حصہ 1: ایکٹیوسائیڈ C-Fos انڈکشن اور NF-KB پاتھ وے کو روک کر اور ROS کی پیداوار کو کم کر کے RANKL-ثالثی آسٹیو کلاسٹوجینیسیس کو دباتا ہے۔
Mar 05, 2022
رابطہ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ای میل:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
خلاصہ
متعدد مطالعات میں بتایا گیا ہے کہ سوزش والی سائٹوکائنز آسٹیوکلاسٹوجنیسیس کے لیے اہم ثالث ہیں، اس طرح ہڈیوں کی ضرورت سے زیادہ ریزورپشن اور آسٹیوپوروسس کا باعث بنتے ہیں۔cistanche جڑی بوٹی سے Acteoside، رحمانیہ گلوٹینوسا کا اہم فعال مرکب، جو روایتی مشرقی ادویات میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا ہے، سوزش اور اینٹی آکسیڈینٹ صلاحیت رکھتا ہے۔ اس مطالعہ میں، ہم نے پایاایکٹیوسائیڈبون میرو میکروفیجز (BMMs) اور RAW264.7 میکروفیجز سے آسٹیو کلاس تفریق اور تشکیل کو واضح طور پر روکا جو نیوکلیئر فیکٹر کپا بی (NF-kB) ligand (RANKL) کے ریسیپٹر ایکٹیویٹر کے ذریعہ حوصلہ افزائی کرتا ہے۔ایکٹیوسائیڈقبل از علاج خوراک پر منحصر انداز میں بالغ آسٹیو کلاسٹس کے ذریعہ ہڈیوں کی بحالی کو بھی روکتا ہے۔ ایکٹیوسائیڈ (10 ایم ایم) نے p38 کناز کی RANKL-حوصلہ افزائی ایکٹیویشن، ایکسٹرا سیلولر سگنل ریگولیٹڈ کناز، اور c-Jun N-terminal kinase، اور p65 سبونائٹ اور kBahi کے فاسفوریلیشن کو روک کر NF-kB ایکٹیویشن کو بھی دبا دیا۔ اس کے علاوہ، RANKL-ثالثی C-Fos کے اظہار میں اور متحرک T-cells کے جوہری عنصر، cytoplasmic 1 (NFATc1)، اور ٹیومر نیکروسس فیکٹر-a، interleukin (IL)-1b کی پیداوار میں اضافہ کرتا ہے۔ ، اور IL-6 کو بظاہر ایکٹیوسائیڈ پریٹریٹمنٹ سے روکا گیا تھا۔ مزید، زبانیایکٹیوسائیڈسطح کو کنٹرول کرنے کے لیے اوورییکٹومی سے متاثرہ ہڈیوں کا نقصان اور سوزش والی سائٹوکائن کی پیداوار میں کمی۔ ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ ایکٹیوسائڈ مائٹوجن ایکٹیویٹڈ پروٹین کنیزس اور ٹرانسکرپشن عوامل جیسے NF-kB، c-Fos، اور NFATc1 کی RANKL حوصلہ افزائی ایکٹیویشن کو دبا کر آسٹیو کلاسٹک پیشگی سے آسٹیو کلاسک تفریق اور پختگی کو روکتا ہے۔ اجتماعی طور پر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ ایکٹیوسائیڈ آسٹیوکلاسٹ ایکٹیویشن کو روک کر ہڈیوں کے نقصان کو کم کرنے کے لیے ایک اینٹی ریزورپٹیو ایجنٹ کے طور پر کام کر سکتا ہے۔
تعارف
ہڈیوں کو متوازن آسٹیوکلاسٹ اور آسٹیو بلاسٹ سرگرمی کے ذریعہ مستقل طور پر دوبارہ بنایا جاتا ہے [1]۔ Osteoclasts monocyte/macrophage نسب کے hematopoietic precursor خلیات سے پیدا ہوتے ہیں، جبکہ osteoblasts mesenchymal نسب میں سے ہیں [2]۔ غیر معمولی آسٹیوکلاسٹ ایکٹیویشن یا کم آسٹیو بلاسٹوجینیسیس ہڈیوں کے ہومیوسٹاسس میں خلل ڈال سکتا ہے، آخرکار آسٹیوپوروسس، گٹھیا اور ہڈیوں کے کینسر جیسی بیماریوں کا سبب بنتا ہے [3,4]۔ آسٹیوپوروسس ہڈیوں کی ایک عام بیماری ہے جس سے فریکچر کا خطرہ بڑھ جاتا ہے۔ آسٹیوپوروسس کی سب سے عام شکل رجونورتی خواتین میں ایسٹروجن کی کمی کی وجہ سے ہوتی ہے۔ corticosteroids اور anti-epileptics جیسی دوائیں بھی ہڈیوں کی ریزورپشن اور تشکیل کے درمیان عدم توازن پیدا کر سکتی ہیں، جس کے نتیجے میں آسٹیوپوروسس ہو سکتا ہے [5]۔
