L ثالثی I/R حوصلہ افزائی HK-2 خلیات اپوپٹوس VDAC1 کے ساتھ وابستہ تھا۔

مندرجہ بالا نتائج سے پتہ چلا کہ DsbA-L BUMPT خلیات اپوپٹوسس میں ملوث تھا، تاہم، انسانی گردوں کے نلی نما خلیوں میں DsbA کا کام ابھی تک واضح نہیں ہے۔ DsbA-L siRNA کو HK2 خلیوں میں تبدیل کیا گیا اور پھر 2 گھنٹے کے لیے ATP کی کمی اور 2 گھنٹے کے لیے بحالی کا سامنا کرنا پڑا۔ امیونو بلوٹ کے نتائج نے یہ ظاہر کیا کہ DsbA-L siRNA نے کلیویڈ کیسپیس-3 اور VDAC1 اظہار میں I/R-حوصلہ افزائی میں اضافہ، مائٹوکونڈریا میں بیکس کا بڑھتا ہوا جمع، اور سائٹوسول میں Cyt-c کی بڑھتی ہوئی پیداوار ( شکل S5 an-h)۔ اعداد و شمار نے یہ بھی تجویز کیا کہ HK2 سیل apoptosis میں DsbA-L کا کردار I/R علاج کے دوران VDAC1 سے متعلق تھا۔

14. DsbA-L ثالثی I/R حوصلہ افزائی HK-2 خلیات اپوپٹوس VDAC1 پر منحصر ہے

مزید تصدیق کرنے کے لیے کہ آیا HK2 سیل اپوپٹوسس میں DsbA-L کا کردار VDAC1 پر منحصر ہے۔ سب سے پہلے، HK2 خلیوں کو DsbA-L siRNA پلس کے ساتھ VDAC1 پلاسمڈ کے ساتھ یا اس کے بغیر منتقل کیا گیا اور پھر 2 گھنٹے کے لیے اے ٹی پی کی کمی اور 2 گھنٹے کے لیے بحالی کا سامنا کرنا پڑا۔ امیونو بلوٹ کے نتائج نے اشارہ کیا کہ DsbA-L siRNA نے کلیویڈ کیسپیس اور VDAC1 ایکسپریشن میں نمایاں طور پر I/R حوصلہ افزائی میں اضافہ، مائٹوکونڈریا میں بیکس کا بڑھتا ہوا جمع، اور سائٹوسول میں Cyt-c کی بڑھتی ہوئی پیداوار، یہ اثر VDAC1 پلاسمڈ (فگر S6a-h) کے اوور ایکسپریشن سے الٹ گیا۔ دوم، HK2 خلیات کو VDAC1 siRNA پلس کے ساتھ DsbA-L پلازمیڈ کے ساتھ یا اس کے بغیر منتقل کیا گیا اور پھر I(2 h)/R(2 h) کے سامنے لایا گیا۔ امیونو بلوٹ کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ VDAC1 siRNA نے کلیویڈ کیسپیس-3 اور VDAC1 اظہار میں خاص طور پر I/R-حوصلہ افزائی میں اضافہ، مائٹوکونڈریا میں بیکس کا بڑھتا ہوا جمع، اور سائٹوسول میں Cyt-c کی بڑھتی ہوئی پیداوار، یہ اثر DsbA-L پلازمیڈ (شکل S7a-h) کے زیادہ اظہار سے نہیں بڑھا تھا۔ ڈیٹا نے واضح طور پر تصدیق کی کہ VDAC1 نے I/R علاج کے دوران HK-2 سیلوں میں DsbA-L کے پرو اپوپٹوسس رول میں ثالثی کی۔

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h اور Dongshan Zhang a,b *

ایمرجنسی میڈیسن کا شعبہ، عوامی جمہوریہ چین

b ایمرجنسی میڈیسن اور مشکل امراض کا ادارہ، دوسرا ژیانگیا ہسپتال، سنٹرل ساؤتھ یونیورسٹی، چانگشا، ہنان 410011، عوامی جمہوریہ چین

c شعبہ امراض چشم، عوامی جمہوریہ چین

d محکمہ پیشاب کی سرجری، عوامی جمہوریہ چین

ای ڈپارٹمنٹ آف چیسٹ سرجری، عوامی جمہوریہ چین

f جنرل سرجری کا شعبہ، دوسرا ژیانگیا ہسپتال، عوامی جمہوریہ چین

g ڈیپارٹمنٹ آف پبلک ہیلتھ، سینٹرل ساؤتھ یونیورسٹی، چانگشا، ہنان، عوامی جمہوریہ چین

ایچ ڈیپارٹمنٹ آف اینڈو کرائنولوجی، شینزین پیپلز ہسپتال، جنان یونیورسٹی کا دوسرا کلینیکل میڈیکل کالج، سدرن یونیورسٹی آف سائنس اینڈ ٹیکنالوجی کا پہلا منسلک ہسپتال، شینزین، عوامی جمہوریہ چین

1 Xiaozhou Li اور Jian Pan نے اس مطالعہ میں یکساں تعاون کیا۔