Tlr8 اور اس کے Endogenous Ligand MiR-21 کے درمیان تعامل کے ذریعے پوڈوسائٹ کی چوٹ رکاوٹ اور اس کے کولیٹرل گردے میں

رابطہ:joanna.jia@wecistanche.com/ واٹس ایپ: 008618081934791

cistanche erectile dysfunction گردے سے متعلق

اگرچہ گردے کی دائمی بیماری بالغوں میں پائی جاتی ہے، لیکن نوجوان اور بوڑھے دونوں مریضوں میں رکاوٹ نیفروپیتھی (ON) کی اطلاع ملی ہے۔ ON میں، tubulointerstitial گھاووں (TILs) کی وسیع پیمانے پر چھان بین کی گئی ہے، لیکن glomerular گھاووں (GLs) کو بڑی حد تک نظرانداز کیا گیا ہے۔ یہاں، ہم نوجوان اور بوڑھے چوہوں میں ON میں GL کی ترقی کے تحت ایک نیا طریقہ کار دکھاتے ہیں۔ TILs GLs سے پہلے تیار ہوتے ہیں جس کی وجہ tubulointerstitium میں سوزش والے خلیوں کی دراندازی ہوتی ہے، لیکن GLs کی نشوونما ٹول نما رسیپٹر 8 (Tlr8) کے ایکٹیویشن کے بعد ہوتی ہے حالانکہ گلوومیرولس میں دراندازی کرنے والے سوزشی خلیوں کی عدم موجودگی۔ TLR8 اور interleukin 1 beta (IL1b) پروٹینز پوڈو سائیٹ فنکشن مارکرز (PFMs) کو کم کرنے کے ساتھ جمع ہوتے ہیں، جو زخمی پوڈوسیٹس میں TLR8 سگنلنگ کو چالو کرنے کی نشاندہی کرتے ہیں۔ مزید برآں، ٹی ایل آر 8 کے لیے ایک اینڈوجینس لیگنڈ miR-21 کے گلوومیرولر اور سیرم لیولز شیم کنٹرول کے مقابلے ON ماؤس ماڈل میں زیادہ تھے۔ Tlr8 کا گلومیرولر اظہار مثبت طور پر miR-21 اور ڈاؤن اسٹریم سائٹوکائنز Il1b اور Il6 کے ساتھ اور منفی طور پر PFMs (Nphs1 اور Synpo) کے ساتھ تعلق رکھتا ہے۔ ہم TLR8 اور IL1b پروٹین کی اجتماعی شکل بھی دکھاتے ہیں جس میں PFMs کو کم کرنے کے ساتھ رکاوٹ اور دونوں میںضمانتگردےجوان اور بوڑھے چوہوں کا۔ مزید برآں، وٹرو مطالعہ کے نتائج میں Tlr8 کے اعلی اظہار اور گلوومیرولی میں اس کے بہاو والی سائٹوکائنز کا انکشاف ہواگردےکنٹرول کے مقابلے miR- 21 mimic کے ساتھ مندرجہ ذیل علاج۔ آخر میں، Tlr8 کا اوور ایکسپریشن پوڈوسیٹ انجری کے ذریعے ON میں GL کی نشوونما کے لیے ایک قابل عمل طریقہ کار کے طور پر کام کر سکتا ہے۔

مطلوبہ الفاظ: گردے کی دائمی بیماری،رکاوٹی نیفروپیتھی، پوڈوسیٹ، TLR8، رکاوٹ اور کولیٹرل کڈنی

تعارف

دائمی گردے کی بیماری (CKD)صحت عامہ کی ایک بڑی تشویش، عام آبادی کے 8 فیصد -13 فیصد میں پائی جاتی ہے (1)۔ یہ بوڑھے معاشرے کی وجہ سے بوڑھے لوگوں میں کثرت سے ہوتا ہے۔ Obstructive nephropathy (ON) معالجین کے لیے بہت دلچسپی کا باعث ہے، جیسا کہ مختلف عمر کے مریضوں میں اس کی اطلاع دی گئی ہے۔ ON قابل علاج اور الٹنے والا ہے، دوسرے CKDs کے برعکس (2, 3)۔ بچوں میں، یہ 1500 نوجوانوں میں سے کسی ایک میں پایا جاتا ہے، اور ترقی یافتہ ممالک میں اس کا پھیلاؤ 1 فیصد –5 فیصد تک ہے (4,5)۔ بالغوں میں، ON کا پھیلاؤ 1000 میں 5 سے 10000 افراد میں 5 تک ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، دائمی یکطرفہ ON کا پھیلاؤ تقریباً 0.5 فیصد ہے، جبکہ شدید یکطرفہ اور دائمی دو طرفہ ON کا پھیلاؤ تقریباً 0.1 فیصد (4–7) ہے۔

ON شدید گردے کی چوٹ یا CKD کا باعث بن سکتا ہے، جس میں گردوں کے فنکشن میں بتدریج کمی اور 3 ماہ سے زیادہ عرصے تک گردوں کے ڈھانچے میں تبدیلیاں شامل ہیں (8, 9)۔ یکطرفہ ureteral obstruction (UUO) دائمی آن کا مطالعہ کرنے کے لیے وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والی حکمت عملی ہے۔ UUO گردے میں ON کی خصوصیت ہائپر ٹرافی، ہائیڈروونفروسس، بیچوالا علاقے میں سوزش والے خلیوں کی بھرتی، ہائپوکسیا سے نلی نما خلیات کی موت، اور ٹیوبولوئنٹرسٹیٹیئم میں کولیجن کا جمع ہونا، جس کے بعد ٹیوبلوانٹرسٹیشل فائبروسس (TF) کی نشوونما ہوتی ہے۔