آسٹیوپوروسس کے علاج کے لیے بیسفاسفونیٹس، کیلسیٹونن، ایسٹروجن، اور سلیکٹیو ایسٹروجن ریسیپٹر ماڈیولٹرز سمیت بہت سے اینٹی ریزورپٹیو انحیبیٹرز استعمال کیے گئے ہیں۔ یہ روکنے والے آسٹیوکلاسٹ فنکشن کو روک کر ہڈیوں کے بڑے پیمانے کو برقرار رکھتے ہیں [6]۔ ایسٹروجن ریپلیسمنٹ تھراپی پوسٹ مینوپاسل آسٹیوپوروسس کی روک تھام اور علاج کے لیے سب سے مقبول علاج ہے۔ تاہم، طویل مدتی ایسٹروجن متبادل تھراپی اینڈومیٹریال اور چھاتی کے کینسر کے خطرے کو بڑھا سکتی ہے۔ لہذا، بہت سے تفتیش کاروں نے اپنی کوششوں کو ایک نئے اینٹی ریزورپٹیو ایجنٹ تیار کرنے پر مرکوز کیا ہے جس کے مضر اثرات نہیں ہیں [7-10]۔ چونکہ ہڈیوں کی ریزورپشن میں آسٹیو کلاسٹس کام کرتے ہیں، خاص طور پر آسٹیو کلاسٹس کو روکنا متعدد مطالعات میں بنیادی ہدف سمجھا جاتا ہے۔
اوسٹیو کلاسٹس کثیر الجہتی دیو ہیکل خلیات ہیں جو مونوسائٹ/میکروفیج فیملی کے مونو نیوکلیئر پروجینٹرز کے ذریعہ ترتیب وار پھیلاؤ، تفریق، اور ہیماٹوپوئٹک پیشگی خلیات [11] کے فیوژن کے ذریعے تشکیل پاتے ہیں۔ میکروفیج کالونی محرک عنصر (M-CSF) اور نیوکلیئر فیکٹر (NF)-kB (RANK) ligand (RANKL) کے ریسیپٹر ایکٹیویٹر آسٹیو کلاس تفریق کے لیے ضروری عوامل ہیں [12]۔ اس کے علاوہ، کئی سوزش والی سائٹوکائنز، جیسے ٹیومر نیکروسس فیکٹر (TNF) اور انٹرلییوکن (IL)-1b، RANKL، osteoprotegerin، اور M-CSF [7,13] کی شمولیت کو ماڈیول کر کے اوسٹیو کلاسٹوجینیسیس میں حصہ ڈالتے ہیں۔ RANKL سیل کی سطح کے RANK ریسیپٹر کے پابند ہونے کے نتیجے میں RANKL/RANK/TNFR منسلک عوامل (TRAF) کمپلیکس ہوتے ہیں جو ترتیب وار NF-kB اور mitogen-activated protein kinases (MAPKs) کو چالو کرتے ہیں، بشمول c-Jun N-terminal kinase (JNK)، p38 kinase، اور extracellular سگنل سے متعلق kinase (ERK) [14]۔ یہ ایکٹیویشن آسٹیو کلاس تفریق، ایکٹیویشن اور بقا میں ثالثی میں کلیدی کردار ادا کرتی ہے۔ RANKL ٹرانسکرپشن عوامل کے اظہار کو بھی متحرک کرتا ہے جیسے ایکٹیویٹڈ T-خلیات کا جوہری عنصر، cytoplasmic 1 (NFATc1)، اور c-Fos، جو آسٹیوکلاسٹ کی نشوونما کے لیے ضروری ہیں [7,9]۔ لہذا، RANKL سگنلنگ کو اینٹی ریزورپٹیو ایجنٹوں کا بنیادی ہدف سمجھا جاتا ہے جو آسٹیو کلاس ایکٹیویشن اور ہڈیوں کے نقصان کو دباتے ہیں۔
ایکٹیوسائیڈRehmannia glutinosa کا اہم فعال مرکب ہے، جو روایتی مشرقی ادویات میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا ہے [15,16]۔ ایکٹیوسائیڈ ایک مضبوط اینٹی آکسیڈینٹ ہے اور اس میں اینٹی ہیپاٹوٹوکسک، اینٹی سوزش، اور اینٹی نوسیسیپٹیو سرگرمیاں ہیں [17-20]۔ ہم نے پہلے پایا تھا کہ ایکٹیوسائیڈ ERK سگنلنگ [21] کو ریگولیٹ کرکے ٹائروسینیز کی سرگرمی اور میلانن بائیو سنتھیسس کو کم کرتا ہے، ری ایکٹیو آکسیجن پرجاتیوں (ROS) کی ثالثی مسوڑھوں کو پہنچنے والے نقصان سے بچاتا ہے [22]، اور مائکوٹوکسن ثالثی سیل کے نقصان کو دباتا ہے [23]۔ یہ اثرات ROS کو ہٹانے اور MAPK کی ثالثی سگنلنگ کو منظم کرنے کی نیوکلیوسائیڈز کی صلاحیت سے گہرا تعلق رکھتے ہیں۔ خاص طور پر، ROS کو ثالثی RANKL-حوصلہ افزائی سگنلنگ پاتھ ویز اور آسٹیو کلاسٹس میں سیلولر ایونٹس کی تجویز دی جاتی ہے۔ اینٹی آکسیڈینٹس کے ساتھ پہلے سے علاج نے NF-kB، ERK، اور IkBa کی RANKL کی حوصلہ افزائی کی ایکٹیویشن کو روک دیا، اس طرح آسٹیوکلاسٹوجنیسیس کو دبایا [24]۔ ان نتائج نے سختی سے تجویز کیا کہ، سوزش کی سرگرمی کے علاوہ، اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی ایک اینٹی ریزورپٹیو ایجنٹ کے لیے اہم ہے، اس طرح ایکٹیوسائیڈ RANKL کی حوصلہ افزائی آسٹیوکلاسٹوجنیسیس کو دبا سکتا ہے۔
موجودہ مطالعہ میں، ہم نے دریافت کیا کہ آیا ایکٹیوسائیڈ کا ہڈیوں کے نقصان پر علاج کا اثر ہوتا ہے۔ ہم نے وٹرو اور ویوو تجرباتی نظاموں کا استعمال کرتے ہوئے آسٹیو کلاس تفریق اور ہڈیوں کی ریزورپشن اور متعلقہ سیلولر میکانزم پر ایکٹیوسائیڈ کے اثرات کا جائزہ لیا۔
Cistanche acteoside RANKL کی حوصلہ افزائی osteoclastogenesis کو دباتا ہے۔
مواد اور طریقے
اخلاقیات کا بیان
جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کے طریقوں کی منظوری لیبارٹری جانوروں کی نگہداشت اور استعمال میں اخلاقیات پر Chonbuk نیشنل یونیورسٹی کی کمیٹی نے دی تھی (پرمٹ نمبر CBU 2010-0007)۔ اس مطالعے کے تمام تجربات یونیورسٹی کی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی کے رہنما خطوط کے مطابق کیے گئے تھے۔
چوہے، کیمیکل اور لیبارٹری کے سامان
چار ہفتے پرانے مادہ ICR چوہوں کو Orient Bio Inc. (Seul, Korea) سے خریدا گیا اور 2261uC اور 5565 فیصد نمی پر 12 گھنٹے کے روشنی/تاریک چکر میں خوراک اور پانی تک مفت رسائی کے ساتھ رکھا گیا۔ Acteoside (3,4-dihydroxy-bphenethyl-Oa-rhamnopyranosyl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopyranoside; C29H36O15) (تصویر S1) رحمانیہ گلوٹینوسا کے پتوں سے الگ تھلگ تھا۔ استعمال سے پہلے ایکٹیوسائڈ کو فاسفیٹ بفرڈ نمکین (پی بی ایس) میں تحلیل کیا گیا تھا۔ RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6, اور M-CSF R&D سسٹمز (Minneapolis, MN, USA) سے خریدے گئے تھے۔ c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa، اور b-actin کے لیے مخصوص اینٹی باڈیز سانتا کروز بائیو ٹیکنالوجی (سانتا کروز، CA، USA) سے حاصل کی گئی تھیں۔ )۔ p-p38 اور p38 کے لیے اینٹی باڈیز سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی (ڈینورس، MA، USA) سے خریدی گئیں۔ سیرم بائیو کیمیکل پیرامیٹرز کا تعین کرنے کے لیے کیلشیم آسے اور اوسٹیوکالسن (OC) EIA کٹس بالترتیب BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) اور بایومیڈیکل ٹیکنالوجیز (Stoughton, MA, USA) سے خریدی گئیں۔ ماؤس ٹارٹریٹ مزاحم ایسڈ فاسفیٹیس (TRAP) Assay kit (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA) بھی سیرم TRAP5b کی سطح کی پیمائش کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ جب تک کہ دوسری صورت میں وضاحت نہ کی گئی ہو، اضافی کیمیکلز سگما کیمیکل کمپنی (سینٹ لوئس، ایم او، یو ایس اے) سے حاصل کیے گئے تھے، اور لیبارٹری کے سامان SPL لائف سائنسز (پوچن، جنوبی کوریا) سے تھے۔
سیل کلچرز
