RNA کی ترتیب کی بنیاد پر گردے کی عمر بڑھنے میں LncRNA کے کردار کی پیش گوئی کریں Ⅱ

lncRNA Gm43360 اور اس کے ممکنہ ہدف mRNAs کا باہمی تعلق

LncRNA Gm43360 کو مطالعہ کے لیے منتخب کیا گیا تھا کیونکہ اس نے دو lncRNA-mRNA کو ایکسپریشن نیٹ ورکس کو جوڑا ہے۔ Adra1a کی اظہار کی سطح مثبت طور پر منسلک تھی (rho=0.8650, p=0.026) Gm43360 کے ساتھ، Csnk1a1 (کیسین کنیز 1A1) منفی طور پر منسلک تھی (rho{{12) }}.8084، p=0.0084) (تصویر 5a)۔ lncRNA Gm43360 اور اس کے ممکنہ ہدف mRNAs Adra1a اور Csnk1a1 کے ارتباط کی مزید تصدیق کرنے کے لیے، اس مطالعے میں lncRNA Gm43360 کا ایک اوور ایکسپریشن پلازمیڈ ڈیزائن کیا گیا تھا۔ Csnk1a1 کا اظہار توقع کے مطابق کم ہوا، اور Adra1a اظہار بھی کم ہوا، لیکن نمایاں طور پر نہیں۔ اگلا، ہم نے siRNA کے ذریعہ lncRNA Gm43360 کو دستک دیا تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا اس کے ہدف mRNAs کا اظہار متاثر ہوا ہے۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، siRNA منفی کنٹرول گروپ (تصویر 5b) کے نسبت lncRNA Gm43360 ناک ڈاؤن سیلز میں Csnk1a1 میں اضافہ کیا گیا تھا۔ دس، ہم نے سیل سائیکل میں lncRNA Gm43360 کے کردار کا پتہ لگایا۔ سیل گنتی کٹ-8 (CCK-8) کے نتائج سے ظاہر ہوا کہ lncRNA Gm43360 نے سیل کی قابل عملیت کو فروغ دیا (تصویر 5c)۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ lncRNA Gm43360 نے منفی کنٹرول (تصویر 5d) کے مقابلے S فیز سیلز کا فیصد بڑھایا اور G1 فیز سیلز کا فیصد کم کیا۔ te p53 اور p21 پروٹین سیل سائیکل کے ضابطے میں شامل تھے اور اس طرح سیل کی عمر بڑھنے کے نشانات تھے۔ کنٹرول گروپ کے نسبت اوور ایکسپریشن گروپ میں p53 اور p21 کے اظہار کی سطح میں نمایاں کمی واقع ہوئی تھی۔ siRNA کنٹرول گروپ (تصویر 5e) کی نسبت siRNA گروپ میں p53 اور p21 کے اظہار کی سطح میں نمایاں اضافہ ہوا ہے۔ lncRNA Gm43360 کے اوور ایکسپریشن نے SA- -gal-positive خلیات کی تعداد میں کمی کی، اور transfect Gm43360 (تصویر 5f) کے گروپ میں -gal-مثبت خلیات میں اضافہ ہوا۔ ایک ساتھ لے کر، ان نتائج نے اشارہ کیا کہ lncRNA Gm43360 نے گردوں کے نلی نما اپکلا خلیوں کے حواس کو روکاCsnk1a1 کے اظہار کو روکنا.

گردے کے کام کے لیے 25% ایکیناکوسائیڈ اور 9% ایکٹیوسائیڈ کے ساتھ قدرتی آرگینک سیسٹانچ ایکسٹریکٹ حاصل کرنے کے لیے یہاں کلک کریں۔

بحث

اس مطالعے میں، ہم نے نوجوان اور بوڑھے ماؤس کے گردوں سے mRNA اظہار کے اعداد و شمار کا جائزہ لیا اور بائیو انفارمیشن کے تجزیے کیے جس نے غیر معمولی اظہار کردہ mRNAs کے افعال کا انکشاف کیا۔ ہم نے 347 اپ ریگولیٹڈ mRNAs اور 355 ڈاؤن ریگولیٹڈ mRNAs کے ساتھ ساتھ 130 اپ ریگولیٹڈ lncRNAs اور 91 نیچے ریگولیٹڈ lncRNAs کا مشاہدہ کیا۔پرانے ماؤس کے گردے نوجوان ماؤس کے گردوں کے مقابلے میں. اس کے علاوہ، ان mRNAs کو بڑھاپے سے متعلق راستوں میں ملوث دکھایا گیا تھا، جیسےآکسیڈیٹیو فاسفوریلیشن, AMPK سگنلنگ پاتھ وے، Wnt سگنلنگ پاتھ وے، Rap1 سگنلنگ پاتھ وے، اور عمر سے متعلق بیماری، جس نے گردوں کی عمر بڑھنے کے روگجنن میں امتیازی طور پر اظہار شدہ mRNAs کے افعال کو ظاہر کیا۔