TF آخری مرحلے کے گردوں کی بیماری کی ایک اہم خصوصیت ہے اور ترقی پسند گردوں کی چوٹ کا ایک اہم عامل ہے (11)۔ ON ماڈلز میں TF کی بڑے پیمانے پر چھان بین کی گئی ہے، لیکن گلوومیرولر چوٹ، خاص طور پر خون پیشاب کی رکاوٹ (BUB) کی اسامانیتاوں سے متعلق ڈیٹا بہت کم ہیں (8, 9, 12)۔ مزید، مطالعات نے یکطرفہ ON میں کولیٹرل گردے میں ٹیوبلو انٹرسٹیشل گھاووں (TILs) کی تحقیقات کی ہیں، لیکن گلومیرولر گھاووں (GLs) کو بڑی حد تک نظرانداز کیا گیا ہے (12)۔ متعدد رپورٹس نے تجرباتی آن (13، 14) میں TILs کی ترقی میں پیریٹیوبلر کیپلیریوں کی شمولیت کا انکشاف کیا ہے۔ تاہم، گلوومیرولس اور گلوومیرولر کیپلیری بالترتیب نیفران اور پیریٹیوبلر کیپلیریوں کے نلی نما حصوں میں نکل جاتی ہے۔ لہذا، ہم تجویز کرتے ہیں کہ گلوومیرولونفرائٹس ٹیوبولوئنٹرسٹیٹیم کو بھی متاثر کر سکتا ہے۔ ہمارے پچھلے مطالعات نے مختلف ٹول نما رسیپٹرز (TLRs) (15-18) کے زیادہ اظہار کی وجہ سے GL میں گلوومیرولر اندرونی خلیوں، بنیادی طور پر پوڈوسیٹس، کو چوٹ کی شراکت اور آٹومیمون بیماری کے ماؤس ماڈل میں اس کے نتیجے میں TIL کی نشوونما پر روشنی ڈالی ہے۔

گلومیرولر کیپلیری اینڈوتھیلیم اور پوڈوکیٹس BUBs پر مشتمل اہم دربان ہیں۔ ان دو اپیتھیلیا کے درمیان، پوڈوسائٹس مسلسل خطرے کے اشاروں کے سامنے آتے ہیں، بشمول TLR ligands جیسے خطرے سے وابستہ مالیکیولر پیٹرن (DAMPs) یا پیتھوجین سے وابستہ مالیکیولر پیٹرن (PAMPs)، گلوومیرولی (15) میں ان کی منفرد لوکلائزیشن کی وجہ سے۔ لہذا، پوڈوسیٹس میں TLRs اور ان کے endogenous ligands کے درمیان تعامل غیر متعدی حالات میں پوڈوسیٹ کی چوٹ میں حصہ ڈالنے کے بارے میں سوچا جاتا ہے۔ موجودہ مطالعہ میں، ہم نے نوجوان اور بوڑھے چوہوں کے دونوں رکاوٹوں والے اور کولیٹرل گردوں میں GL کی نشوونما پر توجہ مرکوز کی، جیسا کہ ON اکثر جوان اور بوڑھے دونوں انسانوں میں پایا جاتا ہے۔ ہم نے واضح کیا کہ جوان اور بوڑھے چوہوں کے دونوں روکے ہوئے اور کولیٹرل گردوں سے پوڈوسیٹس میں Tlr8 کے اوور ایکسپریشن کے ذریعے پوڈوسیٹ چوٹ کی وجہ سے GL کو آن میں تیار کیا گیا تھا۔

مواد اور طریقے

اخلاقی بیان اور تجرباتی جانوروں کی رہائش لیبارٹری جانوروں کا استعمال کرتے ہوئے تمام تجربات کو انسٹیٹیوشنل اینیمل کیئر اینڈ یوز کمیٹی آف ویٹرنری میڈیسن، ہوکائیڈو یونیورسٹی (منظوری نمبر 16- 0124) کی طرف سے منظور کیا گیا تھا۔ مصنفین نے ہوکائیڈو یونیورسٹی کے لیبارٹری جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کے لیے منظور شدہ گائیڈ کی پیروی کی، فیکلٹی آف ویٹرنری میڈیسن (ایسوسی ایشن فار اسسمنٹ اینڈ ایکریڈیشن آف لیبارٹری اینیمل کیئر انٹرنیشنل کی طرف سے منظور شدہ)۔ چھ ہفتے پرانے C57BL/6N چوہوں کو جاپان SLC Inc. (Hamamatsu, Japan) سے خریدا گیا تھا اور 1:1 ہلکے تاریک ماحول میں مخصوص روگزن سے پاک حالات میں برقرار رکھا گیا تھا۔ تجرباتی جانوروں کو اشتہاری خوراک اور پینے کا پانی فراہم کیا گیا تھا۔

تجرباتی ڈیزائن ہم نے جوان (9 ہفتے) اور بوڑھے (12 ماہ) دونوں چوہوں کا استعمال کیا۔ ہر عمر گروپ (n=4) کے چوہوں کو ایک آن ماڈل گردہ قائم کرنے کے لیے یا تو شیم آپریشن (کنٹرول گروپ) یا UUO (2، 7، 11، اور 21 دن) کا نشانہ بنایا گیا، جیسا کہ ہمارے پچھلے مطالعہ میں بیان کیا گیا ہے۔ (13)۔

نمونہ کی تیاری چوہوں کو بے ہوشی کرنے والے ایجنٹوں کے مرکب کے ساتھ گہری بے ہوشی کی گئی تھی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (16) اور گریوا کی سندچیوتی کے ذریعہ euthanized۔ خون کے نمونے فیمورل شریان کے ذریعے سیرم مارکر تجزیہ کے لیے جمع کیے گئے تھے۔ دونوں UUO اور کولیٹرل گردے اکٹھے کیے گئے اور پتلی ٹکڑوں میں کاٹے گئے۔ ہسٹوپیتھولوجیکل، امیونو ہسٹو کیمیکل اور الیکٹران مائیکروسکوپی اسٹڈیز کے لیے بالترتیب 10 فیصد نیوٹرل بفر فارمیلین (NBF)، 4 فیصد پیرافارمیلڈہائیڈ (PFA) اور 2.5 فیصد گلوٹرالڈہائیڈ (GTA) کے ساتھ گردے کے ٹکڑوں کو طے کیا گیا تھا۔

امیونو ہسٹو کیمسٹری اور امیونوفل فلوروسینس NBF فکسڈ پیرافین بلاکس کو 2 ملی میٹر موٹائی پر کاٹا گیا اور رینل ہسٹوپیتھولوجی کی جانچ کرنے کے لیے متواتر ایسڈ Schiff-hematoxylin (PAS-H) سے داغ دیا گیا۔ سیلولر مارکروں کی امیونو ڈیٹیکشن کی گئی تھی جیسا کہ پہلے بتایا گیا تھا (16) B خلیات (B220)، T خلیات (CD3)، کیپلیری اینڈوتھیلیم (CD31)، IL1b، میکروفیجز (Iba1)، پوڈوکیٹس (podocin اور synaptopodin)، اور TLR8۔ داغدار ہونے کے حالات ٹیبل 1 میں درج ہیں۔