بون میرو سیلز پہلے بیان کردہ طریقوں کے مطابق 6 ہفتہ پرانی خواتین ICR چوہوں کے tibiae اور femora سے حاصل کیے گئے تھے [25]۔ بون میرو سسپنشن کو 50 ng/ml M-CSF کی موجودگی میں 100-mm کلچر ڈش میں لگایا گیا تھا۔ 3 دن کے بعد، آسٹیو کلاسٹک تفریق کو دلانے کے لیے بون میرو میکروفیجز (BMMs) کے طور پر پیروکار خلیات استعمال کیے گئے۔ کچھ ہڈیوں کے گودے کے خلیات کو M-CSF کے بغیر 48 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا، اور پیروکار خلیوں کو آسٹیو بلاسٹ فرق کرنے والے میڈیم میں کلچر کیا گیا تھا، جیسا کہ کہیں اور بیان کیا گیا ہے [25]۔ RAW264.7 میکروفیج سیلز کو Dulbecco کے ترمیم شدہ Eagles میڈیم (DMEM) میں 10 فیصد فیٹل بوائین سیرم (FBS)، 2 mM L-glutamine، اور اینٹی بائیوٹکس کے ساتھ مکمل کیا گیا تھا۔ ان خلیوں کو BMMs کے لئے ایک ہم منصب سیل لائن کے طور پر استعمال کیا گیا تھا تاکہ آسٹیو کلاسٹوجینیسیس پر ایکٹیوسائیڈ کے اثر کو تلاش کیا جا سکے۔
اوسٹیو کلاسک تفریق اور ٹراپ سٹیننگ
BMMs کو مختلف ارتکاز (0–50 mM) کے ساتھ پہلے سے علاج کیا گیا تھا۔ایکٹیوسائیڈ100 ng/ml RANKL کے ساتھ محرک کرنے سے پہلے 2 گھنٹے کے لیے۔ کلچر میڈیا کو 2 اور 5 دنوں کو تازہ میڈیا سے بدل دیا گیا۔ انکیوبیشن کے 7 دنوں کے بعد، کلچرز کو 4 فیصد PBS- بفرڈ پیرافارمیلڈہائیڈ میں طے کیا گیا اور مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق سگما ایلڈرچ کٹ کا استعمال کرتے ہوئے TRAP سے داغ دیا گیا۔ آپٹک مائیکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے TRAP-مثبت خلیوں کی گنتی کی گئی، اور 3 یا اس سے زیادہ نیوکلیائی والے خلیات کو اوسٹیو کلاسٹس سمجھا جاتا تھا۔ RAW 264.7 خلیوں کو بھی 100 ng/ml RANKL سے 2 گھنٹے تک ایکٹیوسائڈ کے ساتھ پریٹریٹمنٹ کے بعد سامنے لایا گیا تھا، اور انکیوبیشن کے 7 دن کے بعد، خلیوں پر ٹراپ داغ لگانے کے لیے کارروائی کی گئی تھی۔
سیل وابستگی کی پیمائش
پانی میں گھلنشیل ٹیٹرازولیم نمک (WST)-8 ری ایجنٹ کے استعمال سے سیل کی قابل عملیت کا تعین کیا گیا تھا۔ مختصراً، BMMs یا RAW264.7 خلیات جو 10 فیصد FBS اور اینٹی بائیوٹکس پر مشتمل گروتھ میڈیم میں کلچر کیے گئے تھے ان کا علاج 10 mM ایکٹیوسائیڈ یا فینولک مرکبات جیسے quercetin، luteolin، apigenin، یا epigallocatechin-3-gallate (EGCG) سے کیا گیا تھا۔ WST-8 ری ایجنٹ کو 48 گھنٹے انکیوبیشن کے بعد ثقافتوں میں شامل کیا گیا۔ اضافی 4 گھنٹے تک انکیوبیٹ کرنے کے بعد، WST-8- مخصوص جذب کو مائکروپلیٹ ریڈر (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA) کا استعمال کرتے ہوئے 450 nm پر ماپا گیا۔
ہڈی ریزورپشن پرکھ
BMMs (16105 سیل/ml) کو 50 ng/ml M-CSF اور 100 ng/ml RANKL پر مشتمل ایک-MEM میں معطل کیا گیا، پھر کیلشیم فاسفیٹ نانو کرسٹلز (OAAS{{6}) کے ساتھ لیپت ایک 24-کنویں پلیٹ میں تقسیم کیا گیا۔ }؛ Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, South Korea) ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ اور اس کے بغیر 26104 خلیات/cm2 کی کثافت پر۔ 7 دن تک انکیوبیشن کے بعد، خلیوں کو 5 فیصد سوڈیم ہائپوکلورائٹ کے ساتھ پلیٹوں سے ہٹا دیا گیا، اور گڑھے کی تشکیل کو آپٹک مائکروسکوپ کے تحت دیکھا گیا۔ ریزوربڈ ایریا کو امیج اینالائزر کے ذریعہ بھی ماپا گیا تھا اور اسے کنٹرول ویلیو کے فیصد کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔
ویسٹرن بلاٹ تجزیہ
مکمل پروٹین لائسیٹس لیسیز بفر میں تیار کیے گئے تھے جیسا کہ کہیں اور بیان کیا گیا ہے [26]۔ سائٹوسولک اور جوہری پروٹین تیار کیے گئے تھے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [25]۔ پروٹین کے عرق کی مساوی مقدار کو 12-15 فیصد SDS-PAGE سے الگ کیا گیا اور پولی وینیل ڈائی فلورائیڈ جھلیوں پر داغ دیا گیا۔ 1 گھنٹہ تک بفر کو بلاک کرنے میں سیکنڈری اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیشن سے پہلے راتوں رات 4uC پر پرائمری اینٹی باڈیز کے ساتھ دھبوں کی جانچ کی گئی۔ دھبے تھے۔
بہتر کیمیلومینیسینس (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) کے ساتھ تیار کیا گیا اور ایکس رے فلم (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA) کے سامنے آیا۔
MAPK سرگرمی پرکھ
خلیات کے ساتھ pretreated کیا گیا تھاایکٹیوسائیڈ2 گھنٹے کے لیے اور پھر ایک اضافی-30 منٹ کے لیے RANKL کے ساتھ حوصلہ افزائی کی گئی۔ ایم اے پی کے کی سرگرمیوں کا تعین امیونو میٹرک پرکھ کٹس کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، جیسے کہ p-p38 کناز پرکھ کٹ (Assay Designs, Inc., MI, USA)، p-ERK انزائم پرکھ کٹ (Assay Designs)، اور p-SAPK/JNK سینڈوچ ELISA کٹ۔ (سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی، ایم اے، امریکہ)۔ تمام طریقہ کار مینوفیکچرر کی ہدایات پر عمل کرتے ہیں، اور جاذبیت کی پیمائش مائکروپلیٹ ریڈر کے ذریعے کی گئی تھی۔
الیکٹروفوریٹک موبلٹی شفٹ پرکھ (EMSA)
DNA-پروٹین بائنڈنگ ری ایکشن کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ کے لیے کیے گئے، 20 ملی بفر میں 10-15 ملی گرام پروٹین جس میں 1 ملی گرام/ملی لیٹر BSA، 0.5 ملی گرام/ملی لیٹر پولی (dI-dC)، 5 فیصد گلیسرول شامل ہے۔ ، 1 mM DTT، 1 mM PMSF، 10 mM Tris-Cl (pH 7.5)، 50 mM NaCl، 30،000 cpm [a-32P] dCTP کے لیبل والے oligonucleotides، اور Klenow ٹکڑا ڈی این اے پولیمریز کا۔ نمونوں کو 6 فیصد پولی کریلامائیڈ جیلوں پر الگ کیا گیا تھا، جنہیں خشک کر کے ایکسرے فلم (ایسٹ مین کوڈک کمپنی) کے سامنے 270uC پر 12-24 گھنٹے کے لیے رکھا گیا تھا۔ NF-kB کے لیے مخصوص oligonucleotide پرائمر کی ترتیبیں تھیں 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 اور 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59۔
NF-kB لوسیفریز پرکھ
مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق 2 ملی لیٹر Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے 24-کنویں پلیٹوں میں RAW264.7 میکروفیجز کو 0.8 mg kB-luciferase رپورٹر ویکٹر سے تبدیل کیا گیا تھا۔ منتقلی کے 24 گھنٹے بعد، خلیات کو RANKL کے ساتھ 24 گھنٹے تک ایکٹیوسائیڈ کی موجودگی اور غیر موجودگی میں متحرک کیا گیا۔ 100 ملی لیٹر رپورٹر لیسس بفر میں خلیوں کو دوبارہ معطل کیا گیا تھا۔