طویل نان کوڈنگ RNA NEAT1 گردوں کے نلی نما اپکلا خلیات [21] میں گردے کے فبروسس کے بڑھنے کا ایک حفاظتی عنصر ہے۔ اتفاق سے، ہمارے تسلسل کے نتائج میں، lncRNA NEAT1 کا اظہار نوجوان چوہوں کے مقابلے بوڑھے چوہوں کے گردوں میں نچلی سطح پر کیا گیا تھا، جو پچھلے نتائج سے مطابقت رکھتا ہے۔ LincRNA-Gm4419 ذیابیطس نیفروپیتھی [22] میں NF-kB/NLRP3 سوزش کی ثالثی کے طریقہ کار کے ذریعہ سوزش اور فبروسس کو تیز کرتا ہے۔ ہمارے ترتیب کے نتائج میں، ہم نے یہ بھی پایا کہ عمر کے چوہوں کے گردوں میں نوجوان چوہوں کی نسبت Gm4419 کا اظہار زیادہ تھا، لیکن کوئی خاص فرق نہیں تھا۔ LncRNA Gm43360 کروموسوم 5 (Chr5:122494022–122,494,908, 2887 bp) پر واقع ہے۔ UCSC جینوم براؤزر کے مطابق، Gm43360 پروٹین کوڈنگ جین Atp2a2 کے انٹرن میں واقع ہے۔ تاہم، آج تک بیماریوں میں lncRNA Gm43360 کے ملوث ہونے کے بارے میں کوئی اطلاع نہیں ملی ہے۔ اس مطالعہ میں، lncRNA Gm43360 کے دستک ڈاؤن نے گردوں کے نلی نما اپکلا سیل سنسنی کو فروغ دیا۔ اس کے علاوہ، ہم نے ترتیب کے نتائج میں بہت سے الگ الگ اظہار کردہ lncRNAs کی نشاندہی کی اور ان کی چھان بین کی۔

LncRNAs کو lncRNA ریگولیٹری میکانزم کی بنیاد پر cis-regulation یا trans-regulation میں درجہ بندی کیا گیا تھا۔ cis-acting lncRNAs cis- ایکٹنگ عناصر، جیسے پروموٹرز، بڑھانے والے، اور ریگولیٹری ترتیب، جو 100 kb سے کم کے lncRNAs اور mRNAs کے درمیان فاصلے ہوتے ہیں، پر انحصار کرتے ہوئے پڑوسی جینوں کے اظہار کو متاثر کر سکتے ہیں۔ ٹرانس ایکٹنگ lncRNAs lncRNAs کا حوالہ دیتے ہیں جو منتقلی کی جگہ کو چھوڑ کر دور دراز مقامات پر کام کرتے ہیں (یعنی، lncRNAs اور mRNAs کے درمیان فاصلہ 100 kb سے زیادہ ہے) [23]۔ lncRNA MAAT ایک cis-regulatory ماڈیول کے ذریعے پڑوسی جین Mbnl1 کے اظہار کو بڑھاتا ہے [24]۔ lncRNA Pnky کارٹیکل ڈیولپمنٹ میں ٹرانس ایکٹنگ ریگولیٹر کے طور پر کردار ادا کرتا ہے [25]۔ اس مطالعہ میں، lncRNA Gm43360 اور Csnk1a1 کے درمیان ایک عبوری تعلق تھا۔ Csnk1a1 ایک ٹیومر دبانے والا جین ہے [26] جو ایک پروٹین کو انکوڈ کرتا ہے جو سیل سائیکل اور سیل ڈویژن کے عمل میں حصہ لیتا ہے [27]۔ Csnk1a1 ڈاؤن ریگولیشن آمادہ کرتا ہے۔سنسنی سے وابستہ سوزشکولوریکٹل ٹیومر میں نمو کی گرفتاری کے ساتھ ردعمل [26]۔ جب Gm43360 کو اپ ریگولیٹ کیا گیا تو Csnk1a1 کو کم کر دیا گیا تھا۔ اس طرح، امکان ہے کہ lncRNA Gm43360 اس میں حصہ لےگردے کی عمر بڑھ رہی ہےکی طرف سےCsnk1a1 اظہار کو منظم کرنا.