Histoplanimetry PAS-H اور مدافعتی گردے کے حصوں کو Nano Zoomer 2 کا استعمال کرتے ہوئے ورچوئل سلائیڈز میں تبدیل کیا گیا۔{2}} RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japan)۔ NDP.view2 سافٹ ویئر (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) کا استعمال کرتے ہوئے 400x میگنیفیکیشن پر tubulointerstitium سے تصادفی طور پر منتخب 20 گلومیرولی یا 20 فوکی سے مثبت خلیات کی گنتی کی گئی۔ PAS-H- داغدار حصوں سے 20 گلومیرولی کی تصاویر بھی آل ان ون فلوروسینس مائکروسکوپ BZ-X710 (کینس، اوساکا، جاپان) کا استعمال کرتے ہوئے ہر ماؤس سے 400x پر حاصل کی گئیں۔ BZ-X تجزیہ کار (Keyence) کا استعمال کرتے ہوئے کیپچر کی گئی تصاویر سے گلوومیرولر میسنجیل ایریا اور سائز کی پیمائش کی گئی۔

شرم سے چلنے والے اور UUO گردے سے RNA نکالنے اور ثقافت کے Glomerulus کو الگ تھلگ کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے (16)۔ مختصراً، چوہوں کو 40 ملی لیٹر ہانک کے متوازن نمک کے محلول (HBSS) کے ساتھ بائیں ویںٹرکل کے ذریعے گہرائی سے بے ہوشی کی گئی تھی اور ڈائنابیڈس (8 × 107؛ لائف ٹیکنالوجیز، کارلسباد، CA، USA) کے ساتھ۔ گردہ نکال دیا گیا۔

اور چھوٹے ٹکڑوں میں کاٹا. اس کے بعد خلیات کو کولیجینیز A (1 mg/mL؛ Roche، Basel، Switzerland) اور deoxyribonuclease I (100 U/ml؛ Life Technologies) کے ساتھ HBSS میں 37 ڈگری پر 30 منٹ تک ہضم کیا گیا۔ ہضم شدہ بافتوں پر مشتمل معطلی کو چپٹے ہوئے موسل کا استعمال کرتے ہوئے 100-mm سیل سٹرینر (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) کے ذریعے آہستہ سے دبایا گیا۔ نتیجے میں سیل معطلی کو 5 منٹ کے لئے 200 ×g پر سینٹرفیوج کیا گیا تھا ، اور سیل گولی کو HBSS کے 2 ملی لیٹر میں دوبارہ معطل کردیا گیا تھا۔ ڈائنابیڈس پر مشتمل گلومیرولی کو مقناطیسی پارٹیکل کنسنٹریٹر (لائف ٹیکنالوجیز) کا استعمال کرتے ہوئے اکٹھا کیا گیا تھا اور اسے RNA تنہائی کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔

ریورس ٹرانسکرپشن اور ریئل ٹائم پی سی آرکل RNA کو RNeasy کٹ (کیجین، ہلڈن، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے گلوومیرولی سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ سی ڈی این اے کو ریورٹرا ایس ریورس ٹرانسکرپٹیس انزائم (ٹویوبو، اوساکا، جاپان) اور بے ترتیب ڈی ٹی پرائمر (پرومیگا) کا استعمال کرتے ہوئے ریورس ٹرانسکرپشن کے ذریعہ کل آر این اے سے ترکیب کیا گیا تھا۔ سی ڈی این اے کو ریئل ٹائم پی سی آر میں شاندار III SYBR گرین QPCR ماسٹر مکس اور Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA) کے ساتھ استعمال کیا گیا تھا۔ گلومیرولر جین کے اظہار کو Actb کے اظہار میں معمول بنایا گیا تھا۔ استعمال شدہ پرائمر جوڑے ٹیبل 2 میں دکھائے گئے ہیں۔

ریورس ٹرانسکرپشن اور تقمان پر مبنی ریئل ٹائم پی سی آرالگ تھلگ گلوومیرولی میں مائکرو آر این اے (miRNA) سمیت کل RNA کو miRNeasy کٹ (کیجین) کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔ miRNA مخصوص اسٹیم لوپ RT پرائمر، ریورس ٹرانسکرپٹیس، ریورس ٹرانسکرپشن بفر، dNTPs، اور RNase inhibitor کا استعمال مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق کل RNA کو ریورس کرنے کے لیے کیا گیا تھا (اپلائیڈ بایو سسٹم، فوسٹر سٹی، CA، USA)۔ ریئل ٹائم پی سی آر کو miR-21- مخصوص TaqMan پرائمر اور مخصوص پروبس (Applied Biosystems) TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Bio Systems) اور Mx3000P (Agilent Technologies) کا استعمال کرتے ہوئے نتیجے میں cDNA کے ساتھ انجام دیا گیا۔

Mimics کے ساتھ الگ تھلگ گلومیرولی کا وٹرو علاجگلومیرولی کو شیم سے چلنے والے اور UUO سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔گردے11 دن کی رکاوٹ کے بعد۔ Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) میڈیم (Fujifilm Wako, Japan) جس میں 300 glomeruli پر مشتمل تھا ایک 96-وییل کلچر پلیٹ (TPP, Trasadingen, Switzerland) کے ہر کنویں میں تقسیم کیا گیا تھا اور PBS، منفی کنٹرول، اور miR-21 mimic (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, South Korea) کے ساتھ 1 pmol/ µL پر 5 فیصد CO2 میں 37 ڈگری پر 4 گھنٹے کے لیے علاج کیا جاتا ہے۔ Tlr8 اور اس کے بہاو والی سائٹوکائنز کے اظہار کی پیمائش کی گئی تھی جیسا کہ پچھلے حصے میں بیان کیا گیا ہے۔