(پرومیگا، میڈیسن، WI، USA)۔ پروٹین کے نمونوں کی مساوی مقدار کو اچھی طرح سے مائیکرو پلیٹس میں 96- رکھا گیا تھا اور لوسیفریز سبسٹریٹ کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ Luminescence کی پیمائش مائکروپلیٹ luminometer (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) کے ذریعے کی گئی۔ اس تجربے میں، ایک قابل رسائی NF-kB inhibitor peptide (BIOMOL، Butler Pike، PA، USA) کو مثبت kB روکنے والے کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔
سائٹوکائنز کی پیمائش
BMMs یا RAW264.7 خلیات کو RANKL کے ساتھ 24- ویل کلچر پلیٹوں میں ایکٹیوسائیڈ کی موجودگی میں متحرک کیا گیا تھا۔ انکیوبیشن کے 48 گھنٹے کے بعد، ELISA کے ذریعے TNF-a-، IL-1b- اور IL-6-مخصوص OptEIATM کٹس کا استعمال کرتے ہوئے صنعت کار کی ہدایات کے مطابق کلچر سپرنٹنٹس کو جمع کیا گیا اور ان کا اندازہ لگایا گیا۔
ریئل ٹائم ریورس ٹرانسکرپشن پولیمریز چین ری ایکشن (RT-PCR)
آسٹیو کلاسٹک مارکروں کا mRNA اظہار، جیسے c-Fos، NFATc1، اور TNF-a، کا تعین ریئل ٹائم RT-PCR کے ذریعے کیا گیا تھا۔ مختصراً، کل آر این اے کو مینوفیکچرر کی ہدایات (انویٹروجن) کے مطابق ٹریزول ریجنٹ کے ساتھ میکروفیجز سے نکالا گیا تھا۔ سی ڈی این اے کو سپر اسکرپٹ ریورس ٹرانسکرپٹیس II اور پرائمر (انویٹروجن) کا استعمال کرتے ہوئے کل آر این اے کے 1 ملی گرام کے ساتھ ترکیب کیا گیا تھا۔ پاور ایس وائی بی آر گرین پی سی آر ماسٹر مکس (اپلائیڈ بایو سسٹم، فوسٹر سٹی، سی اے، یو ایس اے) ABI 7500 سیکوینس ڈٹیکشن سسٹم (اپلائیڈ بایو سسٹم) کے ساتھ سائیکلنگ کے دوران PCR پروڈکٹ کے جمع ہونے کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ 10 منٹ کے لئے 95uC پر ڈینیچریشن کے بعد، پی سی آر تھا۔
15 سیکنڈ کے لیے 95uC پر ڈینیچریشن کے چالیس 3-اسٹیپ سائیکل، 1 سیکنڈ کے لیے 60uC پر اینیلنگ، اور 30 سیکنڈ کے لیے 72uC پر ایکسٹینشن کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔ تمام پی سی آر رد عمل کم از کم سہ رخی میں کیے گئے تھے، اور اسی ردعمل میں ہاؤس کیپنگ جین HPRT میں اظہار کی سطح کو معمول بنایا گیا تھا۔ اس مطالعے میں وہی پرائمر تسلسل استعمال کیے گئے جو کہیں اور بیان کیے گئے ہیں [7]۔
انٹرا سیلولر ROS کی پیمائش
29،79-dichlorodihydrofluorescein-diacetate (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Germany) کا ایک سٹاک حل DMSO میں تیار کیا گیا تھا اور اندھیرے میں 220uC پر محفوظ کیا گیا تھا۔ مختصراً، BMMs (106 سیل/ml in 6- well plates) کو 24 گھنٹے کے لیے 50 ng/ml M-CSF کے ساتھ کلچر کیا گیا اور پھر مختلف ارتکاز (0–10 mM) کے ساتھ علاج کیا گیا۔ایکٹیوسائیڈ100 ng/ml RANKL کے ساتھ محرک سے 2 گھنٹے پہلے۔ شریک انکیوبیشن کے 1 گھنٹہ کے بعد ، ان خلیوں کو بعد میں 25 ایم ایم DCFH-DA کے ساتھ 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ FACS VantageH سسٹم (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے 29,79-dichlorofluorescein (DCF) کا سبز فلوروسینس 515 nm (FL 1) پر ریکارڈ کیا گیا، اور 10,000 واقعات فی نمونہ شمار کیے گئے تھے۔
Ovariectomy-حوصلہ افزائی آسٹیوپوروسس کی شمولیت
اس تحقیق کے لیے خواتین ICR چوہوں (6 ہفتے پرانے) استعمال کیے گئے تھے۔ چوہوں کو اینستھیزیا کے تحت شیم آپریشن (Sham, n =10) یا سرجیکل ovariectomized (OVX, n=20) ملا۔ سرجری کے ایک ہفتہ بعد، OVX چوہوں کو تصادفی طور پر 10 چوہوں کے 2 گروپوں میں تقسیم کیا گیا: دو طرفہ OVX اور دو طرفہ OVX 200 ملی لیٹر کے ساتھ اضافی
پی بی ایس جس میں 1 ایم ایم ایکٹیوسائیڈ زبانی طور پر (AC گروپ) ہوتا ہے۔ سرجری کے بعد 8 ہفتوں کے لئے ہر 3 دن میں ایک بار زبانی ایکٹیوسائڈ کا انتظام کیا جاتا تھا ، اور
PBS کی اتنی ہی مقدار شام اور OVX گروپوں کو دی گئی۔ آخری انتظامیہ کے 1 دن کے بعد، چوہوں کی قربانی دی گئی اور پھر سیرم میں بائیو کیمیکل پیرامیٹرز اور 3- جہتی ہڈیوں کی ساخت کا تجزیہ کیا گیا۔
سیرم بائیو کیمیکل پیرامیٹرز کا تعین
خون کے نمونے کارڈیک پنکچر کے ذریعے جمع کیے گئے تھے اور سیرم سینٹرفیوگریشن کے ذریعے جمع کیے گئے تھے۔ سیرم کے نمونے بائیو کیمیکل پیرامیٹرز کے تجزیہ کے لیے 280uC پر محفوظ کیے گئے تھے۔ IL-1b اور IL-6 کے سیرم کی سطحوں کا اندازہ ELISA کٹ کے استعمال سے لگایا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے، جبکہ الکلائن فاسفیٹیس (ALP) کی سرگرمی کا تعین بائیو کیمیکل رنگین میٹرک پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا جو p کی مقدار کو ماپتا ہے۔ -نائٹروفینول p-nitrophenol فاسفیٹ سبسٹریٹ سے پیدا ہوتا ہے، جیسا کہ کہیں اور بیان کیا گیا ہے [27]۔ ہڈیوں کی تشکیل اور ریزورپشن کے بائیو مارکر کا اندازہ لگانے کے لیے، سیرم OC، کیلشیم، اور TRAP5b کی سطحوں کا تعین بھی مینوفیکچررز کی ہدایات کے مطابق کیا گیا تھا۔
ہڈیوں کی ساخت اور مورفومیٹرک پیرامیٹرز کا تجزیہ
چوہوں کے فیمورا (شام، او وی ایکس، اور اے سی گروپس) کو الگ کیا گیا تھا اور میکانیکل ٹیسٹنگ کے لیے جسمانی نمکین سے بھرا گیا تھا۔ فیمر کی مکینیکل طاقت کو ماپا گیا جیسا کہ کہیں اور بیان کیا گیا ہے [28]۔ فریکچر بوجھ کو نیوٹن میں چوٹی کی قوت کے طور پر اس مقام پر ریکارڈ کیا گیا تھا کہ دائیں فیمر کے فریکچر کا وسط شافٹ۔ اس کے علاوہ، مائیکرو کمپیوٹر ٹوموگرافی (مائیکرو-سی ٹی) سسٹم (اسکائی اسکین 1076 مائیکرو فوکس ایکس رے سسٹم، کونٹیچ، بیلجیم) کا استعمال کرتے ہوئے ہر جانور کے ہلکے فیمر کا ہسٹو مورفومیٹرک تجزیہ کیا گیا۔ مختصراً، 4 فیصد فارملڈہائیڈ سٹوریج میں موجود ہڈیوں کو کاغذ کے ٹشو پر سطحی طور پر خشک کر دیا گیا تھا، اس سے پہلے کہ اسے پلاسٹک کی ’’کلنگ فلم‘‘ یا پیرا فلم میں لپیٹ دیا جائے، تاکہ اسکیننگ کے دوران خشک ہونے سے بچا جا سکے۔ ہر پلاسٹک سے لپٹی ہوئی ہڈی کو پلاسٹک/پولیسٹیرین فوم ٹیوبوں میں رکھا گیا تھا جنہیں 1076 سکینر کے نمونے کے چیمبر میں عمودی طور پر افقی طور پر نصب کیا گیا تھا۔
مائیکرو سی ٹی امیجنگ۔ اسکیننگ 100 kV سورس وولٹیج اور 140 mA سورس کرنٹ کے ساتھ 35 ملی میٹر ریزولوشن کے ساتھ کی گئی۔
فیمر کی ٹریبیکولر ہڈیوں کے تین جہتی ماڈلز کو SkyScan CT تجزیہ کار ورژن 1.11 کا استعمال کرتے ہوئے دوبارہ بنایا گیا تھا۔ ساختی پیرامیٹرز جیسے ٹریبیکولر بون منرل ڈینسٹی (BMD, g/cm3)، ہڈیوں کا حجم (BV)/ٹشو والیوم (TV)، فیصد، موٹائی (Tb.Th، mm)، علیحدگی (Tb.Sp) ، mm)، اور نمبر (Tb.N، 1/mm) پھر ماپا گیا۔