نتائج

میں lncRNA-mRNA coexpression نیٹ ورک کی ہماری تحقیقاتگردے کی عمر بڑھ رہی ہےایک lncRNA، lncRNA Gm43360، گردے کی عمر بڑھنے میں حفاظتی کردار ادا کر سکتا ہے اور اس میں شامل میکانزم کے بارے میں ہماری سمجھ کو بڑھا سکتا ہے۔گردے کی عمر بڑھ رہی ہے

مواد اور طریقے

جوان (3-ماہ کے) اور بوڑھے (24-ماہ کے) نر C57BL/6J چوہوں کے نمونے Xiamen یونیورسٹی کے تجرباتی جانوروں کے مرکز سے خریدے گئے تھے اور ان کی پرورش ایک معیاری ماحول میں ہوئی تھی۔ تمام چوہوں کو خوراک اور پانی تک مفت رسائی حاصل تھی۔ چوہوں کو قربانی سے پہلے ایک ماہ تک نئی سہولت سے ہم آہنگ کیا گیا۔ نمونہ جمع کرنے سے پہلے چوہوں کو 750 ملی گرام/کلوگرام کی خوراک میں انٹراپیریٹونیل انجیکشن کے ذریعے یوریتھین کے ساتھ اینستھیز کیا گیا تھا۔ ایک ہی دن جوان اور بوڑھے چوہوں کی قربانی دی گئی۔بقایا ماؤس گردےہر پرکھ میں ترتیب کے لیے ٹشو استعمال کیا جاتا تھا۔ آر این اے سیک اور ہسٹوپیتھولوجی پر کارکردگی کا مظاہرہ کیا گیا۔علیحدہ گردےایک ہی ماؤس سے. گردے کے ٹشو چوہوں سے جمع کیے گئے تھے۔ ایک گردے کو فوری طور پر 10% نیوٹرل بفرڈ فارملین میں ڈبو دیا گیا تاکہ بعد کے حصے میں سرایت ہو جائے، اور دوسرے گردے کو کئی ٹشوز میں تقسیم کر کے فوری طور پر مائع نائٹروجن میں رکھا گیا اور پھر -80 ڈگری پر ذخیرہ کر دیا گیا۔ اس مطالعہ کو Xi'an Jiaotong یونیورسٹی (Shaanxi، China) کے پہلے منسلک ہسپتال کی اخلاقیات کمیٹی (نمبر 2018-G-164) کی حمایت حاصل تھی۔ تمام طریقے جانوروں کی اخلاقیات کے رہنما خطوط اور ضوابط کے ذریعہ انجام دیئے گئے تھے۔ یہ مطالعہ ARRIVE رہنما خطوط کی تعمیل میں کیا گیا تھا۔

گردے کی ہسٹوپیتھولوجی

نوجوان اور بوڑھے چوہوں کے رینل ٹشو کے نمونے راتوں رات 10% paraformaldehyde محلول میں طے کیے گئے۔ دس حصوں کو پانی کی کمی، پیرافین ایمبیڈڈ، اور 4-µm موٹائی پر سیکشن کیا گیا تھا۔ معیاری پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے پی اے ایس اور میسن کے ٹرائی کرومیٹک داغ لگائے گئے تھے۔ کیمرہ کے ذریعہ تصاویر کو پکڑا گیا تھا، اور داغ لگانے والے مثبت علاقے کی پیمائش کی گئی تھی۔ ہسٹوپیتھولوجی کیمرہ امیجز کے رقبے کا شمار امیج پرو پلس 6.0 کے ساتھ کیا گیا تھا۔

SA-gal داغ

SA{{0}}گل سرگرمی کا تجزیہ کارخانہ دار کے پروٹوکول کے مطابق SA- -گیل سٹیننگ کٹ (سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی #9860) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ مثبت داغ کے علاقے کی پیمائش کی گئی، اور امیج-پرو پلس 6.0 کا استعمال کرتے ہوئے SA- -گیل پازیٹو سیلز کا حساب لگایا گیا۔