الیکٹران مائکروسکوپی اسکین کرنامعمول کی اسکیننگ الیکٹران مائکروسکوپی (SEM) کے لیے، چھوٹاگردہ سلائسیں4 گھنٹے کے لیے 2.5 فیصد جی ٹی اے کے ساتھ اور 1 گھنٹے کے لیے 1 فیصد اوسمیم ٹیٹرو آکسائیڈ کے ساتھ بعد میں طے کیا گیا، اس کے بعد 1 گھنٹے کے لیے 1 فیصد ٹینک ایسڈ کے ساتھ علاج کیا گیا۔ اس کے بعد نمونوں کو 1 فیصد اوسمیم ٹیٹرو آکسائیڈ کے ساتھ 1 گھنٹے کے لیے طے کیا گیا اور بالترتیب 10 منٹ اور 1 گھنٹے کے لیے 0.5 فیصد اور 1 فیصد ٹینک ایسڈ کے ساتھ علاج کیا گیا۔گردہسلائسیںالکحل کے بڑھتے ہوئے درجات کے ساتھ پانی کی کمی کی گئی، 3-میتھائل بائٹل ایسیٹیٹ میں منتقل کی گئی، اور آخر میں ایک HCP-2 اہم پوائنٹ ڈرائر (ہٹاچی، ٹوکیو، جاپان) کے ساتھ خشک کیا گیا۔ نمونوں کو آئن سپٹرنگ کا نشانہ بنایا گیا اور پھر 12 kV کے تیز وولٹیج پر S-4100 سکیننگ الیکٹران مائکروسکوپ کے تحت جانچا گیا۔

شماریاتی تجزیہاقدار کو اوسط ± معیاری غلطی (se) کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔ نتائج کا شماریاتی طور پر ایک نان پیرامیٹرک مان – وٹنی یو-ٹیسٹ (P < 005)="" کا="" استعمال="" کرتے="" ہوئے="" تجزیہ="" کیا="" گیا۔="" کرسکل="" والس="" ٹیسٹ="" کا="" استعمال="" تین="" یا="" اس="" سے="" زیادہ="" آبادیوں="" کا="" موازنہ="" کرنے="" کے="" لیے="" کیا="" گیا="" تھا،="" اور="" ایک="" بار="" اہم="" فرق="" دیکھنے="" کے="" بعد="" شیفے="" کے="" طریقہ="" کار="" کا="" استعمال="" کرتے="" ہوئے="" متعدد="" موازنہ="" کیے="" گئے="" تھے="" (p="">< 0.05)۔="" دو="" پیرامیٹرز="" کے="" درمیان="" ارتباط="" کا="" تجزیہ="" اسپیئر="" مین="" کے="" درجہ="" کے="" ارتباط="" کے="" قابلیت="" ٹیسٹ="" (p=""><0.05) کا="" استعمال="" کرتے="" ہوئے="" کیا="">

نتائج

نوجوان چوہوں کے روکے ہوئے گردوں میں TILs اور GLsہم نے سب سے پہلے TILs اور GLs کا معائنہ کیا جو نوجوان چوہوں کے شیم سے چلنے والے اور UUO گردوں میں مختلف اوقات کے لیے رکاوٹ کا شکار تھے۔ جب کہ شیم سے چلنے والے گردے نارمل tubulointerstitium (شکل 1A) دکھاتے ہیں، UUO کے 2 دن کے بعد رکے ہوئے گردے TILs دکھاتے ہیں اور نلیوں کے پھیلاؤ کی وجہ سے نمایاں تھے۔ کچھ نلیوں میں پیشاب کی نالی بھی ہوتی ہے۔ اس طرح کے گھاووں میں رکاوٹ کی ترقی کے ساتھ اضافہ ہوا (شکل 1A)۔ GLs، بنیادی طور پر glomerulosclerosis، UUO کے بعد 21 دن کے آخری مرحلے میں دیکھے گئے اور متواتر ایسڈ-Schiff (PAS) -مثبت مواد کے جمع ہونے سے نمایاں ہوئے۔ شام اور ابتدائی UUO گردوں (2، 7، اور 11 دن) دونوں میں گلوومیرولر ڈھانچہ نارمل تھا (شکل 1B)۔ UUO گردے (شکل 1C) میں رکاوٹ کے بعد گلوومرولر خلیوں کی تعداد میں دن -11 تک اضافہ ہوا اور دن -21 میں کمی کا رجحان رہا۔ گلومیرولر میسنجیل جمع میں رکاوٹ کے بعد 7 دن سے اضافہ ہوا تھا (شکل 1D)۔

رکاوٹ (شکل 1F) کے بعد 21 دن میں UUO گردوں کے گلومیرولی کے مرکز میں غیر حاضر تھا۔ پولیمریز چین کے رد عمل نے UUO گردوں میں PFMs (Nphs1 اور Synpo) میں رکاوٹ کے 21 دن بعد نمایاں کمی کا انکشاف کیا (شکل 1G)۔ مزید برآں، SEM کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ شرم سے چلنے والے گردوں میں نارمل پوڈوسیٹ فٹ پروسیس (PFPs)۔ تاہم، UUO گردوں میں PFP کی افزائش اور مائیکروویلس نما ڈھانچے کی اطلاع رکاوٹ کے 21 دن بعد ہوئی تھی (شکل 1H)۔ ایک ساتھ، یہ نتائج رکاوٹ کے 21 دن بعد رکاوٹ گردے میں پوڈوسیٹ کی چوٹ کی موجودگی کی تجویز کرتے ہیں۔

انففلٹریٹنگ مدافعتی خلیات رکاوٹ گردے میں غائب ہیں ہم نے پہلے دکھایا ہے کہ پوڈوسیٹ کی چوٹ گلومیرولس (13, 16, 18) میں انفیفلٹریٹنگ مدافعتی خلیوں سے تعلق رکھتی ہے۔ لہذا، ہم نے B- اور T-خلیات کی دراندازی کے ساتھ ساتھ TILs اور GLs میں شمع سے چلنے والے اور UUO گردوں (شکل 2) میں میکروفیجز کی جانچ کی۔ رکاوٹ کے بعد تمام دنوں میں UUO گردوں کے TILs میں متعدد infiltrating B-، T-cells اور macrophages دیکھے گئے، لیکن وہ شام اور UUO دونوں گردوں کے گلومیرولی میں تقریباً غائب تھے یا کم تھے (اعداد و شمار 2A–E)۔ گلوومیرولس میں بی، ٹی سیلز اور میکروفیجز کی تعداد بہت کم تھی (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا) لیکن اس میں نمایاں طور پر زیادہ ہے۔