Osteogenic Differentiation and Mineralization Assay بون میرو سیلز جو کہ {{{{10}}}} ویل کلچر پلیٹوں میں کلچر کیے گئے تھے ان کا علاج DAG (10 nM dexamethasone، 50 mM ascorbic acid، اور 20 mM b-glycerophosphate) سے کیا گیا تھا۔ 10 ایم ایم ایکٹیوسائیڈ کی موجودگی۔ تفریق کے 2 ہفتوں کے بعد، خلیات کو 1 گھنٹہ کے لیے آئس کولڈ 70 فیصد (والیوم/ والیوم) ایتھنول کے ساتھ طے کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ کے لیے آست پانی میں 0.2 فیصد ایلیزارین ریڈ ایس کے ساتھ داغ دیا گیا۔ خلیات کو ٹھکانے لگانے اور ہوا سے خشک ہونے کے بعد، سیل کلچر پلیٹوں کو الٹی مائکروسکوپ (Nikon TS100، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے ہلکی مائکروسکوپی کے ذریعے جانچا گیا۔ سرخ رنگ کی مقدار کا تعین کرنے کے لیے، داغ کو 20 منٹ تک ہلاتے ہوئے 10 فیصد ایسٹیل پائریڈینیم کلورائیڈ کے ساتھ مٹا دیا گیا اور جاذبیت کی پیمائش 560 nm کی گئی۔ سیل کی تہوں میں جمع ہونے والے کیلشیم کی مقدار کو بھی مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق کیلشیم سی کٹ (واکو کیمیکل انکارپوریٹڈ اوساکا، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے ناپا گیا۔ اس کے علاوہ، ہڈی کے مخصوص mRNA مارکروں کا اظہار، جیسے رنٹ سے متعلق ٹرانسکرپشن فیکٹر-2 (Runx2)، اوسٹرکس، بون سیالوپروٹین (BSP)، اور OC کا تعین ریئل ٹائم RT-PCR کے ذریعے کیا گیا تھا۔ ان مارکروں کے Oligonucleotide پرائمر کو پرائمر ایکسپریس سافٹ ویئر 3.0 (Applied Biosystems) کا استعمال کرتے ہوئے 200 bp سے کم پروڈکٹ سائز کے ساتھ ڈیزائن کیا گیا تھا جیسا کہ کہیں اور بیان کیا گیا ہے [27]۔
cistanche acteoside ہڈیوں کی تشکیل کو بڑھاتا ہے۔
نتائج
ایکٹیوسائیڈ خوراک پر منحصر انداز میں میکروفیجز کے ذریعہ آسٹیو کلاسسٹ کی تشکیل کو روکتا ہے
آسٹیو کلاسٹس میں BMM کی تفریق پر ایکٹیوسائیڈ کے اثر کی تصدیق کرنے کے لیے، خلیات کو 50 ng/ml M- CSF اور 100 ng/ml کی موجودگی میں 7 دن تک ایکٹیوسائیڈ کے مختلف ارتکاز (0– 20 mM) کے ساتھ کلچر کیا گیا۔ RANKL ایکٹیوسائیڈ نے خوراک پر منحصر انداز میں آسٹیو کلاسٹس کی تعداد کو کم کیا۔ جب خلیات کو 2 گھنٹے کے لیے 10 ایم ایم ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ پریٹریٹ کیا گیا تو، M-CSF اور RANKL (تصویر 1A) کے ساتھ اضافی خلیوں کے مقابلے آسٹیو کلاس کی تعداد میں 43 فیصد کمی واقع ہوئی۔ تصویر 1B RANKL-ثالثی آسٹیو کلاس تفریق اور ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ مشترکہ علاج کے ذریعے اس کی روک تھام کو ظاہر کرتا ہے۔ اس نتیجے کے مطابق، ایکٹیوسائیڈ پریٹریٹمنٹ نے RAW264.7 خلیات اور اوسٹیو کلاس کی تشکیل (تصویر 1C اور D) کے RANKL-متحرک تفریق کو کم کیا۔ جب BMMs پر ایکٹیوسائیڈ کی اینٹی آسٹیو کلاسک صلاحیت کا ایک ہی ارتکاز (10 ایم ایم) میں متعدد فینولک مرکبات کی اینٹی آسٹیو کلاسک صلاحیتوں سے موازنہ کیا گیا تو، لیوٹولن نے سب سے زیادہ سرگرمی دکھائی (تصویر 2A)۔ تاہم، luteolin، quercetin، یا apigenin نے خود خلیات کی عملداری کو کم کیا (تصویر 2B)۔ تمام مرکبات نے RAW264.7 میکروفیجز کے ذریعہ درج ذیل رشتہ دارانہ سرگرمیوں کے ساتھ آسٹیو کلاسٹک تفریق کو روکا: luteolin۔ quercetin=apigenin .
Cistanche acteoside Osteoclast کو روکتا ہے۔