آر این اے نکالنے کی لائبریری کی تعمیر اور ترتیب

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7۔{1}} کو ترتیب دینے والی لائبریری کی تعمیر کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ کل RNA نکالنے کے بعد، mRNA کو کل RNA (5ug) سے Dynabeads Oligo (dT) (تھرمو فشر، CA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے دو راؤنڈ صاف کیا گیا۔ تطہیر کے بعد، mRNA کو اعلی درجہ حرارت (Magnesium RNA Fragmentation Module (NEB, cat. e6150, USA) 94 ڈگری 5-7 منٹ سے کم) پر divalent cations کا استعمال کرتے ہوئے چھوٹے ٹکڑوں میں تقسیم کیا گیا۔ پھر کلیویڈ RNA کے ٹکڑوں کو SuperScript™ II ریورس ٹرانسکرپٹیس (انویٹروجن، بلی 1,896,649، USA) کے ذریعے cDNA حاصل کرنے کے لیے ریورس ٹرانسکرائب کیا گیا، جو اگلا E. coli DNA پولیمریز I (کے ساتھ U-لیبل والے دوسرے پھنسے ہوئے DNAs کی ترکیب کے لیے استعمال کیے گئے تھے۔ NEB, cat.m0209, USA), RNase H (NEB, cat.m0297, USA) اور dUTP حل (Termo Fisher, cat.R0133, USA)۔ اس کے بعد ہر اسٹرینڈ کے کند سروں پر ایک A-بیس شامل کیا گیا تھا، ان کو انڈیکسڈ اڈاپٹر کے ساتھ لگنے کے لیے تیار کیا گیا تھا۔ ہر اڈاپٹر میں اڈاپٹر کو A-ٹیلڈ فریگمینٹڈ ڈی این اے سے منسلک کرنے کے لیے ایک T-بیس اوور ہینگ ہوتا ہے۔ ڈوئل انڈیکس اڈیپٹرز کو ٹکڑوں پر باندھ دیا گیا تھا، اور سائز کا انتخاب AMPureXP موتیوں کے ساتھ کیا گیا تھا۔ ہیٹ لیبل UDG انزائم (NEB, cat.m0280, USA) U-لیبل والے دوسرے پھنسے ہوئے DNAs کے علاج کے بعد، ligated مصنوعات کو PCR کے ساتھ درج ذیل شرائط کے ساتھ بڑھا دیا گیا: 3 منٹ کے لیے 95 ڈگری پر ابتدائی ڈینیچریشن؛ 15 سیکنڈ کے لیے 98 ڈگری پر ڈینیچریشن کے 8 چکر، 15 سیکنڈ کے لیے 60 ڈگری پر اینیلنگ، اور 30 ​​سیکنڈ کے لیے 72 ڈگری پر توسیع؛ اور پھر 5 منٹ کے لیے 72 ڈگری پر حتمی توسیع۔ حتمی سی ڈی این اے لائبریریوں کے لیے اوسط داخل کی لمبائی 300 ± 50 bp تھی۔ آخر کار، ہم نے مینوفیکچرر کے پروٹوکول [28] کے مطابق Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, China) پر 2×150 bp پیئرڈ اینڈ سیکوینسنگ (PE150) انجام دیا۔

بائیو انفارمیٹکس تجزیہ ترتیب اور کلین ریڈز کی فلٹرنگ

سے پولڈ آر این اے سے ٹیکنالوجی کے ذریعے تعمیر کردہ سی ڈی این اے لائبریریگردے کے نمونےچوہوں کی ترتیب ترتیب دی گئی اور Illumina NovaseqTM 6000 ترتیب پلیٹ فارم کے ساتھ چلائی گئی۔ ایلومینا پیئر اینڈ آر این اے سیق اپروچ کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے ٹرانسکرپٹوم کو ترتیب دیا، جس سے کل مل لون 2×150 bp پیئرڈ اینڈ ریڈز تیار ہوئے۔ ترتیب دینے والی مشینوں سے حاصل کردہ ریڈز میں خام ریڈز شامل ہیں جن میں اڈاپٹر یا کم معیار کی بنیادیں شامل ہیں جو درج ذیل اسمبلی اور تجزیہ کو متاثر کریں گی۔ اس طرح، اعلیٰ معیار کی کلین ریڈز حاصل کرنے کے لیے، ریڈز کو Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/، version:cutadapt-1.9) کے ذریعے مزید فلٹر کیا گیا۔ پیرامیٹرز مندرجہ ذیل تھے:

1) اڈاپٹر پر مشتمل ریڈز کو ہٹانا؛

2) پولی اے اور پولی پر مشتمل ریڈز کو ہٹانا؛

3) 5% سے زیادہ نامعلوم نیوکلیوٹائڈز (N) پر مشتمل ریڈز کو ہٹانا؛

4) کم کوالٹی ریڈز کو ہٹانا جس میں 20 فیصد سے زیادہ کم کوالٹی (کیو ویلیو 20 سے کم یا اس کے برابر) بیسز ہوں۔

FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9) کا استعمال کرتے ہوئے دس ترتیب کے معیار کی تصدیق کی گئی۔ صاف ڈیٹا کے Q20، Q30، اور GC مواد سمیت۔ اس کے بعد، کل جی بی پی کلین، پیئر اینڈ ریڈز تیار کیے گئے۔ خام ترتیب کا ڈیٹا NCBI جین ایکسپریشن اومنیبس (GEO) ڈیٹاسیٹس کو الحاق نمبر GSE154223 کے ساتھ جمع کرایا گیا ہے۔

حوالہ جینوم/تشریح Mus_musculus.GRCm38 تھی۔ تجزیوں کے لیے استعمال ہونے والی جین تشریح کا ماخذ اور ورژن Ensembl_v88 تھا۔

ٹرانسکرپٹ اسمبلی

سب سے پہلے، کٹاڈیپٹ [29] کا استعمال ان ریڈز کو ہٹانے کے لیے کیا گیا تھا جس میں اڈاپٹر آلودگی، کم معیار کے اڈے، اور غیر متعین اڈے تھے۔ FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/) کا استعمال کرتے ہوئے دس ترتیب کے معیار کو بہت کھلایا گیا تھا۔ ہم نے Bowtie2 [31] اور Hisat2 [32] کا استعمال ماؤس کے جینوم کے پڑھنے کے نقشے کے لیے کیا۔ ہر نمونے کے میپڈ ریڈز کو StringTie [33] کا استعمال کرتے ہوئے جمع کیا گیا تھا۔ دس، تمام نقلیں منجانبگردے کے نمونےپرل اسکرپٹس کا استعمال کرتے ہوئے ایک جامع ٹرانسکرپٹوم کو دوبارہ تشکیل دینے کے لیے ضم کیا گیا تھا۔ حتمی ٹرانسکرپٹوم تیار ہونے کے بعد، تمام ٹرانسکرپٹس کے اظہار کی سطح کا اندازہ لگانے کے لیے StringTie [33] اور edgeR [34] کا استعمال کیا گیا۔

LncRNA شناخت

سب سے پہلے، وہ ٹرانسکرپٹس جو معلوم mRNAs اور 200 bp سے چھوٹی ٹرانسکرپٹس کے ساتھ اوورلیپ ہو گئی تھیں، مسترد کر دی گئیں۔ پھر ہم نے CPC [35] اور CNCI [36] کو کوڈنگ کی صلاحیت کے ساتھ نقل کی پیش گوئی کرنے کے لیے استعمال کیا۔ سی پی سی سکور کے ساتھ تمام ٹرانسکرپٹس<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

امتیازی طور پر اظہار شدہ تجزیہ جین (DGEs) تجزیہ

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 کو الگ الگ اظہار شدہ جین سمجھا جاتا تھا۔

ہدف جین کی پیشن گوئی اور lncRNAs کا فعال تجزیہ

lncRNAs کے فنکشن کے فنکشن کو دریافت کرنے کے لیے، ہم نے lncRNAs کے cis-ٹارگٹ جینز کی پیش گوئی کی۔ LncRNAs پڑوسی ہدف والے جینوں پر عمل کرنے میں cis کا کردار ادا کر سکتے ہیں۔ اس مطالعہ میں، پرل اسکرپٹ کے ذریعے 100،000 اپ اسٹریم اور ڈاؤن اسٹریم میں کوڈنگ جینز کا انتخاب کیا گیا تھا۔ اس کے بعد، ہم نے BLAST2GO [39] اسکرپٹس کا استعمال کرکے lncRNAs کے لیے ہدف والے جینوں کا ایک فعال تجزیہ دکھایا۔ پبلک ڈومین سے مکمل کمانڈز کا لنک Jie-Li/README.md تھا main · dandan-li/Jie-Li (github.com) پر۔

جین آنٹولوجی (GO) کیٹیگریز اور کیوٹو انسائیکلوپیڈیا آف جینز اینڈ جینوم (KEGG) تجزیہ