شام گردے کے مقابلے میں 2-، 7-، 11-، اور 21- دن کے گردے کا ٹیوبلوئنٹرسٹیٹیم (شکل 2F)۔ لہٰذا، مدافعتی خلیوں میں گھسنا رکاوٹ گردے میں TILs کی نشوونما میں معاون ثابت ہو سکتا ہے۔ تاہم، دیگر عوامل GL کی ترقی سے متعلق ہو سکتے ہیں۔

TLR فیملی کے مختلف ممبران کے اظہار اور نوجوان چوہوں کے شمع سے چلنے والے اور رکاوٹ شدہ گردے میں ڈاؤن اسٹریم سائٹوکائنز کا اظہار پچھلے مطالعات میں بیمار گردے کے پوڈوسائٹس میں مختلف TLRs کے اعلی اظہار کا انکشاف ہوا ہے (15, 16, 19, 20)۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ ہمارے ڈیٹا نے UUO 21- دن کے گروپ سے الگ تھلگ گلومیرولی میں Tlr8 اور Tlr9 کا نمایاں طور پر اعلی اظہار ظاہر کیا ہے جو شم گروپ کے گلومیرولی (شکل 3A) کے مقابلے میں ہے۔ مزید برآں، ہم نے شام اور UUO 21- دن کے گروپوں سے گلوومیرولی میں TLR خاندان کے افراد کے بہاو والے سائٹوکائنز کے اظہار کی جانچ کی اور انٹلییوکن 1 بیٹا (Il1b) اور انٹرلییوکن 6 دونوں کو انکوڈنگ کرنے والے جینوں کے اظہار میں نمایاں اپ گریجشن پایا۔ (Il6) UUO گروپ میں شام گروپ کے مقابلے میں (شکل 3B)۔

TLR8 کو PFM کے ساتھ لوکلائز کیا گیا چونکہ Tlr8 اور Tlr9 کا اظہار رکاوٹ گردے سے الگ تھلگ گلومیرولی میں زیادہ تھا، ہم نے امیونو فلوروسینس سٹیننگ کے ذریعے ان کے لوکلائزیشن کی جانچ کی۔ TLR8 پروٹین کا پتہ شمع سے چلنے والے گردے (شکل 4A) میں نہیں پایا گیا تھا لیکن UUO گردے (شکل 4B) میں PFM synaptopodin کے ساتھ جمع کیا گیا تھا۔ مزید برآں، ہم گردے میں TLR9 پروٹین ایکسپریشن کا پتہ لگانے میں ناکام رہے یا تو دھوکہ سے چلنے والے یا UUO چوہوں سے (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔

نوجوان چوہوں کے روکے ہوئے گردے میں پوڈوکیٹس سے IL1b کی پیداوار جیسا کہ شکل 3B میں دکھایا گیا ہے، glomerular Il1b (TLR خاندان کی ایک نیچے کی طرف سائٹوکائن) کا اظہار UUO گردے میں شمع گردے کے مقابلے میں 21 دنوں میں نمایاں طور پر زیادہ تھا۔ لہذا، ہم نے امیونو فلوروسینس سٹیننگ کے ذریعہ UUO گردوں کے گلومیرولی میں IL1b کے ماخذ کی جانچ کی۔ IL1b پروٹین کا اظہار شمع گردوں کے گلوومیرولی میں نہیں پایا گیا تھا لیکن UUO گردوں (اعداد و شمار 4C، D) کے گلومیرولی میں دیکھا گیا تھا۔ مزید برآں، IL1b کو PFM پوڈوسن (شکل 4D) کے ساتھ جمع کیا گیا۔

UUO میںگردہشام میں اس سے 21 دن میںگردہ.لہذا، ہم نے امیونو فلوروسینس سٹیننگ کے ذریعہ UUO گردوں کے گلومیرولی میں IL1b کے ماخذ کی جانچ کی۔ شم کے گلوومیرولی میں IL1b پروٹین ایکسپریشن کا پتہ نہیں چلاگردےلیکن UUO کے گلوومیرولی میں دیکھا گیا۔گردے(اعداد و شمار 4C، D)۔ مزید برآں، IL1b کو PFM پوڈوسن (شکل 4D) کے ساتھ جمع کیا گیا۔

ON ماڈل چوہوں میں Putative Endogenous Tlr8 Ligand کی بڑھتی ہوئی سطح ایک پچھلی تحقیق سے پتہ چلتا ہے کہ miR-21 TLR8 (21) کے لیے ایک ligand کے طور پر کام کرتا ہے۔ لہذا، ہم نے شام اور UUO 21- دن کے گروپوں کے درمیان miR-21 کے گلوومیرولر اور سیرم کی سطح دونوں کا موازنہ کیا۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ UUO 21- دن کے گروپ نے شم گروپ (P < 0.05)="" کے="" مقابلے="" میں="" گلومیرولر="" mir-21="" کی="" نمایاں="" طور="" پر="" اعلی="" سطح="" ظاہر="" کی،="" تاہم،="" سیرم="" mir="" کا="" بڑھتا="" ہوا="" رجحان-21="" {10}}="" کو="" مؤخر="" الذکر="" (p="0.06)" (شکل="" 4e)="" کے="" مقابلے="" سابقہ="" ​​گروپ="" میں="" دیکھا="">

Tlr8 اظہار کا تعلق اس کے Ligand miR-21 اور PFMs کے ساتھ رکاوٹ میںگردہجیسا کہ جدول 3 میں دکھایا گیا ہے، ہم نے Tlr8 mRNA اور اس کے endogenous ligand (miR-21) کے ساتھ ساتھ ڈاؤن اسٹریم سائٹوکائنز Il1b اور Il6 کے گلوومیرولر اظہار کے درمیان ایک اہم مثبت ارتباط کا مشاہدہ کیا۔ دوسری طرف، Tlr8 mRNA اور PFMs Nphs1 اور Synpo کے درمیان ایک منفی ارتباط واضح تھا۔

miR{{0}} کے ساتھ Glomeruli کی Vitro Stimulation in Mimic Tlr8 اور اس کے ڈاؤن اسٹریم سائٹوکائنز کے اظہار کو متحرک کرتا ہے Tlr8 کے اظہار میں اضافہ ہوتا ہے (P=0۔{8}}6) لیکن اس کی بہاو والی سائٹوکائنز (Ifng اور Il1b) نمایاں طور پر (P <0.05 اور 0.01) میں مندرجہ ذیل شیم چوہوں کے گلومیرولی میں اضافہ ہوا

miR-21 mimic کے ساتھ علاج PBS اور منفی کنٹرول مِمک (شکل 5A) کے ساتھ علاج کیے جانے والے چوہوں کے گلومیرولی کے مقابلے میں۔ تاہم، مشابہت کے ساتھ علاج کے بعد شم چوہوں کے گلوومیرولی میں Tlr8 اور اس کے بہاو والی سائٹوکائنز کے اظہار کے درمیان کوئی خاص ارتباط نہیں دیکھا گیا (ٹیبل 4)۔ Tlr8 اور اس کے بہاو والی سائٹوکائنز کا اظہار UUO کے گلوومیرولی میں نمایاں طور پر زیادہ تھا۔گردے, miR-21 کے ساتھ علاج کے بعد UUO کے گلوومیرولی کے مقابلے میں نقلگردےPBS اور منفی کنٹرول مِمِک (شکل 5B) کے ساتھ علاج کیا جاتا ہے۔ Tlr8 کے اظہار اور UUO گردے کے گلوومیرولی میں اس کے بہاو والی سائٹوکائنز کے درمیان نقلی علاج کے بعد ایک اہم ارتباط کا پتہ چلا، جو Tlr8-ثالثی والے جوہری عنصر کاپا B (NF-kB) راستے کی اعلی سرگرمی کا اشارہ ہے اور روکے ہوئے گردے میں proinflammatory cytokines کا سراو (ٹیبل 4)۔

نوجوان چوہوں کے کولیٹرل گردوں میں TLR8 لوکلائزیشن اور پوڈوکیٹ انجریشیم سے چلنے والے گردے نارمل گلوومیرولس دکھاتے ہیں، جب کہ کولیٹرل گردے میں گلوومیرولر ہائپر ٹرافی، گلومیرولر سیل نمبر میں اضافہ، اور گلومیریلر کیپلیریوں کا پھیلاؤ (شکل 6A) تھا۔ شام سے چلنے والے گردوں سے گلومیرولی Synaptopodin اظہار کے لیے مثبت تھے اور TLR8 اظہار کی کمی تھی (شکل 6B)۔ دوسری طرف، کولیٹرل گردے نے گلوومیرولی کے مرکز میں Synaptopodin اظہار کھو دیا لیکن گلومیرولر ریٹ (شکل 6C) کے ساتھ TLR8 اظہار دکھایا۔ مزید یہ کہ TLR8 پروٹین کو Synaptopodin (شکل 6C) کے ساتھ باہم مقامی بنایا گیا تھا۔ شام سے چلنے والے گردوں نے پوڈوسن کا عام اظہار دکھایا لیکن گلومیرولی میں IL1b کا کوئی اظہار نہیں (شکل 6D)۔ تاہم، کولیٹرل گردے کے اندر موجود گلوومیرولی نے مرکز میں پوڈوسن کا اظہار کھو دیا لیکن گلوومیرولر ریٹ (شکل 6E) کے ساتھ IL1b اظہار تھا۔ مزید برآں، IL1b پروٹین کو پوڈوسن (شکل 6E) کے ساتھ اجتماعی شکل دی گئی تھی۔ SEM تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ شرم سے چلنے والے ماؤس کے گردے میں عام PFPs ہیں، لیکن PFP Effacement اور microvillous-like structures colateral kidneys (شکل 6F) میں دکھائی دے رہے تھے۔

TLR8 لوکلائزیشن اور بوڑھے چوہوں کے روکے ہوئے اور کولیٹرل گردوں میں پوڈوکیٹ انجریشام سے چلنے والے گردوں نے Synaptopodin کا ​​معمول کا اظہار دکھایا لیکن ان کے گلومیرولی (شکل 7A) کے اندر TLR8 پروٹین کے لئے کوئی داغ نہ ہونے کا انکشاف کیا۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ کولیٹرل اور UUO دونوں گردوں نے گلومیرولی کے مرکز میں Synaptopodin اظہار کا نقصان ظاہر کیا لیکن گلومیرولر ریٹ (اعداد و شمار 7B، C) کے ساتھ TLR8 اظہار کو برقرار رکھا۔ TLR8 پروٹین کو کولیٹرل اور UUO گردوں (اعداد و شمار 7B، C) میں synaptopodin کے ساتھ اجتماعی شکل دی گئی تھی۔ شام سے چلنے والے گردے بھی اسی طرح نارمل پوڈوسن اظہار دکھاتے ہیں لیکن ان کے گلوومیرولی (شکل 7D) میں کوئی IL1b اظہار نہیں تھا۔ دوسری طرف، دونوں کولیٹرل اور UUO گردوں نے گلومیرولی کے مرکز میں پوڈوسن کا اظہار کھو دیا لیکن گلوومیرولر ریٹ (اعداد و شمار 7E، F) کے ساتھ IL1b اظہار دکھایا۔ کولیٹرل اور UUO گردے (اعداد و شمار 7E، F) کے گلومیرولی میں پوڈوسن کے ساتھ مثبت داغدار پایا گیا تھا۔ SEM امتحان نے پرانے چوہوں کے کولیٹرل اور UUO دونوں گردوں (شکل 7G) میں شرم سے چلنے والے ماؤس کڈنی، پی ایف پی ایفیسیمنٹ، اور مائیکرو ویلس نما ڈھانچے میں عام PFPs کا انکشاف کیا۔

بحثآن

پھیلاؤ نوزائیدہ بچوں کے ساتھ ساتھ عمر رسیدہ افراد (4-7) میں بھی عام ہے۔ لہذا، ہم نے مختلف عمر گروپوں کے افراد کی آن حالت کی نقل کرنے کے لیے نوجوان اور بوڑھے چوہوں کو UUO کے تابع کیا اور TILs اور GLs کی جانچ کی۔ روکے ہوئے گردے میں، TILs کی بڑھوتری رکاوٹ کے پہلے مرحلے میں واضح تھی (2 دن)؛ تاہم، پوڈوسیٹ چوٹ کے ساتھ ساتھ GLs کی ترقی کو بعد کے مرحلے میں دیکھا گیا۔ کولیٹرل گردے نے ایک ہی وقت میں GLs اور پوڈوسیٹ کی چوٹ دکھائی۔ یہ مشاہدہ اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ پوڈوسیٹ کی چوٹ رکاوٹ شدہ اور کولیٹرل گردوں دونوں میں ہوتی ہے، حالانکہ ابتدائی توہین مختلف ہو سکتی ہے۔ ہمارے پچھلے مطالعات نے پوڈوسیٹ کی چوٹ اور گلوومیرولس (13، 16، 18) میں مدافعتی خلیوں کی دراندازی کے مابین ارتباط کو اجاگر کیا ہے۔ تاہم، موجودہ مطالعے میں شمع یا رکاوٹ گردے کے گلوومیرولی میں مدافعتی خلیوں کی دراندازی کا مشاہدہ نہیں کیا گیا۔ لہذا، ہم نے رکاوٹ گردے میں پوڈوسیٹ کی چوٹ میں دیگر عوامل کے ملوث ہونے پر غور کیا۔ ہم نے قیاس کیا کہ خطرے کے اشارے (DAMPs یا PAMPs)، یا تو گردش کی اصل میں سے ہیں یا خراب نلی نما اپیتھیلیم سے پیدا ہونے والے، ON میں پوڈوسیٹ کی چوٹ میں حصہ ڈال سکتے ہیں، کیونکہ گلوومیرولس میں اس کے منفرد مقام کی وجہ سے۔ اہم بات یہ ہے کہ DAMPs اور TLRs کے درمیان تعامل کو غیر متعدی امراض کے روگجنن میں اہم کردار ادا کرنے کے لیے دکھایا گیا ہے (15)۔ TLR خاندان کے مختلف افراد کا اظہار سیل پلازما میمبرین یا انٹرا سیلولر ویسیکلز (22) پر ہوتا ہے اور ان کی خصوصیات پیدائشی مدافعتی سینسر ہیں جو DAMPs یا PAMPs کو مؤثر طریقے سے پہچانتے ہیں۔ متعلقہ DAMPs یا PAMPs کے ذریعے چالو کرنے پر، TLRs نے NF-kB پاتھ وے کے ذریعے نیچے کی دھارے والی سائٹوکائنز کے اظہار کو بڑھایا اور میزبان دفاعی نظام (22) کی حوصلہ افزائی کی۔ مزید برآں، DAMPs ٹشو کی چوٹ کی موجودگی کو مدافعتی خلیوں یا مقامی اندرونی خلیات تک پہنچاتے ہیں، اور نتیجتاً بافتوں کے نقصان کو بڑھاتے ہیں (23-26)۔ اہم بات یہ ہے کہ تمام TLRs NF-kB پاتھ وے کو چالو کرتے ہیں جو سوزش والی سائٹوکائن جینز (27) کی ایک صف کے اظہار کو کنٹرول کرتا ہے۔ اس کے علاوہ، TLRs کی ایکٹیویشن NF-kB کو چالو کرنے کے لیے ان کے بہاو والے راستوں کا اشارہ دیتی ہے، جو سوزش کے لیے ذمہ دار ہے اور خراب ٹشوز (28) کے روگجنن سے منسلک ہے۔ Shichita et al. endogenous ligands اور TLR2 یا TLR4 کے مابین پیتھولوجیکل تعاملات کا انکشاف ہوا ، جو اسکیمک دماغی چوٹ میں حصہ ڈالتے ہیں (25)۔ پچھلے مطالعات نے TLR خاندان کے افراد کی گردے (TLR2, 4, 5, 7, اور 11) اور GLs (TLR1–6, 8, اور 9) (17, 29–33) میں TILs پیدا کرنے کی صلاحیت کا بھی مظاہرہ کیا ہے۔ )۔ موجودہ مطالعہ میں، ہم نے رکاوٹ شدہ اور کولیٹرل گردے میں پوڈوسیٹ کی چوٹ پایا اور واضح کیا کہ

TLR فیملی کے مختلف ممبران کے کردار جو پوڈوسیٹ چوٹ میں حصہ ڈال سکتے ہیں (15, 16, 19, 20)۔ جیسا کہ ہم نے قیاس کیا، Tlr8 اور Tlr9 کا گلوومیرولر اظہار UUO گردے سے الگ تھلگ گلومیرولی میں شمع سے چلنے والے چوہوں کی نسبت زیادہ تھا۔ مزید یہ کہ، NF-kB پاتھ وے سے متعلق سوزش والی سائٹوکائنز کا گلوومیرولر اظہار، بشمول Il1b اور Il6، UUO گردے میں رکاوٹ کے 21 دنوں میں زیادہ تھا۔ لہذا، ہم نے یہ نتیجہ اخذ کیا کہ TLR- ثالثی NF-kB راستہ رکاوٹ گردے میں GL کے روگجنن میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ TLR خاندان کے دیگر ارکان کے برعکس، TLR8 اور TLR9 خلیوں کے اینڈوسومس میں پائے جاتے ہیں۔ TLR8 مائکروجنزموں سے واحد پھنسے ہوئے RNAs اور مختصر ڈبل پھنسے ہوئے RNAs کو پہچانتا ہے اور متعدد NF-kB- ثالثی سائٹوکائنز (22) کی پیداوار کو متحرک کرتا ہے۔ دوسری طرف، TLR9 ڈبل پھنسے ہوئے DNAs کو پہچانتا ہے اور NF-kB راستے کو بہاو سائٹوکائنز (16، 34) پیدا کرنے کے لیے چالو کرتا ہے۔ اس مطالعے میں، ہم نے گلوومیرولی میں PFM synaptopodin کے ساتھ ساتھ TLR8 پروٹین کے اجتماعی عمل کو تسلیم کیا۔ ہمارے پچھلے مطالعات میں یہ بھی دکھایا گیا ہے کہ TLR8 اور TLR9 دونوں PFMs کے ساتھ جمع ہوتے ہیں اور پوڈوسیٹ چوٹ (15، 16) کو دلانے کے لئے NF-kB- ثالثی سوزش والی سائٹوکائن کی پیداوار کو چالو کرتے ہیں۔ مزید برآں، دیگر مطالعات نے TLR- ثالثی راستے اور وٹرو میں پوڈوسیٹ چوٹ کے درمیان پیتھولوجیکل ارتباط ظاہر کیا ہے (34، 35)۔ بناس وغیرہ۔ جی ایل کی نشوونما (35) کے دوران مدافعتی نظام کے ساتھ پوڈوسیٹس میں TLR4 کے تعامل کا انکشاف ہوا۔ اس طرح، پوڈوسائٹس TLR-ثالثی راستوں کے ذریعے مدافعتی نگرانی میں حصہ ڈال سکتے ہیں۔ اس مطالعے میں، ہم نے TLR8 جین کا اظہار اور پروٹین کی لوکلائزیشن کو روکے ہوئے گردے کے پوڈوسیٹس کے ساتھ ساتھ گلوومیرولس میں بہاو والی سائٹوکائنز کا اعلی اظہار دکھایا۔ لہٰذا، ہم یہ نتیجہ اخذ کرتے ہیں کہ TLR8-ثالثی راستے روکے ہوئے گردے میں پوڈوسیٹ کی چوٹ کے ذریعے GL کی نشوونما میں حصہ ڈالتے ہیں۔

پچھلے مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ miR-21، TLR8 کا ایک endogenous ligand، سیلولر اینڈوسوم میں TLR8 تک پہنچ سکتا ہے اور اس کا پابند ہوسکتا ہے، جس میں یہ NFkB کے راستے کی TLR8-ثالثی ایکٹیویشن اور proinflammatory cytokines کے سراو کو آمادہ کر سکتا ہے۔ (21)۔ موجودہ مطالعہ میں، ہم نے UUO گردے میں گلومیرولر miR-21 کی نمایاں طور پر اعلی سطحوں کے ساتھ ساتھ سیرم miR-21 کی بلند سطحوں کو شرم کنٹرول میں رکھنے والوں کے مقابلے میں پایا اور Tlr8 کے گلوومیرولر اظہار کے ساتھ اس کے ارتباط کو ظاہر کیا۔ . دلچسپ بات یہ ہے کہ miR-21 mimic کے ساتھ علاج کیے جانے والے UUO گردوں سے گلومیرولی نے Tlr8 اور اس کے بہاو والی سائٹوکائنز کا زیادہ اظہار دکھایا ہے جو کہ miR-21 mimic کے ساتھ علاج کیے گئے شام چوہوں سے گلومیرولی میں موجود ہیں، جو اینڈوجینس miR کی بڑھتی ہوئی دستیابی کی نشاندہی کرتا ہے۔ روکے ہوئے گردے میں خراب ٹشوز سے -21 اور UUO گردے میں Tlr8 کے اوور ایکسپریشن کو چالو کرنا شیم کے مقابلے میں۔ ایک ساتھ مل کر، ہم یہ نتیجہ اخذ کرتے ہیں کہ رکاوٹ گردے میں miR-21 کی زیادہ مقدار پوڈوسائٹس میں اینڈوسوم تک پہنچتی ہے اور Tlr8-NF-kB راستے کی ثالثی ایکٹیویشن اور proinflammatory cytokines کی رطوبت کو اکساتی ہے۔ یہ سائٹوکائنز، بدلے میں، پوڈوسیٹ چوٹ کے ذریعے جی ایل کی نشوونما میں حصہ لیتے ہیں۔

IL1b NF-kB-پاتھ وے کی ایک اہم ڈاؤن اسٹریم سائٹوکائنز میں سے ایک ہے، جو بنیادی طور پر بیماری کے حالات میں گلومیرولس میں پوڈوکیٹس کے ذریعے تیار ہوتی ہے۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ IL1b PFMs (36، 37) کو کم کرکے پوڈوسیٹ چوٹ کو متاثر کرتا ہے۔ موجودہ مطالعے میں، ہم نے Il1b کا اعلی گلوومیرولر اظہار اور PFMs کے ساتھ اس کا اجتماعی اظہار دکھایا، جس نے اظہار کو کم کیا۔ مزید یہ کہ Il1b کا گلوومیرولر اظہار Tlr8 کے ساتھ منسلک ہوتا ہے اور PFMs (Nphs1 اور Synpo) کے اظہار کے ساتھ ہم آہنگ ہوتا ہے۔ لہذا، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ Tlr8 کے بہاو والے عوامل، بشمول Il1b اور Il6، PFM اظہار کو کم کر کے رکاوٹ گردے میں پوڈوسیٹ کی چوٹ کا سبب بن سکتے ہیں۔

نوجوان چوہوں کے کولیٹرل گردے نے بھی GLs اور PFMs کا نقصان ظاہر کیا۔ اس نتیجہ کی تصدیق SEM کے ذریعہ کی گئی، جس نے کولیٹرل گردے میں پوڈوسیٹ کی چوٹ کا انکشاف کیا۔ ہمیں آن ماؤس ماڈل میں سیرم miR-21 کی اعلی سطح بھی ملی۔ مزید برآں، IL1b پروٹین PFM کے ساتھ مل کر مقامی ہے۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ سیرم miR-21 کولیٹرل گردے کے پوڈوسائٹس میں TLR8 کے ساتھ تعامل کرتا ہے اور ڈاون اسٹریم سائٹوکائنز کی پیداوار کو چالو کرتا ہے، جس کے نتیجے میں پوڈوسیٹ فنکشن اور پوڈو سائیٹ کی چوٹ کم ہوتی ہے۔ پوڈوسائٹ کی چوٹ پرانے چوہوں کے روکے ہوئے اور کولیٹرل گردے میں بھی ایسے ہی میکانزم کے ذریعے دیکھی گئی جس کا مشاہدہ نوجوان چوہوں میں ہوتا ہے۔

آخر میں (شکل 8)، یکطرفہ ureteral رکاوٹ کے بعد glomerular miR-21 اظہار بلند ہوتا ہے، جس میں یہ پوڈوسیٹس میں TLR8 کے ساتھ تعامل کرتا ہے اور NF-kB پاتھ وے کو چالو کرنے کی تجویز کرتے ہوئے نیچے کی طرف سائٹوکائنز (Il1b اور Il6) کی پیداوار کو اکساتا ہے۔ سائٹوکائنز کی اعلیٰ سطح PFM کو کم کرتی ہے، جس کے نتیجے میں پوڈوسیٹ کی چوٹ اور اس کے نتیجے میں GLs کی نشوونما ہوتی ہے۔ سیرم miR-21 کی بلند سطح کولیٹرل گردے کے پوڈوسائٹس میں TLR8 کو چالو کرتی ہے اور پوڈوسیٹ انجری کے ذریعے GLs کو دلاتی ہے۔ لہذا، یہ مطالعہ واضح طور پر Tlr8 اوور ایکسپریشن کے بعد پوڈوسیٹ چوٹ کے ذریعے رکاوٹ شدہ اور کولیٹرل گردوں میں GL کی نشوونما کو ظاہر کرتا ہے۔