آر این اے کی ترتیب کے لیے بایو انفارمیٹکس تجزیہ OmicStudio ٹولز (http://www.omicsudio. cn/tool) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ جین اونٹولوجی (GO) فنکشنل افزودگی تجزیہ اور کیوٹو انسائیکلوپیڈیا آف جینز اینڈ جینومز (KEGG) [37–39] افزودگی کا تجزیہ پیش گوئی شدہ ہدف جینوں کے حیاتیاتی افعال کا تجزیہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ GO تجزیہ تین پہلوؤں کے ذریعے اہم حیاتیاتی عمل کو واضح کرتا ہے: سیل کی ساخت، سالماتی افعال، اور حیاتیاتی عمل (http://www.geneontology. org/)۔ تجزیہ فرسٹ GO ڈیٹا بیس میں تمام مختلف جینز اور بیک گراؤنڈ جینز کو رکھتا ہے۔ ہر آئٹم کو میپ کیا جاتا ہے، ہر آئٹم میں جینز کی تعداد کا حساب لگایا جاتا ہے، اور افزودگی کے نتیجے کی P قدر حاصل کرنے کے لیے ہائپر جیومیٹرک ڈسٹری بیوشن کا استعمال مفروضے کی جانچ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ P قدر جتنی کم ہوگی، افزودگی کا نتیجہ اتنا ہی اہم ہوگا۔ KEGG ایک ڈیٹا بیس کا وسیلہ ہے جو ٹارگٹ جینز (https://www.genome.jp/kegg/) سے متعلق اہم راستوں کو دریافت کرنے کے لیے جینیاتی حیاتیات کے ذریعے الگ الگ اظہار کردہ mRNAs کا تجزیہ کرتا ہے۔ نتائج کا اظہار p-values ​​سے کیا جاتا ہے۔ پی ویلیو جتنی کم ہوگی، افزودگی کا نتیجہ اتنا ہی اہم ہوگا۔

کیو آر ٹی – پی سی آر

GAPDH کو اینڈوجینس کنٹرول کے طور پر استعمال کیا جاتا تھا۔ پھر، نامعلوم جینوں کے متعلقہ اظہار کی سطحوں کا حساب لگایا گیا۔ تمام پرائمر خاص طور پر اس تجربے کے لیے ڈیزائن اور ترکیب کیے گئے تھے۔ GAPDH کے لیے پرائمر کو تجارتی بنا دیا گیا ہے۔ Adra1a اور Csnk1a1 پرائمر کی خصوصیت کی شناخت پگھلنے والے وکر کی واحد چوٹی سے کی گئی تھی۔

mRNA-lncRNA کو ایکسپریشن نیٹ ورک بنائیں

ٹرانس ریگولیشن تحقیق پر مبنی تھی، اور پھر ٹرانس انرجی کا حساب لگایا گیا۔ ٹرانس انرجی جتنی چھوٹی تھی، بائنڈنگ کا امکان اتنا ہی زیادہ تھا۔ پھر، mRNA-lncRNA کے ارتباطی گتانک کا بھی حساب لگایا گیا۔ mRNA-lncRNA نیٹ ورک کو اسپیئر مین کے ارتباط کے قابلیت کو منتخب کرکے بنایا گیا تھا جو 0.9 سے زیادہ ہے۔ mRNA-lncRNA coexpression نیٹ ورک Cytoscape سافٹ ویئر (v3.7.1) کا استعمال کرتے ہوئے بنایا گیا تھا۔

سیل کلچر

ماؤس رینل پروکسیمل ٹیوبلر اپیتھیلیل سیلز (MRPT-EpiCs) کو اپیٹیلیل سیل میڈیم اینیمل (EpiCM-a, Cat. #4131) میں کلچر کیا گیا تھا جس میں 2% فیٹل بوائین سیرم (FBS, Cat. #0010) اور اپیتھیلیل سیل گروتھ سپلیمنٹ- (EpiCGS-a, Cat. #4182) بغیر نمی والے انکیوبیٹر میں 37 ڈگری اور 5% CO2 پر اینٹی بائیوٹکس کے۔ ثقافت کا ذریعہ ہر 2-3 دن میں تبدیل کیا جاتا تھا۔ لوگاریتھمک نمو کے مرحلے میں خلیات ذیلی ثقافتی تھے جب نمو 90٪ تک پہنچ گئی۔ ٹرپسن کے ذریعے ہضم شدہ سیل معطلی کو ہر کنویں میں 2*104 -5*104 سیلوں کے ساتھ 6-کنویں کی پلیٹوں میں سیڈ کیا گیا تھا۔ منتقلی کے لیے استعمال ہونے والے خلیے 2 اور 5 کے درمیان تھے۔

پلازمیڈ کی تعمیر اور سیل کی منتقلی

lncRNA Gm43360 اوور ایکسپریشن پلازمیڈ جین کیم (شنگھائی، چین) نے بنایا تھا۔ پلاسمڈ ریڑھ کی ہڈی GV658 تھی، اور CMV پروموٹر نے lncRNA اظہار کو چلایا۔ کلون شدہ نیوکلیوٹائڈ کی ترتیب ضمنی مواد میں فراہم کی گئی ہے۔ lncRNA Gm43360 ناک آؤٹ کے لیے، تین lncRNA ENS کو siRNAs کو00000197656-ہدف بنانا ہوگا (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm',9CCUCAUCAU2}} UGAAGUUTT-3'؛ اور lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3') کو جین فارما (شنگھائی، چین) میں ڈیزائن اور ترکیب کیا گیا تھا۔ مینوفیکچرر کے پروٹوکول کے مطابق، خلیات کو 2500 ng پلازمیڈ یا 100 pmol siRNA کے ساتھ 6 µl Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, USA) فی کنویں کے ساتھ منتقل کیا گیا تھا۔ آر این اے اور پروٹین کے اظہار کی سطح کو منتقلی کے بعد 48 گھنٹے پر پتہ چلا، اور ہر تجربہ کو کم از کم تین بار دہرایا گیا۔ ریئل ٹائم مقداری پی سی آر کا استعمال lncRNA Gm43360 اوور ایکسپریشن اور ناک ڈاؤن کی کارکردگی کو درست کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔

مغربی دھبے کا تجزیہ

مہذب خلیوں کو برف کے ٹھنڈے پی بی ایس سے دھویا گیا، 120 µl RIPA بفر (ہارٹ، چائنا) شامل کیا گیا، اور پروٹیز انحیبیٹر اور PMSF (ہارٹ، چائنا) کو برف پر 30 منٹ کے لیے شامل کیا گیا۔ مختلف مائیکرو سینٹرفیوج ٹیوبوں میں خلیوں کو جمع کرنے کے بعد، پروٹین کی حراستی کی مقدار درست کردی گئی۔ لوڈنگ بفر کو ہر نمونے میں شامل کیا گیا اور پھر 7 منٹ کے لئے ابالا۔ نمونے کے تیس مائکروگرامس کو 12٪ SDS – PAGE (Beyotime، China) کے ذریعے الگ کیا گیا اور PVDF جھلیوں (تھرمو فشر، USA) میں الیکٹرو ٹرانسفر کیا گیا۔ اس کے بعد، جھلیوں کو 5٪ دودھ کے ساتھ روک دیا گیا تھا. جھلیوں کو مخصوص بنیادی اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا: اینٹی p21 (1:1000، Abcam، ab109199)، اینٹی p53 (1:1000، Proteintech، 10442-1-AP)، اور اینٹی GAPDH (1:3000، Profintech , 60004-1-Ig) رات بھر 4 ڈگری پر۔ TBST کے ساتھ دھونے کے بعد، جھلیوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے کے لیے سیکنڈری اینٹی باڈی کے ساتھ انکیوبیٹ کیا جاتا تھا۔ کیمیلومینیسینس کٹ (ملی پور، امریکہ) کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین بینڈ کا مشاہدہ کیا گیا۔ GAPDH کا اظہار پروٹین کی سطح کو معمول پر لانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔

سیل پھیلاؤ پرکھ

سیل کے پھیلاؤ کی صلاحیت کا تعین سیل گنتی کٹ-8 (CCK-8) پرکھ کے ذریعے کیا گیا تھا۔ منتقلی کے اڑتالیس گھنٹے بعد، ہر کنویں میں 90 µl نیو میڈیم اور 10 µl CCK-8 محلول شامل کیا گیا (بیو ٹائم، C0042)۔ خلیوں کو 5% CO2 میں 37 ڈگری پر 1–4 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا اور یونیورسل مائکروپلیٹ ریڈر (Bio-Tek, USA) کے ذریعہ 450 nm پر ماپا گیا تھا۔

فلو سائٹومیٹرک تجزیہ

خلیوں کو منتقلی سے ایک دن پہلے 6-کنویں پلیٹوں میں چڑھایا گیا تھا۔ منتقلی کے اڑتالیس گھنٹے بعد، خلیوں کو ٹرپسنائز کیا گیا اور 5 منٹ کے لیے 1000 rpm پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ پھر، خلیات کو 70٪ ایتھنول میں 4 ڈگری پر کم از کم 4 گھنٹے کے لیے طے کیا گیا۔ سینٹرفیوگریشن کے بعد، RNase A اور propidium iodide (PI) سٹیننگ سلوشن کو خلیوں میں شامل کیا گیا، اور پھر خلیات کو اندھیرے میں کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا۔ ACEA NovoCyte (Biosciences, USA) کا استعمال کرتے ہوئے Te-stained خلیوں کا تجزیہ کیا گیا۔

شماریاتی تجزیہ

عام تقسیم کے ذریعہ پیمائش کے اعداد و شمار کو اوسط ± SD کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ دو مختلف گروپوں کے درمیان فرق کا تعین دو دم والے بغیر جوڑ والے طالب علم کے ٹی-ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، اور p-value < 0.05 کو شماریاتی لحاظ سے اہم سمجھا جاتا تھا۔ تمام حسابات GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., USA) کا استعمال کرتے ہوئے کئے گئے تھے۔

حوالہ جات

1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre JV, Ferenbach DA. گردے میں سیلولر سنسنی جے ایم سوک نیفرول۔ 2019؛ 30(5):726–36۔

2. تیتر ایل، ڈیلن جے، سلیگ بوم پیئ۔ بڑھتی عمر کے عالمی چیلنجوں کا سامنا کرنا۔ فطرت 2018؛561(7721):45–56۔

3. پین جے ایکس۔ LncRNA H19 MAPK اور NF-kB سگنلنگ پاتھ ویز کو ریگولیٹ کرکے ایتھروسکلروسیس کو فروغ دیتا ہے۔ Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017؛21(2):322–8۔

4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. لانگ نان کوڈنگ RNA HOTAIR EZH2-سیسٹیمیٹک میں منحصر myofibroblast ایکٹیویشن کو چلاتا ہے۔ نوچ کی miRNA 34a پر منحصر ایکٹیویشن کے ذریعے سکلیروسیس۔ این ریمیٹک ڈس۔ 2020؛79(4):507–17۔

5. Luo J، Wang K، Yeh S، Sun Y، Liang L، Xiao Y، Xu W، Niu Y، Cheng L، Maity SN، et al. LncRNA-p21 EZH2/ STAT3 سگنلنگ کو ماڈیول کرنے کے ذریعے اینٹی اینڈروجن اینزلوٹامائڈ سے متاثرہ پروسٹیٹ کینسر نیورو اینڈوکرائن تفریق کو تبدیل کرتا ہے۔ نیٹ کمیون۔ 2019؛ 10(1):2571۔

6. Wang Y، Yang L، Chen T، Liu X، Guo Y، Zhu Q، Tong X، Yang W، Xu Q، Huang D، et al. ایک ناول lncRNA MCM3AP-AS1 miR-194-5p/FOXA1 محور کو نشانہ بنا کر ہیپاٹو سیلولر کارسنوما کی نشوونما کو فروغ دیتا ہے۔ مول کینسر۔ 2019؛ 18(1):28۔

7. وو YY، Kuo HC. نیوروڈیجینریٹیو بیماریوں کے روگجنن میں نان کوڈنگ آر این اے کے فنکشنل کردار اور نیٹ ورک۔ جے بایومیڈ سائنس 2020؛ 27(1):49۔

8. لی زیڈ، وانگ زیڈ۔ عمر رسیدہ گردے اور عمر بڑھنے سے متعلق بیماری۔ ایڈو تجرباتی میڈ بائیول۔ 2018؛ 1086:169-87۔

9. Wang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Rule AD. عمر، گردے کا کام، اور خطرے کے عوامل گردے کے کارٹیکل اور میڈولری حجم کے ساتھ مختلف طریقے سے منسلک ہوتے ہیں۔ کڈنی انٹ۔ 2014؛85(3):677–85۔

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR RAB3IP کے ذریعے پارکنسنز کی بیماری کے بڑھنے کو فروغ دینے کے لیے miR-126-5p کو نشانہ بناتا ہے۔ بائیول کیم۔ 2019؛ 400(9):1217–28۔

Wecistanche کی معاون خدمت - چین میں سب سے بڑا cistanche برآمد کنندہ:

ای میل:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

مزید تفصیلات کے لیے خریداری کریں:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop